WO2012152208A1 - 一类噻唑类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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陈飞
张仰明
李佳
周宇波
苏明波
丁健
蒙凌华
谢欣
王识贤
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中国科学院上海药物研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a class of thiazole compounds, a process for their preparation and use, and more particularly to a novel derivative of the natural product largazole, a process for its preparation and as a histone deacetylase (HDAC) inhibitor
  • HDAC histone deacetylase
  • HDAC Histone deacetylase
  • MS Multiple Sclerosis
  • the pathogenesis of MS disease is characterized by acute inflammation of the central nervous system and demyelination, which is one of the most important causes of non-invasive neurological spasm and disability in young people.
  • the clinical manifestations of MS were mostly heterogeneous, and more than 80% of patients showed repeated remission phenotypes. Because the mechanism of the disease is unknown, and there is currently no sensitive diagnostic marker, the diagnosis of MS can still only be based on the multiple temporal and spatial aspects of the disease.
  • many other diseases such as optic neuromyelitis and MS have very similar conditions, so the current treatment and even diagnosis of MS is still very difficult.
  • T H 1 cells characterized by the production of IFN gamma
  • TH 17 there is increasing evidence that the latter has a presence in the pathogenesis of MS.
  • mice with a small number of TH 17 cells are less likely to obtain EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis), and TH 17 cells are identified in brain tissue lesions of MS patients.
  • Histone acetylation and deacetylation of chromatin are one of the key aspects regulating gene expression, and abnormal gene expression is the molecular biological basis for tumors and some genetic and metabolic diseases.
  • the degree of histone acetylation is coordinated by histone acetylase (HAT) and histone deacetylase (HDAC).
  • HAT histone acetylase
  • HDAC histone deacetylase
  • HDACs There are eighteen subtypes of HDACs, which can be divided into four categories, namely type 1 ( ⁇ (:1,2,3,8), type II (HDAC4,5,6,7,9), type III (SIR1 - 7) and type IV (HDAC11).
  • type 1 ⁇ (:1,2,3,8)
  • type II HDAC4,5,6,7,9
  • type III SIR1 - 7
  • type IV HDAC11
  • HDAC HDAC inhibitors
  • HDACi increase the level of chromatin histone acetylation, thus leading to specific gene activation and expression, which in turn leads to terminal differentiation or cancer Apoptosis of cells.
  • Clinical studies have shown that histone hyperacetylation levels can be obtained by inhibiting the activity of HDAC.
  • HDACi discovered by the following can be divided into the following categories: short-chain fatty acids; hydroxamic acids; electrophilic epoxyketones; o-phenylenediamines and macrocyclic peptides (Miller, TA et al. 2003 J. Med. Chem. 46:5097; Rosato, RR et al. 2004 Expert. Opin. Invest. Drugs 13 : 21 ; Monneret, C., 2005 Eur. J. Med. 40: 1 ; Yoo, CB et al. 2006 Nat. Rev. Drug Discovery 5:37). HDACi structure-activity relationship studies indicate that most HDACi can be divided into surface recognition domains, zinc ion chelation regions (ZBG), and two-part hydrophobic fatty chains (Marks, P. 2007 Oncogene 26: 1351).
  • ZBG zinc ion chelation regions
  • Histone acetylase is an important epigenetic regulatory protein that regulates chromatin remodeling, gene expression, and functions of a variety of proteins including transcription factors, histones, and cytoskeletal proteins.
  • HDACi is a class of small molecule compounds that block HDAC activity, which can lead to cell cycle arrest, cell differentiation and apoptosis, and are currently used in cancer therapy. Recent experimental results indicate that HDACi may also have anti-inflammatory and immunomodulatory effects.
  • Camelo et al. found that HDACi TSA can effectively inhibit T cell invasion of the central nervous system of mice in the experimental animal autoimmune encephalomyelitis (EAE), thereby reducing its clinical symptoms. Chung et al.
  • HDACi phenylbutyrate and TSA inhibit TNF-alpha expression in animal arthritis models, reduce monocyte infiltration, and thereby alleviate disease symptoms.
  • Bosisio et al study demonstrated HDACi antigen presenting dendritic cells can be beneficial to inhibit the secretion of T H 1 T H 17 and induced cytokine, including IL-12, IL-23 and the like.
  • Tao et al study showed that HDACi can enhance the differentiation of Treg cell suppressive, and enhance its function of inhibiting T H 1 and T H 17 cells.
  • Largazole is a highly functionalized sixteen-membered cyclic peptide isolated from the marine phytobacteria mp/oa of Florida. Taori, K., et al. 2008 J. Am. Chem. Soc. 130: 1806-1807; Ying, Y. et al. 2008 J. Am. Chem. Soc. 130:8455-8459), the structure of which is shown below.
  • the natural product has a novel skeleton structure, and its structure includes: a coupling moiety of a 4-methyl substituted dihydrothiazole ring with a thiazole ring, -proline and (3S,4E)-3-hydroxy-7-mercapto-4- Heptenoic acid.
  • the object of the present invention is to design and synthesize a novel class of thiazole compounds which can be used as histone deacetylase inhibitors, thereby opening up new avenues for anti-tumor and drug discovery for treating multiple sclerosis.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the above thiazole compound.
  • a further object of the invention is to provide the use of the above thiazole compounds.
  • Ri is Ri Rib or Ri
  • R4 b and R 5b are each independently selected from A; or b and R 5b together form a 3-10 membered ring, or C attached thereto comprising 1-3 heteroatoms selected from N, 3-10 heteroatoms 0 and S Metacyclic ring
  • the A is one of the following groups: H, halogen, hydroxy, nitro, C 3 -C 6 cycloalkyl, dC 6 alkoxy, C 6 -d.
  • C 6 -C 1() aryl substituted dC 6 alkyl, C 2 -C 6 alkenyl, hydroxy substituted C 2 -C 6 alkenyl, dC 4 alkoxy substituted C 2 -C 6 chain Alkenyl, fluoro C 2 -C 6 alkenyl, C 6 -d.
  • the 5-7 membered heteroaryl contains 1-3 heteroatoms selected from N, 0 and S;
  • H a halogen atom, a hydroxyl group, a CrC 6 alkoxy group, C 6 -d.
  • the heteroaryl group contains 1-3 heteroatoms selected from N, 0 and S.
  • R 2 is one of the following groups: H, dC 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, optionally substituted by hydroxy, benzyloxy or C 6 -C 1() aryl dC 6 alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 6 -C 1 () aryl, optionally substituted with a halogen atom or a nitro group C 6 -C 1 () aryl;
  • n 0, 1 or 2; preferably 0; X is -N(R 7 )- or wherein R 7 is selected from H or dC 6 alkyl; X is preferably -NH-;
  • Y is absent or is -(d-doalkyl)-, -(C 2 -C 9 alkenyl) -, -(C 6 -C 1() aryl) -, -(C r C 6 alkyl MC 6 -C 10 aryl) -, -(C 6 -Cio aryl)-(C 2 -C 6 alkenyl) -, -(C 3 -C 6 cycloalkyl) -, -(Ci-C 5- alkyl) -CC -NH ⁇ d-Cs alkyl) -, -(Ci-C 5 alkyl) -CC -C d-Cs alkyl) - or -(d-Cs alkyl) -C(0 -0-(C 2 -C 9 alkenyl)-; preferably -(Ci-Cioalkyl)-, -(C 6 -Cioaryl) -,
  • R 8 is H or dC 6 alkylcarbonyl; preferably H ;
  • R 9 is! ! Or - .
  • Alkylcarbonyl
  • Rl is Rla
  • n 0;
  • R 2 , X, Y and R 3 are defined as a:
  • R4a » a is as defined above; preferably, F n R 5a are each independently H, dC 6 alkyl or Boc protected amino Ci-Ce fluorenyl 0
  • Ri is Rib
  • n 0 ;
  • R 2 , X, Y and R 3 are as described above, and the structure II b is as follows :
  • R4 b and R 5b are as defined above; preferably R 4 b and R 5b are each independently H, d-Cs alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl or The C 6 -C 1Q aryl group, or R 4 b and R 5b together with the C attached thereto form a 3-10 membered ring.
  • Ri is Ric
  • n 0 ;
  • R 2 , X, Y and R 3 are defined as C:
  • R4 C, R 5c, and are as defined above; R 5c and preferably R4c and are each independently H or C r C 6 alkyl group.
  • R 2 , 3 ⁇ 4 , R 5b and Y are as defined above.
  • H dC 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, hydroxy substituted dC 6 alkyl, dC 6 alkyl substituted C 3 -C 6 cycloalkyl, C 2 -C 8 alkenyl, Hydroxyl-substituted C 2 -C 8 alkenyl, C 6 -C 1() aryl, C 6 -d.
  • b and R 5b are each independently preferably H, F, C r C 6 alkyl, hydroxy substituted C r C 6 alkyl, fluoro C r C 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, C 2 a -C 6 alkenyl group, a hydroxy-substituted C 2 -C 6 alkenyl group, a fluoro C 2 -C 6 alkenyl group or a C 6 -C 1() aryl group, or a C to which b and R 5b are attached or form a 3-10 membered ring containing 1-3 heteroatoms selected from N, 0, and 3-10 membered heterocyclic ring together with the S atoms; R4 b and R 5b are each independently more preferably H, F, C r C 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, hydroxy substituted C r C 6 alkyl, fluoro C r C 6 alkyl or C 6 -
  • the present invention is specifically:
  • the present invention provides a process for the preparation of a thiazole compound having the structure of the formula I.
  • This preparation method can be carried out by any one of the following Route 1 to Route 5.
  • R 2 , n, X and Y have the same definitions as above;
  • compound 1 and activated zinc powder form compound 2 in THF, and compound 2 and 2-bromothiazole compound 3 are subjected to Negishi coupling reaction in toluene under the catalysis of palladium acetate and triphenylphosphine to obtain compound 4, compound 4 hydrolysis in sodium hydroxide / methanol-water system to obtain the corresponding acid 5, compound 5 and different nucleophile HX-Y-COOMe in the condensation agent 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl Condensation reaction in DMF under the action of carbodiimide hydrochloride (; 00001;), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt;), diisopropylethylamine G-Pr 2 NEt Obtaining compound 6, compound 6 and methanol solution of fresh hydroxylamine to obtain the thiazole compound I a of the present invention ;
  • R 2 , R 8 , n, X and Y have the same definitions as above;
  • compound 6 is hydrolyzed in a methanol or THF/water system via a base such as NaOH or LiOH to give compound I e , compound I e and mono Boc protected o-phenylenediamine in condensing agents EDCI, HOBt, -Pr 2
  • the condensation reaction occurs in DMF under the action of NEt to obtain compound 7, and the compound 7 is deprotected by the Boc protecting group under the action of ethyl acetate solution to obtain the thiazole compound I b of the present invention, or the compound 7 and the different nucleophilic reagent R 8 H reacts to obtain the thiazole compound I b of the present invention ;
  • Route 3 :
  • R 2 , n, X and Y have the same definitions as above;
  • compound 5 is condensed with a different nucleophile HX-Y-NHCOCH 2 STrt in a condensing agent EDCI, 4-dimethylaminopyridine (DMAPM oxime in dichloromethane to give compound 8, compound) 8 in the trifluoroacetic acid conditions to remove the protecting group to obtain the thiazole compound I c of the present invention ;
  • EDCI condensing agent 4-dimethylaminopyridine
  • DMAPM oxime 4-dimethylaminopyridine
  • R 2 , R 9 , n, X and Y have the same meanings as above.
  • R 2 , R 3 , R 4 C , R 5c , , n, X and Y have the same meanings as defined above.
  • compound 9 is compounded by Lawesson's reagent to form compound 10, and compound 10 is reacted with different R 2 -substituted ethyl bromopyruvate to form a thiazole ring by a Hantzsch reaction to obtain compound 11, which is basic in methanol/water system.
  • Hydrolysis is carried out to obtain compound 12, and compound 12 and a different nucleophile HX-YR 3 are condensed in DMF under the action of a condensing agent EDCI, HOBt, -Pr 2 NEt to obtain a thiazole compound II c of the present invention.
  • the thiazole compound of the formula I of the present invention can be used for the preparation of a drug for a histone deacetylase inhibitor, thereby being applicable to the preparation of a medicament for antitumor and treatment of multiple sclerosis, including a colon cancer Cell HCT-116, pancreatic cancer cell Bx-PC3, leukemia cell HL60, human lung adenocarcinoma cell line A549, breast cancer cell MDA-MB-23 K Mammary epithelial cells HMEC. It can thus be used to treat colon cancer, pancreatic cancer, leukemia, lung cancer or breast cancer.
  • Figure 1 shows the clinical score of HDACi CFH367-C for effective relief of EAE.
  • MR was measured using a Mercury-Vx 300M instrument manufactured by Varian, MR calibration: 5 H 7.26 pm (CDCl 3 ), 2.50 ppm (DMSO-i3 ⁇ 4, 3.15 ppm (CD 3 OD) ; Provided by Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.; TLC thin layer chromatography silica gel plate is produced by Shandong Yantai Huiyou Silicone Development Co., Ltd., model HSGF 254; normal phase column chromatography silica gel used for compound purification is produced by Shandong Qingdao Marine Chemical Plant Branch, model ZCX - 11, 200-300 mesh.
  • the activated Zn powder (298 mg, 4.58 mmol) was dissolved in dry distilled THF (20 mL), N 2 was applied , and compound 13 (875 mg, 5.34 mmol) was added dropwise to control the drop rate to prevent bumping. After the addition, the mixture was refluxed for 1.5 h, and the mixture was cooled to give the compound 14.
  • the inhibitory activity test of the human histone deacetylase 1, 3, 6 of the compound of the present invention was carried out.
  • Human HDAC1, HDAC3 and HDAC6 were obtained using a baculovirus expression system.
  • HDAC1,3 Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC (HDAC1,3) and Boc-lys(Ac)-AMC (HDAC6) as substrates, using fluorescence detection in 96-well or 384-well flat-bottom microplates The enzyme activity was measured. After the substrate was deacetylated by HDAC, the product AMC obtained by trypsin hydrolysis was detected by a fluorescent detector at 355 nm excitation at 460 nm. The initial velocity of the reaction is calculated by detecting the change in the fluorescence signal over time.
  • Sample Handling Samples were dissolved in DMSO, stored at low temperature, and the concentration of DMSO in the final system was controlled to the extent that it did not affect the activity of the assay.
  • the activity of the sample was tested by initial screening at a single concentration, for example 20 ⁇ 1.
  • the activity dose dependence is tested, i.e., IC 5 . /EC 5 .
  • the value is obtained by nonlinearly fitting the sample concentration.
  • the software used for the calculation is Graphpad Prism 4, and the model used for fitting is sigmoidal dose-response (varible slope). For most inhibitor screening models, the model will be fitted. The bottom and top of the curve are set to 0 and 100. In general, each sample is set to ⁇ n ⁇ 2) during the test, and is represented by Standard Deviation (SD) or Standard Error (SE) in the results. Each test has the reported compound SAHA Vorinostat) as a reference.
  • SD Standard Deviation
  • SE Standard Error
  • Test compound has no inhibitory activity at 20 ⁇ ; b: not tested
  • the isobutenyl substituted compound CFH395 has the best inhibitory activity against HDAC1.
  • the compound CFH355 has a selectivity to HDAC1 and HDAC3 of 8 times.
  • HDAC1 has the best inhibitory activity when the chain length is 7 methylene groups, and HDAC1 has the best inhibitory activity when the chain length is 6 methylene groups for cyclopropyl substitution.
  • the immobilized group is isobutyl substituted, and the inventors examined the side chain fragment Y and the different Zn ion chelating groups (ZBG;).
  • ZBG Zn ion chelating groups
  • the antitumor activity test of the compound of the present invention was carried out, and the in vitro antitumor activity of the compound was evaluated by measuring the growth inhibitory activity of the compound against human colon cancer HCT-116 cell line.
  • the analytical method is to metabolically reduce 3-(4,5-dimethyl-2-thiazole;)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ( Based on MTT).
  • MTT tetramethylazozolium salt
  • Formazan in DMSO
  • the optical density can be measured at a wavelength of 550/690 nm using a microplate reader.
  • Sample Handling Samples were dissolved in DMSO, stored at low temperature, and the concentration of DMSO in the final system was controlled to the extent that it did not affect the activity of the assay.
  • the cell viability was measured by MTT assay, and the cells growing in the logarithmic growth phase were digested with 0.05% trypsin, counted, and seeded at a cell density of 2.0 ⁇ 10 3 /well in a 100-well plate at 100 mL, placed at 5% C0. 2 Incubate overnight at 37 ° C in an incubator. Six concentration gradients were set for each compound, three wells were set for each concentration, and each concentration was added to the corresponding wells, cultured in a 5% C0 2 37 °C incubator for 72 hours, and 20 mL of 5 mg/mL MTT was added. .
  • the supernatant was aspirated, dissolved in 100 mL of DMSO, and the absorbance at 550 nm (L1) was measured using a SpectraMAX 340.
  • the reference wavelength was 690 nm (L2), and the (L1-L2) value was suppressed.
  • the agent was plotted at different concentrations and fitted to the IC 50 by the formula.
  • the activity of the sample was tested by initial screening at a single concentration, for example 20 ⁇ 1.
  • the activity dose dependence is tested, i.e., IC 5 . /EC 5 .
  • Value obtained by nonlinearly fitting the sample concentration by sample activity, and the software used for calculation is Graphpad
  • Prism 4 the model used for fitting is sigmoidal dose-response (varible slope), and for most inhibitor screening models, the bottom and top of the fitted curve are set to 0 and 100. In general, each sample is set to ⁇ n ⁇ 2) during the test, and is expressed as Standard Deviation (SD) or Standard Error (SE) in the results. Doxorubicin (doxorubicin;) was used as a reference for each test.
  • Example 3 HDAC inhibitors as a drug for the treatment of multiple sclerosis (MS)
  • HDACi CFH367-C can effectively alleviate the clinical score of EAE.
  • the present invention is of 8 week-old female C57 mice were injected subcutaneously ⁇ ⁇ Freund's complete adjuvant emulsified MOG 35 - 55 (150 ⁇ ⁇ only;) and heat-inactivated toxin ⁇ (5m ⁇ mL), and on the same day On the third day, PTX was injected intraperitoneally twice (200 ng/d/d, PBS dissolved;). The third day after immunization, it was administered by intragastric administration twice a day at a dose of 10 mg/kg body weight.
  • mice The performance of the mice was observed daily and scored according to the following criteria: 0 points: no signs of onset; tail weakness (0.5 points) or sputum (1 point); limb weakness (0.5 points) or sputum (1 point). The above scores are added to the final score. The results showed that (Fig. 1), CFH367-C had a good therapeutic effect on the clinical symptoms of EAE, and the disease severity of the mice in the treatment group was significantly lower than that in the solvent control group (P ⁇ 0.01).
  • HDACi CFH367-C significantly attenuated the demyelination of the spinal cord of EAE animals.
  • Spinal cord samples from normal control, EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis;) and EAE-treated mice were fixed, routinely embedded in paraffin, 5 micron sections, dewaxed to 95% alcohol, Lauro staining at 56 degrees overnight; washed with 95% alcohol, washed with water, then separated with 0.05% lithium carbonate solution; washed twice with 70% alcohol, washed with distilled water, then stained with eosin for 2 minutes; dehydrated with gradient ethanol The xylene is transparent and is sealed with a neutral gum.
  • the main coloring site of firm blue is white matter of the spinal cord, which is mainly composed of nerve fibers and myelin sheath.
  • the experimental results showed that the white matter of normal mice can be stained blue and the structure is dense; while the EAE mice have a large number of vacuoles in the white matter area of the spinal cord, and the degree of coloration is significantly reduced, showing severe demyelination.
  • the white blood protein of the mice administered by CFH367-C was dense and stained, which was close to the level of normal control mice, indicating obvious therapeutic effects.
  • HDACi CFH367-C significantly attenuated the infiltration of peripheral immune cells in the spinal cord of EAE animals.
  • Spinal cord samples from normal control, EAE and EAE treatment groups were fixed, embedded in paraffin, 5 micron sections, sliced with xylene dewaxed, and reconstituted with ethanol at various stages, stained with hematoxylin for 5 minutes; After washing with tap water, hydrochloric acid color separation, tap water washing, and dyeing with eosin for 2 minutes; after dehydration with gradient ethanol, transparent with xylene, and sealed with neutral gum. The results showed that there were almost no infiltrating peripheral immune cells in the spinal cord of normal mice.
  • mice had a tight white matter structure and no obvious peripheral immune cell infiltration, indicating obvious therapeutic effects.
  • HDACi CFH367-C significantly attenuated the infiltration of CD45-positive leukocytes in the spinal cord of EAE animals.
  • the spinal cord of the mouse was taken, and after fixation, OCT was embedded, and ⁇ frozen sections were prepared. The sections were washed three times with PBS for 5 min, then incubated with anti-CD45 antibody (primary antibody;) at 4 ° C overnight; after washing three times with PBS, stained with fluorescently labeled secondary antibody at 37 ° C for 1 h, washed three times with PBS. After that, the glycerin is sealed.
  • CD45 is a common antigen of leukocytes.
  • HDACi CFH367-C significantly attenuated the infiltration of CD4-positive T cells in the spinal cord of EAE animals.
  • Previous studies have shown that CD4-positive T cells play an important role in the pathogenesis of EAE, and the inventors have also observed the effect of drugs on CD4-positive T cell infiltration.
  • the spinal cord of the mouse was taken, and after fixation, OCT was embedded, and ⁇ frozen sections were prepared. The sections were washed three times with PBS for 5 min, then incubated with anti-CD4 antibody (primary antibody;) at 4 ° C overnight; after washing three times with PBS, stained with fluorescently labeled secondary antibody at 37 ° C for 1 h, washed three times with PBS After that, the glycerin is sealed.
  • the histone deacetylase inhibitor CFH367-C can effectively alleviate the clinical symptoms of EAE in experimental mouse models of MS. Staining experiments on the spinal cord of EAE mice revealed that CFH367-C can inhibit peripheral nerve cells, especially CD4 positive T cells, infiltrating the central nervous system of mice, and reduce the demyelination of EAE animal neurons, thus alleviating EAE. Clinical manifestations. The results of this study show that the histone deacetylase inhibitor CFH367-C can be used for the treatment of MS diseases, and may be applied to the treatment of other autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis, psoriasis, systemic lupus erythematosus, etc. .

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Description

一类噻唑类化合物及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一类噻唑类化合物及其制备方法和用途，更具体而言，本发明涉及新颖的 天然产物 largazole的衍生物， 其制备方法以及作为组蛋白去乙酰化酶 (HDAC)抑制剂在抗 肿瘤和治疗多发性硬化症方面的应用。
背景技术
肿瘤在全球范围内是仅次于心血管疾病的第二大 "杀手"， 近年来发病率一直呈上升 趋势，对于癌症的治疗一直以来都是困扰着人类的一个难题。传统上的化疗药物因为缺乏 靶标的选择性，往往产生较为严重的毒副作用，这就要求人们开发出高效低毒的特异性分 子靶标的抗肿瘤药物。以一些与肿瘤细胞分化增殖以及转移相关的细胞信号转导通路的关 键酶作为药物筛选靶点， 发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌 药物巳经成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。 组蛋白去乙酰化酶 (HDAC)正是这样 一种蛋白。
多发性硬化症 (Multiple Sclerosis, MS)是一类典型的自身免疫性疾病。 MS疾病的病 理表现为中枢神经系统的急性炎症并导致脱髓鞘现象，是导致年轻人无创性神经系统瘫痪 以及残疾的最重要的诱因之一。 MS临床表现多为非均质型， 超过 80%的病人表现为反复 的缓解复发表型。 由于疾病的发生机制不明， 以及目前尚缺乏灵敏的诊断标志， 对于 MS 的诊断仍然只能依据疾病在时间和空间上的多发性。加之许多其它疾病例如视神经脊髓炎 和 MS有着极为相似的病症， 因此， 目前对于 MS的治疗甚至是诊断仍然十分的困难。
目前的研究结果表明 CD4+ T细胞对于 MS的发病， 至少是早期疾病的启动有着重要 作用。 早先的研究认为 TH1细胞 (以产生 IFN γ为特征;)对于疾病的发生有着重要的作用， 随着 TH17的发现， 越来越多的证据表明后者在 MS的发病中有着不次于 TH1的作用， 例 如， TH17细胞数量少的小鼠不易得 EAE (实验性自身免疫性脑脊髓炎）， MS病人的脑组 织病灶中鉴定出了 TH17细胞等。
染色质的组蛋白乙酰化和去乙酰化是调节基因表达的关键环节之一，而异常的基因表 达是肿瘤及一些遗传和代谢疾病发生的分子生物学基础。组蛋白的乙酰化程度， 由组蛋白 乙酰化酶 (HAT)和组蛋白去乙酰化酶 (HDAC)协调控制。 当 HDAC过度表达并被转录因子 募集， 就会导致特定基因的不正常抑制， 从而导致肿瘤和其他疾病的发生。
HDACs 有十八种亚型， 可以分成四大类， 分别为 1型（^ (：1，2，3，8)， II型 (HDAC4，5，6，7，9)， III型 (SIR1 - 7)和 IV型 (HDAC11)。 (Johnstone, R. W. 2002 Nature Rev. Drug
Disc. 1 :287)。据报道， HDAC的活性与癌症的发生有关 (Archer, S. Y.等. 1998 Proc. Nat. Acad.
ί/&4， 95: 6791 -6796)。 当 HDAC过度表达时， 会抑制生物体内天然的肿瘤抑制因子例 如 p53的基因表达 (Gu， W.等. 1997 Cell, 90: 595-606)。 而 HDAC抑制剂 (HDACi)会使染色 质组蛋白乙酰化水平提高， 因此导致特定基因激活表达，相应地导致细胞的末端分化或癌 细胞的凋亡。 临床研究表明， 可以通过抑制 HDAC的活性来获得组蛋白高乙酰化水平。 目前巳经发现的 HDACi按结构可分为以下几类： 短链脂肪酸类； 异羟肟酸类； 亲电 环氧酮基类；邻苯二胺类以及大环肽类 (Miller, T. A.等. 2003 J. Med. Chem. 46:5097; Rosato, R. R.等. 2004 Expert. Opin. Invest. Drugs 13 :21 ; Monneret, C.， 2005 Eur. J. Med. 40: 1 ; Yoo, C. B.等. 2006 Nat. Rev. Drug Discovery 5 :37)。 HDACi构效关系研究表明大多数 HDACi可分 为表面识别结构域、 锌离子螯合区 （ZBG) 以及连接两部分的疏水脂肪链 (Marks, P. 2007 Oncogene 26: 1351)。
组蛋白乙酰化酶 (HDAC)是重要的表观遗传调控蛋白， 调控染色质重塑、 基因表达以 及包括转录因子、 组蛋白、 细胞骨架蛋白等多种蛋白质的功能。 HDACi 是一类能阻断 HDAC 活性的小分子化合物， 它们可以导致细胞周期阻滞、 细胞分化及细胞凋亡， 目前 巳被应用于肿瘤治疗。 近期的实验结果表明， HDACi可能也具有抗炎及免疫调节作用。 Camelo 等人发现， HDACi TSA可以在 MS 的小鼠动物模型 (Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)上有效抑制 T细胞对小鼠中枢神经系统的侵袭， 从而减轻其临床 症状。 Chung等人发现， HDACi苯基丁酸和 TSA可以在动物关节炎模型中抑制 TNF-alpha 的表达， 减轻单核细胞的浸润， 从而减轻疾病症状。 Bosisio等人的研究证明 HDACi可以 抑制抗原递呈的树突状细胞分泌有利于 TH1和 TH17诱导的细胞因子， 包括 IL-12, IL-23 等。 Tao等人的研究表明 HDACi可以加强抑制性 Treg细胞的分化， 并增强其对 TH1和 TH17细胞的抑制功能。上述研究表明 HDAC的抑制与自身免疫疾病的发生发展密切相关。 寻找毒性更低， 选择性更好的 HDACi将有助于自身免疫性疾病的治疗， 包括 MS疾病的 治疗。
Largazole是从佛罗里达的海洋藻青菌 mp/oa 中分离得到的高度官能团化的十六 元环肽内酉^ Taori，K.，等.2008 J. Am. Chem. Soc. 130: 1806-1807; Ying, Y.等. 2008 J. Am. Chem. Soc. 130:8455-8459), 其结构如下所示。 该天然产物骨架结构新颖， 其结构包括： 4-甲基取代的二氢噻唑环与噻唑环的偶联部分， -缬氨酸和 (3S，4E)-3-羟基 -7-巯基 -4-庚烯 酸。 药理实验表明， largazole能够选择性抑制乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)以及纤维母细胞 骨肉瘤细胞 (U20S;)的生长， 而对于正常乳腺上皮细胞 (NmuMG)以及正常成纤维细胞 (NIH3T3)影响较小。 随后的研究表明 largazole能够选择性抑制 I型 HDAC。在此基础上， 发明人对其结构作了优化和改造以及评价， 从而得到一系列具有进一步开发潜力的化合 物。
Figure imgf000004_0001
发明内容
本发明的目的在于设计与合成一类新型的噻唑类化合物，其可以作为组蛋白去乙酰化 酶抑制剂， 从而为抗肿瘤和治疗多发性硬化症药物发现开辟新途径。 本发明的另一目的也在于提供上述噻唑类化合物的制备方法
本发明的又一目的是提供上述噻唑类化合物的用途。
本发明所述的噻唑类化合
Figure imgf000005_0001
其中：
Ri为 Ri Rib或 Ri,
Figure imgf000005_0002
和 a各自独立地选自 A或 Boc保护的氨基 CrC6烷基；
R4b和 R5b各自独立地选自 A中； 或者 b和 R5b与其连接的 C一起形成 3-10元环或 含有 1-3个选自 N、 0和 S中的杂原子的 3-10元杂环；
R4C、 R5c和 各自独立地选自 A中；
所述 A为如下基团中的一种： H、 卤素、 羟基、 硝基、 C3-C6环烷基、 d-C6烷氧基、 C6-d。芳基取代的 CrC6烷氧基、 氨基、 CrC6烷氨基、 C6-d。芳基取代的 CrC6烷氨基、 CrC6烷基、 羟基取代的 CrC6烷基、 CrC4烷氧基取代的 CrC6烷基、 氟代 CrC6烷基、
C6-C1()芳基取代的 d-C6烷基、 C2-C6链烯基、 羟基取代的 C2-C6链烯基、 d-C4烷氧基取 代的 C2-C6链烯基、 氟代 C2-C6链烯基、 C6-d。芳基取代的 C2-C6链烯基、 C2-C6链炔基、 羟基取代的 C2-C6链炔基、 CrC4烷氧基取代的 C2-C6链炔基、 氟代 C2-C6链炔基、 C6-C1() 芳基取代的 C2-C6链炔基、 C6-C1()芳基、 5-7元杂芳基； 所述 5-7元杂芳基含有 1-3个选自 N、 0和 S中的杂原子；
为如下基团中的一种： H， 卤原子， 羟基， CrC6烷氧基， C6-d。芳基取代的 CrC8 烷氧基， 氨基， d-C6烷氨基， C6-d。芳基取代的 d-C6烷氨基， d-C6烷基， C3-C6环烷 基， CrC6烷基取代的 C3-C6环烷基，任选被羟基、 CrC4烷氧基、 ¾原子、苄氧基或 C6-C1() 芳基取代的 CrC6烷基， C2-C8链烯基， 任选被羟基、 d-C4烷氧基、 卤原子或 C6-d。芳基 取代的 C2-C6链烯基， C2-C6链炔基， 任选被羟基、 d-C4烷氧基、 ¾原子或 C6-C1()芳基取 代的 C2-C8链炔基， C6-C1()芳基， 任选被卤原子或硝基取代的 C6-C1()芳基， 5-7元杂芳基； 所述 5-7元杂芳基含有 1-3个选自 N、 0和 S中的杂原子。优选地， R2为如下基团中的一 种： H， d-C6烷基， C3-C6环烷基， 任选被羟基、 苄氧基或 C6-C1()芳基取代的 d-C6烷基， C2-C8链烯基， C6-C1()芳基， 任选被卤原子或硝基取代的 C6-C1()芳基；
n为 0、 1或 2 ; 优选为 0; X为 -N(R7)-或 ， 其中 R7选自 H或 d-C6烷基； X优选为 -NH-;
Y不存在或者为 -(d-do烷基) -、 -(C2-C9链烯基) -、 -(C6-C1()芳基) -、 -(CrC6烷基 MC6-C10 芳基) -、 -(C6-Cio芳基 )-(C2-C6链烯基) -、 -(C3-C6环烷基) -、 -(Ci-C5烷基) -C C -NH^d-Cs 烷基) -、 -(Ci-C5烷基) -C C -C d-Cs烷基) -或 -(d-Cs烷基) -C(0)-0-(C2-C9链烯基) -; 优选 -(Ci-Cio烷基) -、 -(C6-Cio芳基) -、 -(Ci-C6烷基 MC6-C1()芳基) -或 -(C6-C1()芳基) -(C2-C6链烯 基) -;
Figure imgf000006_0001
其中， R8为 H或 d-C6烷基羰基； 优选为 H;
R9为！！或 - 。烷基羰基。
在本发明的进一步实施方式中， 通式 I中：
Rl为 Rla;
n=0;
R2、 X、 Y和 R3的定义如 a:
Figure imgf000006_0002
II a
其中：
R4a » a的定义同上； 优选 F n R5a各自独立地为 H、 d-C6烷基或 Boc保护的氨 基 Ci-Ce焼基 0
在本发明的进一步实施方式中， 通式 I中：
Ri为 Rib;
n=0;
R2、 X、 Y和 R3的定义如前所述， 具体如下所示的结构 II b:
Figure imgf000006_0003
li b
其中：
R4b和 R5b的定义同上； 优选 R4b和 R5b各自独立地为 H、 d-Cs烷基、 C3-C6环烷基或 C6-C1Q芳基， 或 R4b和 R5b与其连接的 C一起形成 3-10元环。
在本发明的进一步实施方式中， 通式 I中：
Ri为 Ric;
n=0;
R2、 X、 Y和 R3的定义如 C :
Figure imgf000007_0001
其中：
R4C、 R5c和 的定义同上； 优选 R4c和 R5c和 各自独立地为 H或 CrC6烷基。 在本发明的更优选实施方案中， 所述的 X为 -NH-, 且 n=0， R2、 R3、 ¾、 R5b禾口 Y 的定义如前所述， 具有如下
Figure imgf000007_0002
III
在本发明的特别优选实施方案中， 所述的 X为 -ΝΗ-, 且 η=0， 同时 R3具体为 具有如下所示的结构 IV：
Figure imgf000007_0003
其中， R2、 ¾、 R5b和 Y的定义如前所述。
优选为 H、 d-C6烷基、 C3-C6环烷基、 羟基取代的 d-C6烷基、 d-C6烷基取代的 C3-C6环烷基、 C2-C8链烯基、 羟基取代的 C2-C8链烯基、 C6-C1()芳基、 C6-d。芳基或苄氧 基取代的 CrC6烷基、 C6-d。芳基取代的 C2-C8链烯基、 C6-d。芳基取代的 C2-C8烷氧基、 卤素取代的 C6-C1()芳基或者硝基取代的 C6-C1()芳基；
b和 R5b各自独立地优选为 H、 F、 CrC6烷基、 羟基取代的 CrC6烷基、 氟代 CrC6 烷基、 C3-C6环烷基、 C2-C6链烯基、羟基取代的 C2-C6链烯基、氟代 C2-C6链烯基或 C6-C1() 芳基， 或是 b和 R5b与其连接的 C一起形成 3-10元环或含有 1-3个选自 N、 0和 S中的 杂原子的 3-10元杂环； R4b和 R5b各自独立地更优选为 H、 F， CrC6烷基、 C3-C6环烷基、 羟基取代的 CrC6烷基、氟代 CrC6烷基或 C6-C1()芳基； R4b和 R5b各自独立地最优选为 H 或 -06烷基 （包括 d-C6直链或支链烷基）、 C3-C6环烷基或 C6-C1()芳基， 或 R4b和 R5b 与其连接的 C一起形成 3-10元环。 Y优选为 -(CrC8烷基) -、 -(C6-Cio芳基) -、 基 MC2-C6链烯基) -。
本发 合物具体为:
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
本发明提供了具有通式 I结构的噻唑类化合物的制备方法。该制备方法可以通过下述 路线一〜路线五中的任何一种来实现。
m—.
Figure imgf000012_0001
其中， 、 R2、 n、 X和 Y的定义同上；
具体来说， 化合物 1与活化锌粉在 THF中形成化合物 2， 化合物 2与 2-溴代噻唑化 合物 3在醋酸钯与三苯基膦催化下于甲苯中经 Negishi偶联反应得到化合物 4， 化合物 4 在氢氧化钠 /甲醇-水体系中水解后得相应的酸 5， 化合物 5 与不同的亲核试剂 HX-Y-COOMe在缩合剂 1-乙基 -3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(；£001；)、 1-羟基苯并三氮 唑 (HOBt；)、 二异丙基乙胺 G-Pr2NEt;>的作用下于 DMF中发生缩合反应得到化合物 6， 化合 物 6与新制羟氨的甲醇溶液反应制得本发明所述噻唑类化合物 I a;
路线二
Figure imgf000012_0002
其中， 、 R2、 R8、 n、 X和 Y的定义同上；
具体来说， 化合物 6在甲醇或 THF/水体系中经过碱 (例如 NaOH或 LiOH)水解得到化 合物 I e， 化合物 I e与单 Boc保护的邻苯二胺在缩合剂 EDCI、 HOBt、 -Pr2NEt的作用下 于 DMF中发生缩合反应得到化合物 7， 化合物 7在盐酸乙酸乙酯溶液作用下脱去 Boc保 护基得到本发明所述噻唑类化合物 I b, 或者化合物 7与不同的亲核试剂 R8H发生反应得 本发明所述噻唑类化合物 I b; 路线三:
Et3SiH， TFA CH Cl
Figure imgf000013_0001
其中， 、 R2、 n、 X和 Y的定义同上；
具体来说， 化合物 5与不同的亲核试剂 HX-Y-NHCOCH2STrt在缩合剂 EDCI, 4-二甲 氨基吡啶 (DMAPM乍碱的条件下于二氯甲烷中发生缩合反应得到化合物 8， 化合物 8在三 氟乙酸条件下脱除保护基制得本发明所述噻唑类化合物 I c;
路线四:
Figure imgf000013_0002
I d
其中， 、 R2、 R9、 n、 X和 Y的定义同上。
具体来说， 化合物 5与不同的亲核试剂 HX-Y-SR9在缩合剂 EDCI、 HOBt、 z-Pr2NEt 的作用下于 DMF中发生缩合反应得到本发明所述噻唑类化合物 I d;
Figure imgf000013_0003
其中， R2、 R3、 R4C、 R5c、 、 n、 X和 Y的定义同上。
具体来说， 化合物 9在 Lawesson's试剂作用下生成化合物 10， 化合物 10与不同 R2 取代的溴代丙酮酸乙酯经过 Hantzsch反应构建噻唑环得到化合物 11， 化合物 11在甲醇 / 水体系中碱性条件下水解得到化合物 12，化合物 12与不同的亲核试剂 HX-Y-R3在缩合剂 EDCI、HOBt、 -Pr2NEt的作用下于 DMF中发生缩合反应制得本发明所述噻唑类化合物 II c。
本发明通式 I结构的噻唑类化合物可以用于制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物，从 而可以在制备抗肿瘤和治疗多发性硬化症的药物中应用，所述肿瘤细胞株包括结肠癌细胞 HCT-116、 胰腺癌细胞 Bx-PC3、 白血病细胞 HL60、 人肺腺癌细胞 A549、 乳腺癌细胞 MDA-MB-23 K 乳腺上皮细胞 HMEC。 从而可以用于治疗结肠癌、 胰腺癌、 白血病、 肺 癌或乳腺癌。
附图说明
图 1为 HDACi CFH367-C有效缓解 EAE的临床评分。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述， 但本发明不局限于这些实施例。
化合物制备实施例
下述制备实施例中， MR用 Varian生产的 Mercury- Vx 300M仪器测定， MR定标： 5 H 7.26 pm(CDCl3), 2.50 ppm(DMSO-i¾， 3.15 ppm(CD3OD); 试剂主要由上海化学试剂 公司提供； TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产，型号 HSGF 254; 化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产，型号 ZCX-11， 200-300 目。
Figure imgf000014_0001
将活化的 Zn粉 (298mg， 4.58mmol)溶于重蒸的无水 THF(20mL)中， N2置换， 滴加化 合物 13(875mg，5.34mmol )， 控制滴加速度， 防止暴沸。 加毕， 回流 1.5h， 静置冷却得化 合物 14。
化合物 15(lg，3.82mmol)溶于无水甲苯 (20mL)中， N2置换，将上述 Zn试剂 14转入反 应液中。加入催化剂醋酸钯 (43mg， 0.19mmol),三苯基膦 (100mg， 0.38mmol),加热至 80-90°C 反应直至原料 15消失。过滤除去不溶物，浓缩有机相， CH2Cl2(50mL;>稀释，加 IN HC1 (30mL) 搅拌 10min， 分出有机相， 水相 CH2Cl2(30mLx2 次；)萃取， 合并有机相， 浓缩过柱 (PE/EtOAc=4:l)得化合物 16(750g， 73.5%,黄色油状物）。 ^ MR (300 MHz, CDC13) δ 7.85 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.45 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 3.96 (s, 3H), 3.10-3.14 (m， 1H)， 1.31-1.38 (m， 2H), 0.84-0.89 (m, 2H)。
将化合物 16(700mg， 2.63mmol)溶于 MeOH/H20 (30/6mL)中， 加入 NaOH(210mg， 5.26mmol)固体， 加热回流 lh。 反应完成后， 旋干 MeOH, 加 H20稀释， 水相用 1N盐酸 酸化至 pH=2， EtOAc(20mLx3次;)萃取， 饱和食盐水 (30mL)洗涤， 有机相无水 Na2S04干 燥， 浓缩得固体 17(660mg， 99.5%， 淡黄色固体；)， 直接用于下一步反应。
化合物 17(100mg， 0.40mmol)溶于干燥的 DMF (5mL)中， 冰浴冷却至 0°C， 加入 EDCI(76mg, 0.40mmol)， HOBt(54mg, 0.40mmol)， 保持 0°C下搅拌 10min， 加入化合物 18(73mg，0.44mmol)以及 -Pr2NEt(120mg， 1.20mmol),保持室温下搅拌 12h后，加入 20mL 水稀释， EtOAc萃取 (15mLx3次；)， 合并有机相， 有机相分别用 1N盐酸 (15mL;>， 饱和碳 酸氢钠溶液 (15mL;>， 饱和食盐水 (20mL)洗涤， 无水 Na2S04干燥， 减压旋除溶剂后硅胶柱 层析纯化 (PE/EtOAc=2:l)， 得产品 19(104mg， 71.7%， 淡黄色油状物）。 ^ MR (300 MHz, CDC13) 57.74 (d， J=3.0 Hz 1H)， 7.42 (t， J=5.4 Hz, 1H)， 7.36 (d， J=3.0 Hz 1H)， 3.58 (s, 3H), 3.37 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.30 (t， J=6.6 Hz, 2H), 1.58-1.69 (m， 4H)， 1.19-1.25 (m， 2H), 0.68-0.74 (m, 2H)。
羟氨盐酸盐（197mg， 2.8mmol)悬浮于 MeOH (15mL) 中，加入 KOH(235mg， 4.20mmol), 搅拌 5min后， 过滤除去不溶物， 收集滤液备用。 将化合物 19(104mg， 0.28mmol)溶于无 水 MeOH lOmL) 中， 加入上述新制备羟氨的 MeOH溶液， 室温搅拌 lh。 TLC检测反应 完全， EtOAc稀释， 1N盐酸中和至 pH=5-6， 减压浓缩旋干 MeOH, EtOAc萃取 (15mLx3 次；)， 饱和食盐水洗涤（10mL)， 无水 Na2S04干燥， 浓缩得粗品， 柱层析纯化 (CHCl3/MeOH=20:l-10: l)得产品 CFH367-C(71mg， 68.3%, 淡黄色固体)。 !H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.36 (t， J=5.4 Hz, 1H)， 7.88 (d， J=3.0 Hz 1H)， 7.74 (d， J=3.0 Hz 1H)， 3.41 (q, J=6.6 Hz, 2H), 3.31-3.36 (m， 1H)， 2.16 (t， J=6.6 Hz, 2H), 1.64-1.69 (m， 4H)， 1.29-1.34 (m， 2H)， 0.82-0.86 (m, 2H)。
用同样方法合成以下化合物：
1.51
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
薦 IOZXD/工：) d Z OAV
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
LY Z OAV
Figure imgf000020_0001
Z OAV
Figure imgf000021_0001
薦 IOZXD/工：) d 61· Z OAV (DMSO-de) δ 10.37 (s, 1H)， 9.27 (s, 1H)， 8.69 (s,
1H)， 8.47 (t， J=5.7 Hz, 1H), 8.36 (s, 1H)， 8.27 (s, 1H)，
CFH326-4
3.29 (q, J=5.4 Hz, 2H), 1.98 (t， J=6.9 Hz, 2H), 1.52 (m, 4H)
(DMSO-de) δ 10.36 (s, 1H)， 8.68 (s, 1H)， 8.43 (t， J=6.0 Hz, 1H)， 8.24 (s, 1H)， 8.14 (s, 1H)， 3.30 (q,
CFH340-4
工工 J=6.9 Hz, 2H), 2.74 (s, 3H), 1.98 (t， J=6.9 Hz, 2H),
1.52 (m, 4H)
δ 8.16 (s, 2H), 4.56 (d， J=5.1 Hz, 2H), 3.43 (q, J=5.7
CFH456 工 Hz, 2H), 2.16 (t， J=7.2 Hz, 2H), 1.49-1.69 (m, 4H)，
〇
1.48 (s, 9H)
(DMSO-de) δ 10.28 (s, 1H)， 8.70 (s, 1H)， 8.45 (s, 1H)， 8.25 (s, 1H),8.20 (s, 1H), 7.89 (t， J=5.7 Hz, 1H)，
CFH470
4.45 (d， J=5.1 Hz, 2H ), 3.27 (q, J=5.7 Hz, 2H), 2.21 (t， J=7.2 Hz, 2H), 1.49 (m， 6H)， 1.42 (s, 9H) δ 8.16 (s, 1H)， 7.76 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 7.21 (d， J=3.3
CFH484 Hz, 1H)， 4.56 (s, 2H), 3.43 (q, J=5.7 Hz, 2H), 2.16 (t，
J=7.2 Hz, 2H), 1.23-1.59 (m， 8H)， 1.22 (s, 9H)
Figure imgf000022_0001
化合物 20(90mg， 0.24mmol)溶于 THF/H20(5mL， 4:1)中，加入 NaOH(12mg， 0.29mmol), 室温搅拌 2h， 反应液用 1N盐酸酸化至 pH=2-3， EtOAc萃取 (10mLx3次；)， 饱和食盐水洗 涤 (20mL)，无水 Na2S04干燥，浓缩得化合物 21(85mg， 98%,白色固体)。 ^ MR (300 MHz, CD3OD) δ 7.86 (d， J=3.3 Hz, 1H), 7.70 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 3.38 (t， J=6.3 Hz, 2H), 3.20 (d， J=7.2 Hz, 2H), 2.36 (t， J=6.9 Hz, 2H), 1.89-2.00 (m， 1H)， 1.66-1.68 (m， 4H)， 0.96 (d， J=6.6 Hz, 6H)。
将化合物 21(93mg，0.25mmol)溶于干燥的 CH2Cl2(5mL)中， 分别加入化合物 22(74mg,0.35mmol), HOBt(41mg, 0.30mmol), Et3N(36mg, 0.35mmol), 0°C下搅拌 10min， 加入 EDCI(82mg， 0.43mmol), 室温反应过夜。 反应液分别用 IN 盐酸 (10mL)， 饱和碳酸 氢钠溶液 (10mL)， 饱和食盐水洗涤， 无水 Na2S04干燥， 浓缩过柱 (PE/EtOAc=2:l-l :l)得 23(74mg, 52.5%, 无色透明油状物）。 !H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.86 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 7.66 (t， J=5.4 Hz, 1H)， 7.52 (d， J=7.8 Hz, 1H)， 7.45 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 7.35 (d， J=7.8 Hz, 1H)， 7.06-7.14 (m， 2H), 3.40 (q, J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (d， J=6.9 Hz, 2H), 2.38 (t， J=6.6 Hz, 2H), 1.98-2.01 (m， 1H)， 1.66-1.76 (m， 4H), 1.48 (s, 9H), 0.98 (d， J=6.6 Hz, 6H)。
将化合物 23(73mg， 0.13mmol)溶于 CH2Cl2(2mL)中， 加入 IN 盐酸的 EtOAc溶液 (2mL), 室温搅拌 lOmin后， 浓缩得产物 CFH494(60mg， 93.8%， 白色固体)。 ^ MR (300 MHz, CD3OD) δ 7.93 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 7.80 (d， J=3.3 Hz 1H)， 7.47-7.52 (m， 2H), 7.35-7.42 (m, 3H), 3.45 (q, J=6.6 Hz, 2H), 3.31 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.59 (t， J=6.6 Hz, 2H), 1.81-2.00 (m, 1H)， 1.74-1.79 (m， 4H)， 0.98 (d， J=6.6 Hz, 6H)。
用同样方法合成以下化合物：
J=6.6 Hz, (d， (t， J=6.6 J=6.6 Hz,
Hz, 1H)， (d， J=6.6 7.58 (s,
Figure imgf000023_0001
' Φ (，ς ι) · i ^ oi)pz
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
ζζ Ζ OAV 25(754mg, 1.87mmol), EDCI(488mg, 2.80mmol), DMAP (23 mg, 0.19mmol),室温反应过夜。 反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液 (lOmL), 饱和食盐水洗涤， 水相用 CHCl3(10mLx2次；)萃 取，合并有机相，无水 Na2S04干燥，浓缩，柱色谱 (PE/EtOAc=2:l-l :l)分离得产物 26(640mg， 52.5%,黄色油状物）。 !H NMR (300 MHz, CDC13) δ 7.78 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.51 (t， J=6.3 Hz, 1H)， 7.35 (d， J=8.1 Hz, 6H)， 7.29 (d， J=3.0 Hz, 1H), 7.11-7.23 (m， 9H)， 6.15 (t， J=6.0 Hz, 1H)， 3.32 (q, J=6.0 Hz, 2H), 3.22 (d， J=7.2 Hz, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.96 (q, J=6.0 Hz, 2H), 1.94-1.96 (m， 1H)， 1.44-1.46 (m， 2H), 1.35-1.40 (m， 2H), 0.94 (d， J=6.6 Hz, 6H)。
将化合物 26(320mg，0.5mmol)溶于 CH2C12 (5mL)中， 加入 Et3SiH(188mg， 1.65mmol)和 三氟乙酸 (5.6g， 0.05mol), 室温搅拌 2h， 浓缩过柱 (PE/EA=1 :1-1 :5)得产物 CFH412(150mg， 74.4%, 淡黄色油状物）。 !H NMR (300 MHz, CDC13) δ 7.78 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.59 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 7.38 (d， J=3.0 Hz 1H)， 7.31 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 3.36 (q, J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.19 (s, 2H), 3.17 (d， J=7.2 Hz, 2H), 1.86-1.97 (m， 1H)， 1.47-1.58 (m， 4H)， 0.89 (d， J=6.6 Hz, 6H)。
用同样方法合成以下化合物：
化合物 结构式 H顧 R (CDC13, 300 MHz)数据
δ 7.81 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.76 (t， J=6.6 Hz, 1H)， 7.57 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 7.41 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 3.44 (q,
CFH398-S J=6.3 Hz, 2H), 3.31 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.23 (s, 2H),
Figure imgf000025_0001
3.20 (d， J=6.9 Hz, 2H), 1.91-1.96 (m， 1H), 1.73-1.77
(m， 2H), 0.92 (d， J=6.6 Hz, 6H)
δ 7.78 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.59 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 7.38 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.31 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 3.36 (q,
CFH412 J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.19 (s, 2H),
Figure imgf000025_0002
3.17 (d， J=7.2 Hz, 2H), 1.86-1.97 (m， 1H), 1.47-1.58
(m， 4H)， 0.89 (d， J=6.6 Hz, 6H)
δ 7.74 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.52 (t， J=5.4 Hz, 1H)， 7.36 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.10 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 3.29 (q,
CFH426 J=6.6 Hz, 2H), 3.17 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.15 (s, 2H),
Figure imgf000025_0003
3.14 (d， J=7.5 Hz, 2H), 1.85-1.93 (m, 1H), 1.44-1.55
(m， 4H)， 1.29-1.31 (m， 2H), 0.86 (d， J=6.6 Hz, 6H) δ 7.72 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 7.49 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 7.34 (d， J=3.3 Hz, 1H)， 7.14 (t， J=5.7 Hz, 1H)， 3.25 (q,
CFH440 J=6.6 Hz, 2H), 3.13 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.10 (s, 2H),
Figure imgf000025_0004
3.09 (d， J=7.2 Hz, 2H), 1.81-1.94 (m， 1H), 1.37-1.47
(m， 4H)， 1.06-1.11 (m， 4H)， 0.83 (d， J=6.6 Hz, 6H) δ 7.99 (dd， J=17.4, 11.1 Hz, 1H)， 7.92 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 7.73 (t， J=3.6 Hz, 1H)， 7.51 (d, J=3.0 Hz, 1H)，
CFH367-S 5.78 (d， J=17.4 Hz, 1H)， 5.53 (d， J=ll .l Hz, 1H)， 3.54
Figure imgf000025_0005
(q, J=6.6 Hz, 2H), 3.40 (q, J=6.0 Hz, 2H), 3.29 (d，
J=9.0 Hz, 2H), 1.77-1.87 (m, 2H)
Figure imgf000026_0001
化合物 27(100mg， 0.47mmol)溶于干燥的 DMF (5mL)中， 冰浴冷却至 0°C， 加入 EDCI(108mg, 0.57mmol), HOBt(76mg, 0.57mmol), 保持 0°C下搅拌 10min， 加入化合物 28(81mg， 0.52mmol)以及 -Pr2NEt(91mg， 0.71mmol)， 保持室温下搅拌 12h后， 加入 20mL 水稀释， EtOAc萃取 (15mLx3次；)，合并有机相，有机相饱和食盐水 (20mL)洗涤，无水 Na2S04 干燥， 减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化 (PE/EtOAc=3: l)， 得产品 29(129mg， 77.9%, 无色 油状物）。 !H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8.83 (s, 1Η)， 8.10 (s，lH)， 8.05 (s，lH)， 7.81 (d， J=9.0 Hz, 1H ), 5.87 (dddd, J=17.1, 10.5， 5.7, 5.1 Hz, 1H)， 5.31 (d， J=17.1 Hz, 1H)， 5.23 (d， J=10.5 Hz, 1H)， 4.73 (dd， J=9.3, 5.1 Hz, 1H)， 4.65 (dd，J=17.1， 5.7 Hz, 2H), 2.23-2.33 (m， 1H), 0.96 (t，
J=6.9 Hz, 6H)。
化合物 29(55mg，0.16mmol)溶于重蒸的甲苯 (5mL)中， N2气置换， 分别加入 Grubbs二 代催化剂 （66mg，0.08mmol)的甲苯（ImL)溶液， 化合物 30(100mg，0.48mmol)的甲苯（ImL) 溶液， 110°C加热回流 12h。 浓缩， 过柱 (PE/EtOAc=2:l)得产物 CFH538(23mg，50%， 淡黄 色油状物），回收原料 29(25mg) o ^ MR (300 MHz, CDC13) δ 8.86 (s, 1Η)， 8.13 (s, 1Η)， 8.11
(s, 1Η)， 7.83 (d， J=9.0 Hz, 1H)， 5.74 (dt， J=15.3, 6.6 Hz, 1H)， 5.63 (dt， J=13.2, 6.0 Hz, 1H)， 4.74(dd, J=9.0， 5.4 Hz, 1H)， 4.66 (dd， J=15.3, 5.4 Hz, 2H), 2.91 (t， J=7.5 Hz, 2H), 2.52 (t， J=7.5 Hz, 2H), 2.35-2.43 (m, 2H), 2.22-2.32 (m, 1H)， 1.60-1.67 (m, 2H), 1.19-1.26 (m, 8H)， 1.04 (t， J=6.3 Hz, 6H), 0.86 (t， J=6.9 Hz, 3H)。
用同样方法合成以下化合物：
化合物 结构式 1H NMR (CDCI3, 300 MHz)数据
δ 7.87 (d， J=3.0 Hz, 1H), 7.48 (t， J=4.5 Hz, 1H)，
CFH550 7.44 (d， J=3.0 Hz, 1H)， 5.47 (ddd, J=12.6, 6.3,
Figure imgf000027_0001
薦 IOZXD/工：) d S3 Z OAV 制备实施例五 (化合物编号 CFH325-B)
Figure imgf000028_0001
将化合物 31(lg， 7.86mmol)溶于干燥的 DME(30mL)中， N2气保护下加入 Lawesson's 试剂 (1.6g， 3.9mmol), 室温反应 12h， 过滤， 除去溶剂， 过柱 (PE/EtOAc=10:l-2:l)得化合 物 32(1.0g，88.8%， 白色固体；)， 直接用于下一步反应。
化合物 32(500mg， 3.49mmol)溶于干燥的 DME(30mL)中， 加入 KHC03(2.1g， 21 mmol), 室温搅拌 10min， 滴加入化合物 33(1.5g， 7.68mmol)， 反应 lh后， 冰浴冷却， 滴加入三氟乙酸酐 (2.2g， 10.48mmol)和 2，6-二甲基吡啶（1.87g， 17.46mmol)的 DME(lOmL) 溶液， 保持 0°C反应 lh， 升至室温反应过夜。 TLC检测化合物 32反应完全， 旋干溶剂， EtOAc(50mL)稀释， 有机相分别用 1N盐酸 (20mL)， 饱和碳酸氢钠 (20mL)， 饱和食盐水 (20mL)洗涤，无水 Na2S04干燥， 浓缩过柱(PE/EtOAc=4:l-2:l)得化合物 34(647mg， 77.4%, 淡黄色固体)。 !H NMR (300 MHz, CDC13) δ 8.00 (s, 1H)， 7.50 (d， J=3.9 Hz, 1H)， 7.36 (d， J=5.1 Hz, 1H)， 7.00 (dd, J=4.8， 3.9 Hz, 1H)， 4.34 (q, J=7.2 Hz, 2H), 1.33 (t， J=7.2 Hz, 3H)。
将化合物 34(447mg， 1.87mmol)溶于 EtOH/H2O(20/5mL)中， 0°C下加入 NaOH(149mg， 3.74mol)固体， 室温搅拌过夜。 反应完成后， 旋干 EtOH, 加 ¾0稀释， 1N盐酸酸化至 pH=2 , EtOAc(20mLx3次；)萃取， 饱和食盐水 (20mL)洗涤， 有机相无水 Na2S04干燥， 浓缩 得 35(314g，79.5%， 白色固体)， 直接用于下一步反应。
化合物 35(110mg， 0.52mmol)溶于干燥的 DMF (5mL)中， 冰浴冷却至 0°C， 加入 EDCI(150mg, 0.78mmol), HOBt(106mg, 0.78mmol), 保持 0°C下搅拌 10min， 加入化合物 18(96mg, 0.57mmol)以及 z-Pr2NEt (134mg, 1.04mmol)，保持室温下搅拌 12h后，加入 20mL 水稀释， EtOAc萃取 (15mLx3次；)， 合并有机相， 有机相分别用 1N盐酸 (15mL;>， 饱和碳 酸氢钠溶液 (15mL;>， 饱和食盐水 (20mL)洗涤， 无水 Na2S04干燥， 减压旋除溶剂后硅胶柱 层析纯化 (PE/EtOAc=2:l)， 得产品 36(146mg， 86.4%， 淡黄色油状物）。 ^ MR (300 MHz, CDCI3) δ 7.95 (s, 1H)， 7.47 (d， J=3.9 Hz, 1H)， 7.39 (d， J=5.1 Hz, 1H)， 7.03 (dd, J=5.1， 3.9 Hz, 1H)， 3.62 (s, 3H), 3.42 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.31 (t， J=6.6 Hz, 2H), 1.65-1.71 (m， 4H)。
羟氨盐酸盐（215mg， 3.1mmol)悬浮于 MeOH (15mL) 中， 力卩入 KOH (260mg, 4.65 mmol),搅拌 5min后，过滤除去不溶物，收集滤液备用。将化合物 36(100mg， 0.31mmol) 溶于无水 MeOH (10mL) 中， 加入上述新制备羟氨的 MeOH溶液， 室温搅拌 lh。 TLC检 测反应完全， EtOAc稀释， 1N盐酸中和至 pH=5-6， 减压浓缩旋干 MeOH, EtOAc萃取 (15mLx3 dQ, 饱和食盐水洗涤 (10mL)， 无水 Na2S04干燥， 浓缩得粗品， 柱层析纯化 (CHCl3/MeOH=20:l-10: l)得产品 CFH325-B(86mg， 86%, 白色固体)。 1ιΆ NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.09 (s, 1Η)， 7.87 (s, 1Η)， 7.66 (d， J=3.9 Hz, 1H)， 7.60 (d， J=5.1 Hz, 1H)， 7.14 (dd, J=3.9, 5.1 Hz, 1H)， 3.42 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.16 (t， J=6.6 Hz, 2H), 1.68-1.71 (m, 4H)。
生物实验实施例
实例一： 组蛋白去乙酰化酶 1，3，6(HDAC1，3，6;>抑制活性测试实验
1. 实验目的：
进行本发明化合物的人源组蛋白去乙酰化酶 1，3，6的抑制活性测试。
2. 材料来源
人源 HDAC1、 HDAC3禾 Π HDAC6, 应用杆状病毒表达系统得到。
3. 测试原理：
以 Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC(HDACl，3)和 Boc-lys(Ac)-AMC(HDAC6)为底物， 采用荧 光检测法， 在 96孔或 384孔平底微孔板中检测酶活性。 底物经 HDAC去乙酰化后， 利用胰 酶水解得到的产物 AMC在荧光检测仪的 355nm激发 460nm发射光下可被检测到荧光信号。 通过检测随时间荧光信号的变化， 计算得到反应初速度。
4. 实验过程：
样品处理： 样品用 DMSO溶解， 低温保存， DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响 检测活性的范围之内。
数据处理和结果说明： 初筛选择单浓度条件下， 例如 20 μ^ιη1， 对样品的活性进行测 试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％大于 50，测试活性剂量依赖关系， 即 IC5。/EC5。值， 通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到， 计算所用软件为 Graphpad Prism 4，拟合所使用的模型为 sigmoidal dose-response (varible slope),对于大多数抑制剂筛 选模型， 将拟合曲线底部和顶部设定为 0和 100。一般情况下， 每个样品在测试中均设置复 孑 n≥2)， 在结果中以标准偏差 (Standard Deviation, SD)或者标准误差 (Standard Error, SE)表 示。 每次测试均有巳报道的化合物 SAHA Vorinostat)作为参照。
5. 实验结果：
HDAC1 HDAC3 HDAC6 HDAC1 HDAC3 HDAC6 样品编号 样品编号
Ι 50(μΜ) Κ50(μΜ) Ι 50(μΜ) Κ50(μΜ) Ι 50(μΜ) Ι 50(μΜ)
CFH326 0.212 0.107 1.110 CFH401 0.042 0.030 0.020
CFH340-M 0.606 0.691 1.106 CFH403-1 1.020 0.687 0.295
CFH355 0.031 0.256 0.938 CFH429 0.657 0.410 0.305
CFH369 0.341 0.358 1.206 CFH394 NA NA NA
CFH383 0.031 0.188 0.621 CFH412-4 2.587 1.638 29.451
CFH382 0.047 0.102 1.217 CFH384 NA NA NA
CFH340 NAa NA NA CFH398-4 9.593 3.136 NA
CFH354 A NA NA CFH398-M NA NA NA
CFH368 A NA 19.511 CFH412-M 2.655 2.218 NA
CFH396 0.035 0.086 0.497 CFH426-M 2.453 1.577 NA
CFH410 0.178 0.249 1.246 CFH383-4 1.102 0.352 3.159
CFH424 0.021 0.073 0.575 CFH397 0.438 0.224 2.045
CFH381 0.173 0.194 0.176 CFH326-4 0.816 0.193 1.331 CFH395 0.013 0.142 0.167 CFH340-4 0.535 0.615 1.194
CFH367 0.022 0.106 0.376 CFH456 0.897 0.895 1.156
CFH352 0.116 0.384 2.295 CFH470 0.121 0.174 0.566
CFH399 1.574 2.203 9.536 CFH484 1.684 1.178 1.424
CFH367-C 0.065 0.262 0.785 CFH494 5.911 3.814 NA
CFH409 0.347 0.325 0.748 CFH508 0.984 4.307 NA
CFH409-A 0.628 0.276 0.188 CFH522 15.343 NA NA
CFH403 0.114 0.377 0.467 CFH500 NA NA NA
CFH421 0.204 0.314 0.501 CFH514 NA NA NA
CFH455 0.488 0.587 4.991 CFH325 NA NA NA
CFH437 0.165 0.453 5.178 CFH339-A NA NA NA
CFH447 0.270 0.364 0.473 CFH353 NA NA NA
CFH448-P 0.105 0.201 1.067 CFH367-A NTb NT NT
CFH417 0.058 0.079 1.746 CFH381-A NT NT NT
CFH430 0.047 0.253 0.777 CFH396-A NT NT NT
CFH461 0.050 0.158 0.957 CFH410-A NA NA NA
CFH324-C A NA NA CFH379 NA NA NA
CFH338 NA NA NA CFH398-S 0.181 0.327 0.088
CFH352-C 14.523 3.818 3.571 CFH412 4.507 2.063 0.869
CFH381-C 0.052 0.037 0.105 CFH426 0.263 0.495 0.190
CFH395-C 0.020 0.010 0.010 CFH440 1.052 0.534 1.664
CFH409-C 0.086 0.064 0.134 CFH367-S 1.828 2.245 0.692
CFH397-2 0.917 0.262 1.662 CFH397-S 1.222 0.315 0.181
CFH381-B 0.050 0.060 0.092 CFH383-S 0.937 0.728 0.470
CFH381-M 0.064 0.075 1.761 CFH411 0.956 0.384 0.212
CFH395-M 0.050 0.097 0.565 CFH550 NA NA NA
CFH421-C 0.025 0.063 1.857 CFH384-S 20.638 13.654 NA
CFH407 0.086 0.130 1.290 CFH412-S 0.087 0.058 3.716
CFH435 0.218 0.161 1.823 CFH426-S 0.117 0.106 4.324
CFH449 0.147 0.176 1.784 CFH538 1.898 2.831 NA
CFH412-C 6.274 2.913 3.068 CFH552 2.600 3.558 NA
CFH407-C 0.106 0.052 0.332 CFH325-B 0.134 0.188 0.608
CFH449-H 0.011 0.016 0.049 CFH443-5 0.032 0.011 0.488
CFH455-C 0.079 0.075 0.075 CFH443-4 0.056 0.106 0.185 a: 测试化合物在 20μ^ηΛ无抑制活性; b: 未测
由上表的实验结果可以看出： 部位的改造， 从生物结果来看， 烷基、 烯烃基和芳 香基取代都呈现良好的 HDAC抑制活性， 取代基的多样化有利于化合物的生物活性。 异 丁烯基取代化合物 CFH395对 HDAC1 的抑制活性最好。 化合物 CFH355, CFH437, CFH417选择性抑制 HDAC1(HDAC1/HDAC6=〜30倍)。 同时化合物 CFH355对 HDAC1 与 HDAC3的选择性为 8倍。
同时， 生物活性显示， R2部位取代基相同， Y为 -0^-01()烷基;) -， 链长的长短对活性 影响较大。 同样， 相同侧链长度， 不同的 取代基化合物的活性也大不同。 如对于异丁 基取代的系列化合物，链长为 7个亚甲基时 HDAC1抑制活性最好，而对于环丙基取代时， 链长为 6个亚甲基时 HDAC1抑制活性最佳。
固定 基团异丁基取代， 本发明人考察了侧链片段 Y以及不同 Zn离子螯合基团 (ZBG；)。 对于 HDAC1的抑制作用， ZBG为异羟肟酸活性最好， 当为 α-巯基酮时， 选择性 抑制 HDAC6, 特别是化合物 CFH398-S。
固定 R2基团环丙基取代， 考察 R4b和 R5b取代， 从对 HDAC抑制活性发现， 当 ¾ 和 R5b与其所连 C形成六元环时， 即化合物 CFH421-C对 HDAC1抑制活性最强， 且选择 性抑制 HDAC1(HDAC1/HDAC6=〜75倍)。
实例二： 细胞水平抗肿瘤活性测试实验
1. 实验目的：
进行本发明化合物的抗肿瘤活性测试， 通过测定化合物对人源结肠癌 HCT-116细胞 株的生长抑制活性来评价化合物的体外抗肿瘤活性。
2. 测试原理：
采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法， 该分析方法以代谢还原 3-(4，5-二甲基 -2-噻 唑;) -2，5-二苯基溴化四唑 (MTT)为基础。 活细胞的线粒体中存在与 NADP相关的脱氢酶， 可将黄色的 MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲臜 (Formazan；)， 死细胞此酶消失， MTT不被 还原。 用 DMSO溶解 Formazan后可用酶标仪在 550/690nm波长处测量光密度。
3. 实验过程：
样品处理： 样品用 DMSO溶解， 低温保存， DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响 检测活性的范围之内。
运用 MTT法检测细胞存活率， 即将生长在对数生长期的细胞， 经 0.05 %的胰酶消化， 计数， 以 2.0xl03/孔的细胞密度接种在 96孔板中 lOOmL, 置于 5%C02培养箱内 37°C培养过 夜。每一化合物设六个浓度梯度， 每一浓度设三复孔， 每一浓度分别加入到对应孔中， 5% C02 37°C培养箱内培养 72小时， 加入 20 mL 的 5 mg/mL MTT。 37°C孵育 3小时后， 吸弃上 清， 加入 lOO mL 的 DMSO溶解， 使用 SpectraMAX 340测 550 nm (L1 )光吸收值， 参考波 长 690 nm (L2 ) ， 将 （L1- L2 ) 值对抑制剂不同浓度作图， 经公式拟合得 IC50。
数据处理和结果说明： 初筛选择单浓度条件下， 例如 20 μ^ιη1， 对样品的活性进行测 试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％大于 50，测试活性剂量依赖关系， 即 IC5。/EC5。值， 通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到， 计算所用软件为 Graphpad
Prism 4，拟合所使用的模型为 sigmoidal dose-response (varible slope),对于大多数抑制剂筛 选模型， 将拟合曲线底部和顶部设定为 0和 100。一般情况下， 每个样品在测试中均设置复 孑 n≥2)， 在结果中以标准偏差 (Standard Deviation, SD)或者标准误差 (Standard Error, SE)表 示。 每次测试均有阿霉素 (doxorubicin;)作为参照。
4. 实验结果：
4.1： 化合物在 HCT-116人结肠癌细胞株上的活性结果： 细胞存活率 细胞存活率 细胞存活率 样品编号 样品编号 样品编号
Ι 50(μΜ) Ι 50(μΜ) ICso(MM)
CFH326 11.143±1.167 CFH381-C 0.438±0.018 CFH403 7.596±0.817
CFH369 8.714士1.227 CFH395-C 0.408±0.023 CFH421-C 0.233±0.029
CFH383 7.406±1.473 CFH409-C 2.976±0.188 CFH407 0.310±0.032
CFH382 10.304±1.130 CFH381-B 0.562±0.071 CFH435 0.768±0.099
CFH410 6.696士0.652 CFH381-M 0.472±0.055 CFH449 0.392±0.031
CFH367-C 0.452±0.022 CFH395-M 0.538士0.051 CFH401 0.267士0.007
CFH461 7.647±1.499 CFH407-C 1.117士0.484
CFH396 8.266±0.858 CFH409-A 15.125±2.919
CFH508 9.322士0.433 CFH421 10.023±0.748
4.2： 化合物在 BxPC-3人胰腺癌细胞株上的活性结果： 细胞存活率 细胞存活率 细胞存活率 样品编号 样品编号 样品编号
Ι 50(μΜ) Ι 50(μΜ) ICso(MM)
CFH382 2.6 CFH355 3.3 CFH461 0.9
CFH396 4.3 CFH410 4.7 CFH383 2.6
CFH395 1.9 CFH424 17.8 CFH403 3.9
CFH367 6.2 CFH326 6.8 CFH367-C 1.3
CFH397-2 3.7 CFH340-M 13.0 CFH417 1.9
CFH352 2.1 CFH369 4.8
CFH397 6.4 CFH421 4.8
4.3: 化合物在其它肿瘤细胞株上的抑制活性结果：
HL60 A549 MDA-MB-231 HMEC 样品编号
50(μΜ) Ι 50(μΜ) Ι 50(μΜ) 50(μΜ)
CFH395 0.3 1.6 0.5 1.2
CFH367-C 0.5 2.8 0.7 1.7
CFH383-4 5.1 32.0 9.4 22.0
CFH382 NTa 3.6 2.7 NT
CFH417 NT 3.2 2.1 NT a: 未测
5. 结论： 对 HDAC1有抑制活性的化合物均呈现良好的抑制肿瘤细胞增殖活性， 尤其是 对结肠癌、胰腺癌、肺腺癌、 乳腺癌等具有很好的作用。 从对肿瘤细胞株的抑制生长活性 看， 化合物在细胞上的活性基本与在酶上的活性吻合。
实例三： HDAC抑制剂作为治疗多发性硬化症 (MS)的药物
1. 实验方法及结果： HDACi CFH367-C可以有效缓解 EAE的临床评分。 本发明人对 8周龄的雌性 C57 小鼠进行皮下注射 ΙΟΟμΙ^弗氏完全佐剂乳化的 MOG35— 55(150μ^只;)和热灭活的 ΜΤ毒素 (5m^mL), 并于当天和第三天两次腹腔注射 PTX(200ng/只 /次， PBS溶解；)。免疫后第三天 开始经由灌胃给药， 每日两次， 每次剂量为 10mg/kg体重。 每天观察小鼠的表现， 并依 据以下标准进行评分： 0分： 没有发病的任何征兆； 尾部无力 (0.5分)或者瘫痪 (1分)； 四 肢无力 (0.5分)或者瘫痪 (1分)。 以上得分相加为最后得分。 结果表明 (图 1)， CFH367-C对 于 EAE的临床症状有良好的治疗作用， 治疗组小鼠的疾病严重程度显著的低于溶剂对照 组 (尸<0.01)。
HDACi CFH367-C明显减轻 EAE动物脊髓的脱髓鞘现象。 取正常对照、 EAE (实验 性自身免疫性脑脊髓炎；)及 EAE治疗组小鼠的脊髓样品， 经固定后， 常规石蜡包埋， 5微 米切片， 脱蜡水化至 95 %酒精， 用坚劳蓝染色在 56度过夜； 经 95%酒精洗， 水洗， 然后 用 0.05 %碳酸锂溶液分色； 再用 70%酒精洗两次， 蒸馏水洗， 然后用伊红染色 2分钟； 经梯度乙醇脱水， 二甲苯透明， 用中性树胶封片。坚劳蓝主要着色部位为脊髓白质， 主要 由神经纤维及其髓鞘组成。实验结果表明，正常小鼠的白质可被染成蓝色，结构比较致密； 而 EAE小鼠的脊髓白质区域出现大量空泡， 且着色程度明显降低， 显示出严重脱髓鞘现 象。而 CFH367-C给药的小鼠脊髓白质结构致密， 着色均有， 接近正常对照小鼠水平， 显 示其明显的治疗作用。
HDACi CFH367-C明显减轻 EAE动物脊髓中外周免疫细胞的浸润现象。 取正常对 照、 EAE及 EAE治疗组小鼠的脊髓样品， 经固定后， 常规石蜡包埋， 5微米切片， 切片 用二甲苯脱蜡， 经各级乙醇复水后， 苏木精染色 5分钟； 后经自来水冲洗， 盐酸分色， 自 来水洗， 再用伊红染色 2分钟； 梯度乙醇脱水后， 经二甲苯透明， 用中性树胶封片。 实验 结果表明， 正常小鼠的脊髓中几乎没有浸润的外周免疫细胞； 而 EAE小鼠的脊髓白质区 域出现大量外周免疫细胞的浸润， 并造成附件组织损伤， 出现空泡。而 CFH367-C给药的 小鼠脊髓白质结构致密， 无明显外周免疫细胞浸润现象， 显示其明显的治疗作用。
HDACi CFH367-C明显减轻 EAE动物脊髓中 CD45阳性白细胞的浸润现象。 取小 鼠脊髓， 经固定后， OCT包埋， 制作 ΙΟμιη冰冻切片。 切片用 PBS洗三次， 每次 5min， 然后用抗 CD45的抗体 (一抗；)在 4°C孵育过夜； PBS洗三次后， 用带荧光标记的二抗 37°C 染色 lh， 经 PBS洗三次后， 甘油封片。 CD45为白细胞共同抗原， 实验结果表明， 细胞 核染色显示 EAE实验小鼠的脊髓中有大量细胞聚集， 大部分为 CD45阳性的白细胞。 这 一现象在正常小鼠中不存在， 而在 CFH367C给药的小鼠中也没有观察到 CD45阳性白细 胞的聚集， 显示 CFH367-C可以抑制白细胞对 EAE小鼠脊髓的浸润现象。
HDACi CFH367-C明显减轻 EAE动物脊髓中 CD4阳性 T细胞的浸润现象。前期研 究表明 CD4阳性 T细胞对于 EAE的发病有着重要作用，本发明人也观察了药物对于 CD4 阳性 T细胞浸润的作用。 取小鼠脊髓， 经固定后， OCT包埋， 制作 ΙΟμιη冰冻切片。 切 片用 PBS洗三次， 每次 5min， 然后用抗 CD4的抗体 (一抗；)在 4°C孵育过夜； PBS洗三次 后， 用带荧光标记的二抗 37°C染色 lh， 经 PBS洗三次后， 甘油封片。 实验结果表明， 细 胞核染色显示 EAE实验小鼠的脊髓中有大量细胞聚集，大部分为 CD4阳性的 T细胞。这 一现象在正常小鼠中不存在。而 CFH367-C给药可以明显减轻 EAE小鼠脊髓中 CD4阳性 T细胞的浸润和聚集。
2. 结论：
组蛋白去乙酰化酶抑制剂 CFH367-C可以有效缓解 MS的实验小鼠动物模型 EAE的 临床症状。 对 EAE小鼠的脊髓进行染色实验发现， CFH367-C可以抑制外周免疫细胞， 尤其是 CD4阳性 T细胞对小鼠中枢神经系统的浸润，减轻 EAE动物神经元的脱髓鞘现象， 从而缓解了 EAE的临床表现。 本研究结果显示组蛋白去乙酰化酶抑制剂 CFH367-C可以 用于 MS疾病的治疗，并有可能推广应用到其他自身免疫疾病的治疗，包括类风湿性关节 炎、 牛皮癣、 系统性红斑狼疮等。

Claims

权 利 要 求
1、 一类通式 I所示的噻唑类
Figure imgf000035_0001
其中：
为
Figure imgf000035_0002
和 a各自独立地选自 A或 Boc保护的氨基 CrC6烷基；
b和 R5b各自独立地选自 A中；或者 R4b和 R5b与其连接的 C一起形成 3-10元环或含 有 1-3个选自 N、 0和 S中的杂原子的 3-10元杂环；
R4C、 R5c和 各自独立地选自 A中；
所述 A为如下基团中的一种： H、 卤素、 羟基、 硝基、 C3-C6环烷基、 d-C6烷氧基、 C6-d。芳基取代的 d-C6烷氧基、 氨基、 d-C6烷氨基、 C6-d。芳基取代的 d-C6烷氨基、 CrC6烷基、羟基取代的 CrC6烷基、 CrC4烷氧基取代的 CrC6烷基、氟代 CrC6烷基、 C6-C1() 芳基取代的 d-C6烷基、 C2-C6链烯基、羟基取代的 C2-C6链烯基、 d-C4烷氧基取代的 C2-C6 链烯基、 氟代 C2-C6链烯基、 C6-C1Q芳基取代的 C2-C6链烯基、 C2-C6链炔基、 羟基取代的 C2-C6链炔基、 CrC4烷氧基取代的 C2-C6链炔基、 氟代 C2-C6链炔基、 C6-C1()芳基取代的 C2-C6链炔基、 C6-C1Q芳基、 5-7元杂芳基； 所述 5-7元杂芳基含有 1-3个选自 N、 0和 S 中的杂原子；
为如下基团中的一种： H， 卤原子， 羟基， CrC6烷氧基， C6-d。芳基取代的 CrC8 烷氧基， 氨基， d-C6烷氨基， C6-d。芳基取代的 d-C6烷氨基， d-C6烷基， C3-C6环烷基， d-C6烷基取代的 C3-C6环烷基， 任选被羟基、 d-C4烷氧基、 ¾原子、 苄氧基或 C6-C10芳 基取代的 CrC6烷基， C2-C8链烯基， 任选被羟基、 CrC4烷氧基、 ¾原子或 C6-C1()芳基取 代的 C2-C6链烯基， C2-C6链炔基， 任选被羟基、 d-C4烷氧基、 ¾原子或 C6-d。芳基取代 的 C2-C8链炔基， C6-C1()芳基， 任选被卤原子或硝基取代的 C6-C1()芳基， 5-7元杂芳基； 所 述 5-7元杂芳基含有 1-3个选自 N、 0和 S中的杂原子；
n为 0、 1或 2 ;
Figure imgf000035_0003
Y不存在或者为 -(d-do烷基) -、 -(C2-C9链烯基) -、 -(C6-C1()芳基) -、 -(CrC6烷基 MC6-C10 芳基) -、 -(C6-Cio芳基) -(C2-C6链烯基) -、 -(C3-C6环烷基) -、 -(Ci-C5烷基) -C C -NH^d-Cs 烷基) -、 -(Ci-C5烷基) -C C -C d-Cs烷基) -或 -(d-Cs烷基) -C(0)-0-(C2-C9链烯基) -;
Figure imgf000036_0001
R3a K3b R3c R3d R 3e
其中， R8为 H或 d-C6烷基羰基；
R9为 H或 d-do烷基羰基。
2、 根据权利要求 1所述的噻唑类化合物， 其中， 通式 I中：
为如下基团中的一种： H, CrC6烷基， C3-C6环烷基，任选被羟基、苄氧基或 C6-C1() 芳基取代的 CrC6烷基， C2-C8链烯基， C6-C1()芳基， 任选被卤原子或硝基取代的 C6-C1() 芳基；
n为 0;
X为 -NH-;
Y为 -(d-d。烷基) -、 -( -d。芳基) -、 -(CrC6烷基 H -Ci。芳基) -或 -( -d。芳基 )-(C2-C6 链烯基；) -;
为 H。
3、 根据权利要求 1所述 Ia、 lib或 IIC:
Figure imgf000036_0002
II a
其中：
R2、 X、 Y和 R3的定义如权利要求 1所述；
和 a各自独立地为 H、 CrC6烷基或 Boc保护的氨基 CrC6烷基;
或者，
Figure imgf000036_0003
IIb
其中：
R2、 X、 Y和 R3的定义如权利要求 1所述； b和 R5b各自独立地为 H、 CrC6烷基、 C3-C6环烷基或 C6-C1()芳基， 或 和 R5b 与其连接的 C一起形成 3-10元环；
或者，
Figure imgf000037_0001
其中：
R2、 X、 Y和 R3的定义如权利要求 1所述；
R4c和 R5c和 R6各自独立地为 H或 d-C6烷基。
4、 根据权利要求 1所
Figure imgf000037_0002
其中， R2、 ¾、 R5b和 Y的定义如权利要求 1所述。
5、 根据权利要求 4所述的噻唑类化合物， 其中，
为11、 d-C6烷基、 C3-C6环烷基、羟基取代的 d-C6烷基、 d-C6烷基取代的 C3-C6 环烷基、 C2-C8链烯基、 羟基取代的 C2-C8链烯基、 C6-C1()芳基、 C6-d。芳基或苄氧基取代 的 d-C6烷基、 C6-d。芳基取代的 C2-C8链烯基、 C6-d。芳基取代的 C2-C8烷氧基、 卤素取 代的 C6-C1()芳基或者硝基取代的 C6-C1()芳基；
b和 R5b各自独立地为 H、 F、 d-C6烷基、羟基取代的 d-C6烷基、氟代 d-C6烷基、 C3-C6环烷基、 C2-C6链烯基、羟基取代的 C2-C6链烯基、氟代 C2-C6链烯基或 C6-C1()芳基， 或是 R4b和 R5b与其连接的 C一起形成 3-10元环或含有 1-3个选自 N、 0和 S中的杂原子 的 3-10元杂环；
Y为 -(CrC8烷基) -、 -(C6-Cio芳基) -、 -(CrC6烷基 MC6-C1()芳基) -或 -(C6-C1()芳基 )-(C2-C6 链烯基) -。
6、 唑类化合物， 其中，
Figure imgf000037_0003
Figure imgf000038_0001
ZnSLO/ZlOZSLJ/∑Jd 9 ε Z OAV
Figure imgf000039_0001
OCSHS、
一 、 tS"S: 、
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
7、权利要求 1所述的噻唑类化合物的制备方法， 其特征在于，通过下述路线一〜路线 五中的任何一种来实现；
一: HN
Figure imgf000041_0002
其中， 、 R2、 n、 X和 Y的定义同权利要求 1 ;
化合物 1与活化锌粉在 THF中形成化合物 2， 化合物 2与 2-溴代噻唑化合物 3在醋 酸钯与三苯基膦催化下于甲苯中经 Negishi偶联反应得到化合物 4， 化合物 4在氢氧化钠 / 甲醇-水体系中水解后得相应的酸 5， 化合物 5与不同的亲核试剂 HX-Y-COOMe在缩合剂 EDCI、 HOBt、 /-Pr2NEt的作用下于 DMF中发生缩合反应得到化合物 6， 化合物 6与新制 羟氨的甲醇溶液反应制得本发明所述噻唑类化合物 I a;
路线二:
Figure imgf000042_0001
其中， 、 R2、 R8、 n、 X和 Y的定义同权利要求 1 ;
化合物 6在甲醇或 THF/水体系中经过碱水解得到化合物 I e， 化合物 I e与单 Boc保 护的邻苯二胺在缩合剂 EDCI、 HOBt、 z-Pr2NEt的作用下于 DMF中发生缩合反应得到化 合物 7，化合物 7在盐酸乙酸乙酯溶液作用下脱去 Boc保护基得到本发明所述噻唑类化合 物 I b， 或者化合物 7与不同的亲核试剂 R8H发生反应得本发明所述噻唑类化合物 I b;
路线三:
Et3SiH， TFA CH Cl
Figure imgf000042_0002
其中， 、 R2、 n、 X和 Y的定义同权利要求 1 ;
化合物 5与不同的亲核试剂 HX-Y-NHCOCH2STrt在缩合剂 EDCI， DMAP作碱的条 件下于二氯甲烷中发生缩合反应得到化合物 8， 化合物 8在三氟乙酸条件下脱除保护基制 得本发明所述噻唑类化合物 I c ;
路线四 ··
Figure imgf000042_0003
I d
其中， 、 R2、 R9、 n、 X和 Y的定义同权利要求 1 ;
化合物 5与不同的亲核试剂 HX-Y-SR9在缩合剂 EDCI、 HOBt、 -Pr2NEt的作用下于 DMF中发生缩合反应得到本发明所述噻唑类化合物 I d;
Figure imgf000043_0001
其中， R2、 R3、 R4C、 R5c、 、 n、 X和 Y的定义同权利要求 1 ;
化合物 9在 Lawesson's试剂作用下生成化合物 10， 化合物 10与不同 R2取代的溴代 丙酮酸乙酯经过 Hantzsch反应构建噻唑环得到化合物 11， 化合物 11在甲醇 /水体系中碱 性条件下水解得到化合物 12， 化合物 12与不同的亲核试剂 HX-Y-R3在缩合剂 EDCI、 HOBt、 z-Pr2NEt的作用下于 DMF中发生缩合反应制得本发明所述噻唑类化合物 II c。
8、权利要求 1所述的噻唑类化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物中的用途。
9、 权利要求 1所述的噻唑类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。
10、根据权利要求 9所述的用途， 其特征在于， 所述的肿瘤为结肠癌、 胰腺癌、 白血 病、 肺癌或乳腺癌。
11、 权利要求 1所述的噻唑类化合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的用途。
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