CN102772360A

CN102772360A - 一种兽用盐酸多西环素注射液及其制备方法

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Publication number: CN102772360A
Application number: CN2012103009757A
Authority: CN
Inventors: 胡海燕; 徐士新; 王亦琳; 黄耀凌; 徐倩; 朱馨乐; 孙雷; 毕言峰; 张聪敏; 徐秉恩; 汪霞; 张骊; 朱明文
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-08-22
Also published as: CN102772360B

Abstract

本发明涉及一种兽用高浓度长效盐酸多西环素注射液及其制备方法。该方法包括将适量抗氧剂和稳定剂溶于注射用水中，然后把其水溶液加到有机溶剂中，再加入盐酸多西环素和络合剂，调节pH，保温，接着加入金属离子螯合剂和部分抗氧剂，然后过滤、充氮气、灭菌，得到所述的兽用盐酸多西环素注射液。本发明制备的多西环素注射液安全、稳定、半衰期长约30~39h，延长了药物在体内的作用时间，减少了给药次数和使用量，提高了治疗效果和效率，在兽医临床上将有广阔的应用前景。

Description

一种兽用盐酸多西环素注射液及其制备方法

【技术领域】

本发明属于兽药技术领域。更具体地，本发明涉及一种兽用高浓度长效盐酸多西环素注射液，还涉及所述注射液的制备方法。

【背景技术】

盐酸多西环素（Doxycycline Hydrochloride）为四环素类抗生素，别名盐酸脱氧土霉素、盐酸强力霉素，其体内体外抗菌活性强于同类药物土霉素和四环素。该药不仅对大多数革兰氏阳性菌与阴性菌有效，而且对螺旋体、放线菌、霉形体、衣原体、立克次体和某些原虫（如阿米巴原虫、球虫等）均有抑制作用，对四环素、土霉素的耐药菌也有效，用于治疗畜禽慢性呼吸道疾病、支原体病、大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病、附红细胞体病等。该药脂溶性大，对组织渗透力强，体内分布广，生物利用度高，有效血液浓度维持时间长，毒性较低，在兽医临床上广泛应用。

目前，盐酸多西环素剂型单一，正式产品仅有口服粉剂和片剂，缺乏其作用迅速、剂量准确、疗效可靠的注射剂型，而普通的注射剂由于浓度低，药效持续时间短，造成使用剂量大，给药次数多，操作繁琐，治疗成本较高，直接影响了家畜等动物感染性急症的治疗效果和效率。因此，研发高浓度、长效盐酸多西环素注射液成为本发明的目标。

盐酸多西环素在水溶液中易氧化、降解，导致变色、析出，其不稳定性制约了这种注射液的制备。利用多西环素与金属离子络合的特性使其形成络合物是提高盐酸多西环素溶解度和稳定性的有效手段，这种方法已在制备土霉素注射液中使用过，上世纪六、七十年代曾借鉴其方法应用于制备多西环素注射液。但是，金属离子与多西环素形成络合物的同时也会加速药物的氧化变色，并且生成的络合物还不溶于水，因此，能否有效形成及溶解络合物是这种注射液制备的关键，其涉及因素与药物和金属离子的用量，采用的溶剂、反应温度、pH值的控制及含氧量有关，故优选络合剂、抗氧剂及溶剂等并采用合理的制备工艺均对注射液的安全、稳定、高效和长效起到至关重要的作用。而目前多西环素注射液，特别是高浓度的多西环素注射液在制备技术上有一定难度并存在诸多问题，例如US3674859、US 3957980涉及的是低浓度注射液，给药剂量大；US 4086332抗氧剂甲醛合次硫酸氢钠用量较大，易对注射液的安全造成影响。CN101062013A、CN101062014A与CN101822817A涉及低浓度注射液，未采用金属离子络合，使用EDTA-2Na作为抗氧化剂，没有长效作用，也缺少稳定性试验数据。CN101703464A所述抗氧剂适用于弱酸性药液，在pH7.5~9条件下抗氧效果较弱；CN 101416974A公开其制剂的长效作用不明显；CN 101804062A、CN102144967A缺乏体内动物试验和稳定性试验数据支持其长效作用。CN 101301268A等没有说明其产品具有长效作用。

为了提高和弥补现有技术的不足，本发明人通过对注射液的附加剂种类、用量以及制备工艺的研究和优化，获得一种高浓度、安全稳定、长效的盐酸多西环素注射液及其制备方法。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种兽用高浓度长效盐酸多西环素注射液。

本发明的另一个目的是提供所述兽用高浓度长效盐酸多西环素注射液的制备方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种兽用盐酸多西环素注射液。

所述的兽用盐酸多西环素注射液每100ml含有：

以多西环素计的盐酸多西环素 15~25克；

镁离子化合物络合剂，它与多西环素的摩尔比为1.0~1.8：1；

抗氧剂 0.25~1.0克；

EDTA-2Na金属离子螯合剂 0.01~0.05克；

水溶性高分子化合物稳定剂 1.0~5.0克；

有机溶剂 45~80克；

pH值 3.0~5.0；

残氧量，以所述注射液总体积计<3%；

注射用水，它的量为使所述注射液总量达到100ml的量。

盐酸多西环素是目前市场上销售的抗生素，该药在水溶液中易氧化、降解，从而导致其水溶液变色并析出。为此，让镁离子化合物与多西环素进行络合反应生成络合物，以提高多西环素在所述注射液中的稳定性。

所述的镁离子化合物络合剂是MgCL₂·6H₂O、MgO或MgSO₄。

优选地，所述的镁离子化合物络合剂是MgCL₂·6H₂O或MgO。

以多西环素计的盐酸多西环素为15~25克时，如果镁离子化合物络合剂与其多西环素的摩尔比小于1.0：1，则会使多西环素络合不完全；如果镁离子化合物络合剂与其多西环素的摩尔比高于1.8：1，则会使药液碱性偏高，易氧化并影响其溶解。

因此，镁离子化合物络合剂与其多西环素的摩尔比为1.0~1.8：1时较为适宜。

优选地，镁离子化合物络合剂与其多西环素的摩尔比为1.0~1.6：1。

为了防止多西环素氧化，在本发明的每100ml注射液中使用了0.25~1.0克抗氧剂。

所述的抗氧剂是一种或两种选自甲醛合次硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C的抗氧剂。

优选地，所述的抗氧剂是一种或两种选自甲醛合次硫酸氢钠、亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠的抗氧剂。

以多西环素计的盐酸多西环素为15~25克时，如果抗氧剂的量小于0.25克，则其抗氧效果不足；如果抗氧剂的量大于1.0克，则会对注射剂质量产生影响，如影响其安全性；因此，以多西环素计的盐酸多西环素为15~25克时，所述抗氧剂的量为0.25~1.0克是比较合适的。优选地，所述抗氧剂的量是0.3~0.8克。

为了获得稳定具有长效作用的注射液，在本发明的注射液中使用了水溶性高分子化合物稳定剂。

所述水溶性高分子化合物稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮PVPK₁₇、聚乙烯吡咯烷酮PVPK₃₀、泊洛沙姆₁₈₈或泊洛沙姆₄₀₇。

聚乙烯吡咯烷酮为白色或浅黄色粉末，易溶于水及多种有机溶剂，具有良好的吸湿性、成膜性、络合能力和生理相容性。这些水溶性高分子化合物稳定剂都是目前市场上销售的并常用的药用辅料，例如上海其福青材料科技有限公司生产的聚乙烯吡咯烷酮PVPK₁₇与聚乙烯吡咯烷酮PVPK₃₀。

泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是一类新型的高分子非离子表面活性剂，具有稳定、增溶、促进吸收等作用。它易溶于水或乙醇，水溶液在空气中较稳定，对酸碱水溶液和金属离子稳定。作为优良的药用新辅料-市售的泊洛沙姆已在制药工业中使用，例如上海源叶生物科技有限公司销售的泊洛沙姆系列产品。

以多西环素计的盐酸多西环素为15~25克时，如果水溶性高分子化合物稳定剂的量小于1.0克，则会起不到应有的作用；如果水溶性高分子化合物稳定剂的量高于5.0克，则会加大药液的粘稠度，造成制备和应用中的困难并增加成本。因此，所述水溶性高分子化合物稳定剂的量为1.0~5.0克是合适的。

优选地，所述水溶性高分子化合物稳定剂的量为2.0~4.0克。

为了保证盐酸多西环素络合效果，往往使用过量的络合剂，因此，反应中多余的镁离子以及其它试剂、溶媒或设备等带入的各种微量金属离子均会加速药物的氧化变色，因此，螯合掩蔽过量镁离子与其它微量金属离子极其必要。

为此，在本发明的注射液中使用了EDTA-2Na金属离子螯合剂。它为白色结晶性粉末，能溶于水，是钙、镁及其他金属离子的螯合剂和掩蔽剂。它是一种目前市场上销售的医药化工技术领域里普遍使用的产品。

EDTA2Na作为金属离子螯合剂用于注射液的常用量为0.005-0.05%（克/100ml）。

在本发明的产品中，以多西环素计的盐酸多西环素为15~25克时，如果EDTA-2Na金属离子螯合剂的量小于0.01克，则抗氧化效果不够好；采用0.05克EDTA2Na已能达到预计要求，如果再高于0.05克，则会增加成本；因此，所述EDTA-2Na金属离子螯合剂的量为0.01~0.05克是合适的。

优选地，所述EDTA-2Na金属离子螯合剂的量为0.02~0.05克。

为了有效地制成溶解度小的络合物或形成高分子亲水凝胶减少溶出，采用丙二醇等有机溶剂来增加溶解度和粘滞度，降低扩散系数，这在提高药物稳定性的同时延缓了药物释放，延长了药物作用时间，因此，在本发明的注射液中使用了有机溶剂作为制备介质。

所述的有机溶剂是一种或两种选自α-吡咯烷酮、丙二醇、二甲基乙酰胺或聚乙二醇₄₀₀、聚乙二醇₂₀₀的有机溶剂。

优选地，所述的有机溶剂是一种或两种选自α-吡咯烷酮、丙二醇或二甲基乙酰胺的有机溶剂。

以多西环素计的盐酸多西环素为15~25克时，如果有机溶剂的量小于45克，则导致注射液不稳定，易析出；如果有机溶剂的量大于80克，则造成药液粘稠度大，成本增加；因此，有机溶剂的量为45~80克较为适宜。优选地，有机溶剂的量是50~70克。

就本发明而言，pH值是保证产品稳定性的关键因素之一，络合物能否有效形成又是注射液制备的关键之一。因此，络合反应pH值和终产品pH值的控制是保证药物顺利络合、延缓药物氧化，提高稳定性的关键因素。在本发明中，使用pH调节剂将其反应液的pH值控制在3.0~6.0，优选地3.5~5.0；终产品pH值控制在3.0~5.0，优选地3.9~4.5。所述的pH调节剂是盐酸和/或乙醇胺。

由于多西环素易氧化变色，氧对注射液的稳定性影响很大，注射液中含氧量越高，稳定性越差，药液颜色越深，故本发明注射液中残氧量是控制产品质量的又一个关键指标。

在本发明注射液配制和灌装过程中需要在氮气保护下实施，严格地将产品中氧的含量控制在以所述注射液总体积计3%以下，优选地1%以下，这样可以有效地防止其注射液在生产、灭菌和储存过程中的氧化变色现象，从而有效地保证其注射液产品质量。

优选地，所述的兽用盐酸多西环素注射液所述的注射液每100ml含有：

以多西环素计的盐酸多西环素 18~22克；

镁离子化合物络合剂，它与多西环素的摩尔比为1.0~1.6：1；

抗氧剂 0.3~0.8克；

EDTA-2Na金属离子螯合剂 0.02~0.05克；

水溶性高分子化合物稳定剂 2.0~4.0克；

有机溶剂 50~70克；

pH值 3.9~4.5；

残氧量，以所述注射液总体积计＜1%；

注射用水，它的量为使所述注射液总量达到100ml的量。

本发明还涉及所述兽用盐酸多西环素注射液的制备方法。

所述制备方法的步骤如下：

A、将0.25~1.0克抗氧剂和1.0~5.0克水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，或者将0.25~1.0克抗氧剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计60~75%所述水溶液，加到45~80克有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液。

所述的抗氧剂和水溶性高分子化合物稳定剂如前面所述，在此不再赘述。

B、往步骤A得到的混合液中依次加入镁离子化合物络合剂和15~25克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.0~1.8：1；在温度50-65℃下使用pH调节剂将其混合液的pH值调节至3.0-6.0，搅拌直至得到一种黄色透明液体。

C、然后，在温度50~65℃下保温5-20分钟；往步骤B得到的透明液体中加入0.01~0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计25~40%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用pH调节剂将其pH值调节至3.0-5.0，之后用注射用水补充其总量至100mL，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在以所述注射液体积计3%以下，然后用蒸汽灭菌，得到所述的兽用盐酸多西环素注射液。

在所述制备方法中，所使用的抗氧剂、水溶性高分子化合物稳定剂、镁离子化合物络合剂、EDTA-2Na金属离子螯合剂、有机溶剂与pH调节剂等如前面所述，在此不再赘述。

本发明使用的有机滤膜为聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯或脂肪族尼龙材料，具有广泛的化学相容性，耐适当浓度的酸碱，均是目前医药化工技术领域里普遍使用的市售产品。

本发明灭菌使用的设备是目前市场上销售的医药化工技术领域里普遍使用的产品，例如山东中泰医疗器械股份有限公司销售的产品。

本发明的注射液通常进行蒸汽灭菌15~30分钟。

本发明还涉及所述兽用盐酸多西环素注射液的另一种制备方法。

所述制备方法的步骤如下：

A、将0.25~1.0克抗氧剂的50~75%单独或与1.0~5.0克水溶性高分子化合物稳定剂一起溶于总量50~75%计量的注射用水中，得到一种水溶液，再把所述的水溶液加到45~80克有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、然后，在温度50~65℃下往步骤A得到的混合液中依次加入镁离子化合物络合剂和15~25克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.0~1.8：1；搅拌均匀；再用pH调节剂将其pH值调节至3.0~6.0，待反应体系呈黄色透明；

C、将余下的抗氧剂与0.01~0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于余下一部分注射用水中，把其溶液再加到步骤B的反应溶液体系里，混匀，使用pH调节剂将pH值调节至3.0~5.0，再用注射用水将其总量补充到100ml，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用蒸汽灭菌，得到所述的兽用盐酸多西环素注射液。

采用本发明方法所得到兽用盐酸多西环素注射液的pH值为3.0~5.0。

本发明的技术特点如下：

（1）抗氧剂的组成及制备工艺

本发明采用多西环素与金属离子络合的方法防止其药物氧化水解，还能够延长体内药物吸收，但镁离子在与多西环素络合的同时也能够加速其药物的氧化。本发明使用EDTA2Na作为金属离子螯合剂，可螯合镁等金属离子，防止其对药物的催化起到抗氧化作用，但同时它又参与多西环素的竞争，在一定程度上影响多西环素的络合，甚至会被大量镁离子消耗而失去其络合抗氧化作用。为此，本发明采用在络合反应完成，即形成透明溶液后，再加入EDTA-2Na络合剩余的镁离子和其他微量金属离子，这样既达到络合反应完全，也防止其注射液被微量金属离子氧化，同时采用抗氧剂与EDTA-2Na组合二次加入抗氧剂的方法，有效地补充了络合反应中抗氧剂量的消耗，明显增加了抗氧化效果，从而在保证疗效的情况下提高了产品的稳定性。这种技术方案在该类注射液的现有技术中无任何人报道。

（2）反应温度及络合pH值

络合物能否有效形成是注射液制备的关键之一。本发明络合反应温度控制在50~65℃（优选地55~60℃），络合pH值控制在3.0~6.0（优选地3.5~5.0），可保证多西环素顺利络合，防止因温度和pH过高造成的颜色加深等氧化现象。本发明所提出的具体温度和pH值范围的络合条件，在现有技术中未见具体相同报道。

（3）残氧量控制

多西环素易氧化变色，氧对注射液的稳定性影响很大，注射药液中含氧量越高，稳定性越差，药液颜色越深，故产品中残氧量的控制为关键指标之一。在配制和灌装过程中充入氮气，将产品中氧的含量控制在3%以下，可有效地降低注射液在生产、灭菌和储存过程中的氧化变色现象。本发明提出的该项控制指标在同类专利中未见报道。

（4）采用的延效技术

有效地制成溶解度小的络合物或形成高分子亲水凝胶减少溶出，采用丙二醇等有机溶剂增加粘滞度，降低扩散系数，可在提高药物稳定性的同时延缓了药物释放，延长了药物作用时间。该制剂技术制备的产品吸收快，体内消除半衰期长（>30h），其表明长效作用的参数值明显高于CN101416974公开的作用数据。

（5）pH调节剂

本发明采用的酸性pH调节剂为9M盐酸，而现有技术使用的是浓盐酸（CN101301268A），不够安全并且加入时因局部浓度高有析出，易影响稳定性。本酸性pH调节剂的优点为易于配制和调节并相对安全。试验结果表明，本发明制备的兽用盐酸多西环素注射液产品色泽较浅、稳定性好、具有高效、速效和长效作用。

[有益效果]

本发明的有益效果如下：本发明制备的兽用盐酸多西环素注射液产品色泽较浅、稳定性好、具有高效、速效和长效作用。多西环素属于长效广谱半合成抗生素，脂溶性大，本发明制备的多西环素注射液半衰期长约25~39h，比现有技术提高约10~25h，因此，延长了药物在体内的作用时间，以10mg/kg的剂量给药，可1~2天给药一次，减少了给药次数和使用量，提高了治疗效果和效率，在兽医临床上将有广阔的应用前景。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.25克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂和5.0克聚乙烯吡咯烷酮PVPK₁₇水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计60%所述水溶液，加到45克α-吡咯烷酮有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入MgCL₂·6H₂O络合剂和15克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.3：1；在温度55℃下使用盐酸或乙醇胺调节剂将pH值调节至3.0，搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在温度55℃下保温5分钟；再往其中加入0.01克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计40%步骤A的水溶液，溶解混匀后使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将pH值调节至3.0，之后用注射用水补充其总量至100mL，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在以所述注射液体积计3%以下，然后用流通蒸汽灭菌15分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液，其pH为3.0。

实施例2：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将1.0克甲醛合次硫酸氢钠和亚硫酸氢钠（重量比3：2）抗氧剂和1.0克聚乙烯吡咯烷酮PVPK₃₀水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计68%所述水溶液，加到60克α-吡咯烷酮和二甲基乙酰胺（体积比2：1）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入MgO络合剂和25克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.8：1；在温度64℃下使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将pH值调节至6.0，搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在这个温度下保温20分钟；再往其中加入0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计32%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用所述pH调节剂将pH值调节至5.0，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌30分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液，其pH为5.0。

实施例3：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.50克甲醛合次硫酸氢钠和焦亚硫酸钠（重量比3：2）抗氧剂和3.5克泊洛沙姆407水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计75%所述水溶液，加到50克α-吡咯烷酮和二甲基乙酰胺（体积比2：1）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入MgSO₄络合剂和20克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.2：1；在温度58℃下使用盐酸与乙醇胺调节剂将pH值调节至3.5，搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在这个温度下保温14分钟；再往其中加入0.02克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计25%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用所述pH调节剂将pH值调节至3.5，用注射用水将其总量补充至100mL，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌20分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液，其pH为3.5。

实施例4：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.80克亚硫酸氢钠和维生素C（重量比1：1）抗氧剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计70%所述水溶液，加到70克α-吡咯烷酮和聚乙二醇₂₀₀（体积比4：3）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入MgO络合剂和23克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.6：1；在温度60℃下使用盐酸与乙醇胺调节剂将pH值调节至4.0，搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在这个温度下保温8分钟；再往其中加入0.03克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计30%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用所述pH调节剂将pH值调节至4.2，用注射用水将其总量补充至100mL，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用蒸汽灭菌20分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液，其pH为4.2。

实施例5：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.4克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂和2.0克泊洛沙姆₁₈₈水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计62%所述水溶液，加到65克α-吡咯烷酮有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入MgCL₂·6H₂O络合剂和20克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.4：1；在温度62℃下使用盐酸或乙醇胺pH调节剂将pH值调节至4.6，搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在这个温度下保温10分钟；再往其中加入0.01克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计38%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用所述pH调节剂将pH值调节至4.0，用注射用水补充其总量至100mL，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌30分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液，其pH为4.0。

实施例6：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.65克焦亚硫酸钠和维生素C（重量比1：1）抗氧剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计74%所述水溶液，加到80克聚乙二醇₄₀₀和二甲基乙酰胺（体积比5：3）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入MgSO₄络合剂和15克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.5：1；在温度65℃下使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将pH值调节至5.6，搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在这个温度下保温18分钟；再往其中加入0.04克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计26%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用所述pH调节剂将pH值调节至4.5，用注射用水补充其总量至100mL，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用蒸汽灭菌20分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液，其pH为4.5。

实施例7：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.45克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂和3.0克聚乙烯吡咯烷酮PVPK₁₇水溶性高分子化合物稳定剂溶于以体积计70%所述注射用水中，得到一种水溶液，把所述水溶液加到50克α-吡咯烷酮和丙二醇（体积比4：1）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、在温度50℃下往步骤A得到的混合液中依次加入MgO络合剂和20克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.4：1；搅拌均匀；再使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将其pH值调节至3.8，直至得到一种黄色透明液体；

C、另取0.15克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂与0.02克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于余量30%注射用水，把其溶液加到步骤B得到的透明液体中，混匀后，降至室温，用所述pH调节剂将其pH值调节至4.0，用注射用水将其总量补充到100mL，有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌15分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液。

实施例8：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A将0.4克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂溶于以体积计65%所述注射用水，得到一种水溶液，把所述水溶液加到60克α-吡咯烷酮和丙二醇（体积比1：1）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B在温度55℃下往步骤A得到的混合液中依次加入MgO络合剂和20克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.5：1；搅拌均匀；再使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将其pH调节至4.8，直至得到一种黄色透明液体；

C另取0.3克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂与0.02克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于以体积计35%所述注射用水，把其溶液再加到步骤B得到的透明液体中，混匀后，降至室温，用所述pH调节剂将其pH值调节至4.0，再用注射用水将其总量补充到100mL，有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌15分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液。

实施例9：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A将0.25克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂溶于以体积计60%所述注射用水，得到一种水溶液，把所述水溶液加到75克α-吡咯烷酮和二甲基乙酰胺（体积比3.5：4）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B在温度55℃下往步骤A得到的混合液中依次加入MgO络合剂和20克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.0：1；搅拌均匀；再使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将其pH调节至4.5，直至得到一种黄色透明液体；

C另取0.25克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂与0.02克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于以体积计40%所述注射用水，把其溶液再加到步骤B得到的透明液体中，混匀后，降至室温，用所述pH调节剂将其pH值调节至3.9，再用注射用水将其总量补充到100mL，有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌15分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液。

实施例10：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.29克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂、4.0克泊洛沙姆₁₈₈水溶性高分子化合物稳定剂溶于以体积计75%所述注射用水，得到一种水溶液，再把所述的水溶液加到48克α-吡咯烷酮有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、然后，在温度58℃下往步骤A得到的混合液中依次加入MgCL₂·6H₂O络合剂和15克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.6：1；搅拌均匀；再使用盐酸与乙醇胺pH调节剂将其pH调节至3.5，直至反应体系呈黄色透明；

C、另取0.16克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂与0.01克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于以体积计25%所述注射用水，把其溶液再加到步骤B得到的透明液体中，混匀后，再用所述的pH调节剂将pH值调节至3.8，用注射用水将其总量补充到100ml，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用蒸汽灭菌20分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液。

实施例11：制备兽用盐酸多西环素注射液

其实施步骤如下：

A、将0.4克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂溶于以体积计50%所述注射用水，得到一种水溶液，再把所述的水溶液加到76克聚乙二醇400和二甲基乙酰胺（体积比5：2.6）复合有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、然后，在温度62℃下往步骤A得到的混合液中依次加入MgSO₄络合剂和22克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.2：1；搅拌均匀；再使用所述的pH调节剂将其pH值调节至5.0，直至反应体系呈黄色透明；

C、另取0.4克甲醛合次硫酸氢钠抗氧剂和0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于以体积计50%所述注射用水，把其溶液再加到在步骤B得到的透明液体中，混匀后再使用所述的pH调节剂将pH值调节至4.5，用注射用水将其总量补充到100ml，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在3%以下，然后用流通蒸汽灭菌30分钟，得到本发明的兽用盐酸多西环素注射液。

试验实施例

试验实施例1：反应温度试验

试验样品：实施例1~11制备的盐酸多西环素注射液

在30℃-80℃之间设置不同反应温度，观察不同温度下药物溶解情况，以确定最佳反应温度。

结果：温度在50~70℃之间溶解效果可行，低于40℃，药物络合溶解效果不好；高于70℃，药液颜色易加深，其最佳反应温度为50~65℃。

试验实施例2：pH值的影响

试验样品：A：实施例7制备的20%盐酸多西环素注射液；

B：实施例8制备的20%盐酸多西环素注射液；

C：实施例9制备的20%盐酸多西环素注射液；

按实施例7、8、9配制样品，在pH2.5~8.0范围内，调节药液至不同设置值，分别灌装不同pH值条件下的样品，置于温度60℃的条件下分别考察10天，测定其含量，并与0天测定数据进行比较，确定pH值范围。

结果：三个样品均在pH3.0以下和pH6.0以上含量和色泽等指标变化较大，故该注射液pH调节范围控制在3.0~6.0之间。

试验实施例3：抗氧剂比较试验

采用本发明的两种方法配制盐酸多西环素注射液，其中抗氧剂和EDTA-2Na金属离子螯合剂分别以单一抗氧剂方式和抗氧剂与EDTA-2Na组合两种方式加入，过滤灌装至10ml棕色西林瓶中，分别于60℃和40℃条件下考察10天和6个月，比较外观变化和抗氧剂效果。结果见表1。

表1：抗氧剂比较试验结果

表1结果表明：抗氧剂与金属离子螯合剂EDTA-2Na组合应用比抗氧剂单独使用效果明显增强。

试验实施例4：残氧量的影响

样品：实施例1~11制备的盐酸多西环素注射液

包装：10mL棕色西林瓶石家庄三元药玻有限公司

氧气气体分析仪：GSM希仕代仪器贸易有限公司

实施例7~9制备的样品分灌装前后不充氮和灌装前后充氮两种条件，充氮以手工控制充气时间长短得到不同残氧量数值，以不同残氧量数值的样品分批做好标记，在100℃条件下灭菌30分钟，以色泽变化为考察指标，观察抗氧化效果。

结果：未充氮气和测定残氧量在5%以上的样品，灭菌后均有明显变色或色泽加深现象，而残氧量在3%以下的样品变化较小或几乎不变色，因此，产品中残氧量控制在3%以下为宜。

试验实施例5：高温稳定性试验

试验样品：实施例7~9（A、B、C）制备的20%盐酸多西环素注射液。

检测方法：HPLC法；参照《兽药国家标准兽药地方标准上升国家标准第九册》

试验方法：将样品置60℃恒温条件下考察10天，分别于0、5、10天取样，检测下列各项指标：（1）色泽、（2）澄明度、（3）pH值、无菌检查、（4）多西环素含量

试验结果见表2

表2盐酸多西环素注射液高温试验结果

表2的结果表明：本品在60℃条件下考察10天，三个样品的含量在第10天测定与0天样品比较略有下降，但无明显差异，各项指标符合规定，稳定性良好。

试验实施例6：长期稳定性试验

试验方法：将样品置25±2℃、相对湿度55±5%条件下考察6个月，分别于0、3、6、9、12个月取样，检测下列各项指标：（1）色泽、（2）澄明度、（3）pH值、无菌检查、（4）多西环素含量。

试验结果见表5。

表5：盐酸多西环素注射液长期试验结果

表5的结果表明：三个样品各项指标均无明显差异，稳定性良好。

动物试验

一、安全性试验：本发明注射液给药部位肌肉刺激性试验

试验药物：采用实施例7及实施例8制备的注射液

试验动物：选用健康的大耳白家兔6只，雌雄各半随机分成2组，分别称重，体重2.56±0.06kg；

给药剂量：为靶动物临床给药剂量的2倍，折合为家兔的等效剂量，即20mg/kg·b·w（以多西环素计）。

试验方法：依据卫生部化学药物刺激性研究技术指导原则，设置生理盐水对照和采用同体左右侧自身对比法进行试验。以无菌操作方法分别在每只兔子上述处理的正方形中心肌肉处注射同等剂量的受试药和生理盐水。注射后连续7日每日肉眼观察动物的一般状况、行为、体征及给药局部反应(颜色、红斑、水肿、充血程度及范围),有无全身毒性反应等。在注射2日后宰杀第1组的3只家兔，7日后宰杀第2组的3只家兔，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应并剖解，按指标计算相应的反应级数。

试验结果：试验期间，家兔状况良好，未见明显异常。注射后对照组与给药组动物食欲、饮欲、四肢运动均正常；注射部位未见明显充血、红肿等反应；注射部位进行解剖，肉眼均未见明显刺激反应，反应级数为零级。20%盐酸多西环素注射液对动物肌肉无明显刺激性，符合安全用药标准。

二、靶动物药动学试验：

(1)试验药品:实施例7与实施例8制备的20%盐酸多西环素注射液

(2)试验动物：健康猪，体重约30~50Kg；试验前正常饲喂观察7~10天，选临床观察健康者。

(3)动物分组给药，采用分组交叉试验法；随机分成2组，每组4只，称重，分别肌注试验药物；给药剂量为10mg/Kg b.w。

（4）血样采集，前腔静脉采血，给药前采1次空白血样。试验药物给药后，分别于10、15、20、30、45min及1、2、4、8、12、24、36、48、60、72h采血，每次采集静脉血样约5mL,至于含有肝素的离心管中，混匀，3000r/min，离心10min，分离血浆，-20℃保存。

（5）血浆样品前处理，血浆自然解冻，摇匀,吸取1.0mL,置于50mL离心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液9mL,蜗旋混匀，15000r/min离心5min，转移上清液于另一离心管内，HLB固相萃取柱净化，甲醇-乙酸乙酯溶液洗脱，洗脱液经氮气吹干后，用20%乙腈水溶液溶解，混匀，过滤膜后上UPLC测定。

（6）测定：UPLC法条件

色谱柱：C₁₈2.1×50mm,1.7μm；流速：0.6mL/min；进样量：5μL;柱温：20℃；

流动相：0.3%甲酸乙腈溶液-0.3%甲酸水溶液（18：82）

（7）数据处理

以标准曲线法计算血浆中多西环素的浓度，采用3P97药物动力学程序软件在微机上进行曲线拟合，根据AIC值判断最适合药物动力学模型，计算药动学参数。

(8)试验结果

血浆中多西环素标准曲线在25~4000μg/L浓度范围内呈良好线性关系（r=0.9998）；血浆中添加多西环素25、250、2000μg/L三个不同浓度的平均回收率分别为85.7%、90.7%和102%，批内、批间变异系数符合要求。

药代动力学参数：两个样品消除相半衰期T _1/2β分别为(38.99±10.41)h和（33.71±6.62）h；T_max分别为(0.87±0.50)h和（1.021±0.595）h；C_max分别为(2.97±2.73)和（2.352±0.935）μg/mL，药时曲线下面积AUC分别为(31.9±15.8)(μg/mL)·h和（33.988±9.272）（见表6）。

表6：肌注20%盐酸多西环素注射液药代动力学参数（n=8）

表6结果表明，该制剂在猪体内吸收快，达峰时间短，分布和消除缓慢。

（9）结论多西环素属于长效广谱半合成抗生素，脂溶性大，半衰期长（约为10~20h）。通过本发明的制剂技术进一步延长了药物在体内的作用时间，以10mg/kg的剂量给药，可1~2天给药一次，减少了给药次数和使用量，提高了治疗效果和效率，在兽医临床上将有广阔的应用前景。

Claims

1.一种兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的注射液每100ml含有：

以多西环素计的盐酸多西环素 15~25克；

镁离子化合物络合剂，它与多西环素的摩尔比为 1.0~1.8：1；

抗氧剂 0.25~1.0克；

EDTA-2Na金属离子螯合剂 1 0.01~0.05克；

水溶性高分子化合物稳定剂 1.0~5.0克；

有机溶剂 45~80克；

pH值 3.0-5.0；

残氧量，以所述注射液总体积计 <3%；

注射用水，它的量为使所述注射液总量达到100ml的量。

2.根据权利要求1所述的兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的注射液每100ml含有：

以多西环素计的盐酸多西环素 18~22克；

镁离子化合物络合剂，它与多西环素的摩尔比为1.0~1.6：1；

抗氧剂 0.3~0.8克；

EDTA-2Na金属离子螯合剂 0.02~0.05克；

水溶性高分子化合物稳定剂 2.0~4.0克；

有机溶剂 50~70克；

pH值 3.9-4.5；

残氧量，以所述注射液总体积计＜1%；

注射用水，它的量为使所述注射液总量达到100ml的量。

3.根据权利要求1或2所述的兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的抗氧剂是一种或两种选自甲醛合次硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C的抗氧剂。

4.根据权利要求1或2所述的兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的镁离子化合物络合剂是MgCL₂·6H₂O、MgO或MgSO₄。

5.根据权利要求1或2所述的兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的有机溶剂是一种或两种选自α-吡咯烷酮、丙二醇、二甲基乙酰胺、聚乙二醇₄₀₀和聚乙二醇₂₀₀的有机溶剂。

6.根据权利要求1或2所述的兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的水溶性高分子化合物稳定剂是聚乙烯吡咯烷酮PVPK₁₇、聚乙烯吡咯烷酮PVPK₃₀、泊洛沙姆₁₈₈或泊洛沙姆₄₀₇。

7.根据权利要求1或2所述的兽用盐酸多西环素注射液，其特征在于所述的pH调节剂是盐酸和/或乙醇胺。

8.一种权利要求1或2所述兽用盐酸多西环素注射液的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤如下：

A、将0.25~1.0克抗氧剂和1.0~5.0克水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，或者将0.25~1.0克抗氧剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计60~75%所述水溶液，加到45~80克有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、往步骤A得到的混合液中依次加入镁离子化合物络合剂和15~25克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.0~1.8：1；然后在温度50~65℃下用pH调节剂将其混合液的pH值调节至3.0-6.0，接着搅拌直至得到一种黄色透明液体；

C、然后，在温度50~65℃下保温5~20分钟；再往其中加入0.01~0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计25~40%步骤A的水溶液，溶解混匀后再使用pH调节剂将其pH值调节至3.0~5.0；接着用注射用水加至总量100mL，进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在以所述注射液体积计3%以下，然后用流通流通蒸汽灭菌，得到所述的兽用盐酸多西环素注射液。

9.一种权利要求1或3所述兽用盐酸多西环素注射液的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤如下：

A、将0.25~1.0克抗氧剂的50-75%单独或与1.0~5.0克水溶性高分子化合物稳定剂一起溶于以体积计50~75%所述注射用水中，得到一种水溶液，再把所述的水溶液加到45~80克有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

B、然后，在温度50~65℃下往步骤A得到的混合液中依次加入镁离子化合物络合剂和15~25克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.0~1.8：1；搅拌均匀；再用pH调节剂将其pH调节至3.0~6.0，直至反应体系呈黄色透明；

C、另取余下的抗氧剂与0.01~0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂溶于余下一部分注射用水中，把其溶液再加到步骤B的反应体系里，混匀后，用pH调节剂将其pH值调节至3.0~5.0，再用注射用水将其总量补充到100ml，接着进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在以所述注射液体积计3%以下，然后用蒸汽灭菌，得到所述的兽用盐酸多西环素注射液。