CN102725409B - 细胞编程和重编程 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及将一种或多种体细胞例如部分分化或完全/终末分化的体细胞重编程到分化较低的状态例如多能或多潜能状态的方法。在其他实施方案中，本发明还涉及通过本发明的方法产生的重编程的体细胞、包含本发明的重编程体细胞的嵌合动物、所述细胞的使用以及可用于重编程体细胞的药剂的鉴定方法。
Description
相关申请
本申请要求2008年6月13日提交的美国临时申请No.61/061,525和2008年6月30日提交的美国临时申请No.61/077,068的优先权。这些申请的全部教导内容在此引为参考。
政府支持
本发明全部或部分得到国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的资助5-RO1-HD045022、5-R37-CA084198和5-RO1-CA087869的支持。政府在本发明中具有一定权利。
发明背景
胚胎发育和细胞分化被认为是单方向途径，因为在细胞命运特化过程中细胞经历了发育潜能的逐步丧失。到目前为止，已知有两类多能干细胞：胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。胚胎干细胞是直接来自于胚胎的多能干细胞。胚胎生殖细胞是直接来自于流产胎儿的胚胎组织的多能干细胞。为了简化，胚胎干细胞和胚胎生殖细胞在本文中将合称为“ES”细胞。
通过核移植(NT)产生活动物，证实了体细胞、包括终末分化细胞的表观遗传状态是不稳定的，并且可以被重置成能够指导新生物体发育的胚胎状态。核克隆技术对于移植医学具有潜在价值，但是任何医学应用均受到克隆过程的低效率、对根本机制缺乏了解和伦理学担忧的阻碍。解决这些问题的一个重要突破是Yamanaka通过异位表达四个转录因子Oct4、Sox2、c-myc和Klf4(在后文中称为“重编程因子”或“因子”)，体外衍生了重编程的体细胞(被命名为“诱导的多能干”细胞或“iPS”细胞)(Takahashi和Yamanaka，Cell126：663-676(2006))。
通过建立用于重编程人类体细胞的稳固方法并确定用于操作人类ES和iPS细胞的有效方案，将推动重编程领域的进一步进步。
发明概要
总的来说，本发明涉及使分化的体细胞去分化；产生次级iPS细胞的方法和通过所述方法产生的次级iPS细胞；从所述次级iPS细胞产生的嵌合动物例如小鼠；以及利用次级iPS细胞和嵌合动物筛选重编程剂的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及使分化的体细胞重编程到多能状态的方法，所述方法包括下列步骤：将分化的体细胞与至少一种有助于所述细胞重编程到多能状态的重编程剂相接触；将所述细胞在适合于细胞增殖和至少一种重编程剂的活性的条件下维持足以开始细胞的重编程的一段时间；以及功能性失活所述至少一种重编程剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及使分化的体细胞重编程到多能状态的方法，所述方法包括下列步骤：提供含有至少一种外源导入的、有助于所述细胞重编程到多能状态的因子的分化的体细胞；将所述细胞在适合于细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以活化至少一种内源多能性基因的一段时间；以及功能性失活所述至少一种外源导入因子。
在其他实施方案中，本发明涉及筛选已被重编程到多能状态的分化的体细胞的方法，所述方法包含下列步骤：提供含有至少一种外源导入的、有助于细胞重编程到多能状态的因子的分化的体细胞；将所述细胞在适合于细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以活化至少一种内源多能性基因的一段时间；功能性失活所述至少一种外源导入因子；以及区分或辨别表现出多能性的一种或多种标志物的细胞和不表现它们的细胞。在一个实施方案中，区分或辨别表现出多能性的一种或多种标志物的细胞和不表现它们的细胞，包含选择或富集表现出多能性的一种或多种标志物的细胞，和/或选择掉不表现出多能性的一种或多种标志物的细胞。
在本发明的某些实施方案中，分化的体细胞是部分分化的。在本发明的其他实施方案中，分化的体细胞是完全分化的。
在本发明的某些实施方案中，分化的体细胞是造血谱系的细胞或是间充质干细胞；在某些实施方案中，分化的体细胞从外周血获得。在本发明的一个实施方案中，分化的体细胞是免疫系统细胞。在一个实施方案中，分化的体细胞是巨噬细胞。在一个实施方案中，分化的体细胞是淋巴样细胞。在本发明的其他实施方案中，分化的体细胞是B细胞，例如未成熟的(例如B-细胞原或前B-细胞)或成熟的(例如接触过抗原的)B-细胞。在还有的其他实施方案中，分化的细胞是神经祖细胞、肾上腺细胞、角化细胞、肌肉细胞或肠上皮细胞。
在本发明的某些实施方案中，所述至少一种外源导入因子是多核苷酸。在其他实施方案中，所述至少一种外源导入因子是多肽。在一个实施方案中，所述至少一种外源导入因子选自Oct4、Sox2、Klf-4、Nanog、Lin28、c-Myc及其组合。在本发明的具体实施方案中，分化的体细胞包含外源导入的Oct4、Sox2和Klf-4外源导入的Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc。
在本发明的一个实施方案中，所述至少一种外源导入因子选自Oct4、Sox2、Klf-4、c-Myc及其组合，并且分化的体细胞还包含至少一种能够诱导分化的体细胞去分化的外源导入因子(例如多核苷酸或多肽)。在某些实施方案中，能够诱导所述分化的体细胞去分化的因子选自至少一种下调B细胞晚期特异性标志物的多核苷酸、至少一种抑制Pax5表达的多核苷酸、至少一种下调B细胞晚期特异性标志物的多肽、至少一种抑制Pax5表达的多肽，及其组合。在本发明的一个实施方案中，能够诱导所述分化的体细胞去分化的因子是C/EBPα或C/EBPα的人类同系物。
在本发明的具体实施方案中，使用载体例如诱导型载体或条件表达型载体导入所述至少一种外源导入因子。在一种情况下，使用不进行甲基化介导的沉默的载体导入所述至少一种外源导入因子。在另一个实施方案中，使用病毒载体例如反转录病毒载体或慢病毒载体导入所述至少一种外源导入因子。
本发明还提供了用于产生克隆动物的方法。在该方法中，从具有所需特征的动物分离体细胞，并使用本发明的方法重编程以产生一种或多种重编程的多能体细胞(“RPSC”)。然后将RPSC插入到受体胚胎中，并将得到的胚胎培养以产生大小适合于移植到雌性受体中的胚胎，然后将其转移到雌性受体中以产生怀孕的雌性。将怀孕的雌性维持在适合将胚胎怀到足月的条件下，以产生嵌合动物后代。根据需要，嵌合动物可以进一步与野生型动物交配。本发明还涉及通过本发明的方法产生的嵌合动物，例如嵌合小鼠。
本发明还涉及通过下述方法产生的分离的多能细胞，所述方法包含(a)提供分化的体细胞，所述细胞含有至少一种有助于所述细胞重编程到多能状态的外源导入因子；(b)将所述细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以活化至少一种内源多能性基因的一段时间；(c)使所述至少一种外源导入因子功能性失活；以及(d)将表现出多能性的一种或多种标志物的细胞与不表现标志物的细胞区分开。
本发明还涉及纯化的体细胞群，其包含至少70％的源自下述方法产生的重编程的分化体细胞的多能细胞，所述方法包含(a)提供分化的体细胞，所述细胞含有至少一种有助于所述细胞重编程到多能状态的外源导入因子；(b)将所述细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以开始所述细胞的重编程或活化至少一种内源多能性基因的一段时间；(c)使所述至少一种外源导入因子功能性失活；以及(d)将表现出多能性的一种或多种标志物的细胞与不表现标志物的细胞区分开。
另一方面，本发明涉及从体细胞生产多能细胞的方法，所述方法包含下列步骤：(a)提供一种或多种体细胞，其各自含有至少一种有助于所述细胞重编程到多能状态的外源导入因子，其中所述外源导入因子使用不进行甲基化诱导的沉默的诱导型载体导入；(b)将所述一种或多种细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以开始所述细胞的重编程或活化至少一种内源多能性基因的一段时间；(c)使所述至少一种外源导入因子功能性失活；(d)筛选表现出多能性标志物的一种或多种细胞；(e)利用表现出多能性标志物的所述一种或多种细胞产生嵌合胚胎；(f)从所述嵌合胚胎获得一种或多种体细胞；(g)将所述一种或多种体细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以开始所述细胞的重编程或活化至少一种内源多能性基因的一段时间；以及(h)将表现出多能性的一种或多种标志物的细胞与不表现标志物的细胞区分开。在具体实施方案中，方法产生了纯化的体细胞群，其包含至少70％的源自于重编程的分化体细胞的多能细胞。
本发明还涉及通过下述方法产生的分离的多能细胞：(a)提供一种或多种体细胞，其各自含有至少一种有助于所述细胞重编程到多能状态的外源导入因子，其中所述外源导入因子使用不进行甲基化诱导的沉默的诱导型载体导入；(b)将所述一种或多种细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以开始所述细胞的重编程或活化至少一种内源多能性基因的一段时间；(c)使所述至少一种外源导入因子功能性失活；(d)筛选表现出多能性的标志物的一种或多种细胞；(e)利用表现出多能性的标志物的所述一种或多种细胞产生嵌合胚胎；(f)从所述嵌合胚胎获得一种或多种体细胞；(g)将所述一种或多种体细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以活化至少一种内源多能性基因的一段时间；以及(h)将表现出多能性的一种或多种标志物的细胞与不表现标志物的细胞区分开。
在本发明的优选实施方案中，方法产生了纯化的体细胞群，其包含至少70％(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％)的源自于重编程的分化体细胞的多能细胞。在具体实施方案中，多能细胞是遗传上同质的。
本发明还涉及鉴定重编程剂的方法，所述方法包含(a)提供一种或多种体细胞，其各自含有至少一种有助于所述细胞重编程到多能状态的外源导入因子，其中每种所述外源导入因子的每一种都使用不进行甲基化诱导的沉默并且其表达受到由不同诱导物诱导的调控元件控制的诱导型载体导入；(b)将所述一种或多种细胞在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下维持足以使所述细胞进行重编程或活化至少一种内源多能性基因的一段时间；(c)使所述至少一种外源导入因子功能性失活；(d)筛选表现出多能性的标志物的一种或多种细胞；(e)利用表现出多能性的标志物的所述一种或多种细胞产生嵌合胚胎；(f)从所述嵌合胚胎获得一种或多种体细胞；(g)将所述一种或多种体细胞维持在适合于所述细胞增殖和所述至少一种外源导入因子的活性的条件下，其中所述至少一种外源导入因子的活性本身不足以活化至少一种内源多能性基因；(h)将(g)的体细胞与一种或多种候选重编程剂接触；以及(i)鉴定与所述一种或多种候选重编程剂接触过的、表现出多能性的一种或多种标志物的细胞，其中诱导(g)的体细胞表现出多能性的一种或多种标志物的候选重编程剂，被鉴定为重编程剂。
本发明还涉及利用已知的诱导型启动子系统的方法。作为一个实例，包涵了诱导型载体，例如DOX和三苯氧胺诱导型慢病毒载体。DOX诱导型反转录病毒载体，对于确定小鼠体细胞重编程过程中多能性标志物的顺序活化和载体表达的最少时间是重要的。正如本文所述，我们产生了允许重编程因子的暂时受限表达的诱导型慢病毒载体。按照与用于鼠类基因相同的策略，我们产生了组成型或在DOX诱导型启动子控制之下转导人类OCT4、SOX2、KLF4和C-MYCc-DNA的慢病毒载体。为了产生DOX诱导型系统，我们用带有rtTA反式激活子的慢病毒载体感染人类成纤维细胞。
为了获得载体的独立的诱导型控制，我们还通过将因子与雌激素配体结合结构域融合，产生了OCT4、SOX2和C-MYC雌激素受体(ER)融合构建物，以允许三苯氧胺依赖性表达。向转导有SOX2-ER融合构建物的细胞添加三苯氧胺，导致SOX2蛋白从细胞质移位到核中，正如对于药物诱导的活化所预期的。这些结果显示DOX和ER融合诱导型系统可用于独立地控制被转导的因子的表达。
本发明的一个实施方案涉及多个、例如两个不同的可调控系统的应用，每个系统控制部分因子的表达。例如，人们可以将3种因子置于第一个诱导型(例如dox诱导型)启动子的控制之下，并将第四个因子置于第二个诱导型(例如三苯氧胺诱导型)启动子的控制之下。然后，人们可以通过从这两个启动子诱导表达来产生iPS细胞，从该iPS细胞产生小鼠，并从小鼠分离成纤维细胞(或任何其他细胞类型)。这些成纤维细胞将是遗传上同质的，并且不需要病毒感染即可重编程。然后人们可以尝试在只有第一个启动子有活性的条件下，在可能能够代替第四种因子的不同小分子的存在下，重编程成纤维细胞，以便鉴定小分子“重编程剂”，或优化瞬时转染或其他用于导入第四种因子的方案。许多变化形式是可能的；例如，人们可以稳定地诱导3种因子的表达，并瞬时诱导第四种因子的表达等。使用所述方法可以评估因子的任何组合。此外，人们可以通过使用不同浓度的诱导剂调节因子的表达水平。
另一种途径是将编码一种因子的基因置于重组酶位点之间，然后诱导重组酶的表达以关闭该因子的表达。例如，可以将异源序列放置在启动子与编码序列之间，其中异源序列位于重组酶位点之间；异源序列阻止表达。将重组酶导入细胞(例如通过导入编码重组酶的表达载体，例如腺病毒-Cre)，引起异源序列的切除，从而允许转基因的表达。此外，转基因可以整合在各种不同的非必需基因座中(例如其破坏不显著影响发育的基因座，例如胶原蛋白I或Rosa26基因座)。
这些系统可用于例如鉴定重编程剂以及研究在重编程中的必要条件和发生的事件(包括发现细胞类型特异性差异)。
附图简述
图1A-1D显示了用于表观遗传重编程的遗传同质的细胞培养物的产生。图1A显示了用编码4种重编程因子的dox诱导型慢病毒感染嘌呤霉素抗性的、表达反四环素反式激活因子(M2rtTA)的Nanog-GFP或Nanog-neo初级MEF，然后诱导重编程、进行初级iPS集落筛选、dox撤回、嵌合体形成以及用嘌呤霉素筛选iPS衍生的次级体细胞的方案。图1B示出了从经历了完全表观遗传重编程的嵌合体分离NNeo次级MEF。不依赖于Dox的培养物表达与多能性相关的基因碱性磷酸酶、SSEA1和Nanog。图1C显示了MEF衍生的NNeo和NGFP2次级iPS细胞在畸胎瘤形成分析中产生所有三个胚层的细胞，并且当被注射到囊胚中时，有助于嵌合体形成，正如在黑色背景上存在iPS衍生的深浅环纹毛皮颜色所显示的(图1D)。
图2A-2E显示了在来自不同iPS细胞系的MEF之间重编程动力学和效率的变化。正如图2A中所示，将来自三种“初级”iPS细胞系的次级MEF用dox处理，并目测监测重编程。在dox给药后6天，不同MEF群表现出形态差异，但是在12天内都形成具有ES细胞形态的集落(箭号)。图2B显示了当早在dox诱导后第4天向培养基加入药物时，在NNeo培养物中出现新霉素抗性和碱性磷酸酶阳性的集落。图2C显示了在18天的dox培养过程中，SSEA1和Nanog-GFP报告等位基因(在NGFP2和NGFP3细胞系中)的重新活化的流式细胞术分析。如图2D中所示，将次级NGFP2MEF以0.025-500个细胞/mm2的不同密度铺板，然后添加dox。在4周后对GFP+集落进行计数。正如在图2E中所示，将单一次级MEF铺在含有γ-射线辐照过的MEF饲养细胞层的96孔板中，然后进行dox诱导。在4周后对能够增殖到足以在MEF饲养细胞层上形成可见集落的单细胞的百分数(浅灰色条)以及能够形成GFP+或Neo抗性的次级iPS集落的单细胞的百分率(深灰色条)进行计数。
图3A-3F显示了4种因子的转基因在次级MEF中的必要条件和表达。图3A显示了定量RT-PCR，检测了相对于Gapdh的水平，4种重编程因子对72小时的dox处理做出响应而表达的诱导。图3B显示了dox诱导后72小时在次级MEF培养物中Oct4和Sox2的免疫荧光检测。正如图3C中所示，将NGFP2次级MEF在dox存在下培养指定时间(5-22天，红色条)，然后撤回dox。每日监测培养物以发现GFP活化的第一次出现(绿色条)。蓝色条显示了在dox处理过程中出现GFP+集落的时间段。图3D显示了将NGFP2MEF在dox存在下培养10-15天，在这时撤回dox，并在第34天对GFP+集落进行计数。正如在图3E中所示，将NGFP2MEF在dox存在下培养9天(蓝色线)或22天(红色线)，并且每天对GFP+集落的出现进行计数直到第29天。注意到GFP阳性集落迟至dox撤回后15天才出现(蓝色线)。正如图3F中所示，将NGFP3次级MEF在存在或不存在dox、dox+5-Aza或dox+TSA的情况下培养，在3周后对GFP+集落进行计数。
图4A-4N显示了肠上皮细胞的重编程。如图4A中所示，从嵌合体分离NNeo次级肠上皮隐窝-绒毛结构，并且在存在dox下培养24小时后，在悬液中开始出现球状体(图4B，插图)。图4C显示了在dox培养72小时内，悬浮的球状体附着于γ-射线辐照过的饲养细胞层，并呈现出ES样形态。如图4D中所示，在两周的dox处理过程中集落继续生长，但是在dox撤回后分化并变得不可与饲养细胞层区分(图4E)。图4F显示了在dox给药后两周，sox依赖性的肠上皮集落是新霉素抗性的。图4G显示了在用Sox2和Klf4病毒感染后，在新鲜分离的NNeo次级肠上皮、部分重编程的dox依赖性细胞、完全重编程的NNeoiPS细胞中进行的内源Oct4和Nanog启动子的亚硫酸氢盐测序。如图4H中所示，4种因子和Nanog的表达的qRT-PCR分析显示，dox依赖性NNeo肠上皮集落与ES细胞相比表达高水平的Oct4和cMyc，但是表达非常少量的Sox2和Klf4。图4I显示了在添加dox的24小时内，NGFP2次级肠上皮细胞在悬液中形成球状体，并在72小时内呈现出ES样形态(图4J)。图4K和4L显示NGFP2肠上皮产生dox不依赖性的次级iPS集落，其从内源Nanog基因座表达GFP。如图4M中所示，基于EDTA-DTT将肠绒毛分级成从末梢的分化细胞(级份1)到隐窝的祖细胞(级份7)28，然后进行4天的dox诱导，证明了NNeo和NGFP2次级细胞系二者中的隐窝级份在初始集落形成中更加有效。如图4N中所示，qRT-PCR分析显示除了Klf4之外，其他转基因在NNeo和NGFP2肠上皮细胞的级份7(隐窝)中比在级份1(绒毛尖端)中被更有效地诱导。
图5A-5L显示了其他体细胞类型的重编程。图5A和5B显示了在dox给药三周之前和之后的NNeo间充质干细胞(MSC)。图5C和5D显示了dox处理之前的NGFP2MSC和处理10天之后形成ES样集落。图5E和5F显示出NGFP2MSC产生dox不依赖性iPS集落，其从内源Nanog基因座表达GFP。如图5G中所示，来自具有典型上皮形态的NNeo嵌合体的皮肤角化细胞的集落(插图)在dox处理12天内开始表现出ES细胞的形态(图5H)。这些细胞被完全重编程以形成新霉素抗性的次级iPS集落(图5I)。如图5J中所示，在无血清培养基中扩增后，铺板的NNeo衍生的神经球容易对含dox和血清的ES细胞培养基做出响应分化成星型细胞。当将铺板的神经球细胞在粘附条件下用EGF和FGF2继续扩增3周并然后暴露于含dox的培养基时，在ES细胞(图5K)和无血清培养基(图5L)中都出现了iPS细胞样集落。
图6显示了完全重编程的NGFP2次级MEF重新活化内源Nanog基因座，表达Oct4、AP和SSEA1，并且能够在不存在dox下维持。
图7A-7C显示了附加分析。图7A显示了在对dox处理做出响应进行重编程的时间过程中，NGFP2MEF中内源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录本的qRT-PCR分析。还显示了在两个ES细胞RNA制备物(V6.5系)和NGFP2iPS细胞系中的表达水平。图7B显示了直接感染和次级系统之间iPS集落形成效率的实验间变异性的比较。在10cm平板上，将3x105个Oct4-neoMEF1用由基于Moloney的反转录病毒载体编码的4种因子进行感染，在第6天时开始新霉素筛选，并在第20天对抗性集落进行计数(左侧-直接感染)。将3x104个次级NGFP2MEF铺板在6孔皿中，暴露于含dox的培养基，并在3周后对GFP阳性集落进行计数(右侧-次级系统)。条显示了4个独立实验的每个中的集落数量。图7C显示了用Klf4、c-Myc、Sox2和Oct4cDNA探针对次级iPS细胞系NGFP3、NGFP2和NNeo进行的Southern分析。内源条带用箭号标出，原病毒插入片段用箭头标出，只有NNeo细胞系中的Oct4例外，其是靶向胶原蛋白I基因座的转基因。
图8A-8D显示：图8A显示了NGFP2次级尾梢成纤维细胞成功地重编程成dox不依赖性的GFP+iPS细胞。图8B显示出源自于NGFP2次级肠上皮的iPS细胞表达内源性Nanog和SSEA1。图8C显示出源自于NGFP2次级间充质干细胞的iPS细胞表达内源性Nanog和SSEA1。如图8D中所示，将带有位于Rosa26基因座处的反四环素反式激活子和Tet-操纵子16控制下的Oct4编码序列的初级间充质干细胞用编码Sox2、c-Myc和Klf4的病毒感染。向被感染的MSC添加dox，产生了完全重编程的、dox不依赖性的、表达内源Nanog蛋白(免疫荧光)的iPS细胞。
图9A-9G显示了源自于NNeo次级嵌合体的肾上腺(图9A)、肾脏(图9B)、肌肉(图9C)、角化细胞(图9D)和神经球(图9E)的细胞培养物的成功重编程，重编程的成功由dox不依赖性、新霉素抗性和Nanog表达(红色，免疫荧光)所确定。图9F显示了从NNeo嵌合体分离并在dox存在下培养8、10或12天并对碱性磷酸酶活性进行染色的次级肠上皮。如图9G中所示，在用附加的Sox2和Klf4病毒感染后，NNeo次级肠上皮细胞变成了dox不依赖性的iPS细胞。免疫荧光分析(红色，上排)显示了Oct4、Sox2、Nanog和SSEA1在完全重编程的细胞中的表达(蓝色，下排表示核DAPI染色)。
图10A-10D显示了GFP同源插入到OCT4基因座中。如图10A所示，将H9huES细胞用靶向OCT4基因座的3′UTR的GFP-puroR基因捕获载体进行电穿孔。通过Southern分析(图10B)所鉴定到的正确靶向克隆对GFP染色，在非分化时是puro抗性的(图10C、10D)，但是当分化时标志物和药物抗性基因被沉默(未显示)。
图11A-11B显示了可用DOX和三苯氧胺诱导的因子表达。正如图11A中所示，将人类成纤维细胞用带有可用DOX诱导的因子的慢病毒载体感染(Brambrink等，CellStemCell，Feb7，2(2)：151-159(2008))。当向培养物加入DOX时，通过qPCR进行的分析检测到了强的因子表达，而在不存在DOX的情况下如果有的话也只能看到很少的转录本。此外，源自于被感染的成纤维细胞的iPS细胞也显示出DOX依赖性表达(右边的两个图块)。正如在图11B中所示，将成纤维细胞用含有SOX2-ER融合构建物的载体进行感染。向培养基添加三苯氧胺导致细胞质蛋白向核移位，显示出药物依赖性的蛋白活化。
图12A-12C显示了从人类成纤维细胞产生iPS细胞。如图12A中所示，通过qPCR对OCT4和NANOG表达进行定量，并显示出它们在与对照huES细胞中的类似范围内。图12B显示了从成年人类成纤维细胞产生的iPS细胞的实例。人类iPS细胞形成紧密集落，并对SSEA4、TRA160和OCT4进行染色。图12C显示了在将iPS细胞注射到SCID小鼠中以后形成的具有分化的细胞类型的畸胎瘤。
图13A-13C显示了在通过多顺反子反转录病毒转导四种因子后，小鼠成纤维细胞的重编程。图13A显示了载体的示意图，所述载体带有各自被2A序列分离开的四种转录因子Sox2、Oct4、Klf4和c-myc，或3种或2种因子的各种不同组合。如图13B中所示，将成纤维细胞用图块上部显示的4因子多顺反子载体和单一Oct4病毒共感染。重编程的iPS细胞表达碱性磷酸酶(AP)、SSEA1、Nanog和Oct4。图13C显示了对3个独立的iPS系的原病毒整合的Southern印迹分析的结果。将DNA用在载体的PBS中切开一次(每个原病毒给出1条带)的Spel消化，并用Sox2、Klf4、c-myc和Oct4探针相继探测印迹。细胞系4FO#5和#9带有一个、细胞系4FO#14带有两个多顺反子载体(后者中的一个是截短的并已失去5′cMYC序列)。但是，使用Oct4探针的杂交显示出8到11个另外的Oct4原病毒。
图14A-14E显示了使用单个4F2A多顺反子病毒产生鼠类iPS细胞。图14A显示了通过瞬时转染测试的FUW慢病毒构建物(也在前面的图中显示过)。总共使用了4个2A肽(F2A、T2A、E2A和P2A)。图14B显示了293细胞用FUW2A慢病毒的瞬时转染。在48小时后收获细胞，并通过western印迹(WB)进行分析。在所有测试的构建物中观察到了有效的蛋白表达，表明四个独特的2A肽支持强有力的蛋白表达。注意：在ES细胞中没有检测到Sox2蛋白，这是因为只使用了短暴露。图14C显示了包含3种类型的2A肽(P2A、T2A和E2A)的4F2ADOX-诱导型慢病毒的示意图。鼠类的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA。因子和2A肽的这种特定序列在后文中被称为“4F2A”。图14D显示了在用OSKM4F2A+rtTA转导3天的细胞中mRNA诱导的RT-PCR分析。总的Oct4或Sox2诱导被用于测试与ES细胞相比的4F2A诱导水平。使用E2A-cMyc引物检测病毒特异性转录本。误差线表示三份平行反应的平均值的标准偏差。图14E显示了用4F2A+rtTA转导3天的MEF的Western印迹分析结果。用4F2ADOX诱导型慢病毒+rtTA感染的细胞在添加强力霉素DOX后产生所有四种重编程因子。
图15A-15C显示了4F2AiPS细胞表达多能性标志物。如图15A中所示，Oct4蛋白的免疫染色表明使用4F2A能够实现高滴度的感染。在用4F2A+rtTA转导后，将MEF在DOX培养基中培养2天。图15B显示了用4F2A+rtTA转导的NanogGFP-MEF在ES培养基+DOX中培养的形态变化。与用单一病毒感染的细胞相似，集落在～8天时出现。在第20天时除去DOX培养基后，到第25天时观察到NanogGFP+集落。两个列显示了在平板上观察到的典型集落。图15C显示了从Nanog-GFPMEF或14周的尾梢成纤维细胞(TTF)产生的4F2AiPS细胞系，其对多能性标志物AP、SSEA1、Oct4染色阳性，并已经重新活化了内源Nanog基因座(对于MEF来说GFP+，对于TTF来说通过免疫染色)。
图16A-16C显示了4F2AiPS细胞是多能的，并包含1-3个原病毒整合。图16A显示了4F2AMEF-iPS细胞系#1、2和4的体内分化。在皮下注射到SCID小鼠后诱导的畸胎瘤的组织学分析表明，iPS细胞系对所有三个胚层都有贡献。图16B显示了对出生后嵌合小鼠的中度到高度的贡献，正如通过来自4F2AiPS细胞系#4的深浅环纹毛皮颜色所检测到的。图16C显示了MEF-iPS细胞系#1-4中4F2A原病毒整合的Southern印迹分析的结果。将iPS细胞DNA用BamHI消化。使用所有四种探针对同样分子量片段的杂交表明存在4F2A原病毒。红色箭号突出了含有4F2A的一个原病毒拷贝的iPS细胞株#4。*表示内源等位基因。
图17A-17E显示了使用单个4F2A多顺反子病毒产生人类iPS细胞系。图17A显示了用4F2A(带有小鼠cDNA)+rtTA转导的新生人类包皮角化细胞(NHFK)。在第22天，挑出单个集落并扩增，产生类似hES集落的集落。将这些集落挑出并建立起稳定的hiPS细胞系。图17B显示了对多能性标志物AP、Oct4、Nanog、SSEA-4、Tral-60和Tral-81免疫染色的KerhiPS#1.1。DAPI染色在下方图块中。图17C显示出KerhiPS#1.1的核型是正常的46XY。图17D显示了KerhiPS#1.1的体内分化。由KerhiPS#1.1产生的畸胎瘤切片的苏木精和曙红染色。图17E显示了KerhiPS#1.1的体外分化。(左图)源自于Ker-iPS#1.1的神经元前体暴露于分化条件下6天产生了终末分化的神经元，正如通过抗Tuj1抗体免疫染色(绿色)所检测到的。(右图)Ker-iPS#1.1神经元前体(NP)经历了自发分化。NP通过抗Nestin抗体免疫染色检测，分化的神经元通过抗Tuj1抗体(红色)检测。在两张照片中DNA的DAPI染色都是蓝色。
图18A-18B显示了源自于MEF的iPS细胞系的Southern印迹和dox撤回，表明8天对于产生iPS细胞系是足够的。图18A显示了4F2AMEFiPS细胞系的Southern印迹分析。进行了第二次消化(XbaI)以证实原病毒的拷贝数。在该消化中，iPS细胞系#2和#4显示了1个原病毒拷贝，但是只有#4在两种消化中都具有1个原病毒拷贝。图18B显示了在将NanogGFPMEF用rtTA+OSKM感染后8天后撤回Dox，产生了两种iPS细胞系。这两种在1-2次传代后都产生稳定的iPS细胞系。
图19显示了在MEF中使用4F2A重编程的相对效率。将NanogGFPMEF用4F2A+rtTA感染，并在ES培养基(+/-DOX)中培养48小时。将细胞固定，并对Oct4蛋白进行染色。估算的感染效率是～70％。也使用同样的病毒感染0.25x106个NanogGFPMEF，并将细胞在DOX上培养20天。在第20天撤回DOX后，在第25天对GFP+集落进行计数，在三个板中观察到10、10和17个GFP+集落。
图20A-20B显示了源自于角化细胞的人类iPS细胞系的感染效率和多能性分析。图20A显示了在用4F2A+rtTA感染并在hES培养基+DOX中培养48小时的角化细胞中通过Oct4免疫染色检测到的两个实验的感染效率。基于Oct4蛋白阳性的细胞分数，感染的效率为～10-20％。图20B显示了对hES细胞中表达的多能性标志物染色阳性的人类iPS细胞系(显示的是KeriPS#3)。
图21A-21B显示了源自于角化细胞的人类iPS细胞系的原病毒拷贝数。图21A显示了Ker-iPS细胞系的Southern印迹分析。收获10mg基因组DNA并用XbaI消化。相同分子量片段的杂交表明存在4F2A原病毒。针对Sox2、Klf4和c-Myc的探针表明2个(#1.1)和1个(#3)原病毒拷贝。在两个iPS细胞系之间观察到的共同条带不是病毒整合，因为它们源自于独立的感染。图21B显示了Ker-iPS细胞系的Southern印迹分析。收获10mg基因组DNA并用BamHI消化。相同分子量片段的杂交表明存在4F2A原病毒。针对Oct4和c-Myc的探针表明3个(#1.1)和2个(#3)原病毒拷贝。
图22显示了用于在确定的基因组位置处产生带有单一多顺反子构建物的iPS细胞的策略。
图23A-23B显示了携带DOX诱导型载体、不需病毒转导即可重编程的次级成纤维细胞的产生。如图23A中所示，使用DOX诱导型载体以及带有tetrtTA反式激活子的载体将用所有四种因子转导在OCT4基因座中带有GFP的“初级”成纤维细胞，在DOX诱导后产生了“初级”iPS细胞。细胞在不存在DOX的情况下分化成“次级”成纤维细胞，其带有与允许初级iPS细胞产生的相同的载体组合。如图23B中所示，将次级成纤维细胞重编程到次级iPS细胞，只需要用DOX诱导原病毒而不需要用新的病毒进行感染。
图24显示了不需载体介导的因子转导即可进行的重编程。初级成纤维细胞从huES细胞产生，后者带有OCT4-GFP标志物、tet反式激活子M2rtTA和图13中描述的插入到COL1A1基因座中表达三种重编程因子(在本例中是OCT4、SOX2、cMYC)的DOX诱导型多顺反子构建物。将细胞用两侧具有2Lox位点(Ventura等，ProcNatlAcadSciUSA，Jul13；101(28)：10380-5(2004))的带有KF4cDNA的载体感染。DOX处理将产生初级iPS细胞，其在Cre表达后将删除KLF4载体。产生次级成纤维细胞，其在DOX处理后将允许筛选代替被缺失的KLF4因子的小分子。
图25显示了通过测试不同标志物对重编程效率进行定量的方案。将在OCT4基因座中带有GFP和puro标志物的细胞用3或4种因子转导。在感染后的不同时间，确定细胞群中药物抗性或GFP阳性集落的比例和对碱性磷酸酶(AP)、SSEA4、TRA61或Nanog染色的细胞的外观。
图26显示了使用具有可以被独立诱导的因子的次级成纤维细胞筛选小分子。将带有病毒M2rtTA和OCT4-GFP标志物的初级成纤维细胞使用转导3种因子的三苯氧胺诱导型载体和转导第四种因子(在这种情况下是cMYC)的DOX诱导型载体进行转导。通过在三苯氧胺和DOX中培养将产生初级iPS细胞，并将产生次级成纤维细胞。这些细胞当在三苯氧胺中培养时，可以筛选代替cMYC用于重编程到次级iPS细胞的小分子。
图27A-27C显示了从来自PD患者的成纤维细胞产生的DOX诱导型hiPSC的表征。图27A显示了hiPSC细胞系M3F-1(非PDhiPSC)、PDA3F-1、PDB3F-5、PDC3F-1，PDD3F-1和PDE3F-3的相差照片和对多能性标志物SSEA4、Tra-1-60、OCT4、SOX2和NANOG的免疫荧光染色。图28A显示了在独立的hiPSC细胞系、hESC和初级成纤维细胞中，内源多能性相关基因NANOG、OCT4和SOX2的重新活化的定量RT-PCR。将相对表达水平相对于这些基因在成纤维细胞中的表达进行归一化。图28C显示了OCT4启动子区域的甲基化分析。浅灰色方块标出hiPSCs和亲代初级成纤维细胞的OCT4启动子中未甲基化的CpG，黑色方块标出甲基化的CpG。
图28A-28C显示了源自于PD患者的hiPSC带有低拷贝数的病毒整合。图28A显示了从hiPSC细胞系A6(非PDhiPSC)、PDA3F-1、PDB3F-1、PDC3F-1，PDD3F-1和PDE3F-3产生的畸胎瘤切片的苏木精和曙红染色，显示了：最上一排图：着色的神经上皮；第二行图：神经菊形团；第三行图：肠上皮；第四行图：骨/软骨；最下一行图：平滑肌。图28B显示了hESC细胞系BG01、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞和所标出的源自PD患者的hiPSC(和非PDhiPSC细胞系M3F-1)对于XbaI消化的基因组DNA的原病毒整合的Southern印迹分析结果，使用了针对OCT4、KLF4、SOX2和c-MYC的32P-标记的DNA探针。图28C是一张表，概括了基于图28B中显示的Southern印迹分析，在hiPSC中四种重编程因子的原病毒整合的大概数量。
图29A-29C显示了使用loxP可切除重编程因子产生源自于PD患者的hiPSC。图29A是DOX诱导型慢病毒构建物FUW-tetO-loxP、原病毒整合后的基因组座位(2lox)和Cre重组酶介导的切除后的基因组座位(1lox)的示意图。FUW-TetO-loxP载体含有位于最小的CMV启动子的5’端的四环素响应元件(TRE)和用于诊断性Southern印迹消化的独特MfeI位点。重编程因子两侧带有EcoRI限制性位点。该慢病毒载体的3′LTR含有单一loxP位点，其在原病毒复制过程中复制到5′LTR中。该复制在原病毒的基因组整合后产生了两侧带有2个loxP位点的转基因(2lox)。这允许使用Cre-重组酶切除与完整的启动子序列组合的转基因(1lox)。(WRE＝Woodchuck响应元件)。图29B显示了hiPSC细胞系PDB2lox-17和PDB-21的相差照片和对多能性标志物SSEA4、Tra-1-60、OCT4、SOX2和NANOG的免疫荧光染色。PDB2lox-17和PDB2lox-21通过从图A中显示的FUW-tetO-loxP病毒表达三种重编程因子OCT4、SOX2和KLF4来衍生。在这些细胞中，所有三种重编程因子在它们的基因组整合位点的两侧带有loxP位点。图29C显示了从带有可切除的重编程因子的PDB2lox-17和PDB2lox-21细胞产生的畸胎瘤切片的苏木精和曙红染色。
图30A-30D显示了不含重编程因子的hiPSC的产生和表征。图30A是Cre介导的转基因切除以产生不含重编程因子的hiPSC的示意性纲要。使用转导3种重编程因子OCT4、KLF4和SOX2的FUW-tetO-loxP慢病毒载体产生了IPSPDB2lox细胞。图30B显示了在Cre重组酶介导的转基因切除后，亲代成纤维细胞(PDB)、携带原病毒的PDB2lox克隆(PDB2lox-17和PDB2lox-21)和所标出的PDB1lox克隆的原病毒整合的Southern印迹分析。Puro指示了PDB1lox克隆，其通过嘌呤霉素筛选而分离；GFP指示了通过对EGFP的FACS分拣而分离到的PDB1lox克隆(如30A中所示)。将基因组DNA用XbaI消化，并使用针对OCT4、KLF4和SOX2的32P-标记的DNA探针探测原病毒整合。因为根据图34中显示的MfeI消化，用蓝色标出的PDB1lox克隆仍有转基因整合，因此将其忽略。图30C显示了hiPSC细胞系PDB1lox-17Puro-5的细胞遗传学分析，并且PDB1lox-21Puro-12在Cre介导的转入基因切除后显示出正常核型。图30D概括了不含因子的hiPSC的产生。
图31A-31E显示了不含重编程因子的hiPSC的表征。图31A显示了不含重编程因子的hiPSC细胞系PDB1lox-17Puro-5和PDB1lox-21Puro-12的相差照片和对多能性标志物SSEA4、Tra-1-60、OCT4、SOX2和NANOG的免疫荧光染色。图31B显示了在hESC、成纤维细胞(PDB)、带有原病毒的PDB2lox克隆(PDB2lox-17和PDB2lox-21)和所指示的PDB1lox克隆中，在Cre重组酶介导的转基因切除后，内源多能性相关基因NANOG、OCT4和SOX2的重新活化的定量RT-PCR。将相对表达水平相对于这些基因在成纤维细胞中的表达进行归一化。图31C显示了从不含因子的PDB1lox-17puro-5和PDB1lox-21puro-26细胞产生的畸胎瘤切片的苏木精和曙红染色。图31D显示了在hESC(BG01)、初级成纤维细胞(PDB)、被感染的初级成纤维细胞(PDD3F+/-DOX)、hiPSC(M3F3-1)、PD来源的hiPSC(PDA3F-1、PDB3F-5、PDC3F-1、PDD3F-1、PDE3F-3)、带有原病毒的PDB2lox克隆(PDB2lox-17和PDB2lox-21)和不含重编程因子的PDB1lox克隆(PDB1lox-17Puro-5、PDB1lox-17Puro-31、PDB1lox-21Puro-12、PDB1lox-21Puro-20)中OCT4、KLF4和SOX2的残余转基因表达的定量RT-PCR。将相对表达水平相对于被感染的初级成纤维细胞中DOX诱导的表达进行归一化。图31E是Venn图，分别显示了带有原病毒的PDB2lox细胞系(PDB2lox-5、PDB2lox-17、PDB2lox-21、PDB2lox-22)之间与hESC(H9、BG01)相比，或不含重编程因子的PDB1lox细胞系(PDB1lox-17Puro-5、PDB1lox-17Puro-10、PDB1lox-21Puro-20、PDB1lox-21Puro-26)之间与hESC(H9、BG01)相比的差异表达基因的数量(p＜0.05，通过适中的t-检验确定，对假发现率进行校正)。
图32A-32D显示了在初次感染后，转基因表达8天足以重编程人类成纤维细胞。图32A显示了用4种重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-MYC转导的初级成纤维细胞(PDB)的免疫荧光染色。在DOX诱导的转基因表达后不同时间点(上图在第8天；下图在第10天)，将细胞固定并对NANOG(红色)和Tra-1-60(绿色)的表达进行染色。在8天以前或在没有用DOX处理的培养物中没有检测到NANOG/Tra-1-60阳性细胞。在所有较晚时间点(12、14、16、18、20天)染色的培养物中也可以检测到NANOG和Tra-1-60集落。图32B显示了对hiPSC克隆PDB4F-1和PDB3F-12d的多能性相关标志物SSEA4、TRA-1-60、OCT4、SOX2和NANOG的免疫荧光染色。为了确定转基因表达的时间要求，将初级成纤维细胞(PDB)用带有重编程因子的DOX诱导型慢病毒进行感染。转基因的表达通过添加DOX进行诱导。在不同时间点，将培养基改变成不含DOX的hESC培养基，并在最初添加DOX后24小时时分离iPSC。左图显示了从用四种重编程因子转导并在DOX下暴露8天的培养物分离的hiPSC克隆PDB4F-1。右图显示了从用三种重编程因子转导并在DOX下暴露12天的培养物分离的hiPSC克隆PDB3F-12d。图32C显示了在下列细胞系中内源多能性相关基因NANOG、OCT4和SOX2的重新活化的定量RT-PCR：hiPSC细胞系PDB4F-1和PDB4F-2、D4、A6、hESC和初级成纤维细胞。将相对表达水平相对于这些基因在成纤维细胞中的表达进行归一化。PDB4F-1和PDB4F-2iPSC在四种重编程因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的转基因表达8天后进行分离。图32D显示了从hiPSC细胞系PDB3F-12d和PDB4F-2产生的畸胎瘤切片的苏木精和曙红染色。PDB3F-12d通过三种重编程因子OCT4、SOX2、KLF4的12天的DOX诱导的转基因表达而得到。PDB4F-2通过四种重编程因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的8天的DOX诱导的转基因表达而得到。
图33显示了带有Cre重组酶可切除的病毒重编程因子的hiPSC的产生。所指示的iPSPDB2lox克隆针对XbaI消化的基因组DNA的原病毒整合的Southern印迹分析，使用了针对OCT4、KLF4和SOX2的32P-标记的DNA探针。所有PDB2lox克隆通过用Cre重组酶可切除的慢病毒载体(FUW-tetO-loxP)对3种重编程因子OCT4、SOX2和KLF4进行反转录病毒转导来产生。
图34显示了在hiPSC中重编程因子的切除的Southern印迹分析。在Cre重组酶介导的转基因切除后，对亲代成纤维细胞(PDB)、携带原病毒的PDB2lox克隆(PDB2lox-17和PDB2lox-21)和所指示的PDB1lox克隆的原病毒整合进行Southern印迹分析。Puro表示通过嘌呤霉素筛选分离到的克隆；GFP表示通过对EGFP进行FACS分拣所分离到的克隆(如图5A中所示)。将基因组DNA用MfeI消化，并使用针对OCT4、KLF4和SOX2的32P-标记的DNA探针探测原病毒整合。根据该Southern印迹分析，用蓝色标出的PDB1lox克隆(PDB1lox-17GFP-10、PDB1lox-17GFP-18、PDB1lox-21Puro35和PDB1lox-21GFP-28)被视为转基因部分缺失或含有转基因部分缺失的混合细胞群。
图35显示了FUW-M2rtTA的Southern印迹分析。对亲代成纤维细胞(PDB)、携带原病毒的PDB2lox克隆(PDB2lox-17和PDB2lox-21)和所指示的PDB1lox克隆的FUW-M2rtTA原病毒整合进行Southern印迹分析。Puro表示通过嘌呤霉素筛选分离到的克隆；GFP表示通过对EGFP进行FACS分拣所分离到的克隆(如图30A中所示)。将基因组DNA用MfeI消化，并使用针对FUW-M2rtTA的32P-标记的DNA探针探测原病毒整合。
表1：源自于因子转导的胚胎或成年人类成纤维细胞的人类iPS细胞。将成纤维细胞用转导不同因子组合的组成型或DOX诱导型慢病毒载体感染。在每个实验中挑取50到100个克隆。对病毒整合进行的Southern印迹显示，iPS细胞系源自于独立感染的成纤维细胞。(O＝OCT4，S＝SOX2，K＝KLF4，M＝C-MYC5，L＝LIN28，N＝NANOG)。
表2：在本方案中使用的转基因人类ES或iPS细胞系的概括。携带不同因子组合的DOX诱导型多顺反子载体将被整合到COL1A1基因座的3′UTR中，或GFP将被插入到OCT4基因座或所指示的神经特异性基因中。表中还指出了细胞将用于的具体目标。
发明详述
2008年4月7日提交的PCT申请序列号PCT/US08/004516和2004年11月24日提交的美国专利申请10/997,146的教导内容，在此以其全文引为参考。考虑到了本文描述的发明的各种实施方案和方面可适用于本发明的所有不同方面和实施方案。还考虑到了在适当情况下，任一实施方案或方面可以与一种或多种其他这样的实施方案或方面自由组合。
诱导多能性的研究由于需要使用会产生遗传不同质的细胞群的高滴度反转录病毒进行感染而变得复杂。我们产生了携带由可用强力霉素(dox)诱导的转基因所定义的重编程因子的遗传同质的“次级”体细胞。这些细胞通过用dox诱导型慢病毒感染成纤维细胞、通过添加dox进行重编程、筛选iPS细胞和产生嵌合小鼠来生产。源自于这些嵌合体的细胞在暴露于dox后不需病毒感染即可有效地重编程。利用这种系统，我们证实了(i)重编程因子的各种不同诱导水平能够诱导多能性，(ii)转基因活性的持续时间与重编程效率直接相关，(iii)来自许多体细胞组织的细胞可以被重编程，以及(iv)不同的细胞类型需要不同的诱导水平。这种系统便于重编程的定性，并为遗传或化学筛选以增强重编程或替换个体因子提供了独特的平台。
最近已经显示，小鼠1-4和人类5-8成纤维细胞可以通过四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的反转录病毒介导的导入而重编程到多能状态。重编程也可以在不存在c-Myc的情况下实现，尽管效率降低9，10。然而，使用这些方法，只有非常少部分的被所有4种因子感染的细胞最终重新编程11。随机的病毒感染在被感染的细胞培养物中引起遗传异质性，这可能在诱导多能干(iPS)细胞形成所观察到的低频率中起到重要作用。因此，必须通过内源多能性基因的重新活化1-3、或基于形态学标准11，12来筛选正确地重编程的细胞。已经显示，重编程过程在病毒转导后需要约10到12天的持续转基因表达，随后进行多能性标志物的顺序活化，首先活化碱性磷酸酶和阶段特异性胚胎抗原(SSEA1)，然后重新活化内源Oct4和Nanog基因，在此之后，培养物能够在不存在转基因活性的情况下维持多能状态13，14。
随机感染的成纤维细胞的细胞和遗传异质性，使得探索重编程过程中发生的重要分子事件复杂化，并限制了高通量分析所需的缩放性。为了克服这些问题，我们开发了一种不使用任何进一步的遗传干涉来产生适合于重编程的遗传一致的细胞群的系统。为此，使用编码4种重编程因子的强力霉素诱导型慢病毒来感染初级成纤维细胞。在囊胚注射后产生了嵌合小鼠，其由在克隆上源自于重编程的成纤维细胞的组织类型构成。从这些小鼠可以产生同质的供体细胞群，所述细胞群带有允许重编程的预先选择的载体整合，允许对初级细胞类型进行强有力和简单的强力霉素诱导的重编程，而不需要重编程因子的直接病毒转导。该技术便于产生大量遗传一致的供体细胞，代表了用于遗传或化学筛选应用以改进重编程的有力平台。此外，可以利用同样的手段，通过在多能的、重编程的成纤维细胞中遗传缺失一个特定因子，来筛选代替4种因子中的每种的小分子15。此外，该工具不限于成纤维细胞培养物，而是在原则上能够同样应用于所有其他体细胞类型，为在难以用反转录病毒感染的细胞类型例如淋巴细胞或肠上皮细胞中诱导基因，提供了有吸引力的方式。
结果
产生用于药物诱导型重编程的遗传同质细胞群
为了产生在原病毒整合的数量和位置方面同质的细胞群，我们利用了强力霉素(dox)诱导型转基因系统16，17并构建了编码4种重编程因子的dox诱导型慢病毒载体。用4种慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，所述细胞除了靶向内源Nanog基因座(NGFP)的绿色荧光蛋白(GFP)之外，还含有都靶向ROSA基因座(ROSA-M2rtTA)的反四环素反式激活子和PGK启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因。同样地，我们用编码Klf4、Sox2和c-Myc的dox诱导型慢病毒感染Rosa-M2rtTAMEF，其带有靶向I型胶原蛋白基因座16的四环素操作子控制下的Oct4cDNA和内源Nanog基因座1，18(NNeo)中的新霉素抗性基因(图1a)。
在病毒转导后，向培养基加入强力霉素以活化转基因并启动重编程过程。正如预期，出现了Nanog-GFP阳性和Nanog-neo抗性iPS集落，并建立了克隆的iPS细胞系。所有iPS细胞系可以在缺乏dox下扩增，表现出碱性磷酸酶活性，并均一地表达多能性标志物SSEA1和Nanog(未显示)。这表明这些“初级”iPS细胞系已经活化了它们的内源多能性核心转录网络，并且不再依赖于四种重编程因子的外源表达19。为了产生由带有已知在初级成纤维细胞中实现重编程的相同原病毒插入的遗传同质细胞构成的体细胞组织，我们将这些克隆的初级iPS细胞系中的几种注射到囊胚中。将得到的dox诱导型iPS细胞嵌合体孕育直到E13.5，在这时分离MEF。然后使用嘌呤霉素筛选对源自于宿主囊胚的细胞进行筛选，只留下iPS衍生的细胞。我们将这样的细胞称为“次级”MEF，因为它们源自于初级iPS细胞，并因此带有能够重编程体细胞的特定原病毒插入组(图1A)。
从由三种不同的克隆的初级iPS细胞系(一种Nanog-neo和两种Nanog-GFP细胞系)产生的嵌合iPS细胞胚胎分离次级MEF，并在存在dox的情况下进行培养，以确定整合的慢病毒载体是否在发育的胚胎中分化后保留了介导表观遗传重编程的能力。向这些培养物添加dox启动了剧烈的形态改变，并通过neo筛选或GFP表达从这些培养物中有效分离了“次级”iPS细胞系，然后将其在不存在dox下繁殖。免疫荧光证实，次级iPS细胞已经重新活化ES细胞的多能性标志物碱性磷酸酶、SSEA1和内源Nanog基因(图1B和图6)。这些细胞系的多能性被它们在畸胎瘤形成分析中形成内胚层、外胚层和中胚层谱系的细胞的能力，以及它们在囊胚注射后对成年嵌合小鼠的贡献能力所证实(图1C，1D)。
转基因诱导水平、重编程动力学、和在源自于不同iPS细胞系的次级MEF之间的效率变化
当源自于所有三种dox诱导型iPS细胞系的次级MEF经历重编程以形成次级iPS细胞系时，我们注意到它们在dox处理后在形态改变和增殖速率方面的差异。开始时，来自两个Nanog-GFP细胞系的MEF在暴露于dox后增殖形成合生的成纤维细胞单层。然后来自Nanog-GFP细胞系3(NGFP3)的细胞经历了强有力的合生后增殖，包括细胞在悬液中的生长，而来自Nanog-GFP细胞系2(NGFP2)的细胞生长较慢，在成纤维细胞单层上形成了离散的、碱性磷酸酶阳性的ES样集落(图2A)。源自于Nanog-neo细胞系的成纤维细胞在添加dox后从不形成合生的单层，但是产生大的三维集落。在dox给药后12天，在所有三种培养物中可以容易地看到具有ES细胞形态的iPS细胞集落(图2A，箭号)。
为了更详细地评估重编程动力学，将来自三个细胞系的MEF在含有dox的培养基中培养，并利用流式细胞术分析监测SSEA1和GFP的重新活化(图2C)。所有三种次级MEF都随着时间过程显示出逐渐增加的SSEA1阳性细胞，但是在时间进程上观察到一些差别。NNeoMEF最早显示出SSEA1阳性细胞的增加，在第8天到第11天之间从1.3％增加到17.8％。NGFP2MEF显示出类似的增加，但是在时间点上晚得多(在第14天到第18天之间从4.4％增加到29％)。相反，来自iPS细胞系NGFP3的MEF显示出SSEA1的较慢的、逐渐的活化，在第14天时达到约10％。最早检测到GFP阳性细胞的时间，在NGFP2中早在第14天，在NGFP3MEF中是在第18天。
为了监测NNeo次级MEF中内源Nanog基因座的重新活化的时间进程，我们将细胞铺板，并在dox处理后各种不同时间点时开始药物筛选。与Nanog-GFP报告基因在诱导后2周左右活化相反，当neo早在第4天添加到培养物中时，NNeoMEF就已是新霉素抗性的(图2B)。这可能反映出Nanog基因座的较快的重新活化，与我们在该细胞系中对SSEA1表达所观察到的相似(图2C)。或者，neo抗性集落出现较早可能是因为与GFP检测需要较高表达相反14，20，Nanog基因的低水平活化就足以提供药物抗性。尽管次级细胞是针对其表达能够诱导初级iPS细胞系形成的特定原病毒整合组进行筛选而产生的，但多能性标志物活化的总体动力学与在MEF的直接感染中观察到的类似1，13，14。这支持重编程过程需要一系列顺序的表观遗传变化的观点11，20。
接下来，我们比较了各种不同次级MEF的重编程效率。为了确定最适的铺板密度，我们将次级NGFP2MEF以0.025-500个细胞/mm2的密度在含有dox的培养基中铺板，并在4周后对GFP阳性集落进行计数。如图2D中所示，铺板密度对于iPS形成具有显著影响。显然，低和高的铺板密度完全抑制了GFP阳性克隆的形成。我们推测，为了促进生长，在开始时可能需要旁分泌因子，并且如果在转基因活化之前细胞发生接触抑制，则阻碍了必要的细胞增殖。
为了严格确定次级系统中的重编程效率，我们将来自NNeo和NGFP2细胞系的单个成纤维细胞铺板在含有γ-射线辐照过的MEF作为提供最适生长支持的饲养细胞的96孔板中。我们观察到分别只有～14％和～8％的来自NNeo和NGFP2MEF的接种细胞，在dox给药后增殖到足以形成离生的集落(图2E中的浅灰色条)。但是，那些集落的约四分之一在培养4周后最终变成新霉素抗性或GFP阳性的，产生了对于NNeo细胞系来说～4％和对于NGFP2细胞系来说～2％的总体重编程效率(图2E中的深灰色条)。这比原先报道的基于药物抗性的iPS筛选1，12的效率高25-50倍，比在感染的初级成纤维细胞的培养物中基于形态的iPS筛选11的效率高4-8倍。
接下来，我们比较了使用直接感染的次级MEF系统的可重复性。我们用编码4种重编程因子的基于Moloney的病毒感染Oct4-neoMEF1，并在第20天对neo抗性集落进行计数。四个独立实验显示出使用这种方法时iPS形成的高度实验间变异性(图7B)。相反，我们注意到，在次级系统中，当我们对4个独立实验中来自强力霉素处理的NGFP2MEF的Nanog-GFP阳性集落进行计数时，变异性程度要低得多。
为了将三个次级MEF群的表型行为与转基因诱导相关联，将同等数量的次级MEF在存在或不存在dox的情况下铺板72小时，并在此时通过定量RT-PCR测定4种因子的总转录水平。令人吃惊的是，两个Nanog-GFP细胞系诱导的Oct4水平，与NNeo细胞系从胶原蛋白1A1基因座中的转基因以与ES细胞相似的水平表达Oct4相比，要低得多(图3A)。相反，在Nanog-GFP细胞系中Sox2诱导所达到的水平与ES细胞中内源Sox2的水平接近得多，而NNeo对dox做出响应表达Sox2的水平明显更低。在未诱导的MEF中，与ES细胞相比c-Myc表达更高，并且添加dox在所有三种次级MEF细胞系中引起了转录本水平的急剧诱导。相反，在所有三种次级MEF群中，在转基因诱导后，总Klf4水平与ES细胞中相似。在dox处理的NNeo次级MEF中总Oct4水平与ES细胞最为接近的这一观察结果，可以解释在该细胞系中观察到的更快和更有效的重编程动力学(参见上文)。然后我们在NGFP2MEF中测定了重编程晚期阶段中的表达水平。Sox2、Klf4和c-Myc总是被强烈诱导，只有很少的变动，而Oct4的表达随时间缓慢增加(图7A)。这可能反映了具有较高Oct4诱导的细胞在培养物中随时间的筛选。Southern印迹分析表明在三个被研究的细胞系中存在1-2个c-Myc、1-3个Oct4、1-3个Sox2和3-4个Klf4原病毒的基因组整合(图7C)。
尽管它们遗传同质，但dox诱导引起转基因的活化在单细胞水平上变动，正如通过Oct4和Sox2的免疫荧光分析所确定的(图3B)。因为不是所有的次级MEF都对dox做出响应而同等地诱导转基因，因此我们不能排除重编程需要转基因表达的特定化学计量并仅仅在一部分次级MEF中发生的可能性。
转基因表达对重编程效率和时间进程的影响
为了调查发生稳定的重编程需要4种重编程因子表达多长时间，将次级NGFP2MEF以最适密度铺板(参见上文)，在强力霉素中暴露从5天到22天的各种不同时间段，并每天监测GFP荧光。产生GFP+集落的最小dox暴露时间长度是9天，第一个GFP+集落出现在除去dox后7天的第16天(图3C)。引人注目的是，追加暴露于dox不加速GFP+集落的出现，不论dox给药的长度如何，GFP出现在第16天到18天之间。同样地，发现NNeo次级MEF需要11-13天的dox暴露后才能建立稳定的新霉素抗性的次级iPS集落。
为了将转基因表达的时间长度与总体重编程效率相关联，我们将次级NGFP2MEF暴露于强力霉素10-15天，并在第34天对GFP阳性集落进行定量。我们发现了转基因表达时间长度与GFP阳性集落数量之间的显著相关性14(图3D)。然后我们监测了在同一培养皿中新进化的GFP阳性集落随时间的出现。令人吃惊的是，仅暴露于强力霉素9天的MEF持续产生GFP阳性集落直到第25天(dox撤回后15天)(图3E，蓝色线)。dox处理22天导致显著得多地增加GFP阳性集落随时间的形成(图3E，红色线)。这些发现与重编程即使在该同质系统中也是逐渐的随机过程相符，并与以前基于初级感染的结论相一致11，13，14，20。此外，重编程过程持续，并在4种转基因对dox撤回做出响应被下调后长时间才能结束。
我们还测试了次级细胞是否可用于评估药物对重编程效率的影响。为此，我们研究了DNA去甲基化化合物5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂制曲古菌素A(TSA)的影响。因为它们的作用是染色质修饰，因此这两种小分子都是改进重编程效率的候选物。图3F显示，向培养基添加5-Aza增加了来自NGFP3细胞系的MEF的重编程效率，而TSA处理对集落的数量没有明显影响。
其他细胞类型的重编程
我们试图确定适合于通过从NNeo和NGFP2细胞系产生的iPS细胞嵌合体中分离次级细胞进行重编程的组织类型范围，并检查了从来源于这些嵌合体的多种细胞类型的重编程能力。如表1中所概括的，一些细胞类型当从NGFP2细胞系分离时可以容易地重编程，但是从NNeo细胞系分离的同样的细胞类型不产生iPS细胞，表明不同细胞类型需要不同的转基因诱导水平，这可能是由所研究的细胞系之间的不同原病毒整合位点所致。
表1：从来源于NNeo和NGFP嵌合体的多种组织和细胞类型产生次级iPS细胞的总结
组织/细胞类型NNeoNGFP2
神经祖细胞+N/D
肾上腺+N/D
角化细胞+N/D
肌肉+N/D
肠上皮-+
间充质干细胞-+
造血谱系-+
MEF++
尾梢成纤维细胞-+
肠上皮细胞
来自次级NGFP2和NNeo嵌合体二者的纯化的肠上皮细胞对强力霉素处理的响应相当快，并在48小时内在悬液中形成球状体，其随后附着于MEF饲养细胞层并在3-4天内呈现ES样形态(图4A-4C和4I-4J)。但是，在用dox培养10-12天之前，没有检测到碱性磷酸酶活性(图9F)。使用机械分级规程(参见方法)，我们发现从级份7(主要为隐窝衍生的细胞)形成这些集落比从较前的级份(富含绒毛末梢衍生的细胞)形成要更有效得多(图4M)。源自于NGFP2嵌合体的细胞在dox存在下培养约两周后，发育成表达内源Nanog的dox不依赖性iPS细胞(图4K-4L，图8B)。
相反，源自于NNeo嵌合体的细胞在dox培养两周后变成neo抗性，但是在dox撤回后不稳定并失去它们的ES样形态(图4D-4F)。亚硫酸氢盐测序显示出Nanog启动子的一定程度的去甲基化，但是Oct4启动子只有最低的去甲基化(图4G)，并且当注射到SCID小鼠的皮肤下之后，这些细胞不能在存在或不存在强力霉素的情况下产生畸胎瘤。定量RT-PCR显示这些细胞不能诱导Nanog，并且只表达非常低水平的Sox2和Klf4，但是表达高水平的Oct4和c-Myc(图4H)。使用Sox2和Klf4进行附加感染导致产生完全重编程的dox不依赖性iPS细胞，其表达多能性标志物并显示出它们的Oct4和Nanog启动子完全去甲基化(图4G和图9G)。
在dox处理后48小时，NGFP2和NNeo肠上皮细胞中转基因诱导水平的比较，显示出与来自这些细胞系的次级MEF中观察到的相似的诱导水平差异(图4N，与图3A比较)。源自于隐窝的肠上皮细胞比来自于绒毛的细胞更容易诱导大部分转基因，为它们增加的集落形成率提供了解释。这些发现表明，NNeo细胞系中的原病毒整合位点，尽管允许MEF进行重编程，但与NGFP2中呈现的相反，不能在肠上皮细胞中介导完全重编程。
间充质干细胞和尾梢成纤维细胞
接下来，我们比较了从NNeo和NGFP2嵌合体分离到的源自于骨髓的间充质干细胞(MSC)和尾梢成纤维细胞(TTF)的重编程能力。这些细胞代表了两种适合于通过直接感染进行重编程的间充质群1，4，12(补充图8D)。与肠细胞的情况相同，次级NGFP2MSC和TTF能够对dox做出响应产生iPS细胞，而源自于NNeo嵌合体的细胞则不能(图5A-5F，图8A，8C)。
角化细胞
首先将从NNeo嵌合体的表皮分离的细胞在不存在强力霉素的情况下、在角化细胞最适的生长条件下繁殖21。获得了同质的上皮培养物(图5G)，并向培养基添加强力霉素。上皮细胞成簇增殖并随时间改变它们的形态。在12天后将培养基改变成含有强力霉素的ES细胞培养基(图5H)，并在7天后加入新霉素。在紧密集落中生长的Neo抗性细胞类似于ES细胞(图51)，并在γ-射线辐照过的饲养细胞上传代，此时将培养物在不存在dox下维持，并表达内源Nanog(图9D)。
神经祖细胞
切分来自NNeo嵌合体的脑，将侧脑室周围的组织块解离成单细胞，并铺板在未包被的培养皿上含有EGF和FGF2并不含血清的存在嘌呤霉素的培养基(N3EF)中，以筛选次级细胞。4周后形成神经球，随后将它们铺板在聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿上含有dox的ES细胞或N3EF培养基中，以活化慢病毒转基因。正如对于神经前体所预计的，暴露于含血清的ES细胞培养基的细胞分化成扁平的星形细胞并停止分裂(图5J)。相反，铺板在N3EF培养基中的细胞继续强有力地增殖，类似于未分化的神经上皮细胞。三周后将这些增殖的细胞分开，铺板在含有强力霉素的ES细胞或N3EF培养基中。暴露于血清的细胞大多数采取了扁平形态，而在N3EF中，细胞维持双极形态。但是，与以前的传代相反，在接下来的两周中，在这两种条件下出现了小的ES样集落(图5K，5L)。当在γ-射线辐照过的饲养MEF上传代时，容易地建立了neo抗性、dox不依赖性的表达内源Nanog的iPS细胞系(图9E)。
其他组织
此外，我们也从NNeo嵌合体的肾上腺、肾脏和肌肉移植出的细胞成功产生了次级iPS细胞系。将这些组织切分，在胰蛋白酶中解离并在含有强力霉素的ES细胞培养基中铺板。在dox存在下6-12天后，出现具有ES细胞形态的集落，其最终变成新霉素抗性、dox不依赖性的，并具有活化的Nanog(图9A-9C)。
体细胞表观基因组通过4种转录因子Klf4、Sox2、c-Myc和Oct4的异位表达向多能性胚胎状态的重编程，是缓慢和低效的过程。当前用于诱导重编程的方法是通过反转录病毒基因的递送，产生了原病毒整合在数量和基因组位置两方面不同的异质细胞群，这为直接重编程的变异性和低效率提供了解释。在本文中，我们描述了用于重编程遗传同质细胞群的新系统。使用强力霉素诱导型慢病毒载体进行重编程并随后形成嵌合体，产生了由遗传同质细胞构成的组织，所述细胞带有一致的原病毒整合并在暴露于强力霉素后重新表达重编程因子。这种策略筛选到携带了在有利于药物诱导的活化的基因组座位中插入正确数量的原病毒的细胞，并消除了靶细胞的重新病毒感染所固有的异质性。出人意料的是，在该系统中重编程的时间进程与直接感染的初级成纤维细胞类似。启动重编程所需的最短时间长度是9-13天。该时间尺度与在用载体直接感染的细胞中观察到的10-14天的时间框相符13，14。我们还观察到，当早在第9天从培养物撤回dox时，GFP+次级iPS集落在强力霉素不存在下在随后的几周中持续出现。这些结果支持了重编程由需要最短的转基因表达时间段的表观遗传修饰的随机顺序所驱动的观点。
次级MEF观察到的重编程效率高达4％，与成熟B细胞的重编程效率22相当，大大高于使用重新感染和药物筛选所估计的0.1％的效率，并且比使用形态选择标准所报道的1，11，12高大约8倍。已有明确记载，源自于被感染的MEF的iPS细胞平均带有15个不同的原病毒拷贝，表明了强力筛选到少部分感染细胞，它们携带有“正确的”原病毒数量、或以用于成功重编程的适当化学计量表达4种因子。因此，预计次级MEF的重编程频率较高，因为这些细胞在克隆上源自于带有“正确的”原病毒组合的感染细胞。果真如此的话，为什么只有4％而不是大多数或所有dox处理的次级细胞都产生次级iPS细胞呢？我们考虑了几种不互相排斥的解释。(i)已经确定，直接感染的MEF的遗传一致的亚克隆在明显不同的时间变得重编程或完全不重编程11，20。正如前面讨论的，这表明重编程涉及一系列随机事件，使得带有相同数量原病毒拷贝的细胞将在不同时间活化内源多能性基因。(ii)我们的数据还显示dox处理不在所有细胞中统一地活化原病毒，而是在个体细胞之间存在诱导水平的差异。因为这些多样化的表达水平，只有一部分次级MEF可能获得足够高的因子表达水平或因子之间正确的相对表达水平，因此能够产生次级iPS细胞。
尽管重编程由4种因子的病毒转导所诱导，但多能状态的维持依赖于重新建立参与四种内源多能性因子Oct4、Nanog、Sox2和Tcf3活化20，23和外源因子沉默的自调控环路。同样地，次级MEF能够完全重编程到多能状态，并在不存在转基因表达的情况下维持所述多能状态。
我们还利用次级系统检查几种其他成年体细胞类型的重编程潜力。可以通过dox处理从许多其他组织包括脑、表皮、肠上皮、间充质干细胞、尾梢成纤维细胞、肾、肌肉和肾上腺产生iPS细胞，表明原病毒在MEF之外的细胞类型中也被适当激活。这证实了4种重编程因子能够在具有不同发育起源和表观遗传状态的细胞中介导表观遗传重编程，并突出了次级系统在广泛的细胞类型的重编程研究中的实用性。尽管采取了特别的小心以避免其他污染性细胞类型，但我们不能明确地证明来自这些各种组织类型的iPS细胞的起源细胞。遗传谱系追踪实验事实上证实，在用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4转导后可以从肝和胰腺细胞产生iPS细胞24，25。但是，不是所有的细胞类型都允许通过这四种因子进行重编程。我们已经显示，成熟而不是不成熟的B细胞的重编程需要转导附加的因子(c/EBP-α)或抑制B细胞特异性转录因子Pax522。为了重编程某些细胞类型，可能需要附加的以及尚不知道的因子。本文描述的系统的一个实用优点在于，可以研究各种细胞类型，包括可以耐受离体(exvivo)培养和反转录病毒感染的细胞类型，例如肠上皮细胞。
本文描述的可药物诱导的系统代表了一种具有可预测和高度可重复的动力学和效率的新的重编程平台(参见补充图7B)，其将促进引起表观遗传重编程的早期分子事件的研究。此外，次级细胞类型的遗传同质性为提高重编程效率的化学和遗传筛选方法提供了可行性。作为一个实例，我们证明了DNA去甲基化剂5-氮杂脱氧胞苷显著增加重编程效率。此外，这样的筛选也适用于鉴定代替原来的重编程因子的化合物。因为重编程状态不依赖于外源因子，因此可以将转基因遗传切除并通过形成缺少特定重编程因子的嵌合体产生次级细胞15。
实施例
所有本文引用的参考文献的教导内容在此以其全文引为参考。
实施例1
病毒制备和感染
含有四环素操作子控制下的Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc以及最小CMV启动子的慢病毒载体的构建以前已被描述14。将不能复制的慢病毒粒子在293T细胞中用VSV-G外壳包装，并用于感染在R26基因座处含有M2rtTA和PGK-Puro抗性基因17、并含有靶向内源Nanog基因座的新霉素抗性或GFP等位基因1，11的MEF。将来自包装4种病毒的每种的培养物的病毒上清液合并，通过0.45μm滤膜过滤，并以1∶1与ES细胞培养基(DMEM中添加有w/10％FBS(Hyclone，Logan，UT)、白血病抑制因子、β-巯基乙醇(SIGMA-Aldrich)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸(都来自Invitrogen，Carlsbad，CA)混合，然后施加到MEF。
初级iPS分离，畸胎瘤和嵌合体形成
在添加dox(Sigma-AldrichSt.LouisMO.2μg/mL)后约3周，分离GFP+或新霉素抗性iPS集落，并在不存在dox的情况下扩增。从与NanogGFP1细胞系(在22中描述为MEF-iPS#1细胞系)同样的平板挑取NanogGFP2iPS细胞系，而细胞系NanogGFP3源自于独立的实验。将iPS细胞系注入C57/B6xDBA/1F1囊胚。将囊胚置于矿物油下的一滴含有15％FBS的DMEM中。使用Piezo显微操作器，使用内径为12-15mm的平头显微注射移液器进行iPS细胞注射。将约10个iPS细胞注入囊胚腔，并将囊胚置于KSOM(SpecialtyMedia，Phillipsburg，NJ)中，在37℃下温育，直到将其转移到雌性受体中。将15个注入的囊胚转移到交配后2.5天假孕的C57/B6xDBA/1F1雌性的子宫角。对于畸胎瘤的产生来说，将2x106个细胞皮下注射到受体SCID小鼠的胁肋，并在3-6周后分离肿瘤进行组织学分析。所有动物按照IACUC学术管理准则进行处理。
次级体细胞分离和培养
对于MEF分离来说，在E13.5时分离嵌合胚胎，并除去头部和内部(包括生殖)器官。将剩余组织物理解离，并在37℃下在胰蛋白酶中温育20分钟，然后将细胞重悬浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的MEF培养基中，并传代两次进行扩增，然后冷冻。将用于所述实验的次级MEF融化，并在融化后将实验铺板1-2代。通过在6孔板中每孔铺板4x104个次级MEF，并在指定时间对板进行染色或分析，进行了动力学实验(图2)。细胞密度实验在12孔板中进行，并在dox诱导后4周，对GFP+iPS集落计数。通过将单个次级MEF铺在96孔板中野生型MEF饲养细胞层上，然后进行dox诱导(使用有限稀释法，其在没有MEF饲养细胞的平行样板中通过目测进行验证)，来进行单细胞效率实验。在4周后对iPS形成计数。显示了来自2-3个生物平行样品的代表性实验。对于5-Aza和TSA实验来说，将1x106个次级MEF铺于6孔板中(约100个细胞/mm2)，并用含有5-Aza(1μM)或TSA(1μM)的ES细胞培养基预处理48小时。48小时后，将次级MEF在添加dox但缺乏5-Aza或TSA的ES细胞培养基中进行培养。在诱导后第8-10天之间，将MEF暴露于5-Aza或TSA中再48小时的时间，然后仅使用dox培养，直到在第21天对GFP+集落计数。
从3到4月龄的嵌合体分离体器官。表皮角化细胞的分离和培养如前所述21，26。神经祖细胞的分离和培养如前所述27。将全部肠上皮使用含有3mMEDTA和0.05mMDTT的PBS溶液在室温下解离30分钟。弃去肌肉组织，并将纯化的隐窝/绒毛铺板于dox存在下的γ-射线辐照过的MEF饲养细胞上。对于隐窝-绒毛的分级来说，使用同样的EDTA-DTT溶液，但是级份按照28中所述，通过在温育后轻柔振荡10、6、5、5、9、10和25分钟来收集(分别对应于级份1-7，其中1代表绒毛末梢到7代表隐窝)。将来自每个级份的8x106个上皮细胞在含有2μg/mLdox的ES培养基中铺板在MEF饲养细胞层上。在缺乏dox的培养物中没有观察到生长。次级嵌合小鼠(或从用于直接感染的Coll1-TetO-Oct4、Rosa26-M2rtTA小鼠16)的股骨和胫骨在生长板中移除骨节后，通过用含有DMEM+5％胎牛血清(FBS)(Hyclone，ThermoFisherScientific)的注射器和30号针头冲洗，分离全部骨髓。通过在添加有15％FBS(HyClone)的α-MEM中在组织培养班上差异铺板72小时，筛选间充质干细胞。通过将来自新鲜分离的全骨髓的4x106个有核细胞铺在10cm板上，并允许在嘌呤霉素存在下扩增5天以消除宿主囊胚产生的细胞，然后导入dox以诱导重编程，来进行MSC在培养物中的集落形成。将源自于肾上腺、肌肉和肾脏的培养物切分，机械解离，并在胰蛋白酶中在37℃下消化20分钟，然后铺板在带有含dox的ES培养基的明胶包被的培养皿上。
抗体
为了进行流式细胞术分析，我们使用了APC偶联的抗小鼠SSEA1抗体(R&Dsystems，Minneapolis，MN)和碱性磷酸酶底物试剂盒：VectorRed底物试剂盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)。为了进行免疫荧光，将细胞固定在4％多聚甲醛中，并且我们使用了针对SSEA1的小鼠单克隆抗体(DevelopmentalStudiesHybridomaBank)、山羊抗Sox2抗体(R&DSystems)、小鼠抗Oct4抗体(SantaCruz)和兔抗Nanog抗体(Bethyl)。荧光团标记的适合的第二抗体购自JacksonImmunoResearch。
流式细胞术
将细胞用胰蛋白酶处理，在PBS中清洗1次并重悬浮在FACS缓冲液中(PBS+5％胎牛血清)。将106个细胞用10μlAPC偶联的抗SSEA1抗体在100μl体积中染色30分钟，然后将细胞在PBS中清洗两次。然后将细胞用清洗缓冲液清洗1次并重悬浮在FACS缓冲液中，用于在FACS-calibur细胞分拣器上进行分析。
亚硫酸氢盐测序和Southern印迹分析
DNA的亚硫酸氢盐处理使用CpGenomeDNA修饰试剂盒(Chemicon，Temecula，CA)，按照制造商的说明书进行。得到的修饰DNA通过嵌套式聚合酶链反应(PCR)，使用两个正向(F)引物和一个反向(R)引物来扩增：Oct4(F1，GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT；SEQIDNO：1)；(F2，ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA；SEQIDNO：2)；(R，CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC；SEQIDNO：3)和Nanog(F1，GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT，SEQIDNO：4；F2，AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT，SEQIDNO：5；R，CCCACACTCATATCAATATAATAAC，SEQIDNO：6)。第一轮PCR如下进行：94℃4分钟；5个循环：94℃30秒、56℃1分钟(每个循环-1℃)和72℃1分钟；以及30个循环：94℃30秒、51℃45秒和72℃1分20秒。第二轮PCR循环是94℃4分钟；30个循环：94℃30秒、53.5℃1分钟和72℃1分20秒。将得到的扩增产物凝胶纯化(Zymogen，ZymoResearch，Orange，CA)，亚克隆到TOPOTA载体(Invitrogen)中并测序。通过将10μgDNA用SpeI消化(其在慢病毒载体骨架中切开一次)，然后用针对四种因子的随机引发的全长cDNA探针进行杂交，来进行基因组DNA的Southern印迹分析。
定量RT-PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离总RNA。使用无DNA的RNA试剂盒(ZymoResearch，Orange，CA)，将5微克总RNA用DNaseI处理以除去基因组DNA的潜在污染。使用第一链合成试剂盒(Invitrogen)对1微克DNaseI处理过的RNA进行反转录，最终重悬浮在100μl水中。使用1/50的反转录反应液，在ABIPrism7000(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)中，使用带有ROX的PlatinumSYBRgreenqPCRSuperMix-UDG(Invitrogen)进行三份重复的定量PCR分析。用于扩增的引物如下：Oct4F，5′-ACATCGCCAATCAGCTTGG-3′SEQIDNO：7和R，5′-AGAACCATACTCGAACCACATCC-3′SEQIDNO：8；c-mycF，5′-CCACCAGCAGCGACTCTGA-3′SEQIDNO：9和R，5′-TGCCTCTTCTCCACAGACACC-3′SEQIDNO：10；Klf4F，5′-GCACACCTGCGAACTCACAC-3′SEQIDNO：11和R，5′-CCGTCCCAGTCACAGTGGTAA-3′SEQIDNO：12；Sox2F，5′-ACAGATGCAACCGATGCACC-3′SEQIDNO：13和R，5′-TGGAGTTGTACTGCAGGGCG-3′SEQIDNO：14；NanogF，5′-CCTCCAGCAGATGCAAGAACTC-3′SEQIDNO：15和R，5′-CTTCAACCACTGGTTTTTCTGCC-3′SEQIDNO：16。为了确保在RT反应中cDNA的等量上样，使用下述引物扩增GAPDHmRNA：F，5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′SEQIDNO：17；以及R，5′-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3′SEQIDNO：18。从扩增的线性范围提取数据。显示的qRT-PCR数据的所有图都代表用DNase处理、反转录并平行扩增的RNA样品，以避免这些程序中固有的变动。误差线表示三份重复反应的平均值的标准偏差。
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实施例2
I.概述
A.产生用于人类ES和iPS细胞的遗传操作的工具
本文描述的工作提供了强有力的手段，用于将基因定向到huES细胞中并产生用于将体细胞重编程成iPS细胞的工具。更具体来说，使用同源重组将GFP插入到huES和iPS细胞的关键神经谱系基因中。GFP标志物被用于从操作的iPS细胞分离神经元前体细胞，以评估它们的发育潜力。目前的重编程方案依赖于转录因子的反转录病毒载体介导的转导，在iPS细胞中产生多个原病毒插入。本工作描述的方法避免了使用多次病毒感染，或几乎消除了对病毒介导的重编程的需要。
1.DOX和三苯氧胺诱导型反转录病毒载体
DOX诱导型反转录病毒载体的重要性在于限定了多能性标志物的顺序活化和小鼠体细胞重编程过程中载体表达的最短时间。我们已经产生了诱导型慢病毒载体，其允许重编程因子的暂时受限的表达。
(a)DOX诱导型慢病毒载体：按照与用于鼠类基因相同的策略，我们产生了组成型或在DOX诱导型启动子控制下转导人类OCT4、SOX2、KLF4和C-MYCc-DNA的慢病毒载体[Brambrink，2008#6877]。为了产生DOX诱导型系统，我们用带有rtTA反式激活子的慢病毒载体感染人类成纤维细胞。图11A显示了在用相应的DOX诱导型载体转导的成纤维细胞中OCT4、SOX2和KLF4的高DOX依赖性表达。同样地，在源自于被感染的成纤维细胞的iPS细胞中，观察到了强有力的DOX依赖性转基因表达(图11A的右侧两个图块)。
(b)三苯氧胺诱导型慢病毒载体：为了能够对载体进行独立的可诱导控制，我们还通过将因子与雌激素配体结合结构域融合，产生了OCT4、SOX2和C-MYC雌激素受体(ER)融合构建物，以允许三苯氧胺依赖性表达[Grandori，1996#6505]。如图11B中所示，向用SOX2-ER融合构建物转导的细胞添加三苯氧胺，导致SOX2蛋白从细胞质向核移位，正如对于药物诱导的活化所预计的。这些结果显示，DOX和ER融合诱导型系统可用于独立地控制被转导的因子的表达。
一个重要的概念是使用两种不同的可调控系统，各自控制一部分因子的表达。例如，人们可以将三种因子置于第一种诱导型(例如dox诱导型)启动子的控制之下，并将第四种因子置于第二种诱导型(例如三苯氧胺诱导型)启动子的控制之下。然后，人们可以通过从这两种启动子诱导表达来产生iPS细胞，从该iPS细胞产生小鼠，并从小鼠分离成纤维细胞(或任何其他细胞类型)。这些成纤维细胞将是遗传上同质的，并且不需要病毒感染即可重编程。然后人们可以尝试在只有第一个启动子有活性的条件下，在可能能够代替第四种因子的不同小分子的存在下重编程成纤维细胞，以便鉴定小分子“重编程剂”，或优化瞬时转染或其他用于导入第四种因子的方案。许多变化形式是可能的；例如，人们可以稳定地诱导3种因子的表达，并瞬时诱导第四种因子的表达等。此外，人们可以通过使用不同浓度的诱导剂来调节因子的表达水平。
另一种途径是将编码一种因子的基因置于重组酶的位点之间，然后诱导重组酶的表达以关闭该因子的表达。重组酶的表达可以使用病毒载体(例如腺病毒-Cre)感染而被诱导。Hanna等，Science，318，1920-1923(2007)描述了一种这样的方法，其被用于降低由于c-Myc转基因表达所引起的肿瘤形成的潜在风险——将细胞用编码Oct4、Sox2和Klf4因子的反转录病毒和编码2-loxc-MyccDNA的慢病毒感染。从这些细胞产生的iPS细胞用编码Cre重组酶的腺病毒感染，以删除慢病毒转导的c-Myc拷贝。
这些系统可用于例如鉴定重编程剂以及研究在重编程中的必要条件和发生的事件(包括发现细胞类型特异性差异)。
2.人类iPS细胞的产生证实了诱导型系统正如所预期的在人类以及小鼠中起作用
已经显示，许多不同策略已经显示出从小鼠或人类供体体细胞诱导iPS细胞，包括组成性或诱导性表达四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc或四种因子的一部分或可选的因子组合[Lowry，2008#6827；Park，2008#6783；Takahashi，2007#6769；Yu，2007#6793]。比较了图11A中描述的不同载体系统对人类成纤维细胞重编程的效用。表1显示了通过转导4种或3种(减去C-MYC)组成性表达因子或DOX诱导型转录因子而获得的iPS细胞。当使用DOX诱导型慢病毒时，iPS克隆以与别人报道的相似的频率和大约相同的时间后在被感染的培养物中出现[Takahashi，2007#6769]。图12A显示，内源OCT4和NANOG基因在两个iPS细胞系中的表达水平与在huES细胞中相似。重编程的iPS细胞生长成具有人类ES细胞的典型形态的紧密集落，并且它们表达适合的多能性标志物(图12B)。为了测试多能性，将iPS细胞注射到SCID小鼠中。得到的肿瘤的组织学检查显示出包含多种分化的细胞类型的典型的畸胎瘤(图12C)。
B.通过多顺反子反转录病毒载体产生小鼠和人类iPS细胞
许多现有的产生iPS细胞的方案需要通过四种不同的反转录病毒载体转导4种转录因子Oct4、Sox2、c-myc和Klf4。在这种方式中，重编程涉及筛选带有多个整合的载体(多达15个或以上的原病毒)的一小部分感染的细胞，由于使用了强有力的癌基因和/或反转录病毒诱导的插入诱变而增加了对癌症的顾虑。为了减少重编程所需的独立原病毒整合的数量，我们设计并使用了能够转导任何因子组合的多顺反子载体，其目的是减少原病毒整合的数量。
内部核糖体进入位点(IRES)被广泛用于从一个启动子表达多个基因，但是这常常引起基因的非化学计量的表达。自切割的18-22个氨基酸长的2A肽介导脯氨酸和甘氨酸残基之间的“核糖体跳过(ribosomalskipping)”并抑制肽键形成而不影响下游翻译。这些肽允许多个蛋白被编码成聚蛋白(polyprotein)，其在翻译后分离成组分蛋白。术语“自切割”的使用不打算是指蛋白水解切开反应。
自切割肽在小RNA病毒科的成员中发现，包括口蹄疫病毒例如口蹄疫病毒(FMDV)、马甲型鼻炎病毒(ERAV)、Thoseaasigna病毒(TaV)和猪捷申病毒-1(PTV-1)(Donnelly，ML等，J.Gen.Virol，82，1027-101(2001)；Ryan，MD等，J.Gen.Virol.，72，2727-2732(2001))和心脏病毒例如泰勒病毒(Theilovirus)(例如泰勒鼠脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中有时分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。口蹄疫病毒2A多肽典型长度为～18-22个氨基酸，并含有Dx1Ex2NPG(SEQIDNO：34)，其中x1通常为缬氨酸或异亮氨酸。正如上面提到的，据认为2A序列介导脯氨酸和甘氨酸之间的“核糖体跳过”，损害P和G之间正常肽键的形成而不影响下游翻译。示例性的2A序列是来自FMDV的VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQIDNO：35)，其中下划线的残基在许多2A肽中是保守的。心脏病毒2A肽的C末端是保守的，与FMDV2A肽显示出高度相似性，并已显示也介导自切割(Donnelly，ML，等，J.Gen.Virol.，78，13-21(1997))。FDMV2A肽已显示出介导人工聚蛋白的切割(Ryan，MD和Drew，J.，EMBOJ.，13，928-933(1994))。最近，使用自加工2A肽表达四种CD3蛋白，证实了在体内从一个多顺反子有效并化学计量地表达四种蛋白的能力(Szymczak等，NatureBiotech.5，589-594，2004)。其中各cDNA被2A肽分隔开的多顺反子转基因，已显示出在转染的细胞包括huES细胞中促进多顺反子基因的表达(Hasegawa，K.等，StemCells.2007Jul；25(7)：1707-12，2007)。
本发明提供了可用于产生诱导的多能干(iPS)细胞的多顺反子核酸构建物、表达盒和载体。在某些实施方案中，多顺反子核酸构建物包含编码自切割肽的部分。本发明提供了包含至少两个编码区的多顺反子核酸构建物，其中编码区各自通过编码自切割肽的核酸相连以便形成单个开放阅读框，并且其中编码区编码的第一和第二种重编程因子能够单独或与一种或多种附加的重编程因子组合，将哺乳动物体细胞重编程为多能性。在本发明的某些实施方案中，构建物包含由自切割肽分开的两个编码区。在本发明的某些实施方案中，构建物包含三个各自编码重编程因子的编码区，其中相邻的编码区由自切割肽隔开。在本发明的某些实施方案中，构建物包含四个各自编码重编程因子的编码区，其中相邻的编码区由自切割肽隔开。因此，本发明提供了构建物，其编码含有2、3或4种由自切割肽隔开的重编程因子的聚蛋白。在某些实施方案中，构建物包含适合于在哺乳动物细胞中指导表达的表达控制元件，例如启动子，其中构建物编码聚蛋白的部分与表达控制元件可操作连接。因此，本发明提供了表达盒，其包含与启动子(或其他适合的表达控制元件)可操作连接的、编码含有重编程因子的聚蛋白的核酸，每个重编程因子通过自切割肽与至少一种其他重编程因子相连。启动子驱动编码重编程因子的多顺反子信使的转录，各个重编程因子通过自切割肽与至少一种其他重编程因子相连。启动子可以是病毒启动子(例如CMV启动子)或哺乳动物启动子(例如PGK启动子)。表达盒或构建物可以包含其他遗传元件，例如，以增强转录本的表达或稳定性。在本发明的某些实施方案中，任何上述的构建物或表达盒还可以包含不编码重编程因子的编码区，其中编码区通过自切割肽与相邻的编码区隔开。在某些实施方案中，附加的编码区编码选择性标志物。
可以由多顺反子构建物编码的具体重编程因子包括转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog，它们在本技术领域中是已知的并在本文中进一步描述。本发明涵盖了两种或以上上述因子的以各种可能次序的所有组合。出于简明的目的，不是所有这些组合都在本文中单独列出。在某些实施方案中，构建物编码由2A肽隔开的Oct4、Klf4和Sox2。在某些实施方案中，构建物不编码c-Myc。在某些实施方案中，构建物含有编码Lin28的编码区。在某些实施方案中，构建物含有编码C/EBPα的编码区。
在某些实施方案中，构建物包含一个或多个介导或便于构建物整合到哺乳动物细胞基因组中的位点。在某些实施方案中，构建物包含一个或多个介导或便于将构建物靶向哺乳动物细胞基因组中的选定基因座的位点。例如，构建物可以包含一个或多个与基因组中选定的基因座同源的区域。
在某些实施方案中，构建物包含在哺乳动物细胞中起作用的重组酶的位点，其中所述位点位于构建物至少包含因子的编码区的部分的两侧(即一个位点位于构建物编码聚蛋白的部分的5′端，第二个位点位于该部分的3′端)，以便在重编程后可以将编码因子的序列从基因组切除。重组酶可以是例如Cre或FIp，其中相应的重组酶位点是LoxP位点和Frt位点。在某些实施方案中，重组酶是转座酶。应该理解，重组酶位点不必与编码聚蛋白的区域直接相邻，但其位置将使得需要最终从基因组移除的区域位于位点之间。在某些实施方案中，重组酶位点在表达盒的′和3′末端上。切除可以产生保留在基因组中的重组酶位点的残留拷贝，其在某些实施方案中是由重编程过程产生的唯一遗传变化。
在某些实施方案中，构建物包含单一重组酶位点，其中该位点在构建物插入基因组过程中被拷贝，使得构建物的至少编码含有因子的聚蛋白的部分(以及任选的希望需要从基因组移除的构建物的任何其他部分)，在整合到基因组中后在两侧带有两个重组酶位点。例如，重组酶位点可以在反转录病毒(例如慢病毒)载体的3′LTR中(参见例如实施例4)。
在某些方面，本发明提供了包含多顺反子核酸构建物的载体。在某些实施方案中，载体是反转录病毒载体例如慢病毒载体。在其他实施方案中，载体是非反转录病毒载体，例如其可以是病毒(例如腺病毒)或非病毒的。示例性的多顺反子核酸构建物、表达盒和载体描述在实施例3中。
在某些方面，本发明提供了细胞和细胞系(例如体细胞和细胞系例如成纤维细胞、角化细胞和本文中讨论的其他类型的细胞)，其在基因组中整合有多顺反子核酸构建物或表达盒(例如本文描述的任何构建物或表达盒)。在某些实施方案中，细胞是啮齿动物细胞，例如鼠类细胞。在某些实施方案中，细胞是灵长动物细胞，例如人类细胞。
在某些实施方案中，至少构建物的编码聚蛋白的部分两侧带有重组酶位点。在产生重编程细胞后，可以通过例如蛋白转导将重组酶导入细胞中，或者可以使用载体例如腺病毒载体将编码重组酶的基因导入到细胞中。重组酶从基因组切除编码外源重编程因子的序列。在某些实施方案中，细胞含有编码重组酶的诱导型基因，其中重组酶在诱导后表达并切除表达盒。在某些实施方案中，诱导型基因被整合到基因组中。在某些实施方案中，诱导型基因在游离基因上。在某些实施方案中，细胞不含编码重组酶的诱导型基因。
在某些实施方案中，使用例如同源重组将核酸构建物或表达盒靶向基因组中的特定基因座。在某些实施方案中，基因座是对哺乳动物体内大多数或所有细胞类型的发育非必要的基因座。在某些实施方案中，基因座是其中插入不影响从基因座中含有插入的体细胞产生多能iPS细胞的能力的基因座。在某些实施方案中，基因座是其中插入不扰乱ES细胞的多能性的基因座。在某些实施方案中，基因座是COL1A1基因座或AAV整合基因座。在某些实施方案中，基因座包含组成型启动子。在某些实施方案中，构建物或表达盒是定向的，以便从构建物或表达盒所定向的基因座中存在的内源启动子来驱动编码含有因子的聚蛋白的多顺反子信使的表达。
本发明还提供了从基因组中带有核酸构建物或表达盒的体细胞产生的多能重编程细胞(iPS细胞)。iPS细胞可用于为多能细胞所设想的任何目的。此外还提供了源自于多能重编程细胞的分化的细胞系(例如神经细胞、造血细胞、肌肉细胞、心脏细胞)。从其产生的示例性的体细胞和iPS细胞描述在实施例3中。
本发明确定了重编程因子具有允许在2A序列位于重编程因子之间时对其进行有效加工的先决结构特点，这是一个重要的发现，因为认识到了切割是基于结构的事件(Szymczak，同上)。本公开确定了在其C-末端具有附加的来自2A肽的～17-21个氨基酸的转录因子保留了进入核并执行其功能的能力。本公开还确定了重编程因子能够忍受保留在上游蛋白的C-末端上的来自2A肽的附加的～17-21个氨基酸的存在，并在重编程中保持功能。
尽管用高滴度反转录病毒载体感染以表达所需重编程因子的重编程是高度可重复的，但过程相对低效，并且在因子的表达时间和次序方面的精确要求以及所需的绝对和相对表达水平，还未完全了解。此外，当在许多现有方案中通过用各自编码单个因子的多个病毒感染细胞来产生iPS细胞时，已显示每个病毒引起了2-6个之间的位置处的整合，导致整个基因组中～14-20个插入事件。该过程产生了遗传修饰的iPS细胞，其可能含有未知的插入产生的突变。此外，因为仅有一小部分被感染的细胞变得重编程，因此使用这些多病毒方案获得的结果没有解决这样一个问题，即整合的位置和/或来自转基因的表达所发生的相对时间是否是细胞将变得重编程的一个重要决定因素。本发明确定，从多顺反子转录本基本上同时地表达多个因子、并且相对水平依赖于2A切割事件的效率，能够有效诱导重编程。此外，本发明确定，因子的单个拷贝对于重编程是足够的。因为在本发明的某些实施方案中，四种因子从确定的位置表达(例如预先选定的位置或在载体整合后决定的位置)，因此多顺反子载体系统可以简化重编程机制的研究并便于载体的切除。在某些实施方案中，这样的切除导致移除了至少编码重编程因子的外源序列。在某些实施方案中，这样的切除产生除了某些实施方案中残留的重组酶位点之外不带有遗传修饰的iPS细胞。在其他实施方案中，具有不超过2、3、4或5个残留的重组酶位点。不希望受到理论的限制，含有单个整合构建物的重编程细胞将增加使用基于重组酶的手段回收不含转基因的iPS细胞的可能性或容易度。还考虑到了编码2、3或4种因子的多顺反子载体可以与增强重编程和/或代替不由多顺反子载体编码的一种或多种因子的小分子、蛋白或其他药剂组合使用。
实施例4描述了使用Cre重组酶切除型病毒从患有帕金森氏病(PD)的个体的成纤维细胞产生不含重编程因子的人类诱导多能干细胞(hiPSC)的实验。在本发明的某些实施方案中，不带有编码重编程因子的外源基因的iPS细胞，如实施例4中所述或使用类似方法产生，区别在于使用了包含编码含有多个因子(2、3或4种因子)的聚蛋白的多顺反子核酸构建物的单一载体而不是编码单个因子的多个载体。当然，实施例4中描述的方法也可以使用编码单个因子的多个载体，以便获得不含编码重编程因子的外源基因的iPS细胞，其中得到的iPS细胞仅具有少数残留的重组酶位点。尽管在实施例4中使用来自患有PD的个体的成纤维细胞作为示例性细胞类型，但方法也适用于从正常体细胞(例如成纤维细胞或其他细胞类型例如角化细胞、肠细胞、血液细胞)或从来自患有目标疾病的个体的体细胞产生具有最少遗传改变的iPS细胞。在某些实施方案中，编码反式激活子的基因也在两侧带有重组酶位点，以便也将其从基因组中移除。
从它们获得的iPS细胞和分化细胞可用于研究目的(例如作为模型系统研究疾病和/或鉴定疾病的治疗药剂)，和/或用于开发基于细胞的疗法，其在某些实施方案中是患者特异性的基于细胞的疗法。
C.人类iPS细胞的发育潜力以及从外周血的衍生
iPS系统的令人激动的潜力是产生患者特异性多能细胞。本文描述的工作记述了允许在体外使用患者特异性iPS细胞研究复杂的人类疾病的方案。例如，目前，患者特异性iPS细胞从深部皮肤活检组织产生。在建立在临床情况下分离iPS细胞的可能更简单的方案的尝试中，本文描述的方法使用了外周血作为供体材料以产生iPS细胞。
D.筛选小分子
本文描述的工作提供了用于鉴定改进重编程效率的小分子的高通量系统。这允许建立起不需遗传操作或插入外源遗传元件例如载体介导的癌基因如C-MYC或KLF4的转导的重编程方法。
II.实验方法
在小鼠系统中，使用允许转录因子的药物诱导型表达的载体，对于确定导致重编程的分子事件来说是关键的。这些实验表明，重编程涉及ES细胞标志物例如碱性磷酸酶、SSEA1、Oct4和Nanog的顺序活化，并且被转导的转录因子需要表达至少12天以便产生iPS细胞[Brambrink，2008#6877]。目标A的主要目的是产生有助于体细胞的重编程并允许对人类ES和iPS细胞进行遗传操作的工具。这些工具对于致力于人类体细胞重编程的机制的目标B是重要的。目标C的目的是建立实验系统，用于在体外以及嵌合小鼠体内评估人类iPS细胞分化成有功能的神经元细胞的潜力。此外，我们将设计用于从人类外周血产生iPS细胞的方案。最后，目标D的焦点在于筛选作为可替代物通过遗传手段活化重编程途径的化学化合物。
A.产生用于人类ES和iPS细胞的遗传操作的工具
通过同源重组遗传改变内源基因的能力已经革新了生物学，并且与胚胎干细胞组合，为分子医学带来了极大希望。尽管在小鼠ES细胞中基因定向是常规步骤，但将该技术转移到人类胚胎干细胞在以前是困难的[Giudice，2008#6863]。事实上，自从Thomson在十年前首次分离到人类ES细胞起，仅出现4份出版物报道了成功的内源基因定向[Davis，2008#6860；Won，2007#6857；Zwaka，2003#6223；Urbach，2004#6163]。为了实现人类ES细胞的全部潜能，需要克服遗传修饰内源基因的困难。
本工作的焦点在于建立允许对人类ES和iPS细胞进行有效遗传操作的工具。为了产生在谱系特异性基因中带有标志物的huES细胞，我们将使用两种不同方法，使用常规的同源重组产生在关键的发育调控子中带有标志物的遗传修饰的人类ES细胞。这些插入到谱系特异性基因中的标志物，将被用于随后将iPS细胞分化成特异性神经元谱系的目的。也开发了允许在缺少反转录病毒介导的因子转导的情况下对体细胞进行有效重编程的实验系统。
谱系特异性基因通过同源重组的寻靶
通过插入到谱系特异性内源基因中的可用于分离所需分化细胞类型的标志物，促进了从未分化ES细胞产生分化细胞。我们的初步实验证实了GFP或药物抗性标志物在OCT4以及COL1A1基因座中的定位。因此，目标是产生这样的ES和iPS细胞，即其在神经或其他谱系的细胞所表达的基因中带有药物抗性标志物和/或GFP(或其他可检测标志物)序列，并可用于筛选或选择在疾病例如阿茨海默氏病和帕金森氏病中受影响的分化的细胞类型
(i)神经谱系特异性靶基因通过同源重组的基因定向：
与小鼠ES细胞相反，在筛选细胞克隆用于增强单细胞生长的染色体畸变时，人类ES细胞通常仅使用有限的酶消化进行机械传代。这种情况以及缓慢的生长，可能是在huES细胞中基因定向效率如此之低的重要原因。最近，已经显示向huES细胞施加ROCK抑制剂Y-27632显著降低了解离诱导的凋亡并增加了克隆效率[Watanabe，2007#6549]。因此，所有实验将在存在这种抑制剂的情况下进行。
为了进行同源重组，使用常规程序，从BGO2或H9ES细胞的等基因的基因组DNA构建了含有由2A序列隔开的GFP和neo抗性标志物的定向载体。按照已发表的程序将DNA通过电穿孔转入细胞[Costa，2007#6868]，并从药物抗性集落分离DNA并分析正确的定向。我们将对在神经分化过程中不同时间并在如下详述的不同神经元亚组中活化的基因进行定向。
SOX1：转录因子SOX1是最早了解到的专门在小鼠的神经前体细胞中表达的基因[Aubert，2003#6841]。插入到该基因中的GFP用作筛选huES或iPS细胞衍生的神经元前体细胞的便捷标志物。
FOXG1：该基因的表达已在增殖的端脑前体细胞和基底前脑的乙酰胆碱能神经元[Hebert，2000#6844]、在阿茨海默氏病中受影响的细胞中得到证实。
PITX3：该同源域转录因子在酪氨酸水解酶阳性神经元的终末分化过程中选择性表达，并且分拣从PITX3-GFP转基因小鼠产生的分化的ES细胞，已被显示富集了多巴胺能神经元[Hedlund，2008#6845；Zhao，2004#6846]。
LMX1：该同源域转录因子似乎是增殖的多巴胺能前体细胞的关键决定因素[Andersson，2006#6840]。
已经显示，相关的谱系特异性基因被GFP的标记帮助建立了强有力的分化方案，以允许分离富集的或甚至同质的分化细胞群。在4个基因中带有GFP的HuES细胞，允许富集前体以及与源自患有疾病例如阿茨海默氏病或帕金森氏病的患者的iPS细胞的研究相关的更分化的细胞。
建立同源重组的有效方法的困难极大地阻碍了huES细胞系统的利用。初步数据是令人鼓舞的，并证明了两个内源基因座OCT4和COL1A1已经被GFP和嘌呤霉素抗性cDNA定向(图10)。但是，到目前为止只有在ES细胞中表达的基因(OCT4、HPRT、ROSA26[Irion，2007#6857；Zwaka，2003#6223；Urbach，2004#6163])或准备表达的基因例如MOXL1[Davis，2008#6860]，已经在人类ES细胞中定向。此外，在小鼠细胞中COL1A1基因座是高度诱重组性的[Beard，2006#6199]，并且该基因座的定向可能对于其他非表达基因来说不是代表性的。因此，因为我们的目的是通过同源重组定向非表达基因，因此这种目的提出了挑战。
带有不同重编程因子组合的“次级”iPS细胞
我们已经显示，小鼠iPS细胞可带有15个或以上的原病毒插入[Wernig，2007#6641]，提示对少部分具有每种载体多个拷贝的细胞进行强力选择，以获得启动重编程过程所需的因子的高水平或某种化学计量的表达。本文描述的是回避了对病毒转导的需求、从而消除了对选择少部分带有原病毒的“正确”组合的细胞的必要性的系统。事实上，以克隆手段从“初级”iPS细胞产生并带有适合数量的DOX诱导型原病毒、一开始已实现重编程的“次级”成纤维细胞，允许我们将成熟的B细胞重编程到多能状态[Hanna，2008#6842]。这种方法适合于人类细胞，并且其产生的次级成纤维细胞携带的重编程因子(i)作为原病毒载体整合到预先选择的染色体位置中或(ii)通过同源重组插入到基因组表达基因座中。该系统可用于确定重编程的机制，并用于筛选增强重编程或代替任一种因子的小分子。
(i).带有预先选定的原病毒的次级成纤维细胞：为了预先选择带有“正确的”反转录病毒拷贝的组合和数量的细胞，可以利用两步方案。图23A-23B概括了这种方法，其依照与用于将小鼠B细胞重编程成iPS细胞相同的逻辑[Hanna，2008#6842]。首先，将在OCT4基因中带有GFP标志物以及慢病毒转导的tetrtTA反式激活子的ES或iPS细胞分化成成纤维细胞。这些“初级”成纤维细胞将使用DOX诱导型载体转导所有4种因子，并在DOX存在下培养和筛选OCT4的活化，以分离重编程的“初级”iPS细胞。这些iPS细胞将在不存在DOX下分化，产生“次级”成纤维细胞(图23A)。这种方法的根本原理在于，由于次级成纤维细胞在第一步中作为“初级”iPS细胞筛选，因此它们带有“正确的”载体拷贝的组合。这些次级成纤维细胞是遗传同质的，因为它们从单一iPS集落产生。在向这样的培养物添加DOX后，整合的载体将被重新活化，导致一致地产生“次级”iPS细胞，而不需要新的因子转导(图23B)。这可以用于产生人类次级iPS细胞(或小鼠、猴等)，而不用经过从初级iPS细胞产生动物的过程。可选地，DOX诱导型多顺反子载体(图13A-13C)可用于代替单因子载体，用于产生初级iPS细胞。
(ii).在COL1A1基因座中带有重编程因子的次级成纤维细胞：为了努力避免所有的反转录病毒感染，产生了在COL1A1基因座或其他非必需基因座例如ROSA26或AAVS1基因座(其中整合了腺相关病毒(AAV)的特定基因座)中带有所有重编程因子的次级成纤维细胞。在小鼠ES细胞中，我们已经显示Col1a1基因座可以被有效定向，以产生被插入的转基因的可重复的遍在表达或诱导型表达[Beard，2006#6199；Hochedlinger，2005#5758]。构建了报告细胞，其除了Dox诱导型rtTA反式激活子和OCT4GFP报告基因之外，还含有插入到COL1A基因座中编码在tet操作子控制下的所有或一部分重编程因子的多顺反子载体(图24)。在该图中，OCT4、SOX2和cMYC已被插入到COL1A1基因座中。初级成纤维细胞将在体外产生，并用两侧带有两个Lox位点的KLF4病毒感染。如上所述筛选具有由DOX诱导的三种因子的初级iPS细胞，并通过Cre转导删除KLF4病毒[Hanna，2007#6781]，并通过体外分化产生缺乏vKLF4的次级成纤维细胞。这些细胞可用于筛选在重编程中代替对KLF4的需要的小分子(参见后文目标D)或用于精简瞬时转染方案(目标B.2，4)。
重编程筛选了小部分带有高的原病毒插入数量的iPS细胞。在本目标中提出的实验力图建立允许更有效和可重复地重编程的实验系统，同时过程将不依赖于筛选稀少的iPS细胞的随机原病毒插入。目的是产生携带2或3种DOX诱导型因子的任何组合的次级成纤维细胞，因此将允许筛选代替失去的因子的小分子，用于我们筛选能够增强或诱导重编程的小分子的目标(目标D)。此外，本系统对于研究重编程的分子机制也是重要的(目标B.4)。
B.人类体细胞的体外重编程
DOX诱导型慢病毒系统已被用于确定小鼠成纤维细胞的重编程动力学。本文描述的工作使用了上面描述的工具来确定人类体细胞重编程的动力学和最低载体表达。此外，我们将开发最小化或避开遗传改变的重编程方法，并且我们将使用插入诱变来分离增强重编程的其他基因。最后，我们将确定iPS细胞的表观遗传状态以及重编程的中间阶段。
C.发育潜力和从血液供体细胞的衍生
患者特异性iPS细胞的最重要应用是它们在试管中研究复杂人类疾病的潜力。对于这种应用来说，需要在该技术可用于临床情况下之前，建立起稳固的实验方法。本文描述的工作建立了允许iPS和huES细胞的可重复的体外分化和iPS细胞的体内潜力评估的程序。也可以进行从人类外周血样品分离iPS细胞。
3.B细胞、T细胞和巨噬细胞作为供体
将从外周血样品获得的细胞代替来自深层皮肤活检组织的细胞进行直接重编程是有利的，因为这将便于在临床环境下产生患者特异性iPS细胞。最近，我们显示了不成熟和成熟的小鼠B细胞能够有效地重编程成多能iPS细胞，并且这些细胞带有供体细胞特异性的免疫球蛋白基因座的基因重排[Hanna，2008#6842]。令人吃惊的是，重编程成熟小鼠B细胞的效率是3％，其显著高于成人成纤维细胞或MEF的效率。本目标将力图使得用于小鼠类淋巴细胞的重编程方法适合于人类外周血样品。
供体细胞：需要用c/EBPa转录因子进行转导，以赋予成熟的小鼠B细胞对四种重编程因子的作用的易感性[Hanna，2008#6842]。我们将从人类外周血分离各种不同细胞群，并测试它们对重编程的易感性。
(i)B和T细胞：为了试图改造用于小鼠B细胞重编程的方案，我们将使用已建立的程序来刺激B和T细胞的增殖[Mercier-Letondal，2008#6855]，并用转导c/EBPa和tetrtTA反式激活子的载体感染细胞。在细胞因子中培养几天后，将细胞用四种DOX诱导型重编程因子OCT4、SOX2、C-MYC和KLF4转导，并在ES细胞培养基中培养。通过形态和对多能性标志物例如TRA160、SSEA3/4、NANOG和OCT4的表达进行测试，分离重编程的集落。为了验证iPS细胞的供体细胞来源，我们将分析基因组DNA中Ig或TCR重排的存在。
(ii)单核细胞：我们使用小鼠的结果表明，成熟B细胞重编程中的中间步骤可能是巨噬细胞样细胞[Hanna，2008#6842]。通过Ficoll梯度离心从人类志愿者的白细胞层分离单核细胞，并收集粘附性细胞。按照已建立的程序将细胞在IL4和GM-CSF中生长[Damaj，2007#6854]。然后我们将用四种因子OCT4、SOX2、cMYC和KLF4如上所述转导细胞，并在存在DOX的ES细胞培养基中继续培养。挑取具有iPS形态的集落，并如上所述分析多能性标志物的表达。血液衍生的iPS细胞的发育潜力将通过标准程序例如畸胎瘤形成和体外分化进行评估。
目前，分离患者特异性iPS细胞的策略设想的是对源自于深层皮肤活检组织的供体细胞进行重编程，该程序比采血更为复杂和痛苦。对于常规临床应用来说，设计从外周血样品常规分离患者特异性iPS细胞的可重复的方案是明显有利的。我们期望所提出的实验将帮助建立这样的方案。
由于小鼠B细胞重编程的简便和效率，我们得到鼓励，这种方案在人类外周血衍生细胞的重编程中也应该是有效的。因为B或T细胞衍生的iPS细胞将在Ig或TCR基因座中分别带有遗传重排，因此使用巨噬细胞或单核细胞作为供体对于潜在的治疗应用可能是有利的，因为它们将不带有遗传改变。尽管我们不了解导致c/EBPα赋予成熟B细胞对OCT4、SOX2、cMYC和KLF4引起的重编程有易感性的机制，但它可能涉及B细胞的身份向巨噬细胞的转变[Xie，2004#5447]。这些考虑表明，从人类单核细胞产生iPS细胞可能是直接的。但是，如果在小鼠中开发的程序不能产生血液衍生的人类iPS细胞，我们将使用已建立的方法筛选其他因子。
D.对小分子的筛选
通过反转录病毒载体介导的基因转移、特别是癌基因的转导来诱导重编程，呈现了对这种方法的最终治疗性应用的严重障碍。例如，我们和其他人[Okita，2007#6542]已经看到，由于v-mycc-Myc的活化，在iPS细胞产生的嵌合体中形成了肿瘤。因此，鉴定增加重编程效率或活化相关途径并因此取代了对表达给定因子例如C-MYC或KLF4的需要的小分子，将是有利的。本目标的目的是建立高通量的基于细胞的分析系统，用于从化学文库中筛选这样的化合物。
D.1用于小分子文库筛选的实验设计和报告细胞
为了在高通量筛选中检测重编程，我们需要带有标志物例如插入到内源OCT4或NANOG基因座中的GFP的细胞。这样的细胞将不表达标志物，但是可用于筛选活化任一内源基因的化合物。
为了设立用于重编程的高通量筛选，我们考虑了限制实验涉及的两个主要制约因素。
●异质细胞群：最关键的限制大概是胞用四种因子转导成纤维细将产生遗传上异质的细胞群。正如前面在V.A.3中讨论的，可能只有带有特定数量的病毒载体、能够产生四种因子的“正确的”表达水平或表达水平的“正确的”组合的少部分感染细胞，才能在重编程筛选时被筛选到。因此，每个孔中的感染细胞在病毒整合和病毒拷贝数方面不同，阻碍了在筛选中对暴露于不同化合物的孔进行有意义的比较。
●分析法的标志物活化频率、灵敏度和时间限制：为了建立筛选，另一个重要的考虑涉及检测系统的灵敏度：需要多少细胞表达OCT4-GFP报告基因才能在给定孔中被检测到？报告基因的表达是一个重要制约因素，因为重编程细胞的比例需要足够高，以在具有活性化合物的孔中产生至少单个可检测的重编程事件。此外，重编程的细胞只有在用四种因子感染后3到5周才在成纤维细胞群中出现。因此，被感染的细胞需要在这段时间内在96孔或384孔板中存活并增殖，这限制了可以铺板的细胞的数量。
为了克服这些限制，我们将产生遗传上同质的成纤维细胞群，因为它们(i)带有相同数量的载体整合或(ii)带有通过同源重组插入到内源表达基因座中的各种不同的重编程因子组合。
(i).带有特定和预定的原病毒组合的“次级”克隆成纤维细胞：最近，我们显示了可以从通过用转导四种转录因子Oct4、Sox2、c-myc和Klf4的DOX诱导型慢病毒对成纤维细胞进行感染而产生的“初级”iPS细胞来产生“次级”小鼠iPS细胞[Hanna，2008#6842]。因为在“次级”成纤维细胞中带有原病毒拷贝的“正确”组合和数量，因此不需要病毒感染来诱导B细胞向次级次级iPS细胞的重编程。
我们将按照与预先选择带有“正确的”反转录病毒拷贝组合和数量的细胞相似的方案。如图23A-23B中所示，通过不使用DOX的体外分化从“初级”iPS细胞产生了“次级”成纤维细胞。代替使用转导单个因子的载体，我们将替代地使用如图13A-13C和14A-14E中所述的多顺反子构建物来转导因子的不同组合。正如在VI.A.3中概述的，这种使用“次级”成纤维细胞或B细胞的方法引起了重编程因子的有效和DOX依赖性的活化，导致不需任何附加的病毒感染即可形成iPS[Hanna，2008#6842]。为了评估在添加DOX后产生的iPS细胞的比例，我们将在96孔板中每个孔铺板500到1000个细胞，在384孔板中每个孔铺板约100个细胞，并评估了GFP阳性细胞的比例。在小鼠细胞中的结果表明，次级iPS细胞只在DOX诱导后2到3周才产生。因为细胞在96孔或384孔板中只能培养约7天，因此我们将在铺板前用DOX对次级成纤维细胞预处理不同的时间。
(ii).在COL1A1基因座中带有DOX诱导型重编程因子的转基因成纤维细胞：我们已经显示，插入到Col1a1基因座中的转基因在转基因小鼠中高度表达，并且如果在tet操作子的控制之下，在施加DOX后能够在所有组织中可重复地活化[Beard，2006#6199；Hochedlinger，2005#5758]。我们将把在tet操作子控制之下表达3种或所有4种重编程因子的不同组合的多顺反子构建物插入到在OCT4基因座中带有GFP标志物的huES细胞的COL1A1基因座中(图10)。此外，将细胞用转导rtTA反式激活子的慢病毒载体感染。细胞将分化成次级成纤维细胞，其可筛选增强重编程或代替给定因子的化合物(参见后文，图24)。
D.2筛选增强重编程效率的化合物
为了筛选增加重编程效率的化合物，我们将在DOX存在下培养带有所有四种因子的“正确”组合的次级iPS细胞或在COL1A1基因座中带有所有四种因子的成纤维细胞(图24)。在初步实验中，我们将确定可以在筛选中检测到的GFP阳性细胞的比例。由于从用四种因子转导的成纤维细胞产生的重编程细胞的比例低，因此除非给定化合物显著增加重编程细胞的比例，否则在每个96孔或384孔板可以铺板的1000或100个细胞中检测单个重编程细胞可能是困难或不可能的。但是，该分析法具有非常低的背景，这补偿了固有的低信号。
在试筛选中，我们将测试在四种因子报告细胞中产生的GFP阳性细胞的比例，所述报告细胞在DOX存在下培养并且用或没有用5-azadC处理或DNMT1siRNA载体进行感染，这两种处理方式都将降低整体DNA甲基化水平，是已显示出能增加小鼠成纤维细胞的重编程的处理[Mikkelsen，2008#6891]。在任何这些条件下GFP阳性细胞的比例，将决定在严紧性较低的筛选中需要在每个孔铺板多少个细胞才能检测增加GFP阳性细胞比例的化合物。更严紧的筛选将使用未用5-azadC处理或未用DNMT1siRNA载体感染的细胞，因为这将对未增敏的细胞进行监测，以筛选与上述相比更有效地活化报告基因的化合物。
D.3筛选代替四种因子任一种的化合物
为了筛选能够代替任一反转录病毒转导的因子的化合物，我们将用可以独立调控的载体转导细胞。方法的概念是三种因子在一个诱导型系统的控制之下，第四种因子在独立的诱导型控制之下。我们将使用两种不同策略产生用于筛选的细胞。
(i)三苯氧胺诱导型载体：我们已产生了转导OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC雌激素受体(ER)融合构建物的载体[Grandori，1996#6505]，通过向培养基添加三苯氧胺激活其表达(图11B)。如图26中所概述，OCT4-GFP报告初级成纤维细胞将用表达三种三苯氧胺诱导型因子的反转录病毒和从DOX依赖性载体表达的第四种因子转导。感染的细胞将生长在含有三苯氧胺和DOX的培养基中，并通过筛选GFP表达选择“初级”iPS细胞。如上所述，产生次级成纤维细胞，将其暴露于三苯氧胺以活化三种三苯氧胺依赖性因子，并在不存在DOX和cMYC表达的情况下筛选活化GFP报告基因的小分子化合物。
(ii)在COL1A1基因座中带有不同因子组合的转基因成纤维细胞：我们将采取图24中概述的避免反转录病毒感染的替代策略。初级成纤维细胞将从除了OCT4-GFP标志物和转导了tetM2rtTA反式激活子的病毒之外还在COL1A1基因座中带有编码三种重编程因子的任何组合的多顺反子构建物的huES细胞产生[Beard，2006#6199；Hochedlinger，2005#5758]；对比图13A-13C和14A-14E)。将成纤维细胞用两侧带有Lox并带有失去的第四种因子(图24中是KLF4)的载体转导，并将产生初级iPS细胞。在Cre转导以删除KLF4载体后，将产生次级成纤维细胞。DOX暴露将活化插入到COL1A1基因座中的三种DOX依赖性因子，并且细胞将可用于筛选在不存在失去的第四种因子(在这种情况下是KLF4)的情况下活化GFP报告基因的小分子。为了增加筛选的灵敏度，我们将使用已用5-aza-dC处理的细胞。
D.4筛选平台
小分子文库的筛选将与Scripps的S.Ding的实验室合作进行(参见S.Ding的来信)。例如，Ding的实验室已经开发并优化了基于细胞的表型高通量筛选[Xu，2008#6875]，并鉴定到在化学确定培养基中并且不存在LIF的情况下维持ES细胞的自身更新的小分子pluripotin[Chen，2006#6871]。筛选是基于Oct4启动子驱动的GFP标志物的表达。我们将针对GFP活化来筛选带有上述不同的因子组合的OCT4-GFP转基因成纤维细胞。
任何在筛选中得分为正的化合物的活性，将在确定的培养条件下验证。主要问题是调查参与重编程过程的分子途径。
可能的结果和解释：我们预期对OCT基因活化的筛选将鉴定到促进从体细胞表观遗传状态向具有多能细胞特征的状态转变、并因此使重编程过程更加有效的化合物。这些实验的另一个重要目的是发现能够代替对涉及编码癌基因例如cMYC、OCT4或KLF4的基因进行转导的遗传操作的需要的小分子化合物。
高通量筛选的两个最重要的潜在问题是(i)发生重编程所需的时间，以及(ii)在可以铺于96或384孔板的每个孔中的有限细胞数量中是否可以检测到稀少的重编程事件。正如上面讨论的，我们将对细胞进行预调制使其带有“正确的”因子数量和组合，并进一步增敏细胞以增加各种报告基因的重编程诱导的活化频率。一旦鉴定到增加重编程效率的化合物，它们将在随后的筛选中用作增敏剂，以筛选能够进一步增加iPS细胞形成的其它化合物。
重要性：现有的诱导重编程的策略依赖于强有力的癌基因的转导，这对于任何治疗性应用来说是是一种障碍。本目标力图鉴定能够活化相关途径的小分子，从而提高效率并可能使诱导重编程所需的遗传改变降到最低。
重要性和长期意义
体外产生多能iPS细胞的方法有希望革新复杂人类疾病的研究，并对最终治疗变性疾病具有重要意义。已经显示，小鼠体细胞向多能状态的体外重编程相当有效，并且正在对该过程背后的分子机制进行积极的研究。但是，已证明人类细胞的重编程更加繁琐和困难，在该技术可适用于临床应用之前有大量技术问题需要解决。本文描述的工作力图确定导致人类体细胞向多能状态转变的分子机制，以设计用于评估人类iPS细胞的发育潜力的策略并且不需要遗传操作即可实现重编程。本文描述的工作将有助于解决目前阻碍该技术应用于人类疾病研究及其最终用于变性疾病的移植疗法的一些关键障碍。
实施例3：使用单一多顺反子载体重编程鼠类和人类体细胞
材料和方法
病毒制备和感染
在从FUW慢病毒骨架进行EcoRI克隆后，产生了含有在四环素操作子和最小CMV启动子控制下的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的4F2A慢病毒载体构建物。所有构建物都在通过PCR扩增后使用独特的限制性位点以将单个因子置于相应的2A肽之间来产生(第一个XbaI-NheI；第二个SphI；第三个XhoI；第四个AscI)。相应的2A序列为：
P2A-
GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT(SEQIDNO：21)；
T2A-
GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT(SEQIDNO：22)；
E2A-
CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCC(SEQIDNO.23)。
不能复制的慢病毒粒子(4F2A和M2rtTA)在293T细胞中用VSV-G外壳包装，并用于感染含有靶向内源Nanog基因座的GFP等位基因的MEF(25)(7)。按照以前的出版物，从小鼠产生14周龄的尾梢成纤维细胞(12)。人类角化细胞(NHFK)从Coriell医学研究所(CoriellInstituteforMedicalResearch)Camden，NJ获得。将来自包装两种病毒中的每种的培养物的病毒上清液合并，通过0.45μM滤膜过滤，并通过超离心进行浓缩。将病毒沉淀重悬浮在ES细胞培养基中(DMEM中添加有10％FBS(Hyclone)、白血病抑制因子、β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸(都来自Invitrogen))，然后施加于细胞24小时。
Western印迹
100μl裂解缓冲液含有2％SDS、10mM二硫苏糖醇、10％甘油、12％尿素、10mMTris-HCl(pH7.5)、1mM苯基甲基磺酰氟、1x蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、25μMMG132蛋白体(protesome)抑制剂，并将其煮沸5分钟。然后使用Bradford试剂(Pierce)并在590nm处获取分光光度读数，对蛋白进行定量。对照使用牛血清白蛋白产生的标准曲线估算浓度。将总蛋白(5μg)在含有10％SDS的10％变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。然后使用半干式转移装置将蛋白转移到Immobilon-P膜上(Millipore)。将膜在含有2％脱脂奶粉(Bio-Rad)的PBS、0.01％吐温20中阻断。通过与阻断溶液中浓度为50ng/ml的抗体一起温育来检测蛋白。使用的抗体是Oct4(h-134SantaCruzBiotechnology)、Sox2(小鼠单克隆抗体，R&DBiosystems)、c-Myc(06-340Upstate)、Klf4(H-180SantaCruzBiotechnology)、GAPDH(sc-25778SantaCruzBiotechnology)。
定量RT-PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA。将5微克总RNA使用无DNA的RNA试剂盒(ZymoResearch)，用DNaseI处理以除去基因组DNA的潜在污染。使用第一链合成试剂盒(Invitrogen)对1微克DNaseI处理过的RNA进行反转录，并最终重悬浮在100mμl水中。使用1/50的反转录反应液，在ABIPrism7000(AppliedBiosystems)中，使用带有ROX的PlatinumSYBRgreenqPCRSuperMix-UDG(Invitrogen)进行一式三份的定量PCR分析。通过扩增GAPDHmRNA来实现等量上样，并且所有反应进行三份平行样。用于扩增的引物如下：
Oct4F，5′-ACATCGCCAATCAGCTTGG-3′(SEQIDNO：24)和R，5′-AGAACCATACTCGAACCACATCC-3′(SEQIDNO：25)
Sox2F，5′-ACAGATGCAACCGATGCACC-3′(SEQIDNO：26)和R，5′-TGGAGTTGTACTGCAGGGCG-3′(SEQIDNO：27)
4F2A(E2A-cMyc)F，5′-GGCTGGAGATGTTGAGAGCAA-3′(SEQIDNO：28)和R，5′-AAAGGAAATCCAGTGGCGC-3′(SEQIDNO：29)
GAPDHF，5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′(SEQIDNO：30)和R，5′-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3′(SEQIDNO：31)
误差线表示三份平行反应的平均值的标准偏差。
Southern印迹分析
将10μgBamHI消化的基因组DNA在0.7％琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙膜上(Amersham)，并与32P随机引物(Stratagene)标记的针对OCT4(pFUW-tetO-OCT4质粒的EcoRI-PstI片段)、KLF4(全长KLF4cDNA)、c-MYC(全长c-MYCcDNA)和SOX2(pFUW-tetO-SOX2质粒的全长片段)的探针杂交。
免疫荧光染色
将细胞在4％聚甲醛中在25℃下固定20分钟，用PBS清洗三次，并用含有0.1％Triton-X和5％FBS的PBS阻断15分钟。在与针对Oct4(SantaCruzh-134)、Sox2(R&DBiosystems)、Nanog(anti-msR&D和anti-h)、Tra-1-60(小鼠单克隆抗体，ChemiconInternational)、hNANOG(山羊多克隆抗体，R&DSystems)、mNANOG(BethylA300-398A)、Tra1-81(小鼠单克隆抗体，ChemiconInternational)、SSEA4和SSEA1(小鼠单克隆抗体，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)的第一抗体在含有0.1％Triton-X和1％FBS的PBS中温育1小时后，将细胞用PBS清洗三次，并与从JacksonImmunoresearch购买的荧光团标记的适合的第二抗体温育。将样本在Olympus荧光显微镜上分析，使用ZeissAxiocam相机获取照片。
小鼠嵌合体和畸胎瘤的形成
将二倍体囊胚(hCG注射后94-98小时)置于矿物油下的一滴Hepes-CZB培养基中。使用内径为16μm的平头显微注射移液器进行iPS细胞注射。每个囊胚接受8-10个iPS细胞。注射后，将囊胚在钾单纯优化培养基(KSOM)中在37℃下培养并放置，直到将其转移到雌性受体中。将约10个注射过的囊胚转移到交配后2.5天的假孕B6D2F1雌性的每个子宫角。在第19.5天回收幼仔，如果需要交由分泌乳汁的B6D2F1母鼠喂养。通过将2x106个细胞沉积到受体SCID或Rag2-/-小鼠的侧胁来进行对于畸胎瘤的形成。在3-6周后分离肿瘤进行组织学分析。
人类畸胎瘤的形成和分析
通过胶原酶处理(1.5mg/ml)收集hiPSC，并通过随后用培养基清洗并沉降iPSC集落而与饲养细胞分离。通过离心收集iPSC集合体，并以106个细胞的比率重新悬浮在250μliPSC培养基中。通过21号针头将iPSC皮下注射到SCID小鼠(Taconic)的背部。在6周内发展出肿瘤，并在肿瘤尺寸超过直径1.5cm之前将动物处死。在处死小鼠后分离畸胎瘤，并在福尔马林中固定。在切片后，根据苏木精和曙红染色诊断畸胎瘤。使用CLGenetics(Madison，WI)分析核型。
人类IPS细胞体外分化成神经元祖细胞：
使人类角化细胞iPS细胞不传代在培养物中过量生长两周，每天更换培养基。在传代后第15天观察到清晰的神经菊形团，并通过合并玻璃移液管进行机械挑取(26)。将菊形团重新铺在用15μg/ml聚鸟氨酸/10μg/ml层粘连蛋白(Po/Lam)预包被的板上，在添加有FGF2(20ng/ml)和EGF(20ng/ml)(都来自R&DSystems)的N2B27培养基中。在5-7天后，通过在N2B27培养基中用细胞刮刀刮擦和吸取使细胞分离成单细胞，并重新铺板在Po/Lam培养皿上。
分化和免疫细胞化学
神经元祖细胞的分化的诱导，通过从培养基中撤除FGF2和EGF五天来进行。将细胞在4％聚甲醛中固定20分钟，并对人类巢蛋白(Chemicon；1∶100)和Tuj-1(1∶100)进行染色，然后用PBS清洗3次，并与从JacksonImmunoresearch购买的荧光团标记的适合的第二抗体进行温育。将样本在Olympus荧光显微镜上分析，并使用ZeissAxiocam相机获取图像。
结果
使用来自一个启动子的两种、三种或所有四种重编程因子的不同组合构建载体。目标是产生能够使用2A肽从单个启动子表达多个重编程基因的多顺反子病毒载体。为此，将一个、两个或三个含有独特限制性位点的2A寡肽连接到FUW慢病毒(18)骨架中，以允许有效克隆各被不同2A序列隔开的Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。对于使用不同组合的F2A、T2A、E2A或P2A序列来连续携带四个、三个或两个因子的载体(图13A和14A)，通过在人类293细胞中的瞬时转染测试了它们表达各个因子的能力。Western印迹分析证明2A肽支持两个、三个或所有四个顺反子从单个多顺反子载体的有效表达(图14B)。
为了测试多顺反子载体对于重编程的用途，我们一开始将带有2或3种重编程因子的不同组合的反转录病毒载体转导到MEF中，并显示这些构建物与带有另外的单因子cDNA的载体组合，能够产生iPS细胞。重要的是，带有所有四种因子的多顺反子载体能够产生iPS细胞。在该初步实验中，我们将Oct4-GFP成纤维细胞用多顺反子Sox2-Oct4-Klf4-myc载体和附加的Oct4载体共转染(以解释重编程可能需要相对多Oct4蛋白的可能性；图13B)。图13B显示获得的iPS细胞表达AP、SSEA、Nanog和Oct4。此外，从用四因子2A载体加Oct4Moloney病毒感染的iPS细胞系产生了成年嵌合体。为了确定原病毒整合的数量，将Southern印迹用Sox2、Klf4、c-myc和Oct4探针顺序杂交。图13C显示出在3个不同的被测iPS细胞系中的2个中整合有单个多顺反子载体，并且在第三个细胞系中带有2个原病毒(在该细胞系4FO#14中，在一个原病毒中c-myc序列缺失)。令人吃惊的是，在每个iPS细胞系中带有另外的8到11个Oct4原病毒，表明了对多个Oct4原病毒整合的强烈筛选。因为我们在由四个分别转导的因子诱导的iPS细胞中从未看见超过4个或5个Oct4原病毒，因此尽管不能排除，但筛选不太可能是针对高Oct4表达的。另一种解释是对于多个原病毒的筛选是由于对未知细胞基因的插入活化的选择。这些初始数据表明可以从单个多顺反子原病毒表达至少3种重编程因子以诱导重编程。正如将在下面进一步描述的，我们接下来仅仅使用带有四种因子的多顺反子载体成功地产生了鼠类iPS细胞，并且也已使用多顺反子载体系统以产生带有最少遗传变化的人类iPS细胞。
构建了四环素诱导型慢病毒载体，其中基因的表达受到四环素操作子最小启动子(tetOP；图14C)的控制。为了测试单个四因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc)病毒的所有四种基因是否能够在添加DOX后表达，将MEF用多顺反子载体(在下文中称为“4F2A”)以及带有四环素可控的反式激活子(M2rtTA；缩写为rtTA)的组成型FUW慢病毒进行感染。进行了两个独立的实验，并在感染后三天通过qRT-PCR测试病毒的药物诱导型表达。使用针对病毒特异性转录本(E2A-cMyc)的引物，在用DOX培养的细胞中与对照培养基中的细胞相比，观察到了强烈的表达(7-10倍)(图14D)。为了测试与ES细胞相比的相对诱导，使用了不能区别病毒转录本或内源转录本的Oct4和Sox2引物，并且在这两个实验中，感染的DOX诱导的MEF明显高于在ES细胞中(分别超过ES水平～3.5和～17倍)。在感染后第3天分离的细胞的Western印迹分析表明，当细胞不用DOX培养时只有很少或没有蛋白表达，而在DOX存在下看到强有力的诱导，其中Oct4和Sox2蛋白的水平与ES细胞中相似(图14E)。
为了测试4F2A载体是否能够将体细胞重编程到多能状态，将含有由内源Nanog启动子驱动的GFP报告基因的MEF用病毒(4F2A+rtTA)感染。在转导后48小时，85-90％的细胞对Oct4染色，表明了高滴度的感染(图15A)。在添加DOX后几天观察到形态变化(数据未显示)，明显的集落约8天后出现，Nanog-GFP+细胞在DOX诱导后约25天出现(图15B)。在机械分离并随后传代后，细胞具有典型的ES细胞形态并且生长不依赖于DOX。建立了四个独立的4F2AiPS细胞系，它们对于多能性标志物AP、SSEA1和Nanog-GFP是阳性的(图15C)。
为了调查成年体细胞是否能够使用4F2A载体重编程，我们用4F2A+rtTA载体感染了来自14周龄小鼠的尾梢成纤维细胞(TTF)。与MEF相似，在添加DOX培养基后几天，观察到了典型的形态变化。集落在8天左右出现并继续扩增，直到根据形态将它们挑出(第16天)。在几次传代后，建立了四个稳定的iPS细胞系，其对于所有多能性标志物(Nanog、Oct4、SSEA、AP)染色为阳性(图15C)。将MEFiPS细胞系皮下注射到SCID小鼠中，并显示诱导了含有所有三种胚层的分化细胞的畸胎瘤(图16A)。最后，将MEFiPS细胞(#4)注入囊胚产生了新出生的嵌合体(图16B)，证明了单一4F2A多顺反子病毒能够将MEF重编程到多能状态。
为了确定4F2AiPS细胞系中携带的原病毒数量，提取DNA，并使用不在载体序列中切开的酶进行Southern印迹分析。使用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4探针进行杂交，我们检测到分子量一致的条带，证实了因子序列携带在一个原病毒中。对于带有单个病毒插入的iPS细胞系#4，原病毒的总数介于1到3之间(图16C)。来自iPS细胞系#1的两个整合中的一个在c-Myc杂交后不能产生条带，表明可能发生了c-Myc序列的3′缺失。第二个消化证实了原病毒拷贝数(图18A)。
为了估计重编程效率，将MEF用4F2A和rtTA载体感染，并以每个10cm培养皿0.25x106个铺板。在感染后48小时，通过Oct4免疫染色估计有约70％的MEF被感染(图19A)。将细胞在含有DOX的ES培养基中培养20天，然后转移到ES细胞培养基中，直到在第25天对GFP+集落进行计数。在三个独立的培养皿中检测到平均～14.7±4个集落(10+10+17)，表明相对效率为0.0001％。这比“初级”感染的成纤维细胞低1到2个数量级(3，7)。
为了测试使用4F2A病毒进行重编程的动力学，我们进行了dox撤回实验，其中在指定的天数(即2、4、8、12等)，将含有DOX的培养基用ES培养基代替，并在第25天对Nanog-GFP+集落的数量计数。使用分别的药物诱导型病毒递送四种因子，据报道～9-12天是用于产生稳定的iPS细胞的最少时间(20，21)。在该时间期间不对细胞进行传代，以便最小化重编程事件的复制。进行了两个独立实验，在两种情况下都在DOX培养基中培养的板上出现单个Nanog-GFP+集落，与使用分别的病毒所需的最少时间相似(图14B)。
这些数据证明，含有通过三个2A肽相连的四种因子的单一多顺反子病毒，使因子的表达足以从胚胎或成年体细胞产生iPS细胞。重要的是，我们的结果还显示，单个多顺反子原病毒拷贝足以使体细胞重编程为多能性。
使用单个多顺反子病毒产生人类iPS细胞
为了研究人类细胞是否能够用多顺反子载体进行重编程，将新生儿的人类包皮角化细胞(NHFK)用组成型rtTA和DOX诱导型4F2A载体转导。通过在转导后48小时对Oct4进行染色，确定了被感染的细胞比例为10％(图20A)。将细胞在角化细胞培养基+DOX中温育，并允许其生长6天，直到将它们在明胶化的板上在hESC培养基+DOX中进行传代和培养。集落在第12天首次出现，并且大多数显示出转变的形态，有几个集落表现出类似hESC样形态的独特外观。在感染后22到35天之间挑取在独立的感染中产生的两个这样的集落，并发现其扩增成具有类似hESC形态的清晰集落(图17A)。将这些细胞在不存在DOX下扩增，并在附加的2-5次传代后产生了与hESC一致的同质群(Ker-iPS)。细胞对多能性标志物AP、Oct4、Nanog、Sox2、SSEA4、Tra1-60、Tra1-81染色(图17B、图10B)，并具有正常核型(图17C)。DNA指纹分析排除了这些Ker-iPS细胞系是来自于我们实验室以前建立的人类iPS细胞或hES细胞系的污染(数据未显示)。为了确定Ker-iPS细胞系中的原病毒拷贝数，提取基因组DNA，并使用不在载体序列中切开的酶进行Southern印迹分子。针对所有四种重编程因子的探针再次显示出与同样分子量条带的杂交，表明它们携带在单一病毒上。两种不同的消化(XbaI&BamHI)显示出4F2A原病毒拷贝数分别是3(#1.1)和2(#3)(图21A-B)。
为了测试多能性，将一个细胞系Ker-iPS#1.1皮下注射到SCID小鼠中。这些细胞诱导了畸胎瘤，并在组织学检查后发现分化成所有三种胚层的细胞(图17D)。此外，Ker-iPS#1.1细胞当进行体外神经分化方案时，通过免疫染色检测到产生了巢蛋白+神经祖细胞群以及Tujl+有丝分裂后的神经元(图17E)。
讨论：
上面描述的实验显示，插入到多顺反子载体中由2A序列分隔开的最多四种不同重编程因子，可以表达到足以实现重编程的水平。当用转导Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的FUWrtTA和2A载体感染时，胚胎和成年鼠类成纤维细胞以及新生儿的人类角化细胞被诱导形成了多能iPS细胞。
我们观察到重编程效率明显低于以前使用单一载体转导四种因子的每一种的实验(图19B和表3)。
表3：多能性实验以及所有产生的iPS细胞系的相对效率的总结表。GFP，存在的GFP报告基因；ES，ES细胞标志物(AP、SSEA1、Oct4或Sox2)的表达；TF，畸胎瘤形成；PC，新生嵌合体。小鼠的嵌合性通过深浅环纹毛皮颜色评估。
| 细胞系 | 注射的胚细胞 | 成活幼仔 | 嵌合体数量 | 嵌合性(％) |
| MEF iPS #4 | 60 | 30 | 2 | 30-50 |
| MEF iPS #2 | 20 | 14 | 1 | 10 |
可能较低的重编程效率是由于从多顺反子载体以化学计量表达因子所致，其对于诱导重编程来说可能不是最适的。使用分别的载体转导允许每种因子有不同数量的原病毒整合，因此可以筛选产生高表达或不同因子之间最适化学计量的特定一组原病毒整合来进行重编程。但是，已报道2A系统支持体内接近等摩尔的蛋白表达(17)。此外，当使用转导四种因子中每一种的单独载体诱导iPS细胞时，早至DOX诱导后16天时就检测到Nanog-GFP阳性细胞，与此对照，在4F2A载体转导后22-25天观察到GFP阳性细胞，这与未达最适重编程相一致。此外，尽管iPS细胞经常带有多个Oct4或Klf4原病毒，但发现总是具有较少的Sox2原病毒，表明Sox2的高水平表达可能对重编程是不利的(24)。
在其他实验中，使用flp-in转基因系统产生了在胶原蛋白基因座中含有4、3、和2因子2A构建物的多个鼠类细胞系(图22)(20)。系统包含两个组分：四环素可控的反式激活子(rtTA)和驱动目标基因的四环素操作子最小启动子(tetOP)。在添加含有强力霉素的培养基后，反式激活子驱动转基因在胶原蛋白基因座处的表达。如果需要，在Nanog基因处插入GFP报告构建物允许检测到Nanog基因座的完全重新活化，并用作基因组广度的表观遗传重编程的标志物。
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实施例4：不含病毒重编程因子的人类诱导多能干细胞
实验程序
细胞培养
在本文中描述的所有初级成纤维细胞系购自Coriell细胞保藏中心(CoriellCellRepository)。将成纤维细胞在成纤维细胞培养基[DMEM添加有15％FBS(Hyclone)、1mM谷氨酰胺(Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)和青霉素/链霉素(Invitrogen)]中培养。将HiPSC和hESC细胞系BG01和BG02(NIH编号：BG01和BG02；BresaGen，Inc.，Athens，GA)维持在hESC培养基[DMEM/F12(Invitrogen)添加有15％FBS(Hyclone)、5％KnockOutTM血清替代物(Invitrogen)、1mM谷氨酰胺(Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)和4ng/mlFGF2(R&Dsystems)]中丝裂霉素C(MMC)失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上。每5到7天，通过手动或用IV型胶原酶(Invitrogen；1.5mg/ml)酶法处理将培养物传代。按照制造商的说明书，将人类胚胎干细胞H9(NIH编号：WA09，WisconsinAlumniResearchFoundation，Madison，WI)维持在MMC失活的MEF或MMC失活的人类成纤维细胞(D551；美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Manassas，VA)上。对于EB诱导的分化来说，使用1.5mg/mlIV型胶原酶(Invitrogen)收获ESC/hiPSC集落，通过重力与MEF饲养细胞分离，轻柔研磨，在非粘附性悬液培养皿(Corning)中在添加有15％FBS的DMEM中培养10天。
对于Cre重组酶介导的载体切除来说，在电穿孔之前，将hiPSC细胞系在Rho激酶(ROCK)抑制剂(Calbiochem；Y-27632)中培养24小时。使用0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen)收获细胞，并将重悬浮在PBS中的1x107个细胞通过以前描述过的电穿孔(Costa等，2007；GenePulserXcellSystem，Bio-Rad：250V，500μF，0.4cm小杯)，用pCre-PAC(50μg；Taniguchi等，1998)转染或用pTurbo-Cre(40μg；Genbank登记号AF334827)和pEGFP-N1(10μg；Clontech)共转染。然后将细胞在前24小时铺于MEF饲养细胞层上(DR4MEF用于嘌呤霉素筛选)添加有ROCK抑制剂的hESC培养基中。使用下列方法之一筛选表达Cre重组酶的细胞：1)在电穿孔后2天加入嘌呤霉素(2μg/ml)，为期48小时。2)在电穿孔后60小时进行单细胞悬液的FACS分拣(FACS-Aria；BD-Biosciences)以筛选表达EGFP的细胞，然后以低密度重新铺板在含有ROCK抑制剂的hESC培养基中。在电穿孔后10到14天挑取各个集落。
病毒构建物
FUW-M2rtTA慢病毒载体和含有在四环素操作子和最小CMV启动子控制下的KLF4(FUW-tetO-hKLF4)、OCT4(FUW-tetO-hOCT4)、SOX2(FUW-tetO-hSOX2)和c-MYC(FUW-tetO-hMYC)的人类cDNA的慢病毒载体，已在以前描述(Hockemeyer等，2008)。为了产生Cre重组酶可切除的DOX诱导型慢病毒载体，将含有四环素操作子/最小CMV启动子和KLF4、OCT4或SOX2的人类cDNA的NotI/Bsu36I片段，从每个FUW-tetO载体亚克隆到在3′LTR中含有loxP位点的FUGW-loxP的NotI/BSU36I位点中(Hanna等，2007)。
慢病毒感染和hiPSC产生
按照以前的描述在293细胞中产生VSVG包被的慢病毒(Brambrink等，2008)。简单来说，在转染后12小时改变培养基，并在转染后60-72小时收集含有病毒的上清液。将病毒上清液通过0.45μm滤膜过滤。对于3和4种因子的感染来说，合并含有病毒的上清液，并添加FUW-M2rtTA病毒和等体积的新鲜培养基。在转导前24小时将1x106个人类成纤维细胞接种在T75培养瓶中。在存在2μg/ml聚凝胺的情况下在48小时的时间内进行四次连续的感染。最后一次感染后12小时改变培养基。转导后5天，使用胰蛋白酶将成纤维细胞传代，以5X104到2x105个细胞/10cm2之间的不同密度重新铺板在明胶包被的培养皿上。为了诱导重编程，在48小时后将培养基替换成添加有DOX(Sigma-Aldrich；2μg/ml)的hESC培养基。在DOX诱导后3到5周之间，根据形态手动挑取HiPSCs集落，并按照hESC的方案在不存在DOX的情况下手动维持和传代。为了确定重编程效率，将1x105个人类成纤维细胞接种在10cm2的明胶包被的培养皿上。在20天后根据多能性标志物Tra-1-60和NANOG的免疫细胞化学计算重编程效率。
微阵列基因表达分析
使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)，从与饲养细胞机械分离的hESC和iPSC中提取RNA。按照制造商的说明书(Affymetrix单循环cDNA合成试剂盒)，使用2μg总RNA制备生物素化的cRNA。简单来说，该方法包含使用T7-寡聚(dT)启动子引物进行SuperscriptII指导的反转录，以产生第一链cDNA。按照T7RNA聚合酶指导的体外转录进行RNaseH介导的第二链cDNA合成，其在cRNA扩增过程中掺入生物素化的核苷酸类似物。使用在1X杂交混合物中的15μg生物素化的cRNA，按照Affymetrix杂交手册制备用于杂交的样品。将基因芯片阵列(人类U1332.0)在基因芯片杂交炉中，以60RPM在45℃下杂交16小时。使用基因芯片流体工作站450，按照制造商的说明书，使用在Affymetrix基因芯片杂交、清洗和染色试剂盒中提供的缓冲液进行清洗。将阵列在基因芯片扫描仪3000上扫描，使用基因芯片操作软件v1.4提取图像并分析。
U133Plus2.0微阵列(Affymetrix)使用MAS5算法进行处理，每个探针组需不需要存在使用标准Affymetrix算法来确定，两种算法都在Bioconductor中进行。除去在所有样品中都不存在的探针组以进行下一步分析。通过使用R中的“limma”包进行适度t-检验(校正假发现率)或通过倍数变化来确定差异表达。当基因由多个探针组表现时(根据Affymetrix的注释)，基因表达的对数比率和p-值分别被计算为这些探针组的平均值和最小值。在对数变换的基因表达率的基础上，使用非中Pearson相关性和配对平均联接来进行层次聚类。相关性使用Fisher′sZ转换来比较。层次聚类的置信度使用利用R包“pvclust”的多尺度自助模拟重采样(multiscalebootstrapresampling)来计算。
总RNA的反转录和实时PCR
从与饲养细胞机械分离的EB或hESC和iPSC中，使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)或Trizol提取以及随后的乙醇沉淀，来分离RNA。对1μg总RNA使用寡聚dT引物和Thermoscript反转录酶(Invitrogen)在50℃下进行反转录。实时PCR在带有PlatinumSYBRgreenpPCRSuperMIX-UDG和ROX(Invitrogen)的ABIPrism7000(AppliedBiosystems)中，使用一部分在以前描述(Hockemeyer等，2008；Yu等，2007)和一部分在Soldner等，2009，补充实验程序(SupplementalExperimentalProcedures)中描述的引物来进行。
畸胎瘤形成与分析
通过胶原酶处理(1.5mg/ml)收集hiPSC，并通过随后用培养基清洗和通过重力沉降来与饲养细胞分离。通过离心收集iPSC集合体，并重新悬浮在250μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。将HiPSC皮下注射到SCID小鼠(Taconic)的背部。一般在4-8周内发展出肿瘤，并在肿瘤尺寸超过直径1.5cm之前将动物处死。在处死小鼠后分离畸胎瘤，并在福尔马林中固定。在切片后，根据苏木精和曙红染色诊断畸胎瘤。
甲基化分析
从与饲养细胞机械分离的hESC和hiPSC收集基因组DNA。将DNA用蛋白酶K处理并用酚-氯仿抽提，并使用QiagenEpiTect亚硫酸氢盐试剂盒对1μgDNA进行转化。OCT4的启动子区使用以前描述的引物扩增(Yu等，2007)：
OCT4正向：ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT(SEQIDNO：32)
OCT4反相：CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC(SEQIDNO：33)
PCR产物使用pCR2.1-TOPO载体克隆，并使用M13正向和反向引物测序。
免疫细胞化学
将细胞固定在含有4％聚甲醛的PBS中，并按照标准方案使用下列第一抗体进行免疫染色：SSEA4(小鼠单克隆抗体，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)；Tra1-60(小鼠单克隆抗体，ChemiconInternational)；hSOX2(山羊多克隆抗体，R&DSystems)；Oct-3/4(小鼠单克隆抗体，SantaCruzBiotechnology)；hNANOG(山羊多克隆抗体，R&DSystems)；使用适合的MolecularProbesAlexaFluor偶联的第二抗体(Invitrogen)。
Southern印迹分析
将XbaI、EcoRI或MfeI消化的基因组DNA在0.7％琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙膜上(Amersham)，并用32P随机引物(Stratagene)标记的针对OCT4(pFUW-tetO-hOCT4质粒的EcoRI-PstI片段)、KLF4(全长hKLF4cDNA)、c-MYC(全长c-MYCcDNA)、SOX2(pFUW-tetO-hSOX2质粒的FspI-EcoRI片段)和M2rtTA(M2rtTAc-DNA的380bpC-末端片段)的探针杂交。
登记号
微阵列数据可以在NCBI基因表达综合数据库(NCBIGeneExpressionOmnibusdatabase)中在系列登记号GSE14711下获得。
概述
在本实施例中，我们显示了来自5位患有特发性帕金森氏病(PD)患者的成纤维细胞可以被有效重编程。此外，我们使用Cre重组酶可切除病毒产生了不含重编程因子的人类诱导多能干细胞(hiPSC)。无因子的iPSC维持多能状态，并且与带有转基因的hiPSC相比，显示出与hESC更密切相关的整体基因表达分布情况。我们的结果表明，在带有病毒的hiPSC中残留的转基因表达能够影响它们的分子特性，并因此表明无因子hiPSC代表了用于模拟人类疾病的更适合的细胞来源。
结果
通过DOX诱导型慢病毒载体对来自PD患者的成纤维细胞进行重编程
来自5位患有特发性PD的患者(活组织检查时的年龄在53到85岁之间)和两位未患病对象的皮肤成纤维细胞，从Coriell医学研究所(CoriellInstituteforMedicalResearch)获得(参见表4)。为了诱导重编程，将1x106个成纤维细胞用表达反四环素反式激活子的组成型活性慢病毒(FUW-M2rtTA)和转导4种(OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4)或3种(OCT4、SOX2、KLF4)重编程因子的DOX诱导型慢病毒一起进行感染。在后文中，我们将把通过4种因子转导产生的hiPSC细胞系称为hiPSC4F，通过三种因子获得的称为hiPSC3F。在DOX诱导的转基因表达后3到5周，选择并手工挑取具有明确的hESC样形态的集落。所有从PD患者和非PD患者获得的成纤维细胞都产生稳定的hiPSC，它们在不存在DOX的情况下维持30次传代以上。对来自每个供体成纤维细胞系的至少一种细胞系进行了详细分析(表4)。所有这些hiPSC一致地表达多能性标志物Tra-1-60、SSEA4、OCT4、SOX2和NANOG，正如通过免疫细胞化学所确定的(图27A)。此外，所有通过定量RT-PCR分析的hiPSC细胞系都显示出与在hESC中观察到的表达水平相似的内源多能性相关基因OCT4、SOX2和NANOG的重新活化(图27B)。正如对于hiPSC所预期的，发现PD患者衍生的hiPSC的OCT4启动子区的甲基化程度低，与其在亲代成纤维细胞中的高甲基化状态相反(图27C)。为了测试多能性，将从每种供体成纤维细胞系分离的hiPSC注射到SCID小鼠中。所有hiPSC形成畸胎瘤，包含从所有胚胎胚层发育的组织，包括软骨、骨、平滑肌(中胚层)、神经菊形团、色素沉着的神经上皮(外胚层)以及具有杯状和Paneth样细胞的肠上皮(内胚层)(图28A)。
对PD特异性hiPSC细胞系进行的细胞遗传学分析显示，在12个细胞系中有11个具有正常的核型(参见Soldner，2009，补充图1)。从转导有4种因子的成纤维细胞系PDD衍生的三个克隆中只有一个(iPSPDD4F-5)，显示出18号染色体的长臂与22号染色体的长臂之间的不均衡易位，产生了衍生的18号染色体和单拷贝的22号染色体。从非PD患者的成纤维细胞系衍生的两个独立hiPSC(iPSM3F-1和iPSM3F-2)显示出4号和7号染色体的短臂与长臂之间的平衡易位，表明4；7易位在供体成纤维细胞中已经存在(参见Soldner等，2009，补充图1)。进行了PD患者衍生的hiPSC和亲代成纤维细胞的DNA指纹分析，以验证hiPSC的起源并排除与存在的多能细胞系的交叉污染(数据未显示)。探测慢病毒整合的Southern印迹分析显示每个hiPSC细胞系具有独特的图谱，证实了所分析的每个细胞系源自于带有总共4到10个原病毒拷贝的独立感染的成纤维细胞(图28B，28C)。
为了进一步定性该系统的可用性，我们对一个成纤维细胞系(PDB)详细测定了重编程效率。重编程效率在20天后根据多能性标志物Tra-1-60和NANOG的免疫细胞化学进行计算。在用三种因子转导后产生HiPSC的效率约为0.005％，在用四种因子转导后的产生效率约为0.01％。这与以前使用基于Moloney的反转录病毒载体或组成型活性慢病毒载体时所报道的效率相当(Nakagawa等，2008；Takahashi等，2007；Yu等，2007)。在DOX添加后不同时间点对NANOG和Tra-1-60的免疫细胞化学分析显示，在四种因子转导的成纤维细胞中，早至转基因诱导后8天即可检测到小的多能集落(图32A)。通过改变在转导有3种或4种重编程因子的成纤维细胞中DOX诱导的转基因表达的时间，我们还确定了对重编程因子表达的时间要求。在24天后，我们能够从暴露于DOX仅8天的4种因子转导的成纤维细胞分离到hiPSC集落(PDB4F-1、2、3)，而来自3种因子转导细胞的hiPSC只有在暴露于DOX至少12天后才能分离到(PDB3F-d12)。尽管重编程因子仅表达有限的时间，但所有挑取的细胞都产生完全重编程的hiPSC，其对多能性标志物染色(图32B)、重新活化内源OCT4、NANOG和SOX2基因(图32C)，并形成包含源自三种发育胚层的细胞的畸胎瘤(图32D)。我们的结果表明，与用4种因子重编程相比，通过3种因子重编程效率较低并花费较长时间，这与以前的观察相符(Nakagawa等，2008；Wernig等，2008)。但是，我们发现使用三种因子产生hiPSC更加实用，因为被感染的成纤维细胞培养物不会过度生长粒状的、快速生长的非hiPSC集落，正如以前对用4种因子感染的培养物所描述的(Nakagawa等，2008；Takahashi等，2007)。
到目前为止描述的结果显示，重编程因子的DOX诱导型递送能够在不存在c-MYC的情况下，从由PD患者获得的皮肤活检组织有效地产生hiPSC，其动力学和效率与以前报道的使用其他方法相似。重要的是，13个三因子hiPSC中的8个带有总共仅仅3到5个原病毒整合(图28B，28C)，其明显少于在以前的研究中所观察到的(Wernig等，2007)。
不含病毒重编程因子的源自PD患者的hiPSC的产生
为了得到不含原病毒的hiPSC，我们产生了在整合后能够使用Cre重组酶切除的慢病毒载体。将在3′LTR中包含loxP的FUGW-loxP慢病毒(Hanna等，2007)的人类遍在蛋白启动子，用DOX诱导型最小CMV启动子代替，该启动子后跟有OCT4、KLF4或SOX2的人类cDNA。在原病毒复制后，3′LTR中的loxP位点复制到5′LTR中，导致在整合的转基因两侧的LTR中都具有loxP位点(图4A)。使用这3种病毒以及表达反四环素反式激活子的组成型活性慢病毒(FUW-M2rtTA)同时转导1x106个成纤维细胞(PDB)。在添加DOX后3到4周，以与上述相似的动力学和效率分离到24个hiPSC细胞系(PDB2lox-1到24)。对12个细胞系的Southern印迹分析显示，4个PDB2lox细胞系(PDB2lox-5、PDB2lox-17、PDB2lox-21、PDB2lox-22)仅包含5到7个重编程因子整合(图33)。这些PDB2lox细胞系在不存在DOX下维持20次传代以上，并显示出所有hiPSC的特征，例如多能性相关的标志物蛋白Tra-1-60、SSEA4、OCT4、SOX2和NANOG的表达(图29B)，以及内源多能性相关基因OCT4、NANOG和SOX2的重新活化(包含在图31B中)。此外，所有测试的PDB2lox克隆(PDB2lox-5、PDB2lox-17、PDB2lox-21、PDB2lox-22)证明了EB中的体外多谱系分化(数据未显示)，并且在皮下注射到SCID小鼠中以后形成了产生所有三种胚胎胚层的畸胎瘤(图29C)。
我们着力于两个克隆，其带有总共5个(PDB2lox-21)或7个(PDB2lox-17)重编程因子整合，以测试是否慢病毒载体两侧的loxP位点的切除将产生不含转基因的细胞。使用了两种不同的Cre介导的载体切除策略(图30A)：(1)瞬时表达编码Cre重组酶和嘌呤霉素抗性标志物的载体(pCre-PAC)。在电穿孔中，使用嘌呤霉素筛选细胞48小时，以富集瞬时表达Cre重组酶和嘌呤霉素的细胞。(2)共转染Cre重组酶和EGFP表达质粒，并随后在转染后60小时进行FACS分拣，拣出EGFP阳性和表达Cre的细胞。使用这两种方法，我们在电穿孔后10到14天分离到总共180个克隆(图30A)。使用内部EcoRI消化对KLF4(最高的整合数量)切除进行筛选的最初Southern印迹分析显示，48个克隆对KLF4慢病毒整合为阴性(数据未显示)。随后使用XbaI外部限制性消化对KLF4、OCT4和SOX2原病毒整合进行的Southern印迹分析表明，源自PDB2lox-17的7个克隆和源自PDB2lox-21的9个克隆没有整合任何重编程因子(图30B，称为PDB1lox克隆)。使用不同的限制性消化，通过附加的Southern印迹分析证实了所有重编程因子的切除(图34)。此外，使用特异性针对Cre重组酶的引物进行的基因组DNA的PCR证实，没有PDB1lox克隆稳定地整合有电穿孔的质粒(数据未显示)。针对反四环素反式激活子M2rtTA整合的Southern印迹分析显示，PDB2lox-17细胞系有一个整合，PDB2lox-21细胞系有两个整合(图35)。这意味着PDB2lox-21细胞系中包括反式激活子在内的原病毒整合的总数与从PDB2lox-17切除的转基因的数量相同，表明切除包括反式激活子在内的所有转基因应该是可能的。细胞遗传学分析证明，14个被分析克隆中的14个在Cre介导的转基因切除后显示出正常核型(图30C和未显示的数据)。
所有无病毒的克隆在15次传代以上的长时间培养后保持了稳定的hESC样形态，并维持所有的hIPSC特征，例如通过免疫细胞化学所显示的hESC相关标记物蛋白Tra-1-60、SSEA4、OCT4、SOX2和NANOG的表达(图31A)，以及内源多能性相关基因OCT4、SOX2和NANOG的表达与hESC和转基因切除前的亲代hiPSC的水平相当(图31B)。为了证明不含重编程因子的PDB1lox克隆在重编程因子切除后维持多能性，通过EB形成或皮下注射到SCID小鼠中，对独立的PDB1lox克隆进行体外分化。所有测试的PDB1lox克隆在体外显示出多谱系分化，并发展成产生所有三种胚胎胚层的畸胎瘤(图31C)。
为了比较带有整合的转基因的不同hiPSC与不含因子的hiPSC之间的残留转基因表达，我们使用转基因特异性PCR引物进行了定量RT-PCR。正如以前使用慢病毒或基于Moloney的反转录病毒载体所报道的(Dimos等，2008；Ebert等，2008；Hockemeyer等，2008；Park等，2008a；Yu等，2007)，我们在所有带有整合病毒的细胞系中检测到了重编程因子对大多数转基因的残余表达，但是在未感染的成纤维细胞、hESC或PDB1lox细胞系中没有检测到(图31D)。我们的结果表明，使用两侧带有loxP的载体进行重编程然后进行Cre介导的切除，能够有效地产生不含重编程因子的hiPSC。
为了阐明剩余的转基因表达是否能够影响重编程细胞的总体基因表达情况，我们通过基因组范围的基因表达分析比较了hESC、亲代成纤维细胞和转基因切除之前和之后的hiPSC。基于在成纤维细胞与hESC之间显示出表达相差至少4倍的所有基因的初始相关性分析，证实了不论转基因是否被除去，所有hiPSC都与hESC密切相关(参见Soldner等，2009，补充图7)。尽管hESC与hiPSC之间有相似性，但比较PDB1lox和PDB2lox细胞与hESC的关联性的统计学分析证明，PDB1lox细胞与亲代PDB2lox细胞相比更类似hESC(Soldner等，2009，补充图7)。尤其是，基于在带有或不带有转基因的hiPSC之间显示出表达相差至少2倍的所有基因的相关性分析，证实了每个单独的PDB1lox细胞系与PDB2lox细胞系相比，其基因表达情况与hESC更密切相关(数据未显示)。在带有病毒整合的hiPSC中，271个基因显示出与hESC相比有统计学显著性的差异表达(p＜0.05)(图31E)。类似的差异已在以前报道过(Takahashi等，2007)。相反，在不含转基因的hiPSC与hESC之间只有48个基因差异表达(图31E)。这表明在除去重编程因子后失调控的基因减少了80％以上。在不含因子的hiPSC中剩余的差异表达基因更可能是由于hESC和hiPSC的多样化遗传背景或反式激活子的表达或重编程的体细胞来源的遗传记忆所致。差异调控的基因的详细名单显示在Soldner等，2009的补充表1中。
讨论
在本实施例描述的工作中，我们从患有特发性PD的患者获得的皮肤活检组织产生了hiPSC。我们开发了稳固的重编程方案，允许可重复地产生带有低的原病毒载体整合数量的患者特异性hiPSC。使用在整合的原病毒两侧带有loxP位点的修改的慢病毒，允许有效地移除所有转基因序列并产生不含重编程因子的hiPSC。不含因子的hiPSC是多能的，并且使用分子标准判断，与带有常规载体的亲代hiPSC相比，更类似胚胎来源的hESC。了解许多神经变性疾病例如PD背后的病理生理学的努力受到在体外模型中缺乏真实性的阻碍。使用hiPSC技术，我们使用转导3种或4种重编程因子的DOX诱导型慢病毒载体，从5位患有特发性PD的患者上建立了hiPSC细胞系。这些细胞显示出具有多能ES细胞的所有特点，包括分化成所有胚胎谱系的细胞类型的能力。
我们的结果表明，通过Cre/lox介导的重组来移除整合的转基因，能够产生不含载体的hiPSC。以前的报道未能切除两侧带有loxP位点的转基因(Takahashi和Yamanaka，2006)。不受理论的限制，这可能是由于高的反转录病毒整合数量(20个以上)使得不可能完全移除所有原病毒或引起了灾难性的基因组不稳定性。我们的基于DOX诱导型慢病毒转导的结果，显示出可以产生带有少至3或4个病毒整合的hiPSC。使用在3′LTR中具有loxP位点的DOX诱导型慢病毒载体，在Cre重组酶介导的转基因切除后，我们产生了PD患者特异性的不含重编程因子的hiPSC。移除自失活(SIN)慢病毒载体中的启动子和转基因序列，预计将显著降低由于病毒介导的癌基因活化和/或被转导的转录因子的重新表达所引起的癌基因转化的风险(Allen和Berns，1996；vonKalle等，2004)。其余的基因破坏的风险，可以通过将重编程因子作为两侧带有loxP位点的多顺反子单一表达载体定向到基因组的安全港(safe-harbor)基因座中来消除。
不含因子的hiPSC维持多能ESC样状态
尽管已报道了几种hiPSC的转基因表达沉默，但所有到目前为止产生的hiPSC(包括在本实施例中描述的在除去重编程因子之前的细胞系)，都维持低的但是可检测的残余转基因表达(Dimos等，2008；Ebert等，2008；Hockemeyer等，2008；Park等，2008a；Yu等，2007)。因此，hiPSC是否依赖于重编程因子的表达来维持多能ESC样状态这一问题，还没有结论性地解决。不含因子的hiPSC在形态和生物学方面不能与亲代hiPSC相区分并且维持hESC的所有特征的这一观察结果，证明人类体细胞能够被重编程到可以在完全不存在外源重编程因子的情况下维持的自持续多能状态。这些结果提供了hiPSC重新建立多能性相关的自调控回路的附加证据，该观点的提出是依赖于四种内源转录因子OCT4、NANOG、SOX2和TCF3的活化(Jaenisch和Young，2008)。
来自部分沉默的病毒载体的残余转基因表达扰乱了hiPSC的转录情况
因为特定原病毒的基因组整合位点影响原病毒的沉默及其被重新活化的风险，所以具有一致和可预测性质的hiPSC不能通过依赖于随机沉默的方法产生。残余的转基因表达可能影响iPSC的分化性质。事实上，已观察到小鼠ES细胞和iPSC之间分化成心肌细胞的能力的显著差异(K.Hochedlinger，个人通讯)，以及不同hiPSC克隆的部分阻断的EB诱导的分化和不完全的OCT4和NANOG下调(Yu等，2007)。这些观察结果与仅仅部分沉默的载体的可变基础转录可能影响功能分化细胞的产生这一可能性相一致。
在评估载体的移除是否影响hiPSC性质的工作中，我们比较了带有原病毒的亲代hiPSC、不含因子的hiPSC和源自胚胎的hESC中的整体基因表达图谱。正如以前报道的(Park等，2008b；Takahashi等，2007；Yu等；2007)，与供体成纤维细胞相比，带有原病毒的hiPSC和不含因子的hiPSC与hESC聚类更为接近。但是，对不同hiPSC细胞类型之间最趋异的基因进行的更详细的分析显示，与带有原病毒的亲代hiPSC相比，源自胚胎的hESC和不含因子的hiPSC彼此之间更加紧密相关。在不含载体的hiPSC与hESC之间基因表达的残留的少量差异可能是由于在我们的实验中尚未被切除的反式激活子的表达。这里呈现的这些结果提供了清楚的证据，表明在常规iPS细胞中携带的原病毒的基础表达能够影响细胞的分子特征。本文描述的系统为在例如体外和体内分化范例的背景中进一步阐明残留转基因的表达，提供了基础。此外，这些结果证明，产生不含重编程因子的hiPSC，不仅对于潜在的治疗应用、而且对于生物医学研究以便开发更可靠和可重复的体外疾病模型来说，都是极为有利的。为此，我们建议，通过Cre介导的切除产生不含转基因的hiPSC提供了显著优点，例如其高效率和实验的简单性。本文描述的系统有潜力成为一种用于产生hiPSC的常规技术，其将允许从不同来源、使用不同的重编程因子组合产生标准化的hiPSC。
表4
从初级成纤维细胞衍生的hiPSC的概要
NA未获得
a关于这些成纤维细胞系的附加信息可以从Coriell研究所获得。
bPDB3F-12d在实验中被分离用于确定转基因表达的时间要求。PDB3F-12d从暴露于强力霉素12天的培养物中分离。
c这些细胞在实验中产生以确定转基因表达的时间要求。PDB4F-1到-3从暴露于强力霉素8天的培养物中分离，而PDB4F-4和-5分别暴露于强力霉素10和12天。
d这些hiPSCs细胞以前已在Hockemeyer等，2008中表征。
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Claims (10)
1.一种核酸构建物，其包含至少两个编码区，其中所述至少两个编码区由编码自切割肽的核酸彼此相连以便形成单一开放阅读框，并且其中所述第一个编码区编码第一种重编程因子，和所述第二个编码区编码第二种重编程因子，其中所述核酸构建物能够将哺乳动物体细胞重编程为多能性，并且其中所述第一种和第二种重编程因子选自Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、Lin28和c-Myc，
其中所述核酸构建物不包含口蹄疫病毒的2A序列。
2.权利要求1的核酸构建物，其还包含：
(a)编码第三种重编程因子的第三个编码区，其中所述第三种重编程因子选自Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、Lin28和c-Myc；或
(b)编码第三和第四种重编程因子的第三和第四个编码区，其中所述第三种和第四种重编程因子选自Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、Lin28和c-Myc。
3.权利要求1的核酸构建物，其中：
(a)自切割肽是病毒2A肽；或
(b)所述核酸构建物不包含编码选自Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog的重编程因子之一的编码区；或
(c)所述核酸构建物包含编码一组选自如下的重编程因子的编码区：
(i)Oct4和Sox2；(ii)Oct4和Klf4；(iii)Oct4和Nanog；(iv)Oct4、Klf4和Sox2；(v)Oct4、Nanog和Lin28；(vi)Oct4、Nanog和Sox2；以及(vii)(i)-(vi)任一个并另外包括c-Myc。
4.一种表达盒，其包含：与启动子可操作连接的权利要求1的核酸构建物，其中所述启动子驱动编码重编程因子的多顺反子信使的转录，每种重编程因子通过自切割肽与至少一种其他重编程因子相连；或
与启动子可操作连接的权利要求1的核酸构建物，其中所述启动子驱动编码重编程因子的多顺反子信使的转录，每种重编程因子通过自切割肽与至少一种其他重编程因子相连并且还包含介导在哺乳动物细胞的基因组中整合的一个或多个位点。
5.一种表达载体，其包含：
(a)权利要求4的表达盒；或
(b)权利要求4的表达盒，其中载体是反转录病毒载体；或
(c)权利要求4的表达盒，其中启动子是诱导型的。
6.一种分离的哺乳动物细胞，其包含：
(a)权利要求4的表达盒；
(b)权利要求4的表达盒，其中细胞选自：体细胞、终末分化的体细胞、和iPS细胞；或
(c)权利要求4的表达盒，其中细胞是人类细胞；或
(d)权利要求4的表达盒，其中细胞从表达盒表达两种或三种重编程因子；或
(e)权利要求4的表达盒，其中细胞从表达盒表达三种重编程因子，其中所述三种重编程因子不足以以至少0.05％的效率重编程哺乳动物成纤维细胞；或
(f)权利要求4的表达盒，其中细胞从表达盒表达三种重编程因子，其中所述三种重编程因子足以以至少0.05％的效率重编程哺乳动物成纤维细胞；或
(g)权利要求4的表达盒，其中细胞还包含整合在基因座中的报告基因，所述基因座的活化被用作重编程为多能性的标志物。
7.一种鉴定重编程剂的方法，所述方法包含：
(A)将包含权利要求6的哺乳动物细胞和被测药剂的组合物，在从表达盒表达重编程因子并发生细胞增殖的条件下维持一段时间，所述哺乳动物细胞具有整合在Nanog或Oct4基因座中的报告基因，所述Nanog或Oct4基因座的活化用作重编程为多能性的标志物；以及
(B)评估细胞重编程的程度，其中如果重编程的发生频率明显高于组合物缺乏被测药剂的情况下的频率，则所述被测药剂被鉴定为重编程剂或重编程的增强剂。
8.权利要求7的方法，其中如果细胞在不存在被测药剂的情况下维持所述时间段，不以可检测的频率重编程，但是如果在所述被测药剂存在下维持至少一部分所述时间段，以可检测的频率重编程，则所述被测药剂被鉴定为重编程剂；或
其中如果细胞在不存在被测药剂的情况下维持所述时间段，以可检测的频率重编程，并且如果在所述被测药剂存在下维持至少一部分所述时间段，以明显更高的频率重编程，则所述测试药剂被鉴定为重编程剂的增强剂。
9.权利要求7的方法，其中细胞从表达盒表达一组重编程因子，其中所述组由下列构成：(i)Oct4和Sox2；(ii)Oct4和Klf4；(iii)Oct4和Nanog；(iv)Oct4、Klf4和Sox2；(v)Oct4、Nanog和Lin28；(vi)Oct4、Nanog和Sox2；以及(vii)(i)-(vi)任一项并另外包括c-Myc。
10.一种将分化的体细胞重编程为多能状态的体外或离体方法，所述方法包含将分化的体细胞与权利要求1的核酸构建物在适于所述细胞增殖以及足以重编程所述细胞的时间段的条件下相接触。
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