JP2017221229A - 細胞のプログラミングおよび再プログラミング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本開示は、1種以上の体細胞、例えば、部分的に分化したまたは完全分化/最終分化した体細胞を、より分化していない状態、例えば、多能性または多分化能状態まで再プログラミングする方法に関する。さらなる実施形態において、本発明はまた、本発明の方法によって産生された再プログラミングされた体細胞、本発明の再プログラミングされた体細胞を含むキメラ動物、上記細胞の使用、および体細胞を再プログラミングするために有用な薬剤を同定するための方法にも関する。
【選択図】なし
Description
本願は、2008年6月13日に出願された米国特許61/061,525号、2008年6月30日に出願された米国特許61/077,068号の利益を主張する。これらの出願の全体の教示は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、国立衛生研究所からの助成金5−RO1−HD045022、5−R37−CA084198、および5−RO1−CA087869により、その全体または一部が支援されたものである。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1) 少なくとも2つのコード領域を含む核酸構築物であって、ここで、前記コード領域は、単一のオープンリーディングフレームを形成するように自己切断ペプチドをコードする核酸によって各々に連結されており、前記コード領域は、単独で、または1つ以上のさらなる再プログラミング因子と組み合わせてのいずれかで、哺乳動物体細胞を多能性まで再プログラミングすることが可能である第1および第2の再プログラミング因子をコードする、核酸構築物。
(項目2) 第3の再プログラミング因子をコードする第3のコード領域をさらに含み、前記3つのコード領域は、単一のオープンリーディングフレームを形成するように自己切断ペプチドをコードする核酸によって互いに連結されている、項目1に記載の核酸構築物。
(項目3) 第3および第4の再プログラミング因子をコードする第3および第4の遺伝子をさらに含み、前記4つのコード領域は、単一のオープンリーディングフレームを形成するように自己切断ペプチドをコードする核酸によって互いに連結されている、項目1に記載の核酸構築物。
(項目4) 前記自己切断ペプチドがウイルス性の2Aペプチドである、項目1に記載の核酸構築物。
(項目5) 前記自己切断ペプチドがアフトウイルス2Aペプチドである、項目1に記載の核酸構築物。
(項目6) 前記再プログラミング因子がOct4、Nanog、Sox2、Klf4、Lin28、およびc−Mycから選択される、項目1に記載の核酸構築物。
(項目7) 前記コード領域が、哺乳動物体細胞を多能性に再プログラムするために少なくとも1種のさらなる再プログラミング因子を必要とする第1および第2の再プログラミング因子をコードする、項目1に記載の核酸構築物。
(項目8) Oct4をコードしない、項目1に記載の核酸構築物。
(項目9) Klf4をコードしない、項目1に記載の核酸構築物。
(項目10) Sox2をコードしない、項目1に記載の核酸構築物。
(項目11) c−Mycをコードしない、項目1に記載の核酸構築物。
(項目12) Lin28をコードしない、項目1に記載の核酸構築物。
(項目13) Nanogをコードしない、項目1に記載の核酸構築物。
(項目14) 前記コード領域が、(i)Oct4およびSox2からなるセット;(ii)Oct4およびKlf4からなるセット;(iii)Oct4およびNanogからなるセット;(iv)Oct4、Klf4、およびSox2からなるセット;(v)Oct4、Nanog、およびLin28からなるセット;(vi)Oct4、Nanog、およびSox2からなるセット;ならびに(vii)(i)〜(vi)のいずれかからなりかつc−Mycをさらに含むセットから選択される再プログラミング因子のセットをコードする、項目1に記載の核酸構築物。
(項目15) プロモーターに作動可能に連結された項目1に記載の核酸構築物を含む発現カセットであって、ここで、前記プロモーターは、前記再プログラミング因子をコードするポリシストロン性メッセージの転写を駆動し、各再プログラミング因子が、自己切断ペプチドによって、少なくとも1つの他の再プログラミング因子に連結されている、発現カセット。
(項目16) 哺乳動物細胞のゲノムへの組込みを媒介する1つ以上の部位をさらに含む、項目15に記載の発現カセット。
(項目17) 項目15に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
(項目18) レトロウイルス性である、項目17に記載の発現ベクター。
(項目19) プロモーターが誘導性である、項目18に記載の発現ベクター。
(項目20) 項目15に記載の発現カセットを含む哺乳動物細胞。
(項目21) 体細胞である、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目22) 最終分化した体細胞である、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目23) iPS細胞である、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目24) 項目23に記載の哺乳動物iPS細胞から少なくとも部分的に生成されるキメラマウス。
(項目25) 前記哺乳動物iPS細胞をマウス未分化胚芽細胞(blastocyt)に注入すること、および前記未分化胚芽細胞をインビボでマウスに成長させることによって生成される、項目24に記載のキメラマウス。
(項目26) 前記iPS細胞から誘導される、項目24に記載のマウスから得られた細胞。
(項目27) ヒト細胞である、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目28) 前記発現カセットが、ゲノムの座に組み込まれ、前記ゲノムの座の破壊が細胞に対して最小限の作用を有するかまたは全く作用を有さない、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目29) 前記発現カセットから2つの再プログラミング因子を発現する、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目30) 前記発現カセットから3つの再プログラミング因子を発現する、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目31) 前記発現カセットから3つの再プログラミング因子を発現し、前記3つの再プログラミング因子は、少なくとも0.05%の効率で哺乳動物線維芽細胞を再プログラムするために十分ではない、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目32) 前記発現カセットから3つの再プログラミング因子を発現し、前記3つの再プログラミング因子は、少なくとも0.05%の効率で哺乳動物線維芽細胞を再プログラムするために十分である、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目33) 座に組み込まれたレポーター遺伝子をさらに含み、前記レポーター遺伝子の活性化が多能性への再プログラミングのマーカーとして役立つ、項目20に記載の哺乳動物細胞。
(項目34) 座がNanogおよびOct4から選択される、項目31に記載の哺乳動物細胞。
(項目35) 複数の本質的に遺伝的に同一な項目20に記載の細胞を含む組成物。
(項目36) 項目20に記載の1つ以上の哺乳動物細胞および試験薬剤を含む、再プログラミング因子を同定するための組成物。
(項目37) 発現カセットからの再プログラミング因子の発現を誘導する薬剤をさらに含む、項目34に記載の組成物。
(項目38) 再プログラミング因子を同定する方法であって:
(i)再プログラミング因子が発現カセットから発現され、かつ細胞増殖が起こる条件下で、一定の期間、項目34に記載の組成物を維持する工程;および
(ii)細胞が再プログラミングされた状態になる程度を評価する工程であって、再プログラミングが、前記組成物が試験薬剤を欠く場合に起こるよりも有意に高い頻度で起こるとき、前記試験薬剤が再プログラミング因子または再プログラミングのエンハンサーとして同定される、工程
を包含する方法。
(項目39) 前記組成物が少なくともX日間維持される、項目36に記載の方法。
(項目40) 前記試験薬剤が少なくともX日間存在している、項目36に記載の方法。(項目41) 前記細胞が、一定の期間に前記試験薬剤の非存在下で維持された場合には検出可能な頻度で再プログラミングされた状態にならないが、前記期間の少なくとも一部の間に前記試験薬剤の存在下で維持された場合には検出可能な頻度で再プログラミングされた状態になるとき、前記試験薬剤が再プログラミング因子として同定される、項目36に記載の方法。
(項目42) 前記細胞が、一定の期間に前記試験薬剤の非存在下で維持された場合には検出可能な頻度で再プログラミングされた状態になり、かつ前記期間の少なくとも一部の間に前記試験薬剤の存在下で維持された場合には有意により高い頻度で再プログラミングされた状態になるとき、前記試験薬剤が再プログラミング因子のエンハンサーとして同定される、項目36に記載の方法。
(項目43) 前記細胞が、前記発現カセットから再プログラミング因子のセットを発現し、ここで、前記セットは、(i)Oct4およびSox2;(ii)Oct4およびKlf4;(iii)Oct4およびNanog;(iv)Oct4、Klf4、およびSox2;(v)Oct4、Nanog、およびLin28;(vi)Oct4、Nanog、およびSox2;ならびに(vii)c−Mycをさらに含む(i)〜(vi)ののうちの任意のものからなる、項目36に記載の方法。
(項目44) 分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって:
(a)分化した体細胞を、前記細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の再プログラミング因子と接触させる工程;
(b)前記細胞の再プログラミングを開始するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の再プログラミング因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程;ならびに
(c)前記少なくとも1種の再プログラミング因子を機能的に不活化する工程
を包含する方法。
(項目45) 分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって:
(a)分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を含む、前記分化した体細胞を提供する工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性化のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程;ならびに
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程
を包含する方法。
(項目46) 多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を選択する方法であって:
(a)分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を含む、分化した体細胞を提供する工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;ならびに
(d)多能性の1種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程
を包含する方法。
(項目47) 再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された、単離された多能性細胞。
(項目48) 再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された少なくとも70%の多能性細胞を含む、精製された体細胞集団。
(項目49) 単離された多能性細胞であって、以下の工程:
(a)分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を含む、前記分化した体細胞を提供する工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;ならびに
(d)多能性の1種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程;
を包含する方法によって産生される細胞。
(項目50) 再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された少なくとも70%の多能性細胞を含む、精製された体細胞集団であって、以下の工程:
(a)分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を含む、前記分化した体細胞を提供する工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;ならびに
(d)多能性の1種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程;
を包含する方法によって産生される、精製された体細胞集団。
(項目51) 多能性細胞を体細胞から産生する方法であって、以下の工程:
(a)体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記1つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入される、工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;
(d)多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を選択する工程;
(e)前記多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程;(f)前記キメラ胚から1つ以上の体細胞を得る工程;
(g)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な時間の間、前記1つ以上の体細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の体細胞を維持する工程;ならびに
(h)多能性の1種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程
を包含する方法。
(項目52) 単離された多能性細胞であって、以下の工程:
(a)体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記1つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入される、工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;
(d)多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を選択する工程;
(e)前記多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程;(f)前記キメラ胚から1つ以上の分化した体細胞を得る工程;
(g)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の分化した体細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の分化した体細胞を維持する工程;ならびに(h)多能性の1種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程;
を包含する方法によって産生される、細胞。
(項目53) 再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された少なくとも70%の多能性細胞を含む、精製された体細胞集団であって、以下の工程:
(a)体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記1つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入される、工程;
(b)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;
(d)多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を選択する工程;
(e)前記多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程;(f)前記キメラ胚から1つ以上の分化した体細胞を得る工程;
(g)少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の分化した体細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の分化した体細胞を維持する工程;ならびに(h)多能性の1種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程
を含有する方法によって産生される、精製された体細胞集団。
(項目54) 分化した免疫細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、以下の工程:
(a)各々が誘導性ベクターの制御下にあり、かつ外因的に導入されたC/EBPαをさらに含む、外因的に導入されたOct4、Sox2、Klf−4、およびc−Mycを含む分化した免疫細胞を提供する工程;
(b)内因性Nanogおよび/またはOct4を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、ならびにOct4、Sox2、Klf−4、c−Myc、およびC/EBPαの活性のために適切な条件下で、前記細胞を維持する工程;ならびに
(c)外因的に導入されたOct4、Sox2、Klf−4、およびc−Mycを機能的に不活化する工程
を包含する方法。
(項目55) 再プログラミングされた分化した免疫細胞から誘導された少なくとも70%の多能性細胞を含む、精製された免疫細胞集団であって、以下の工程:
(a)各々が誘導性ベクターの制御下にあり、かつ外因的に導入されたC/EBPαをさらに含む、外因的に導入されたOct4、Sox2、Klf−4、およびc−Mycを含む分化した免疫細胞を提供する工程;
(b)内因性Nanogおよび/またはOct4を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、ならびにOct4、Sox2、Klf−4、c−Myc、およびC/EBPαの活性のために適切な条件下で、前記細胞を維持する工程;ならびに
(c)外因的に導入されたOct4、Sox2、Klf−4、およびc−Mycを機能的に不活化する工程;
を包含する方法によって産生される、精製された免疫細胞集団。
(項目56) 再プログラミング因子を同定する方法であって、以下:
(a)体細胞を多能性状態に再プログラミングすることに寄与する少なくとも1種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記1つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子の各々は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入され、その発現は別個のインデューサによって誘導されている調節エレメントによって制御されている、工程;
(b)前記細胞を再プログラミングするため、または少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の細胞を維持する工程;
(c)前記少なくとも1種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程;
(d)多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を選択する工程;
(e)前記多能性のマーカーを示す1つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程;(f)前記キメラ胚から1つ以上の体細胞を得る工程;
(g)前記1つ以上の体細胞の増殖のため、および前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記1つ以上の体細胞を維持する工程であって、ここで、前記少なくとも1種の外因的に導入された因子の活性は、少なくとも1種の内因性多能性遺伝子を活性化するためにそれ自体では不十分である、工程;
(h)前記(g)の体細胞を、1種以上の候補再プログラミング因子と接触させる工程;ならびに
(i)多能性の1種以上のマーカーを示す前記1種以上の候補再プログラミング因子と接触した細胞を同定する工程であって、ここで、前記(g)の体細胞に多能性の1種以上のマーカーを示すように誘導する候補再プログラミング因子が、再プログラミング因子として同定される、工程
を包含する方法。
2008年4月7日に出願されたPCT出願シリアル番号PCT/US08/004516および2004年11月24日に出願された米国特許出願10/997,146は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。本明細書に記載される本発明の種々の実施形態および態様が、本発明のすべての異なる態様および実施形態に適用可能であることが意図される。適切な場合にはいつでも、これらの実施形態または態様のいずれかが、1つ以上の他のこのような実施形態または態様と自由に組合せることができることもまた意図される。
薬物誘導性再プログラミングのための遺伝的に均質な細胞集団の生成
プロウイルス組込みの数および位置に関して均質である細胞集団を生成するために、本発明者らは、ドキシサイクリン(dox)誘導性導入遺伝子系16、17を利用し、4種の再プログラミング因子をコードするdox誘導性レンチウイルスベクターを構築した。内因性Nanog遺伝子座に標的化されたグリーン蛍光タンパク質(GFP)(NGFP)に加えて、リバーステトラサイクリントランス活性化因子と、ROSA遺伝子座に標的化されたPGKプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子(ROSA−M2rtTA)の両方を含むマウス胚性線維芽細胞(MEF)は、4種のレンチウイルスで感染された。同様に、本発明者らは、I型コラーゲン遺伝子座に標的化されたテトラサイクリンオペレーターの制御下にあるOct4 cDNA、および内因性Nanog遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子1、18(NNeo)を有するRosa−M2rtTA
MEFに、Klf4、Sox2、およびc−Mycをコードするdox誘導性レンチウイルスを感染させた(図1a)。
3種すべてのdox誘導性iPS細胞系統から誘導された二次MEFは二次iPS細胞系統を形成するように再プログラミングを受けた間、本発明者らは、dox処理後のそれらの形態学的変化および増殖速度に関する違いに気付いた。最初に、両方のNanog−GFP系統からのMEFは、doxへの曝露後、増殖してコンフルエント線維芽細胞単層を形成した。次いで、Nanog−GFP系統3(NGFP3)からの細胞は、懸濁中の細胞の増殖を含む、強固なコンフルエント後増殖を受けたのに対し、NanogGFP系統2(NGFP2)からの細胞はより遅く増殖し、控えめな、アルカリホスファターゼ陽性であり、ES様のコロニーを線維芽細胞単層上に形成した(図2A)。Nanog−neo系統から誘導された線維芽細胞は、dox添加の際に決してコンフルエント単層を形成しなかったが、しかし、大きな三次元コロニーを生成した。dox投与の12日後、ES細胞形態を有するiPS細胞コロニーは、ES細胞形態を有するiPS細胞コロニーが3つすべての培養において容易に見られた(図2A、矢印)。
MEFからのNanog−GFP陽性コロニーを計数したときに、本発明者らは、二次系においてはるかに小さな変動性の程度に気付いた。
4種の再プログラミング因子のどれほど長い発現が、安定な再プログラミングが起こるために必要であるかを研究するために、二次NGFP2 MEFは最適密度にプレートされ(上記を参照のこと)、5〜22日間の範囲の種々の時間の間、ドキシサイクリンに曝露され、そしてGFP蛍光について毎日モニターした。GFP+コロニーを生じるdox曝露の最小の長さは9日間であり、最初のGFP+コロニーは16日目でのdox除去の7日後に出現した(図3C)。顕著には、doxへのさらなる曝露は、GFP+コロニーの出現を加速せず、GFPは、dox投与の長さには関係なく、16日と18日の間に出現した。同様に、NNeo二次MEFは、dox曝露の11〜13日間を必要とすることが見出され、その後、安定なネオマイシン耐性二次iPSコロニーが樹立できた。
本発明者らは、NNeoおよびNGFP2系統から生成したiPS細胞キメラから二次細胞を単離することによって、どの範囲の組織型が再プログラミングに対して感受性であるかを決定することを探求し、これらのキメラから誘導された複数の細胞型の再プログラミング能力を試験した。表1に要約されているように、ある細胞型は、NGFP2系統から単離されたときに容易に再プログラミングできたが、NNeo系統から単離された同じ細胞型はiPS細胞を生じなかった。このことは、異なる細胞型が異なる導入遺伝子誘導レベルを必要とすることを示唆し、このレベルは、研究された系統間での異なるプロウイルス組込み部位から生じる可能性がある。
二次NGFP2とNNeoキメラの両方からの精製腸上皮細胞は、ドキシサイクリン処理に対して著しく迅速に応答し、48時間以内に懸濁中でスフェロイドを形成し、これは、引き続いて、MEF支持細胞層に接着され、3〜4日以内にES様形態をとった(図4A〜4Cおよび4I〜4J)。しかしながら、アルカリホスファターゼ活性は、doxを伴う10〜12日間の培養の前には検出されなかった(図9F)。機械的分画プロトコールを使用して(方法を参照のこと)、本発明者らは、これらのコロニーが、より初期の画分(ウイルス端誘導細胞)からよりも画分7(大部分は腺窩誘導細胞)からはるかにより効率的に形成したことを見出した(図4M)。NGFP2キメラから誘導された細胞は、doxの存在下で、約2週間の培養後に内因性Nanogを発現したdox非依存性iPS細胞に発達した(図4K〜4L、図8B)。
次に、本発明者らは、NNeoおよびNGFP2キメラから単離された骨髄由来の間充織幹細胞(MSC)および尾端線維芽細胞(TTF)の再プログラミング能力を比較した。これらの細胞は、直接感染による再プログラミングに感受性である2つの間充織集団を表す1、4、12(補足の図8D)。腸細胞と同様に、二次NGFP2 MSCおよびTTFは、doxに応答してiPS細胞を生成可能であったのに対して、NNeoキメラから誘導されたものはそうではなかった(図5A〜5F、図8A,8C)。
NNeoキメラの上皮から単離された細胞は、ケラチノサイトのために最適化された増殖条件において、ドキシサイクリンの非存在下で最初に増殖された21。均質な上皮培養物が得られ(図5G)、ドキシサイクリンが培地に加えられた。上皮細胞のクラスタが増殖し、経時的にそれらの形態を変化させた。12日後、培地がドキシサイクリン含有ES細胞培地に変更され(図5H)、7日後にネオマイシンが添加された。密接したコロニー中で増殖しているneo耐性細胞はES細胞に類似しており(図5I)、γ照射した支持細胞上で継代され、その時点で、培養物はdoxの非存在下で維持され、内因性Nanogを発現した(図9D)。
NNeoキメラからの脳は解剖され、側脳室周囲の組織ブロックが単一の細胞に解剖され、二次細胞を選択するために、ピューロマイシンの存在下で、EGFおよびFGF2含有無血清培地(N3EF)中のコートされていない培養ディッシュにプレートされた。4週間後、ニューロスフェアが形成し、これは、引き続き、レンチウイルス導入遺伝子を活性化するために、doxを含むES細胞培地またはN3EF培地のいずれかの中で、ポリオルニチン/ラミニンコートされたディッシュにプレートされた。神経前駆細胞について予測されたように、血清を含有するES細胞培地に曝露された細胞は平らな星状細胞に分化し、分裂を停止した(図5J)。対照的に、N3EF培地にプレートされた細胞は強固に増殖を継続し、未分化神経上皮細胞に類似していた。3週間後、これらの増殖している細胞は分割され、ドキシサイクリンを含むES細胞培地またはN3EF培地のいずれかにプレートされた。血清に曝露された細胞は、大部分が平らな形態をとっていたのに対し、N3EF中では細胞は双極性形態を維持していた。しかしながら、以前の継代とは対照的に、小さなES様コロニーが次の2週間にわたって両方の条件で出現した(図5K、5L)。γ照射した支持細胞MEFに継代したときに、内因性Nanogを発現するneo耐性、dox非依存性iPS細胞系統が容易に樹立された(図9E)。
加えて、本発明者らは、NNeoキメラの副腎、腎臓、および筋肉から拡大された細胞から二次iPS細胞系統を生成することにもまた成功した。これらの組織は解剖され、トリプシンで解離され、そしてドキシサイクリンを含むES細胞培地にプレートされた。doxの存在下で6〜12日後、ES細胞の形態を有するコロニーが出現し、これは、最終的には、ネオマイシン耐性、dox非依存性になり、Nanogを活性化した(図9A〜9C)。
ウイルスの調製および感染
テトラサイクリンオペレーターおよび最小CMVプロモーターの制御下にあるKlf4、Sox2、Oct4、およびc−Mycを含むレンチウイルスベクターの構築物は以前に記載されている14。複製可能でないレンチウイルス粒子はVSV−Gコートで293T細胞にパッケージされ、内因性Nanog遺伝子座に標的化されたネオマイシン耐性またはGFP対立遺伝子のいずれかと同様に1、11、R26遺伝子座17においてM2rtTAおよびPGK−Puro耐性遺伝子を含むMEFに感染させるために使用された。MEFに適用する前に、4種のウイルスの各々をパッケージしている培養からのウイルス上清をプールし、0.45μMフィルターを通して濾過し、そしてES細胞培地(w/10%FBS(Hyclone,Logan,UT)、白血病阻害因子、β−メルカプトエタノール(SIGMA−Aldrich)、ペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミン、および非必須アミノ酸(すべてInvitrogen,Carlsbad,CAより)を補充したDMEM)と1:1で混合した。
dox(Sigma−Aldrich St.Louis MO.2μg/mL)の添加の約3週間後、GFP+またはネオマイシン耐性iPSコロニーを単離し、doxの非存在下で拡大した。NanogGFP2 iPS系統を、NanogGFP1系統(22においてMEF−iPS#l系統として記載)として同じプレートから拾い上げたのに対して、NanogGFP3系統は、独立した実験から誘導された。iPS系統は、C57/B6×DBA/1 F1胚盤胞に注入された。胚盤胞は、ミネラルオイルの下で、15%FBSを伴うDMEMの一滴の中に配置された。12〜15mmの内径を有する先端が平らなマイクロインジェクション用ピペットは、ピエゾ極微操作装置を使用するiPS細胞注入のために使用した。約10iPS細胞を胚盤胞腔に注入、胚盤胞はKSOM(Specialty Media,Phillipsburg,NJ)に配置し、これらがレシピエント雌に移されるまで、37℃でインキュベートされた。15個の注入した胚盤胞は、性交2.5日後に偽妊娠C57/B6×DBA/1 F1雌の子宮角に移した。テラトーマ生成については、2×106細胞を、レシピエントSCIDマウスの脇腹に皮下注射し、腫瘍は3〜6週後に組織学的分析のために単離した。すべての動物は、施設のIACUCガイドラインに従って扱った。
MEF単離のために、キメラ胚をE13.5で単離し、頭部および内部(生殖器を含む)器官を除去した。残りの組織を物理的に解剖し、37℃で20分間、トリプシン中でインキュベートし、その後、細胞を、ピューロマイシン(2μg/mL)を含むMEF培地中に再懸濁し、2継代の間拡大し、その後凍結した。記載した実験のために使用される二次MEFを融解し、実験は、融解後1〜2継代、プレートした。反応速度論実験(図2)は6ウェルプレートにおいてウェルあたり4×104二次MEFをプレートすることによって実施し、プレートは示された時間、染色または分析した。細胞密度実験は、12ウェルプレート中で実施し、GFP+iPSコロニーはdox誘導後4週間スコア付けした。単一細胞効率実験は、dox誘導前に96ウェルプレート中で野生型支持細胞MEFSの層に単一の二次MEFをプレートすることによって実施した(限界希釈を使用し、これは、支持細胞MEFを欠く複製プレート中で目視によって確認した)。iPS情報は4週間後にスコア付けした。2〜3の生物学的複製からの代表的な実験を示す。5−アザおよびTSA実験について、1×106二次細胞MEFは6ウェルプレート中にプレートし(約100細胞/mm2)、5−アザ(1μM)またはTSA(1μM)を含むES細胞培地で48時間前処理した。48時間後、二次MEFは、5−アザまたはTSAを欠くES細胞培地プラスdox中で培養した。MEFSは、誘導後の8〜10日の間、2度目の48時間の期間、5−アザまたはTSAに曝露し、続いて、GFP+コロニーの21日目のスコア付けまで、doxのみを伴う培養を行った。
フローサイトメトリー分析のために、本発明者らは、APC結合体化抗マウスSSEA1(R&D systems,Minneapolis,MN)およびアルカリホスファターゼ基質キット:Vector Red substrateキット(Vector Laboratories,Burlingame,CA)を使用した。免疫蛍光のために、細胞は、4%パラホルムアルデヒド中に固定し、そして本発明者らは、SSEA1に対するマウスモノクローナル抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank)、ヤギ抗Sox2(R&D Systems)、マウス抗Oct4(Santa Cruz)、およびウサギ抗Nanog(Bethyl)を使用した。蛍光団標識された適切な二次抗体は、Jackson IrnmunoResearchから購入した。
細胞はトリプシン処理し、PBS中で1回洗浄し、そしてFACS緩衝液(PBS+5%ウシ胎仔血清)中に再懸濁した。106細胞を、10μlのAPC結合体化抗SSEA1抗体で、100μl体積で30分間染色し、次いで細胞をPBSで2回洗浄した。次いで、細胞は洗浄緩衝液で1回洗浄し、FACS−caliburセルソーター上での分析のためにFACS緩衝液中に再懸濁した。
DNAのビスルファイト処理は、CpGenome DNA修飾キット(Chemicon,Temecula,CA)を製造業者の説明書に従って使用して行った。得られる修飾DNAは、ネスト化ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、以下の2種のフォワード(F)プライマーおよび1種のリバース(R)プライマー:
Trizol試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して総RNAを単離した。DNA Free RNAキット(Zymo Research,Orange,CA)を使用して、5μgの総RNAをDNaseIで処理して、ゲノムDNAの潜在的汚染を除去した。First Strand Synthesisキット(Invitrogen)を使用して、1μgのDNase I処理RNAを逆転写し、最終的には100μlの水に再懸濁した。Platinum SYBR green qPCR SuperMix−UDG with ROX(Invitrogen)を用いて、ABI Prism 7000(Applied Biosystems,Foster
City,CA)において1/50の逆転写反応を使用して、定量的PCR分析を3連で実施した。増幅のために使用したプライマーは以下の通りであった:
1.概観
A.ヒトESおよびiPS細胞の遺伝子操作のためのツールの生成
本明細書に記載される研究は、huES細胞における遺伝子を標的とするための強固なアプローチを提供し、体細胞のiPS細胞への再プログラミングのためのツールを生成することである。より詳細には、huESおよびiPS細胞の鍵となる神経系統遺伝子にGFPを挿入するために相同組換えが使用される。GFPマーカーは、操作されたiPS細胞から神経前駆細胞を単離してそれらの発生的能力を評価するために使用される。現在の再プログラミングプロトコールは、iPS細胞中に複数のプロウイルス挿入を生じる転写因子のレトロウイルスベクター媒介性形質導入に頼っている。この研究は、複数のウイルス感染の使用を回避するか、またはウイルス媒介性再プログラミングのための要件をほとんど除外するかのいずれかである方法を記載する。
DOX誘導性レトロウイルスベクターは、多能性マーカーの逐次的活性化およびマウス体細胞の再プログラミングの間のベクター発現の最短時間を規定するために重要であった。本発明者らは、再プログラミング因子の時間的に制限された発現を可能にする誘導性レンチウイルスベクターを生成した。
マウスまたはヒトの体細胞ドナー細胞からのiPS細胞を誘導するための多数の異なるストラテジーが示されており、これには、4種の転写因子Oct4、Sox2、Klf4、およびc−mycまたはこれら4種の因子のサブセット、または代替的な因子の組合せの構成的または誘導性発現が含まれる[Lowry、2008 #6827;Park、2008 #6783;Takahashi、2007 #6769;Yu、2007 #6793]。ヒト線維芽細胞の再プログラミングのために図11Aに記載されている異なるベクター系の有用性が比較された。表1は、iPS細胞が、構成的に発現された4種または3種(C−MYCなし)またはDOX誘導性転写因子によって得られたことを示す。DOX誘導性レンチウイルスが使用された場合、他の研究者によって公開されたのと同様の頻度でかつ感染した培養中の同じ時期にiPSクローンが出現した[Takahashi、2007 #6769]。図12Aは、内因性OCT4およびNANOG遺伝子が、huES細胞と同様のレベルで2つのiPS系統で発現されたことを示す。再プログラムされたiPS細胞は、ヒトES細胞に典型的な形態を有する密接したコロニーとして増殖し、これらは、適切な多能性マーカーを発現した(図12B)。多能性を試験するために、iPS細胞はSCIDマウスに注入された。得られた腫瘍の組織学的試験は、複数の分化した細胞型を含む典型的なテラトーマを示した(図12C)。
iPS細胞を生成するための多くの現在のプロトコールは、4つの異なるレトロウイルスベクターによる、4種の転写因子Oct4、Sox2、c−myc、およびKlf4の形質導入を要求する。この様式による再プログラミングは、複数の組み込まれたベクター(15以上までのプロウイルス)を有する感染細胞の小さな画分の選択を含み、強力な発癌遺伝子および/またはレトロウイルス誘導性の挿入変異誘導の使用に起因する癌の懸念を生じる。再プログラミングのために必要とされる独立したプロウイルス組込みの数を減少させるために、本発明者らは、プロウイルス組込みの数を減少させるという目的で、任意の組合せの因子を形質導入できるポリシストロン性ベクターを設計および使用してきた。
iPS系の刺激的な潜在能力は、患者特異的な多能性細胞を誘導することである。本明細書に記載される研究は、患者特異的なiPS細胞を使用して、インビトロでの複雑なヒト疾患の研究を可能にするプロトコールを記載する。例えば、現在のところ、患者特異的なiPS細胞は、深い皮膚の生検から誘導されている。臨床設定においてiPS細胞を単離するための潜在的により単純なプロトコールを確立するための努力において、本明細書に記載される手順は、iPS細胞を生成するためのドナー材料として末梢血を使用する。
本明細書に記載される研究は、再プログラミング効率を改善する小分子を同定するための高スループット系を提供する。これは、遺伝子操作または外因性遺伝子エレメントの挿入、例えば、C−MYCまたはKLF4のような発癌遺伝子のベクター媒介性形質導入を必要としない再プログラミング方法の確立を可能にする。
マウス系において、転写因子の薬物誘導性発現を可能にするベクターの使用は、再プログラミングを引き起こす分子事象を規定するために決定的であった。これらの実験は、再プログラミングが、アルカリホスファターゼ、SSEAl、Oct4、およびNanogなどのES細胞マーカーの逐次的活性化を含むこと、ならびに形質導入される転写因子が、iPS細胞を生じるために少なくとも12日間の間発現される必要があったことを示した[Brambrink、2008 #6877]。目的Aの主要な目標は、体細胞を再プログラミングする際の補助となり、ヒトESおよびiPS細胞の遺伝子操作を可能にするツールを生成することである。これらのツールは、ヒト体細胞再プログラミングのメカニズムに集中している目的Bのために重要である。目的Cの目標は、キメラマウスにおいて、インビトロならびにインビボで、ヒトiPS細胞が機能的神経細胞に分化する潜在能力を評価するための実験系を確立することである。さらに、本発明者らは、ヒト末梢血からヒトiPS細胞を生成するためのプロトコールを設計する。最後に、目的Dの焦点は、遺伝的手段によって再プログラミング経路を活性化することに対する代替として、化学化合物についてスクリーニングすることである。
相同組換えによって内因性遺伝子を遺伝的に変化させる能力は生物学に革命をもたらし、胚性幹細胞との組合せで、分子医薬のために大きな将来性を有する。遺伝子ターゲッティングはマウスES細胞における日常的な手順であるが、この技術をヒト胚性幹細胞に移すことは以前には困難であった[Giudice、2008 #6863]。確かに、10年前のThomsonによるヒトES細胞の最初の単離以来、内因性遺伝子の首尾よい標的化を報告する刊行物の登場は4件のみであった[Davis、2008 #6860;Irion、2007 #6857;Zwaka、2003 #6223;Urbach、2004 #6163]。内因性遺伝子を遺伝的に修飾することの困難さは、ヒトES細胞の完全な潜在能力を実現するためには克服される必要がある。
未分化ES細胞からの分化細胞の誘導は、所望の分化した細胞型の単離のために使用できる系統特異的な内因性遺伝子に挿入されたマーカーによって容易にされる。本発明者らの予備的な実験は、GFPまたは薬物耐性マーカーを用いて、OCT4ならびにCOL1A1遺伝子座の標的化を実証した。従って、目標は、神経または他の系統の細胞中で発現され、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの疾患に罹患している分化した細胞型のスクリーニングまたは選択のために使用できる遺伝子中に、薬物耐性マーカーおよび/またはGFP(または他の検出可能なマーカー)を有するESおよびiPS細胞を生成することであった。
マウスES細胞とは対照的に、ヒトES細胞は、通常は限られた酵素消化のみを使用して機械的に継代される。細胞クローニングは、単一細胞増殖を増強する染色体異常を選択するからである。このことおよびゆっくりとした増殖は、遺伝子ターゲッティングがhuES細胞においてあまりにも非効率的であったことの重要な理由であり得る。最近、ROCK阻害剤Y−27632のhuESへの適用が、解離誘導性アポトーシスを顕著に減少させること、およびクローニング効率を増加させることが示されてきた[Watanabe、2007 #6549]。従って、すべての実験は、この阻害剤の存在下で行われる。
本発明者らは、マウスiPS細胞が15以上のプロウイルス挿入を有してもよいことを示しており[Wernig、2007 #6641]、このことは、再プログラミングプロセスの開始のために必要とされる因子発現の高いレベルまたは特定の化学量論を達成するために各ベクターの複数コピーを有する細胞の小画分についての強力な選択を示唆している。本明細書に示されるものは、ウイルス形質導入のための必要性を回避し、従って、「正しい」プロウイルスの組合せを運ぶ細胞の小画分を選択するための必要性を除外する系である。確かに、「一次」iPS細胞からクローン的に誘導され、第1の場所で再プログラミングを達成したDOX誘導性プロウイルスの適切な数を有する「二次」線維芽細胞の生成は、成熟B細胞を多能性状態に再プログラムすることを本発明者らに可能にした[Hanna、2008 #6842]。このアプローチは、(i)あらかじめ選択された染色体の位置に組み込まれたプロウイルスベクターとしてか、または(ii)ゲノム発現遺伝子座への相同組換えによって挿入されるかのいずれかである、再プログラミング因子を有する、ヒト細胞および生成された二次線維芽細胞に適用される。この系は、再プログラミングのメカニズムを決定するために、および再プログラミングを増強するか、またはいずれかの因子を置き換える小分子をスクリーニングするために使用できる。
GFPレポーターに加えて、tetオペレーターの制御下で再プログラミング因子のすべてまたはサブセットをコードするCOL1A遺伝子座に挿入されたレポーターポリシストロン性ベクターを有するレポーター細胞が構築される(図24)。この図において、OCT4、SOX2、およびcMYCは、COL1A1遺伝子座に挿入されている。一次線維芽細胞はインビトロで誘導され、2つのLox部位によって隣接されるKLF4ウイルスで感染される。一次iPS細胞は、上記のようにDOXによって誘導される3種の因子で選択され、KLF4ウイルスはCre形質導入によって削除され[Hanna、2007 #6781]、vKLF4を各二次線維芽細胞はインビトロ分化によって誘導される。これらの細胞は、再プログラミングにおけるKLF4の必要性を置き換える小分子について(以下を参照のこと、目的D)、または一過性トランスフェクションプロトコールを合理化することについて(目的B.2、4)スクリーニングすることができる。
DOX誘導性レンチウイルス系は、マウス線維芽細胞の再プログラミング反応速度論を規定するために使用されてきた。本明細書に記載される研究は、ヒト体細胞の再プログラミングのための反応速度論および最小ベクター発現を決定するために上記のツールを使用する。さらに、本発明者らは、遺伝子の変化を最小化または回避する再プログラミングの方法を開発し、そして本発明者らは、再プログラミングを増強するさらなる遺伝子を単離するための挿入変異誘導を使用する。最後に、本発明者らは、再プログラミングの中間段階と同様に、iPS細胞の後成的状態を規定する。
患者の特異的iPS細胞の最も重要な適用は、試験管内で複雑なヒト疾患を研究する際のそれらの潜在的な用途である。この適用のために、この技術が臨床設定において使用できる前に、堅固な実験アプローチが確立される必要がある。本明細書に記載されている研究は、iPS細胞およびhuES細胞の再現可能なインビトロ分化を可能にする手順、ならびにiPS細胞のインビボ潜在能力の評価を確立する。ヒト末梢血サンプルからのiPS細胞の単離もまた実施してもよい。
深い皮膚生検からの代わりに末梢血から得られた細胞を直接的に再プログラムすることは関心が持たれる。なぜなら、これは、臨床設定において患者特異的iPS細胞を生成することを容易にするからである。本発明者らは、未成熟および成熟マウスB細胞が多能性iPS細胞に効率的に再プログラムできること、およびこれらの細胞が、免疫グロブリン遺伝子座のドナー細胞特異的な遺伝子再配列を有することを最近示した[Hanna、2008 #6842]。驚くべきことに、再プログラミング成熟マウスB細胞の効率は3%であり、これは、MEFの成体線維芽細胞のそれよりも実質的に高い。この目的は、マウスリンパ球のヒト末梢血サンプルへの再プログラミングのために使用される方法を適合させることを探索する。
性再プログラミング因子OCT4、SOX2、C−MYC、およびKLF4で形質導入し、ES細胞培地で培養した。再プログラムされたコロニーは形態によって単離し、TRA160、SSEA3/4、NANOG、およびOCT4などの多能性マーカーの発現について試験した。iPS細胞のドナー細胞起源を確認するために、本発明者らは、IgまたはTCR再配列の存在についてゲノムDNAを分析する。
レトロウイルスベクター媒介性遺伝子移入による再プログラミングの誘導、特に、発癌遺伝子の形質導入は、このアプローチの最終的な治療的適への深刻な障害を表している。例えば、本発明者らおよび他の研究者らは[Okita、2007 #6542]、キメラにおける腫瘍型が、v−myc c−Myc活性化に起因してiPS細胞を用いて産生されることを見ている。従って、再プログラミング活性を改善するか、または関連する経路を活性化するかのいずれかであり、それゆれにC−MYCまたはKLF4などの所定の因子を発現することの必要性を置き換えることができる、低分子を同定することは関心が持たれるものである。この目的の目標は、このような化合物の化学ライブラリーをスクリーニングするための高スループット細胞ベースアッセイ系を確立することである。
高スループットスクリーニングにおける再プログラミングを検出するために、本発明者らは、内因性OCT4またはNANOG遺伝子座に挿入されたGFPなどのマーカーを有する細胞を必要とする。このような細胞はマーカーを発現しないが、内因性遺伝子のいずれかを活性化する化合物についてスクリーニングするために使用できる。
再プログラミング効率を増加させる化合物をスクリーニングするために、本発明者らは、DOXの存在下で、4種すべての因子の「正しい」組合せを有する二次iPS細胞、またはCOL1A1遺伝子座に4種すべての因子を有する線維芽細胞を培養する(図24)。予備的な実験において、本発明者らは、スクリーニングにおいて検出できるGFP陽性細胞簿の画分を決定する。4種の因子で形質導入した線維芽細胞から生じる再プログラムされた細胞の画分が低いならば、所定の化合物が、再プログラムされた細胞の画分を顕著に増加しない限り、それぞれ、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートあたりにプレートできる1000細胞または100細胞の中に単一の再プログラムされた細胞を検出することは困難または不可能であり得る。しかしながら、このアッセイは、固有に低いシグナルについて補償する非常に低いバックグラウンドを有する。
siRNAベクターで感染されている細胞を使用する。なぜなら、これは、上記よりもより効率的にレポーターを活性化する化合物について、感作されていない細胞モニターするからである。
レトロウイルスで形質導入された因子のいずれかを置き換えることができる化合物をスクリーニングするために、本発明者らは、独立して調節できるベクターで細胞を形質導入する。このアプローチの概念は、3種の因子は1つの誘導性系の制御下にあり、第4の因子が独立した誘導性制御の下にあるということである。本発明者らは、2つの異なるストラテジーを使用して、スクリーニングのために使用される細胞を産生する。
低分子ライブラリーのスクリーニングは、ScrippsにおけるS.Dingの研究室と協力して実施される(S.Dingによるレターを参照のこと)。例えば,Ding研究室は、細胞ベースの表現型高スループットスクリーニングを開発および最適化しており[Xu、2008 #6875]、化学的に規定された培地中で、かつLIFの非存在下で、ES細胞の自己再生を持続する小分子プルリポチンを同定した[Chen、2006 #6871]。このスクリーニングは、Oct4プロモーターで駆動されるGFPマーカーの発現に基づいていた。本発明者らは、GFP活性化についての上記と同様に、様々な組合せの因子を有するOct4−GFPトランスジェニック線維芽細胞をスクリーニングする。
単一のポリシストロン性ベクターを使用するマウスおよびヒトの体細胞の再プログラミング
材料および方法
ウイルスの調製および感染
テトラサイクリンオペレーターおよび最小CMVプロモーターの制御下にあるOct4、Sox2、Klf4、およびc−Mycを含む4F2Aレンチウイルスベクターの構築は、FUWレンチウイルスバックボーンからEcoRIクローニング後に生成した。すべての構築物は、PCRによる増幅後に独特な制限部位を使用して生成して、それぞれの2Aペプチド間に個々の因子を配置した(第1 XbaI−NheI;第2 SphI;第3 XhoI;第4 AscI)。それぞれの2A配列は以下の通りである:
2% SDS、10mM ジチオスレイトール、10% グリセロール、12% 尿素、10mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、1×プロテアーゼインヒビター混合物(Roche)、25μM MG132
プロテオソームインヒビターを含む100μlの溶解緩衝液を5分間煮沸した。次いで、Bradford試薬(Pierce)を使用してタンパク質を定量し、590nmで分光光度的な読み取りを行った。濃度は、ウシ血清アルブミンを使用して生成した標準曲線に対して見積もった。全タンパク質(5μg)を、10% SDSを含む変性10% ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動に供した。次いで、セミドライ転写装置を使用して、タンパク質をImmobilon−Pメンブレン(Millipore)に転写した。メンブレンは、PBS中、2% ノンファット粉末ミルク(Bio−Rad)を含む、0.01% Tween 20でブロックした。タンパク質は、ブロッキング溶液中の50ng/ml濃度の抗体とともにインキュベートすることによって検出した。使用した抗体は
Oct4(h−134 Santa Cruz Biotechnology);Sox2(マウスモノクローナル R&D Biosystems);c−Myc(06−340 Upstate);Klf4(H−180 Santa Cruz Biotechnology);GAPDH(sc−25778 Santa Cruz Biotechnology)であった。
総RNAはTrizol試薬(Invitrogen)を使用して単離した。DNAフリーRNAキット(Zymo Research)を使用して、5μgの総RNAをDNase Iで処理して、潜在的なゲノムDNAの汚染を除去した。1μgのDNase I処理したRNAを、First Strand Synthesisキット(Invitrogen)を使用して逆転写し、最終的に、100μlの水に再懸濁した。定量的PCR分析は、ABI Prism 7000(Applied Biosystems)において、Platinum SYBR green qPCR SuperMix−UDG with ROX(Invitrogen)を用いる逆転写反応の1/50を使用して3連で実施した。等量のローディングはGAPDH mRNAを増幅することによって達成し、すべての反応は3連で実施した。増幅のために使用したプライマーは以下の通りであった:
10μgのBamHI消化したゲノムDNAを0.7% アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン(Amersham)に転写し、そしてOCT4(pFUW−tetO−OCT4プラスミドのEcoRI−PstIフラグメント)、KLF4(全長KLF4 cDNA)、c−MYC (全長c−MYC cDNA)、およびSOX2(pFUW−tetO−SOX2プラスミドの全長フラグメント)についての32Pランダムプライマー(Stratagene)標識したプローブとともにハイブリダイズさせた。
細胞は、4% パラホルムアルデヒド中で25℃にて20分間固定し、PBSで3回洗浄し、そして0.1% Triton−Xを含むPBS中の5% FBSで15分間ブロックした。0.1% Triton−Xを含むPBS中の1% FBS中のOct4(Santa Cruz h−134)、Sox2(R&D Biosystems)、Nanog(anti−ms R&D and anti−h)、Tra−1−60、(マウスモノクローナル、Chemicon International);hNANOG(ヤギポリクローナル R&D Systems); mNANOG(Bethyl A300−398A)、Tral−81(マウスモノクローナル、Chemicon International)、SSEA4およびSSEA1(モノクローナルマウス、Developmental Studies Hybridoma Bank)に対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、細胞は、PBSで3回洗浄し、Jackson
Immunoresearchから購入した蛍光団標識された適切な二次抗体とともにインキュベートした。試料はOlympus蛍光顕微鏡で分析し、画像はZeiss Axiocamカメラで獲得した。
二倍体胚盤胞(hCG注入の94〜98時間後)は、ミネラルオイル下の1滴のHepes−CZB培地中に配置した。16μm内径の平らな先端のマイクロインジェクションピペットをiPS細胞注入のために使用した。各胚盤胞は8〜10個のiPS細胞を受容した。注入後、胚盤胞は、カリウムシンプレックス最適化培地(KSOM)中で培養し、レシピエント雌に移すまで37℃に配置した。約10個の注入された胚盤胞は、交尾2.5日後の偽妊娠B6D2F1雌の各子宮角に移した。仔は19.5日目に回収し、必要な場合、授乳B6D2F1母を里親とした。テラトーマ形成は、レシピエントSCIDまたはRag2−/−マウスの脇腹の下に2×106細胞を沈着させることによって実施した。腫瘍は組織学的分析のために3〜6週間後に単離した。
hiPSCはコラゲナーゼ処理(1.5mg/ml)によって収集し、引き続く培地での洗浄およびiPSCコロニーの沈殿によって支持細胞から分離した。iPSC凝集体は遠心分離によって収集し、250μlのiPSC培養培地中に106細胞の比率で再懸濁し、iPSCはSCIDマウス(Taconic)の背中に21ゲージ針によって皮下注射した。腫瘍は6週間以内に発生し、動物は腫瘍サイズが直径1.5cmを超える前に屠殺した。テラトーマはマウスを屠殺した後で単離し、ホルマリンで固定した。切片化後、テラトーマはヘマトキシリンおよびエオシン染色に基づいて診断した。核型分析はCLGenetics(Madison、WI)を用いて行った。
ヒトケラチノサイトiPS細胞は、毎日培地を交換しながら、2週間の間、継代なしで培養中において成長させた。継代後15日目に、区別できる神経ロゼットが観察され、ガラスピペットによって機械的に拾い上げて集めた(26)。ロゼットは、FGF2(20ng/ml)EGF(20ng/ml)(すべてR&D Systems)を補充したN2B27培地中の15μg/ml ポリオルニチン/10μg/mlのラミニン(Po/Lam)でプレコートしたディッシュ上で再プレートした。5〜7日後、セルリフターを用いて引っ掻くことによって、およびN2B27培地中に単一の細胞をピペッティングすることによって細胞を解離させ、Po/Lam培養ディッシュに再プレートした。
神経前駆細胞の分化の誘導は、培養培地からのFGF2およびEGFの5日間の中止によって実施した。細胞は、20分間、4% パラホルムアルデヒド中に固定し、ヒトネスチン(Chemicon;1:100)およびTuj−1(1:100)について染色し、続いて、PBSで3回洗浄し、Jackson Immunoresearchから購入した蛍光団標識された適切な二次抗体とともにインキュベートした。試料はOlympus蛍光顕微鏡で分析し、画像はZeiss Axiocamカメラを用いて獲得した。
ベクターは、1つのプロモーターからの2種、3種、または4種すべての再プログラミング因子の様々な組合せを用いて構築される。目的は、2Aペプチドを使用して、単一のプロモーターから複数の再プログラミング遺伝子を発現するポリシストロン性ウイルスベクターを生成することであった。このために、独特な制限部位を含む1種、2種、または3種の2AオリゴペプチドをFUWレンチウイルス(18)バックボーンに連結し、異なる2A配列によって各々が分離されているOct4、Sox2、c−Myc、およびKlf4の効率的なクローニングを可能にした。F2A、T2A、E2A、またはP2A配列(図13Aおよび図14A)の異なる組合せを構成的に有する4種、3種、または2種の因子を有するベクターは、ヒト293細胞における一過性トランスフェクションによって個々の因子を発現するそれらの能力について試験した。ウェスタンブロット分析は、2Aペプチドが、単一のポリシストロン性ベクターからの2種、3種、または4種すべてのシストロンの効率的な発現を支持することを実証した(図14B)。
ヒト細胞がポリシストロン性ベクターを用いて再プログラムできるか否かを調べるために、新生児ヒトフォルスコリンケラチノサイト(NHFK)に、構成的rtTAベクターとDOX誘導性4F2Aベクターの両方で形質導入した。感染細胞の画分は、形質導入の48時間後にOct4についての染色によって決定されるように10%であった(図20A)。細胞はケラチノサイト培地+DOX中でインキュベートし、これらが継代され、ゼラチン化プレート上のhESC培地+DOX中で培養されるまで6日間増殖させた。コロニーは12日目に最初に検出し、多くは変形した形態を示し、少数のコロニーはhESC様形態に類似する区別できる外見を示した。独立した感染において生成した2つのこのようなコロニーは、感染後22日目から35日目の間に拾い上げ、hESCに類似する形態を有する区別できるコロニーとして拡大することを見出した(図17A)。これらの細胞はDOXの非存在下で拡大し、さらなる2〜5回の継代後、hESCと同一の均質な集団を生じた(Ker−iPS)。これらの細胞は多能性マーカーAP、Oct4、Nanog、Sox2、SSEA4、Tral−60、Tral−81(図17B、図10B)について染色され、正常な核型を有していた(図17C)。DNAフィンガープリンティングは、このようなKer−iPS細胞系統が本発明者らの研究室からの以前に樹立されたヒトiPS細胞またはhES細胞系統からの夾雑物であった可能性は除外した(データ示さず)。Ker−iPS細胞系統におけるプロウイルスコピー数を決定するために、ゲノムDNAを抽出し、ベクター配列において切断しない酵素を使用するサザンブロット分析に供した。4種すべての再プログラミング因子のためのプローブは、再度、同様の分子量バンドへのハイブリダイゼーションを示し、これらが単一ウイルス上にあったことを示す。2つの異なる消化物(XbaIおよびBamHI)は、4F2Aプロウイルスコピー数がそれぞれ3(#1.1)および2(#3)であることを示す(図21A〜B)。
上記の実験は、2A配列によって分離されているポリシストロン性ベクターに挿入された4種までの異なる再プログラミング因子は再プログラミングを達成するために十分なレベルで発現できることを示す。胚性および成体マウス線維芽細胞ならびに新生児ヒトケラチノサイトは、FUW rtTAおよび2Aベクター形質導入Oct4、Sox2、Klf4、およびc−Mycで感染された場合に、多能性iPS細胞を形成するように誘導された。
ウイルス再プログラミング因子を含まない、ヒト誘導性多能性幹細胞
実験手順
細胞培養
本論文に記載されるすべての一次線維芽細胞細胞株は、the Coriell Cell Repositoryから購入した。線維芽細胞は、線維芽細胞培地[15% FBS(Hyclone)、1mM グルタミン(Invitrogen)、1% 非必須アミノ酸(Invitrogen)、およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したDMEM]中で培養された。HiPSCおよびhESC系統BG01およびBG02(NIHコード:BG01およびBG02;BresaGen,Inc.,Athens,GA)は、hESC培地[15% FBS(Hyclone)、5% KnockOut(商標)血清代替物(Invitrogen)、1mM グルタミン(Invitrogen)、1% 非必須アミノ酸(Invitrogen)、0.1mM β−メルカプトエタノール(Sigma)、および4ng/ml FGF2(R&D systems)で補充されたDMEM/F12(Invitrogen)]中のマイトマイシンC(MMC)不活化マウス胚線維芽細胞(MEF)支持細胞層上で維持した。培養物は、5〜7日毎に、手動でまたはIV型コラーゲン(Invitrogen;1.5mg/ml)を用いて酵素的にのうちのいずれかで継代した。ヒト胚性幹細胞H9(NIHコード:WA09、Wisconsin Alumni Research Foundation,Madison,WI)は、MMC不活化MEFまたはMMC不活化ヒト線維芽細胞(D551;American Type Culture Collection,Manassas,VA)上で、製造業者のプロトコールに従って維持した。EB誘導性分化については、ESC/hiPSCコロニーは、1.5mg/ml IV型コラゲナーゼ(Invitrogen)を使用して収集し、重力によってMEF支持細胞から分離し、穏やかにトリチュレートし、そして15% FBSを補充したDMEM中で非接着懸濁培養ディッシュ(Corning)中で10日間培養した。
テトラサイクリンオペレーターおよび最小CMVプロモーターの制御下にある、FUW−M2rtTAレンチウイルスベクターおよびKLF4(FUW−tetO−hKLF4)、OCT4(FUW−tetO〜hOCT4)、SOX2(FUW−tetO−hSOX2)、およびc−MYC(FUW−tetO−hMYC)についてのヒトDNAを含むレンチウイルスベクターが以前に記載されている(Hockemeyerら、2008)。Creリコンビナーゼ切除可能DOX誘導性レンチウイルスベクターを生成するために、テトラサイクリンオペレーター/最小CMVプロモーターを含むNotI/Bsu36Iフラグメント、およびKLF4、OCT4、またはSOX2のいずれかについてのヒトcDNAが、FUW−tetOベクターからFUGW−loxPのNotI/BSU36I部位にサブクローニングされ、これは、3’LTRにおいてloxP部位を含む(Hannaら、2007)。
VSVGコートされたレンチウイルスは、以前に記載されたように293細胞中で生成した(Brambrinkら、2008)。手短に述べると、培養培地は、トランスフェクション後12時間で交換し、ウイルス含有上清はトランスフェクション後60〜72時間で収集した。ウイルス上清は0.45μmフィルターを通して濾過した。ウイルス含有上清は3種および4種因子感染のためにプールし、FUW−M2rtTAウイルスおよび等量の新鮮な培養培地を補充した。1×106ヒト線維芽細胞はT75フラスコ中で形質導入の24時間前に播種した。2μg/mlのポリブレンの存在下での4回の連続感染が48時間の期間にわたって実施された。培養培地は、最後の感染の12時間後に交換した。形質導入の5日後、線維芽細胞は、トリプシンを使用して継代し、ゼラチンコートしたディッシュ上の10cm2あたり5×104から2×105細胞の間の異なる密度で再プレートした。再プログラミングを誘導するために、培養培地は、DOX(Sigma−Aldrich;2μg/mlを補充したhESCによって48時間後に置き換えられた。HiPSCコロニーは、DOX誘導後3から5週間の間、形態に基づいて手動で拾い上げ、そしてDOX非存在下では、hESCプロトコールに従って、手動で維持および継代を行った。再プログラミング効率を決定するため、1×105ヒト線維芽細胞は、10cm2ゼラチンコートされたディッシュに播種した。再プログラミング効率は、多能性マーカーTra−1−60およびNANOGについての免疫細胞化学に基づいて20日後に計算した。
RNAは、hESCおよびiPSCから単離し、これらは、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して、支持細胞から機械的に分離された。2μgの総RNAを使用して、製造業者のプロトコールに従って(Affymetrix One Cycle cDNA Synthesis Kit)、ビオチン化cRNAを調製した。手短に述べると、この方法は、T7−Oligo(dT)プロモータープライマーを使用するSuperscript II指向性逆転写を含み、第1鎖cDNAを作製する。RNase H媒介第2鎖cDNA合成に、T7 RNAポリメラーゼ指向性インビトロ転写が続き、これは、cRNA増幅の間にビオチン化ヌクレオチドアナログを取り込む。Affymetrixハイブリダイゼーションマニュアルに従って、1×ハイブリダイゼーションカクテル中の15μgビオチン化cRNAを使用して、ハイブリダイゼーションのためのサンプルを調製した。GeneChipアレイ(Human Ul33 2.0)は、60RPMで16時間の間、45℃のGeneChip Hybridizationオーブンの中でハイブリダイズさせた。洗浄は、製造業者の説明書に従って、GeneChip Fluidics Station 450を使用して行い、Affymetrix GeneChip Hybridization,Wash and Stain
Kitの中に提供される緩衝液を使用して行った。アレイはGeneChip Scanner 3000上でスキャンし、画像は、GeneChip Operating Software v1.4を使用して抽出および分析した。U133 Plus 2.0マイクロアレイ(Affymetrix)は、MAS5アルゴリズムを使用して処理され、各プローブセットについての非存在/存在コールは、標準的なAffymetrixアルゴリズムを使用して決定され、両方がBioconductor実装されている。すべてのサンプル中で非存在であるプローブセットは、引き続く分析のために除去される。示差的な発現は、R(偽発見速度について補正)における「リンマ(limma)」パッケージを使用するt検定、または倍数変化を使用して、中程度と決定した。遺伝子が複数のプローブセットによって表されている場合(Affymetrixからの注釈に基づく)、遺伝子発現のログ比率およびp値は、それぞれ、これらのプローブセットの平均および最小値として計算した。階層的クラスタ分析は、非中心ピアソン相関および対平均連鎖を使用して、対数−形質転換遺伝子発現比率に対して実施した。相関は、フィッシャーのZ変換を使用して比較した。階層的クラスタ分析の信頼度は、Rパッケージ「pvclust」を用いるマルチスケールブーツトラップリサンプリングを使用して計算した。
RNAは、支持細胞から機械的に分離させたEBまたはhESCおよびiPSCから、RNeasy Mini Kit(Qiagen)またはトリゾール抽出のいずれか、および引き続くエタノール沈殿を使用して単離した。逆転写は、オリゴdTプライミングおよびThermoscript逆転写酵素(Invitrogen)を50℃で使用して、1μgの総RNAに対して実施した。リアルタイムPCRは、Platinum SYBR green pPCR SuperMIX−UDG with ROX(Invitrogen)とともに、ABI Prism 7000(Applied Biosystems)において、部分的に以前に記載されたプライマー(Hockemeyerら、2008;Yuら、2007)、および部分的にSoldnerら、2009、捕足の実験手順に記載されているプライマーを使用して実施する。
hiPSCはコラゲナーゼ処理(1.5mg/ml)によって収集し、引き続く培地での洗浄およびiPSCコロニーの沈殿によって支持細胞から分離した。hiPSC凝集体は遠心分離によって収集し、250μlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に再懸濁した。hiPSCはSCIDマウス(Taconic)の背中に皮下注射した。腫瘍は一般的に4〜8週間以内に発生し、動物は腫瘍サイズが直径1.5cmを超える前に屠殺した。テラトーマはマウスを屠殺した後で単離し、ホルマリンで固定した。切片化後、テラトーマはヘマトキシリンおよびエオシン染色に基づいて診断した。
ゲノムDNAは、支持細胞から機械的分離によってhESCおよびhiPSCから収集した。DNAはプロテイナーゼK処理し、フェノールクロロホルム処理し、そして1μgのDNAを、Qiagen EpiTect Bisulfiteキットを使用する転換に供した。OCT4のプロモーター領域は、以前に記載されたプライマーを使用して増幅した(Yuら、2007)。
細胞は、PBS中4% パラホルムアルデヒドに固定し、以下の一次抗体:SSEA4(マウスモノクローナル、Developmental Studies Hybridoma Bank);Tra1−60、(マウスモノクローナル、Chemicon International);hSOX2(ヤギポリクローナル、R&D Systems);Oct−3/4 (マウスモノクローナル、Santa Cruz Biotechnology);hNANOG(ヤギポリクローナル R&D Systems);適切なMolecular Probes Alexa Fluor(登録商標)色素結合体化二次抗体(Invitrogen)を使用した。
XbaI、EcoRI、またはMfeI消化ゲノムDNAは、0.7% アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン(Amersham)に転写し、そしてOCT4 (pFUW−tetO−hOCT4プラスミドのEcoRI−PstIフラグメント)、KLF4(全長hKLF4 cDNA)、c−MYC (全長c−MYC cDNA)、SOX2(pFUW−tetO−hSOX2プラスミドのFspI−EcoRIフラグメント)、およびM2rtTA(M2rtTA c−DNAの380bp C末端フラグメント)についての32Pランダムプライマー(Stratagene)標識したプローブとともにハイブリダイズさせた。
マイクロアレイデータは、一連のアクセッション番号GSE14711の下で、NCBI Gene Expression Omnibusデータベースにおいて利用可能である。
本実施例において本発明者らは、特発性パーキンソン病(PD)を有する5例の患者からの線維芽細胞が効率的に再プログラムできることを示す。さらに、本発明者らは、Creリコンビナーゼ切除可能なウイルスを使用して、再プログラミング因子を含まないヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)を誘導した。因子を含まないiPSCは多能性状態を維持し、そして導入遺伝子を有するhiPSCよりもhESCにより密接に関連する、全体の遺伝子発現プロフィールを示す。本発明者らの結果は、ウイルスを有するhiPSCにおける残りの導入遺伝子発現がそれらの分子特性に影響を与えることができ、そして因子を含まないhiPSCは、それゆえに、ヒト疾患のモデリングのためのより適切な細胞の供給源を表すことを示唆する。
DOX誘導性レンチウイルスベクターによるPD患者からの線維芽細胞の再プログラミング
特発性PDを有する5例の患者(生検の年齢、53から85歳の間)および2例の罹患していない被験体からの皮膚線維芽細胞をthe Coriell Institute
for Medical Research(表4を参照のこと)から入手した。再プログラミングを誘導するために、1×106線維芽細胞を、4種(OCT4、SOX2、c−MYC、KLF4)または3種(OCT4、SOX2、KLF4)のいずれかの再プログラミング因子を形質導入するDOX誘導性レンチウイルスとともに、リバーステトラサイクリントランス活性化因子(FUW−M2rtTA)を発現する構成的に活性なレンチウイルスで感染させた。次に、本発明者らは、hsPSC4Fとしての4種因子の形質導入によって駆動されるhsPSC系統、およびhsPSC3Fとしての3種因子の形質導入によって得られるhsPSC系統に言及する。十分に規定されたhESC様形態を有するコロニーは、DOX誘導性導入遺伝子発現の3〜5週間後に、選択しかつ手動で拾い上げた。PD患者および非PD患者から得られたすべての線維芽細胞は、安定なhiPSCを生じ、これは、DOXの非存在下で、30継代より多くの間維持された。各ドナー線維芽細胞からの少なくとも1つの細胞系統が、詳細に分析された(表4)。免疫細胞化学によって決定されたように、これらのhiPSCのすべてが、多能性マーカーTra−1−60、SSEA4、OCT4、SOX2、およびNANOGを一様に発現した(図27A)。加えて、定量的RT−PCRによって分析されたすべてのhiPSC系統は、内因性多能性関連遺伝子OCT4、SOX2、およびNANOGの再活性化を、hESCにおいてみられるのと同様の発現のレベルで示した(図27B)。hiPSCについて予測されるように、PD患者由来のhiPSCのOCT4プロモーター領域は、親の線維芽細胞における過剰メチル化状態とは対照的に、低メチル化状態であることが見出された(図27C)。多能性について試験するために、各ドナー線維芽細胞系統から単離されたhiPSCは、SCIDマウスに注入された。すべてのhiPSC形成したテラトーマは、軟骨、骨、平滑筋(中胚葉)、神経ロゼット、色素性神経上皮(外胚葉)、ならびに杯状細胞およびパーネト様細胞を伴う腸上皮(内胚葉)を含むすべての胚性胚葉から発達する組織から構成された(図28A)。
プロウイルスを含まなかったhiPSCを誘導するために、本発明者らは、Creリコンビナーゼを使用して組込み後に切除できるレンチウイルスベクターを生成した。3’LTRにloxP部位を含むFUGW−loxPレンチウイルスのヒトユビキチンプロモーターは(Hannaら、2007)、DOX誘導性、最小CMVプロモーターで置き換えられ、その後にOCT4、KLF4、またはSOX2のためのヒトcDNAが続く。プロウイルス複製に際して、3’LTRのloxP部位は5’LTRに重複しており、両方のLTRにおけるloxP部位に隣接する組み込まれた導入遺伝子を生じる(図4A)。1×106線維芽細胞(PDB)は、これらの3つのウイルスで、ならびにリバーステトラサイクリントランス活性化因子を発現する(FUW−M2rtTA)。24hiPSC系統(PDB2lox1〜24)は、上記と同様の反応速度論および効率でDOX添加後3〜4週間で単離された。12細胞系統についてのサザンブロット分析は、4種のPDB2lox系統(PDB2lox−5、PDB2lox−17、PDB2lox−21、PDB2lox−22)が、再プログラミング因子の5〜7の組込みのみを含んだことを示した(図33)。これらのPDB2lox細胞系統は、20より多くの継代でDOXの非存在下で維持され、多能性関連マーカータンパク質Tra−1−60、SSEA4、OCT4、SOX2、およびNANOGの発現などのhiPSCの特徴のすべて(図29B)、ならびに内因性関連遺伝子OCT4、NANOG、およびSOX2の再活性化(図31Bに含まれる)を示した。さらに、すべての試験したPDB2loxクローン(PDB2lox−5、PDB2lox−17、PDB2lox−21、PDB2lox−22)は、EBにおけるインビトロ複数系統分化を実証し(データ示さず)、SCIDマウスへの皮下注射後に3種すべての胚性胚葉への寄与を伴ってテラトーマを形成した(図29C)。
本実施例に記載された研究において、本発明者らは、特発性PDを有する患者から得られた皮膚生検からのhiPSCを誘導した。本発明者らは、少ない数のプロウイルスべクター組込みを有する患者特異的hiPSCの再現可能な生成を可能にする強固な再プログラミングプロトコールを開発した。組み込まれたプロウイルスに隣接するloxP部位を有する修飾レンチウイルスの使用は、すべての導入遺伝子配列の効率的な除去を可能にし、そして再プログラミング因子を含まないhiPSCを生成した。因子を含まないhiPSCは多能性であり、分子判断基準を使用すると、従来的なベクター含有の親のhiPSCよりも、胚由来のhESCにより類似していた。PDなどの多くの神経変性性疾患の根底にある病態生理学を理解する努力は、本物のインビトロモデルの欠如によって妨げられている。hiPSC技術を使用して、本発明者らは、3種または4種のいずれかの再プログラミング因子を形質導入するDOX誘導性レンチウイルスベクターを使用して、特発性PDを有する5例の患者からhiPSC系統を樹立した。これらの細胞は、すべての胚性胚葉の細胞型に分化する能力を含む多能性ES細胞の特徴のすべてを有することが示された。
3’LTR中にloxP部位を用いてDOX誘導性レンチウイルスベクターを使用して、本発明者らは、導入遺伝子のCreリコンビナーゼ媒介性切断後に、PD特異的で再プログラミング因子を含まないhiPSCを誘導した。自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクターにおけるプロモーターおよび導入遺伝子配列の除去は、ウイルス媒介性の発癌遺伝子活性化および/または導入された転写因子の再発現に起因する、発癌遺伝子による形質転換のリスクを顕著に減少することが予想される(AllenおよびBerns、1996;von Kalleら、2004)。残されている遺伝子破壊のリスクは、ゲノムの安全な遺伝子座へのloxP部位によって隣接されるポリシストロン性単一発現ベクターとして再プログラミング因子を標的化することによって除去できる。
導入遺伝子発現のサイレンシングはいくつかのhiPSCのために報告されてきたが、今日までに生成されたすべてのhiPSCは(再プログラミング因子の除去の前の本実施例に記載された系統を含む)、弱いがしかし検出可能な導入遺伝子発現を持続している(Dimosら、2008;Ebertら、2008;Hockemeyerら、2008;Parkら、2008a;Yuら、2007)hiPSCが、多能性ESC様状態を維持するために再プログラミング因子の発現に依存するか否かという質問は、それゆえに、結論的に解決したわけではない。因子を含まないhiPSCは形態学的にかつ生物学的に親のhPSCとは区別できず、そしてhESCのすべての特徴を維持していたという観察は、ヒト体細胞が自己保持的多能性状態に再プログラム可能であり、この状態は、外因性再プログラミング因子の完全な非存在下でも維持可能であることを実証する。これらの結果は、hiPSCが、4種の内因性転写因子OCT4、NANOG、SOX2、およびTCF3の活性化に頼ることが提案されてきた(JaenischおよびYoung、2008)、多能性関連の自己調節ループを再確立することのさらなる証拠を提供する。
特定のプロウイルスのゲノム組込み部位はプロウイルスのサイレンシングおよびその再活性されるリスクに影響を与えるので、同一かつ予測可能な特性を有するhiPSCは、確率論的なサイレンシングに頼るアプローチによって生成できない。残りの導入遺伝子発現は、iPSCの分化特性に影響を与え得る。確かに、マウスESとiPSCの間には、心筋細胞に分化するそれらの能力(K.Hochedlinger、私信)ならびに区別できるhiPSCクローンの不完全なOCT4およびNANOGダウンレギュレーションに伴う部分的にブロックされたEB誘導性分化において顕著な違いが観察されてきた。これらの観察は、部分的にのみサイレンシングされたベクターの変動するベースの転写が、機能的に分化した細胞の生成に影響を与え得るという可能性と一致している。
a これらの線維芽細胞系統に関するさらなる情報はCoriell Instituteから入手可能である。
b PDB3F−12dは導入遺伝子発現の時間的な要件を決定するための実験において単離された。PDB3F−12dは12日間ドキシサイクリンに曝露された培養から単離した。
c これらの細胞は導入遺伝子発現の時間的な要件を決定するための実験において誘導した。PDB4F−lから−3は、8日間ドキシサイクリンに曝露された培養から単離したのに対し、PDB4F−4および−5は10および12日間ドキシサイクリンに曝露された培養からそれぞれ単離した。
d これらのhiPSC細胞はHockemeyerら、2008において以前に特徴付けされている。
Claims (1)
- 図面中に記載の発明。
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