CN102690770A - 提供改良质地的发酵奶制品的乳酸菌 - Google Patents

提供改良质地的发酵奶制品的乳酸菌 Download PDF

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Abstract

一种新的嗜热链球菌(ST)细菌，其在如发酵的奶制品中提供改良的质地。

Description

提供改良质地的发酵奶制品的乳酸菌
本申请是申请日为2007年2月20日、发明名称为“提供改良质地的乳酸菌”的中国专利申请200780005994.4的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(ST)细菌，其在如发酵的奶制品中提供改良的质地。
背景技术
嗜热链球菌中的许多菌株会合成胞外多糖(EPS)。这些分子可以形成与细胞呈紧密相连的囊，或它们可被释放进入介质中形成自由的粘液(即“成粘丝的”多糖)。尽管胞外多糖的存在并不赋予在奶中生长或存活的嗜热链球菌任何明显的益处，但是在利用这种嗜热链球菌或其他奶制品用乳酸菌的原位生产典型地赋予发酵的奶制品期望的“成粘丝的”或粘性质地。有研究表明产胞外多糖的嗜热链球菌可提高莫扎里拉(Mozzarella)干酪的功能性特性。进一步的细节参见Broadbent等人的综述文章(J.dairy Sci.86：407-423)。
WO2004/085607A2(Rhodia Chimie)描述了嗜热链球菌(ST)菌株，其包括在EPS的生物合成中涉及的一些特定的具体基因(称为“eps”基因)。
Hassan等人(2003；J.dairy Sci.86：1632-1638)描述了2个“成粘丝的”嗜热链球菌菌株，CHCC3534和CHCC3541。这两种菌株都对噬菌体敏感。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种具有改良性能的新嗜热链球菌菌株，其尤其涉及能够给予改良质地的发酵奶制品如酸奶酪并且其能够用在目前高度工业化的存在噬菌体侵袭问题的奶制品生产中。
如在下面的工作实施例中可以看出，这里描述的登记号为DSM 17876(这里也可称为CHCC8833)的新嗜热链球菌(ST)菌株比有关的商业获得的ST菌株具有改良的质地(以剪切应力测量的)，所述商业获得的ST菌株被认为是具有高质地的且目前用于奶制品工业中。这里描述的新DSM17876ST菌株不包含WO2004/085607A2(Rhodia Chimie)中描述的特定的具体eps基因(通过PCR分析确定-数据未显示)。此外，如实施例2中所示，嗜热链球菌菌株CHCC8833具有能够抵抗奶制品中出现的大量噬菌体的优点。
因此，本发明的第一方面涉及登记号为DSM 17876的乳酸嗜热链球菌(ST)细菌或其突变体，其中突变体菌株是使用保藏的菌株作为原料而制得，且其中突变体保留或进一步改良了DSM 17876的质地性能。
本发明的第二方面涉及起始培养物组合物，其包含第一方面中的细菌。
本发明的第三方面涉及生产食物或饲料的方法，其包括将第二方面中的初始培养物组合物加入到食物或饲料原料中，并且使这样接种的原料保持在细菌活跃新陈代谢的条件下。
本发明的实施方式仅通过实施例的方式描述如下。
附图说明
图1：结果显示出与可由商业获得的、被认为是高质地菌株的ST菌株相比，用新ST菌株发酵的牛奶具有提高的质地(剪切应力)。在实施例2中描述了所述菌株。质地通过测量剪切应力来评价，其通过流变仪测量，以帕斯卡[Pa]表示，如实施例1所述。棒表示1x S.E。
发明详述
新的嗜热链球菌菌株
新的嗜热链球菌(ST)菌株CHCC8833的样品已保藏在DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，保藏号为D SM17876，保藏日期为2006年1月11日。保藏已经国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约规定的条件下进行。
本发明的第一方面涉及这里所描述的新菌株或“其突变体”。
对本领域技术人员显而易见的是，通过使用保藏的菌株作为原料，本领域的读者可以通过常规诱变或再分离技术常规地获得这些菌株的进一步突变体或衍生物，其保留有这里所描述的相关的特征和优点。因此第一方面中的术语“其突变体”涉及使用保藏的菌株作为原料所获得的突变菌株。
因为奶和奶制品场中的环境通常不是无菌的，因此噬菌体对奶制品的生产构成了严重的威胁。噬菌体感染乳酸菌并且以爆炸性的方式进行繁殖，导致细胞死亡结果造成缺陷酸化和生产失败。尤其是在使用非常大的大桶的现代奶制品工业中，噬菌体的攻击涉及到非常重大的经济损失。因此工业界一直努力研发新的抗噬菌体培养物。如实施例1和2中所述，嗜热链球菌菌株CHCC8833(DSM 17876)不仅提供惊人的高质地而且出乎意料地的是，与其它的高质地菌株相比，CHCC8833对所有测试的噬菌体都具有抵抗力。
包含这里所描述的LAB的初始培养物
这里描述的乳酸菌(LAB)在食物和饲料的生产中用作初始培养物。基本上，这种初始培养物组合物中包含浓缩形式的细菌，所述浓缩形式包括基本上具有浓缩的活细胞的冰冻、干燥或冻干的浓缩物，其范围为每克组合物104～1012cfu(菌落形成单位)，所述组合物包括每克组合物至少104cfu，例如至少105cfu/g，至少106cfu/g，至少107cfu/g，至少108cfu/g，至少109cfu/g，至少1010cfu/g，至少1011cfu/g。
组合物可作为进一步的组分含有冷冻保护剂和/或包括如酵母抽提物、糖和维生素的营养物质的常规添加剂。
由于在乳酸菌发酵过程中使用乳酸菌的混合培养物是正常的，所以在某些实施方式中组合物会包含术语相同种类或不同种类的多种菌株。在初始培养组合物中使用的这样的乳酸菌组合的典型例子为明串珠菌属(Leuconostoc sp.)和一种或多种乳球菌亚种的混合物，如乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp.cremoris)或如乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar Diacetylactis)。
生产食物或饲料的方法
如上所述，本发明一方面涉及生产食物或的饲料的方法，其包括将这里所描述的初始培养物组合物加入到食物或饲料原料中，并且使如此接种的原料保持在细菌能够进行活跃新陈代谢的条件下。
有用的食品原料包括常规经过乳酸菌发酵步骤的任何材料，如牛奶、蔬菜、肉类产品、果汁、葡萄汁、生面团以及糊状物。
通过该方法获得的发酵产物，包括典型的奶制品如发酵奶、酸奶酪、包括新鲜干酪产品或莫扎里拉干酪的干酪以及酪乳。
对于这里的有关发酵食品的进一步例子和细节可参考Broadbent等人的综述性文章(J.dairy Sci.86：407-423)，其中相关的发酵食品在题目为“Application in Yogurt and Fermented Milks”和“Application in MozzarellaCheese”的部分中有描述。
在进一步的实施方式中，基质材料为用于动物喂养的原料，例如草、谷类、豌豆类、苜蓿或甜菜叶的青贮饲料，在这些原料中，细菌培养物被接种于青贮的饲料农作物中以保存，或接种于富含蛋白质的动物废物如屠宰下水和鱼下脚中，其目的也是保存这些废料用于动物喂养。
实施例
实施例1：在发酵牛奶中CHCC8833-增加的质地
菌株：
CHCC8833：此处所述的DSM 17876 ST新菌株。
参比菌株：参见实施例2
所有的菌株均为通常被认为具有高质地的商业菌株。
奶发酵：
用冷冻浓缩的ST菌株接种含有9.5％干物质的200mL复制乳，该复制乳在批量加工中在99℃下加热处理15分钟。冷冻浓缩的CHCC8833基本显示1×109和1×1010cfu/g之间细胞数。接种率为1g浓缩物/10L牛奶，因此在1×105和1×106cfu/mL奶之间。在37℃下进行培养直到pH达到4.55，此时奶发生凝结。然后将发酵的奶冷却到5°℃。
发酵奶的质地分析
在接种后的当天，将发酵奶温度达到13°℃，并使用配有钻孔盘的棒子轻轻搅拌直到样品均匀。在配备C25同轴测量系统的流变仪(StressTech，Reologica Instruments，Sweden)上评价样品的流变学性质。
用在21步中从0.27到300s-1变化变化的剪切速率进行粘度测量测试。剪切速率先增加接着降低，记录剪切应力(帕斯卡，Pa)以及表观粘度(Pa*s)的上升和下降曲线。延迟和积分时间分别为5s和10s。对进一步分析，选择在300s-1时的剪切应力。
结果与结论
使用当前奶制品工业中使用的嗜热链球菌菌株(参比菌株)浓缩物进行发酵的发酵奶与使用CHCC8833产生的样品相比粘稠较低(较小的剪切应力)(参见这里的图1)。
实施例2：CHCC8833-噬菌体抗性概述
细菌菌株：
CHCC2389：嗜热链球菌菌株ST143，可从Chr.Hansen A/S商业获得F-DVS ST143，材料号：200144。CHCC2389和CHCC3534(Hassan等人，2003)是相同菌株的不同分离物。
CHCC3021：嗜热链球菌菌株ST10255，可从Chr.Hansen A/S商业获得F-DVS ST-BODY-2，材料号：623155。
CHCC3541：嗜热链球菌菌株ST20，可从Chr.Hansen A/S商业获得F-DVS ST20X，材料号：501696。
CHCC4239：嗜热链球菌菌株ST4239，可从Chr.Hansen A/S商业获得混合培养物F-DVS ABY-4，材料号：675175。
CHCC5086：嗜热链球菌菌株5086，可从Chr.Hansen A/S商业获得混合培养物F-DVS YF-LX701，材料号：660656。
CHCC5389：嗜热链球菌菌株5389，可从Chr.Hansen A/S商业获得混合培养物F-DVS ABY-4，材料号：675175。
CHCC5581：嗜热链球菌菌株TA40，可从Chr.Hansen A/S商业获得。
CHCC8833：嗜热链球菌菌株DSM 17876。
噬菌体测试
用包含43个单独的噬菌体分离物的噬菌体试板，通过斑点试验，对上述提及的高质地商用菌株的噬菌体敏感性进行对比。
斑点试验为琼脂覆盖方法，可计算样品中的噬菌体数目。该方法涉及在柔软上层琼脂的辅助下，将待测细菌菌株平板接种与琼脂板的表面(下层琼脂)。然后将不含细胞的噬菌体分离物的不同稀释液点在上层琼脂上。单个噬菌体将攻击细菌细胞并进行复制，释放出噬菌体粒子，以攻击和裂解附近的细菌，产生透明区域(嗜菌斑)，该区域被不透明的培养物生长所包围，参见Adams，M.H.(1959)Bacteriophages.IntersciencePublishers，Inc.，New York。
方法
简言之，即是用10ul未稀释的和1∶100稀释的噬菌体裂解物物(噬菌斑形成单位(PFU)约109/ml)点在待测试的细菌菌株(宿主菌株)上，并在37℃下进行培养过夜。
使用的琼脂为M17琼脂(Oxoid CM785)+2％乳糖，基本上根据供应商(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，UK)推荐制备。
在1∶100的稀释液中出现的透明区域或单个菌斑被认为是受噬菌体攻击所引起并说明发生了攻击。
结果与结论
斑点试验的结果发现CHCC2389，CHCC3021，CHCC3534，CHCC3541，CHCC4239以及CHCC5086对噬菌体敏感。先前已发现CHCC5381对噬菌体敏感。有趣的是没有发现任何噬菌体攻击CHCC8833。
保藏的微生物[专家方案]
关于13bis.6(PCT)，申请人要求在可应用这样方案的所有地域，对本发明中提及的微生物样品的“专家方案”。
具体的说，它要求涉及以下地域：
欧洲
就寻求欧洲专利保护的那些指定而言，在提及授予欧洲专利的公告之前或在该申请被驳回或撤销或视为撤销之日之前可获得保藏的微生物的样品，且样品的发放仅限于由请求获得该样品的请求人所指定的专家，且已征得i)申请人和/或ii)欧洲专利局的同意。任何一条都可。条约28(4)和28(5)EPC)。
加拿大
申请人请求，在基于申请的基础上，在被授予加拿大专利之前或该申请已被驳回，或放弃和不再能够恢复权利，或撤回，专利局长仅授权向由专利局长指定的独立的专家提供申请中涉及的保藏的生物材料样品，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前将此意图以书面形式通知国际局。
挪威
申请人在此请求，直至申请已向公众公开(由挪威专利局公开)，或在没有公开的情况下由挪威专利局授予专利，样品的提供仅限于向本领域中的专家。此实施请求必须由申请人在不迟于根据挪威专利法第22部分和33(3)部分可由公众获得之日前递交到挪威专利局。如果该请求时已由申请人递交，则由任何第三方提出的提供样品的请求应当标明“使用的专家”。该专家可以是由挪威专利局草拟承认的专家名单中的任何人，或由申请人在个别情况下认可的任何人。
澳大利亚
申请人据此通知微生物样品仅限于在授予专利之前，或在申请失效、驳回或撤回之前向与本发明无利益关系的本领域技术人员提供(澳大利亚专利规章的3.25(3)规章)。
芬兰
申请人在此请求，在申请已向公众公开(通过国家专利与规章委员会)前，或在没有公开调查的情况下已由国家专利与注册委员会授予专利，样品的仅限于向本技术领域中的专家提供。
英国
申请人在此请求，微生物样品的提供仅限于本技术领域中的专家。申请人必须在该申请的国际公开的技术准备完成之前将此意图的请求递交至国际局。
丹麦
申请人在此请求，直至申请已向公众公开(由丹麦专利局公开)，或在没有公开的情况下由丹麦专利局授予专利，样品的提供对象仅限于本技术领域中的专家。申请人的此意图必须在该申请根据丹麦专利法第22部分和33(3)部分可由公众获得之日前递交到丹麦专利局。如果该请求时由申请人递交，则由任何第三方提出的提供样品的请求应当标明使用的专家摂。该专家可以是由丹麦专利局草拟承认的专家名单中的任何人，或由申请人在个别情况下认可的任何人。
瑞典
申请人在此请求，申请已向公众公开(由瑞典专利局公开)前，或在没有公开的情况下由瑞典专利局授予专利，样品的提供对象仅限于本技术领域中的专家。申请人的此请求意图必须在优先权日其16个月届满之前(优选在PCT申请人指南第I卷附件Z中复制的PCT/RO/134表上)递交至国际局。如果该请求时由申请人递交，则由任何第三方提出的提供样品的请求应当标明使用的专家摂。该专家可以是由瑞典专利局草拟承认的专家名单中的任何人，或由申请人在个别情况下认可的任何人。
荷兰
申请人在此请求，在申请已被授予荷兰大专利前或直至该申请已被驳回，或撤回或放弃，根据专利细则3IF(1)，微生物仅可通过向一专家提供样品而获得。申请人必须将此请求的意图在该申请根据荷兰王国专利法第22C部分和25部分中规定的可由公众获得之日中的较早日之前递交到荷兰工业产权局。
冰岛
申请人在此请求，在申请已授予专利前，或由冰岛专利局就一未决的申请作出最终决定，申请人必须将该请求的意图在不晚于根据冰岛专利法地22部分和33(3)部分规定的公众获得日之前递交至芬兰专利局。如果该请求时由申请人递交，则由任何第三方提出的提供样品的请求应当标明使用的专家。该专家可以是由冰岛专利局草拟承认的专家名单中的任何人，或由申请人在个别情况下认可的任何人。
新加坡
申请人在此请求，微生物样品的提供对象仅限于本技术领域中的专家。
斯洛文尼亚
申请人在此请求，向第三方提供样品受以下条件的限制，即该第三方：(a)有权要求获得生物样品；(b)已许诺申请人在专利规定的有效期结束之前不会授予任何第三方获得保藏的微生物样品的权利。
瑞士
申请人在此请求，向第三方提供样品受以下条件的限制，即该第三方向保藏单位表明其名称和地址，以用于记录保藏人和保证人的信息：(a)不会向第三方提供保藏的培养物或由其获得的培养物；(b)不会在法律规定的范围之外使用该培养物；(c)在争端存在情况下，提供没有违反(a)和(b)条款中义务的证据。
马其顿王国的前南斯拉夫共和国
申请人在此请求，向第三方提供样品受以下条件的限制，即该第三方：(a)有权要求获得生物样品；(b)已确保申请人在专利规定的有效期结束之前未授予任何第三方获得保藏的微生物样品的权利。

Claims (5)

1.登记号为DSM 17876的乳酸嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(ST)细菌或其突变体菌株，其中突变体菌株是使用该保藏的菌株作为原料获得的，且其中所述突变体保留或进一步改良了DSM17876的质地性能。
2.起始培养物组合物，其包含权利要求1中的乳酸菌，优选地，其中起始培养物组合物具有每克组合物104～1012cfu范围的活细胞浓度。
3.生产食品或饲料的方法，其包括将权利要求2的初始培养物组合物加入到食品或饲料原料中，并且使如此接种的原料保持在乳酸菌能够进行活跃新陈代谢的条件下。
4.权利要求3的方法，其中发酵的食品是发酵的奶制品。
5.权利要求4的方法，其中发酵的奶制品选自由发酵的奶、酸奶酪、干酪和酪乳组成的列表，其中干酪包括新鲜干酪产品或莫扎里拉干酪。
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