CN102626399A - 一种海藻酸钙微胶囊及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海藻酸钙微胶囊及其制备方法。该海藻酸钙微胶囊是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)将海藻酸钠溶液与可溶性碳酸盐溶液混合均匀，得到混合溶液；2)向所述混合溶液中加入可溶性钙盐溶液、混匀，得到乳状液；3)向所述乳状液中加入酸溶液，使碳酸钙微球溶解产生的钙离子与海藻酸钠交联，形成海藻酸钙微胶囊。该制备方法简单易行，产品产量高，粒径分布均匀，大小可控。所得微胶囊为单组份体系，在很大程度上减少了不相干物质的引入，扩大了载体的应用范围，并降低其毒副作用。此外，还可使用磷脂将海藻酸钙微胶囊功能化，构筑新型药物载体，为联合治疗提供了新的更有效的途径。

Description

一种海藻酸钙微胶囊及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种海藻酸钙胶囊及其制备方法与应用。

背景技术

在世界范围内，恶性肿瘤始终是人类最主要的致死原因。目前用于治疗肿瘤的方法很多，包括手术，化疗，放疗，热疗和光动力治疗等。光动力学疗法是一种冷光化学反应，氧、光敏剂和可见光是光动力效应发生的基本条件。光敏剂本身无毒性，但受到相应波长的光照射后，可与氧发生反应，产生活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性，损伤细胞结构或影响细胞功能，导致细胞受损乃至死亡，从而破坏癌细胞。近年来由于光敏物质、光激活装置和导光系统的发展和进步，该疗法已逐步成为肿瘤的基本治疗手段之一。但是仅仅依靠一种疗法很难攻克癌症，这就需要使用联合疗法，结合两种治疗方法，从而达到互补的目的。在联合治疗中多功能载体可以同时执行多种疗法，因此使用简便方法制备此类载体具有深远的意义。利用微胶囊作为药物缓释载体具有一定优势。微胶囊作为药物载体在提高药效，增强药物的协同性，延长药物活性时间，较长时间内保持血药浓度等方面具有长远的意义。海藻酸是一种广泛存在于棕色海藻中的天然高分子，由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)两种结构单元组成。海藻酸钠是一种聚电解质多糖，在二价阳离子的引发下易形成凝胶，海藻酸钠的凝胶化过程主要是古洛糖醛酸上的钠离子与二价阳离子交换的过程。由于具有良好的生物相容性和稳定性，其在药物控释材料与生物医学工程领域得到广泛应用。但是已经公开的海藻酸钙微胶囊制备方法相对比较复杂，涉及到各种仪器及添加剂，例如中国专利CN 1850058A公开的制备海藻酸钙微胶囊是将海藻酸钠溶液加入到有机溶剂中形成微乳液，经过提纯固化得到，该方法后处理比较麻烦，而且额外引入了有机溶剂及乳化剂，不利于大规模的制备及其在生物体中的应用。文献报道利用微流体装置在油水两相中制备了粒径在50-200μm海藻酸钙微球(参见Biomaterials 2005，26，3327-3331，Size control ofcalcium alginate beads containing living cells using micro-nozzle array)。中国专利CN101856604A公开的制备方法是利用静电喷雾装置，将海藻酸钠混合液在静电作用下喷雾到氯化钙溶液中成膜后，再进行固化最后形成微胶囊。中国专利CN1555784公开的制备方法是借助高压静电液滴发生装置，通过外部凝胶化制备微胶囊。中国专利CN 101810595A公布的海藻酸钙微胶囊的制备方法是将海藻酸钠与有机钙盐交联制备50微米的海藻酸钙胶囊，但是在制备过程中引入了芳香类有机溶剂和醇类溶剂。还有文献报道用脂质体作为模板将海藻酸钠装载入脂质体内部，通过温度来控制钙离子的渗透来制备海藻酸钙胶囊，然后用OBG将磷脂双层除去，但是这种方法步骤比较复杂，不利于大量生产，成本较高(参见Langmuir2008，24，4092-4096，Liposome-Templated Supramolecular Assembly of ResponsiveAlginate Nanogels)。

发明内容

本发明的目的是提供一种海藻酸钙微胶囊及其制备方法。

本发明所提供的海藻酸钙微胶囊是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)将海藻酸钠溶液与可溶性碳酸盐溶液混合均匀，得到混合溶液；

2)向所述混合溶液中加入可溶性钙盐溶液、混匀，得到含碳酸钙微球的乳状液；

3)向所述乳状液中加入酸溶液，使碳酸钙微球溶解产生的钙离子与海藻酸钠交联，形成海藻酸钙微胶囊。

其中，步骤2)所述混合溶液中的可溶性碳酸盐与所述可溶性钙盐的摩尔比为1∶1-1∶10，具体可为1∶1-1∶3。

所述可溶性碳酸盐具体可为碳酸钠；所述可溶性钙盐具体可为氯化钙。

所述氯化钙溶液的浓度为0.1-5mol/L，具体可为0.33-1mol/L。

所述乳状液中海藻酸钠的浓度为0.2-5mg/mL，具体可为0.4-1mg/mL。

步骤3)中所述酸可选择盐酸或醋酸等不与钙离子生成沉淀或发生配位作用的酸；当选盐酸时，其溶液浓度为0.001-0.1M，优选浓度为0.01M。

本发明所得到的微胶囊是单组分微胶囊，其成分仅为海藻酸钙。

该微胶囊的尺寸可控，其尺寸可由中间体碳酸钙微球所决定。通常其粒径可为1-10μm。

所制备的微胶囊作为药物载体可以包埋各种药物，包括水溶性药物和非水溶性药物，并且装载量较大。

本发明选用碳酸钙微球作为模板来制备海藻酸钙微胶囊，是由于碳酸钙具有多孔结构，可将海藻酸钠沉积在碳酸钙的内部；当用盐酸溶解碳酸钙时，产生的钙离子与海藻酸钠交联，形成凝胶微胶囊。

本发明使用共沉积模板法，巧妙地将模板制备与凝胶微胶囊形成相结合，得到了个体大小可控，形貌均匀的海藻酸钙微胶囊。制备方法简单，反应物均不需要特殊处理，不需要引入特殊仪器和其它物质；制备过程时间较短，适合大量生产，为海藻酸钙微胶囊的制备提供了更有效的途径。

此外，还可以对上述制备的海藻酸钙胶囊进行修饰使其具有多功能性，例如靶向性，荧光性，磁性等，方便其在不同领域中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种复合药物载体。

该复合药物载体由所述海藻酸钙微胶囊和包覆在其表面的脂质体组成。

所述复合药物载体可同时装载两种或两种以上的药物，所述药物为水溶性或脂溶性抗肿瘤药物；所述水溶性抗肿瘤药物具体可为阿霉素，所述脂溶性抗肿瘤药物具体可为竹红菌素。

所述脂质体由带正电荷或中性的磷脂构成，当了达到靶向性的目的，也可在磷脂中加入靶向分子修饰的磷脂，如叶酸连接的磷脂。所述脂质体的直径可为50-1000nm。

本发明的再一个目的是提供一种联合化疗和光动力治疗的药物微胶囊。

该微胶囊是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)将所述海藻酸钙微胶囊置于水溶性抗肿瘤药物溶液中进行吸附，然后洗涤至上清液中无药物析出，得到载药的海藻酸钙微胶囊；

2)将光敏药物分散于磷脂中制备得到载光敏药物的脂质体；

3)将步骤1)中得到的载药的海藻酸钙微胶囊加入步骤2)中制备的载光敏药物的脂质体溶液中，震荡后，洗涤离心，得到联合化疗和光动力治疗的药物微胶囊。

其中，所述水溶性抗肿瘤药物为阿霉素，所述水溶性抗肿瘤药物溶液中阿霉素的浓度为1mg/mL；所述吸附的时间为5-24小时。

所述光敏药物为竹红菌素；所述载光敏药物的脂质体的终浓度为0.6-2mg/mL，优选终浓度为1mg/mL；

步骤3)中所述载光敏药物的脂质体相对于所述载药的海藻酸钙微胶囊是过量的。

附图说明

图1是实施例1制备的海藻酸钙微胶囊扫描电镜图片。

图2是实施例1制备的海藻酸钙微胶囊的光电子能谱。

图3是实施例2、实施例5(分别对应图A、图B)制备的海藻酸钙微胶囊的激光共聚焦图片。

图4是实施例2，实施例3和实施例4(分别对应图中的曲线a、曲线b、曲线c)制备的微胶囊药物释放曲线。

图5是实施例6的微胶囊的激光共聚焦图片。

图6是微胶囊对宫颈癌细胞(Hela)细胞毒性柱状分析图；(1)代表无任何外加物质，(2)代表加入例1制备的无药物微胶囊，(3)代表加入例2制备的含阿霉素的微胶囊，(4)代表加入例3制备的含光敏剂竹红菌素的微胶囊。(5)代表加入例4制备的既含有阿霉素又含光敏剂竹红菌素的微胶囊。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

药物模型：

本发明采用阿霉素作为化疗的模型药物，阿霉素是一种很好的水溶性自发荧光药物，激发波长在480nm，其本身带有正电荷，能够通过静电作用力进入微胶囊内部而不会与胶囊本身排斥，而且能够长时间稳定的存在。

本发明采用竹红菌乙素作为光动力治疗的模型药物。竹红菌素是从特产于我国云南箭竹上的一种寄生真菌——竹红菌中提取的一类天然光敏色素，具有单线态氧量子产率高、结构明确、化学修饰性好、暗毒性低、体内代谢快等理想光敏剂的特征，被公认为是一种最有前景的新型光敏剂。竹红菌素的荧光来源于其激发态分子内质子转移，亦即来源于分子内氢键。但是竹红菌素是疏水性药物，水溶性不好，在水溶液中竹红菌素的荧光量子产率比非极性溶剂中降低一个数量级以上，因此提高竹红菌素在水溶液中的分散性具有重要意义。在本发明中要将竹红菌素分散在脂质体中以增加其量子产率。竹红菌素的最大吸收波长位于470nm左右，并且在550nm和580nm处有两个小吸收峰，暴露在该波长的光下会产生活性很强的单态氧，具有杀伤肿瘤细胞的作用。在本发明中，细胞实验中采用的激发波长为480nm。

实施例1、制备海藻酸钙微胶囊

将0.5mL 4mg/mL的海藻酸钠溶液加入到1mL 0.33mol/L的碳酸钠溶液中，磁力搅拌均匀，然后加入1mL 0.33mol/L的氯化钙溶液，搅拌30s后于3000rpm离心3min，去掉多余的离子，洗涤3次。然后向洗涤后的悬浮液中缓缓加入0.01M的稀盐酸溶液，以除去模板，同时形成海藻酸钙凝胶微胶囊。3500rpm离心洗涤3次后可得到直径3μm左右的凝胶微胶囊(如图1所示)。光电子能谱(如图2所示)中钙离子的出现证实了我们制备的胶囊是由钙离子与海藻酸钠交联形成的。钙离子跟古洛糖醛酸基团之间的比为1∶2，而文献中报道当二者比例为1∶4时，就可以形成稳定的二聚体结构，增加二者之间比例可以形成多聚体结构。本实施例及下述实施例中所有制备的微胶囊均放在4℃冰箱中备用。

实施例2、制备海藻酸钙微胶囊

选用阿霉素做模型药物来做药物释放曲线，紫外特征吸收峰在480nm处。

配制1mg/mL的阿霉素溶液。将按照实施例1的方法和用量制备的海藻酸钙凝胶胶囊计为1份加入到1mL阿霉素溶液中吸附5小时后3500rpm洗涤3次。由于阿霉素与海藻酸钙之间的吸附作用，在水溶液中可以稳定的存在于海藻酸钙紧密结构中而不释放出来。激光共聚焦图片如图3A所示，用波长为488nm光源激发阿霉素(绿色)证实了载有阿霉素药物的海藻酸钙微胶囊的完整性，及其空腔结构。在37℃的PBS(pH＝7.4)溶液中做药物释放曲线，用U-3010记录480nm处的吸收峰变化。如图4所示，药物在6.5h内释放完全。这是由于海藻酸钙在PBS溶液中分解，钙离子与钠离子发生离子交换，破坏了钙离子与古洛糖醛酸之间的稳定的蛋壳结构，从而使药物迅速释放出来。

实施例3

配制1mg/mL的阿霉素溶液。

将按照实施例1的方法和用量制备的海藻酸钙凝胶胶囊计为1份加入到1mL阿霉素溶液中吸附5小时后3500rpm洗涤3次，得到载有阿霉素的海藻酸钙微胶囊1份。

由于凝胶的三维网络结构，有较大的孔径，在释放实验中很可能会造成小分子药物的快速释放，因此我们在其表面进行修饰。首先制备0.6-2mg/mL的脂质体，脂质体可以选择带正电荷或者不带电荷的磷脂。本实施例中选用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)制备直径为200nm左右的脂质体。

脂质体的制备方法如下：

首先称取一定量的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)溶于氯仿和甲醇的混合溶液中(体积比1∶1)，超声直至完全溶解。用真空泵将有机溶剂抽干，加入一定量的水(脂质体最终浓度为1mg/mL)，恒温在55℃水浴中一段时间，然后借助Mini-Extruder(购自Avanti公司)制备200nm左右的脂质体。

将制备好的载有阿霉素的海藻酸钙微胶囊1份加入到1mL脂质体溶液中轻轻震荡30min，3500rpm离心洗涤三次，就得到了表面覆盖磷脂的海藻酸钙微胶囊。用U-3010记录480nm处的吸收峰变化，在37℃的PBS(pH＝7.4)溶液中做药物释放曲线。由于磷脂双层有很好的密闭性，当环境温度高于其相转变温度时，双层的通透性得到提高，小分子药物就能够释放出来。在本实施例中所用的DMPC相转变温度为23℃，在37℃的PBS溶液中，阿霉素药物分子可以通过磷脂分子双层，但是磷脂双层也起到了阻碍作用。如图4所示，磷脂修饰过的微胶囊与单纯的海藻酸钙相比具有很好的缓释作用。

实施例4

配制1mg/mL的阿霉素溶液。

将按照实施例1的方法和用量制备的海藻酸钙凝胶胶囊计为1份加入到1mL阿霉素溶液中吸附5小时后3500rpm洗涤3次，得到载有阿霉素的海藻酸钙微胶囊1份。

在本实施例中，我们采用混合磷脂来修饰微胶囊，并进行药物释放试验。首先制备0.6-2mg/mL的脂质体，脂质体可以选择带正电荷或者不带电荷的磷脂。本实施案例中选用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)的混合磷脂制备直径为200nm左右的脂质体。

脂质体的制备方法如下：

首先称取一定量的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)(质量比1∶1)溶于氯仿和甲醇的混合溶液中(体积比1∶1)，超声直至完全溶解。用真空泵将有机溶剂抽干，加入一定量的水(脂质体最终浓度为1mg/mL)，恒温在55℃水浴中一段时间，然后借助Mini-Extruder(购自Avanti公司)制备200nm左右的脂质体。

将制备好的载有阿霉素的海藻酸钙微胶囊1份加入到1mL脂质体溶液中轻轻震荡30min，3500rpm离心洗涤三次，就得到了表面覆盖磷脂的海藻酸钙微胶囊。用U-3010记录480nm处的吸收峰变化，在37℃的PBS(PH＝7.4)溶液中做药物释放曲线。由于磷脂双层有很好的密闭性，当环境温度高于其相转变温度时，双层的通透性得到提高，小分子药物就能够释放出来。相对于实施例3，本实施例中的得到的释放曲线要平缓很多(如图4所示)，在24小时内仅有一小部分(＜30％)释放出。这是由于混合磷脂中掺入了50％的DPPC，DPPC的相转变温度较高(41℃)，高于释放温度37℃，因此磷脂双层的通透性降低，钙离子和钠离子的交换速度降低，海藻酸钙水凝胶的降解速度减慢，从而使阿霉素的释放速度也减慢。

实施例5

载有光敏剂的脂质体制备：

首先称取一定量的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和连接有PEG2000-Folate的1，2-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Folate)(质量比3∶3∶1)溶于氯仿和甲醇的混合溶液中(体积比1∶1)，然后加入一定量的竹红菌素，超声直至完全溶解。用真空泵将有机溶剂抽干，加入一定量的水使脂质体终浓度为1mg/mL，恒温在55℃水浴中一段时间，然后借助Mini-Extruder(购自Avanti公司)制备200nm左右的脂质体。

向按照实施例1用量得到的一份微胶囊悬浮液1mL中加入1mL脂质体，轻轻震荡30min后，洗涤离心3次，将剩余的脂质体除去，最终得到单独载有光敏药物的微胶囊。激光共聚焦图片如图3B所示，用波长为488nm光源激发竹红菌素(红色)证实了载有竹红菌素的脂质体很好的覆盖在海藻酸钙微胶囊上。

实施例6

配制1mg/mL的阿霉素溶液。将按照实施例1的方法和用量制备的海藻酸钙凝胶胶囊计为1份加入到1mL阿霉素溶液中吸附5小时后3500rpm洗涤3次，得到载有阿霉素的海藻酸钙微胶囊1份，待用。然后将1份载有阿霉素的海藻酸钙微胶囊加入1mL水中，得到微胶囊悬浮液，向悬浮液中加入实施例5中得到的载有光敏剂竹红菌素的脂质体1mL，轻轻震荡30min，于3500rpm离心洗涤3次，最终得到载有化疗和光动力治疗药物的凝胶微胶囊。激光共聚焦图片如图5所示，用波长为488nm光源激发阿霉素(绿色)和竹红菌素(红色)，得到黄色的叠加图，证实了海藻酸钙微胶囊同时载有阿霉素和竹红菌素，最终得到了联合治疗的载体。

实施例7

将实施例1和实施例2制备的胶囊表面分别包覆一层如实施例5中制备的脂质体(未加入竹红菌素)分别标记为例1和例2，实施例5和实施例6中得到的微胶囊分别标记为例3和例4，将例1-例4的微胶囊各1份，分别加入750μL水中，配成悬浮液，各取20μL悬浮液分别与宫颈癌细胞(Hela)在24孔板中共同培养24h后，给细胞换液，将未被细胞内吞的微胶囊除去。用480nm光照15min，继续培养12h后，做MTT实验。

对比例1，例2，例3和例4中药物载体的疗效，如图6所示。在未载药的微胶囊与肿瘤细胞培养36h后，细胞成活率为97.8％，证明本发明制备的胶囊具有很好的生物相容性。而例2制备的只载有阿霉素微胶囊与细胞共培养后，细胞成活率为53.3％。例3制备的只载有竹红菌素的微胶囊与细胞共培养后，细胞的成活率为37.3％。例4中制备的同时载有阿霉素和竹红菌素的微胶囊与细胞共培养后，细胞的成活率为16.1％，证明我们制备的同时载有化疗和光动力治疗药物的载体对癌细胞的杀伤效果明显优于单一化疗(例2)和光动力治疗(例3)的药物载体。

结论

本发明利用模板法一步制备了海藻酸钙微胶囊，方法简单，低成本，适合大量生产，而且其表面极易修饰。将光敏性药物分散到脂质体中，然后包覆在微胶囊表面可以作为具有靶向性的化疗和光动力治疗的药物载体。

尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化、和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。

Claims (10)

1.一种制备海藻酸钙微胶囊的方法，包括下述步骤：

1)将海藻酸钠溶液与可溶性碳酸盐溶液混匀，得到混合溶液；

2)向所述混合溶液中加入可溶性钙盐溶液混匀，得到含碳酸钙微球的乳状液；

3)向所述乳状液中加入酸溶液，使碳酸钙微球溶解产生的钙离子与海藻酸钠交联，形成海藻酸钙微胶囊。

2.根据权利要求1所述的海藻酸钙微胶囊，其特征在于：步骤2)所述乳状液中海藻酸钠的浓度为0.2-5mg/mL，具体为0.4-1mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的海藻酸钙微胶囊，其特征在于：步骤2)所述混合溶液中的可溶性碳酸盐与所述可溶性钙盐的摩尔比为1∶1-1∶10，具体为1∶1-1∶3；

所述可溶性碳酸盐具体为碳酸钠；所述可溶性钙盐具体为氯化钙；

所述氯化钙溶液的浓度为0.1-5mol/L，具体为0.33-1mol/L。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的海藻酸钙微胶囊，其特征在于：所述酸是不与钙离子生成沉淀或发生配位作用的酸；所述酸具体为盐酸溶液，其浓度为0.001-0.1M，优选浓度为0.01M。

5.权利要求1-4中任一项所述方法制备的海藻酸钙微胶囊；其粒径优选为1-10μm。

6.权利要求5所述的海藻酸钙微胶囊在制备药物载体的应用。

7.一种复合药物载体，由权利要求5所述的海藻酸钙微胶囊和包覆在其表面的脂质体组成。

8.根据权利要求7所述的复合药物载体，其特征在于：所述复合药物载体可同时装载两种或两种以上的药物，所述药物为水溶性或脂溶性抗肿瘤药物；所述水溶性抗肿瘤药物具体为阿霉素，所述脂溶性抗肿瘤药物具体为竹红菌素；

所述脂质体由带正电荷或中性的磷脂和/或靶向分子修饰的磷脂构成，所述脂质体的粒径为50-1000nm。

9.一种联合化疗和光动力治疗的药物微胶囊，是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)将权利要求5所述的海藻酸钙微胶囊置于水溶性抗肿瘤药物溶液中进行吸附，然后洗涤至上清液中无药物析出，得到载药的海藻酸钙微胶囊；

2)将光敏药物分散于磷脂中制备得到载光敏药物的脂质体；

3)将步骤1)中得到的载药的海藻酸钙微胶囊加入步骤2)中制备的载光敏药物的脂质体中，震荡后，洗涤离心，得到联合化疗和光动力治疗的药物微胶囊。

10.根据权利要求9所述的药物微胶囊，其特征在于：步骤1)中所述水溶性抗肿瘤药物为阿霉素，所述水溶性抗肿瘤药物溶液中阿霉素的浓度为1mg/mL；所述吸附的时间为5-24小时；

步骤2)中所述光敏药物为竹红菌素；所述载光敏药物的脂质体的终浓度为0.6-2mg/mL，优选终浓度为1mg/mL；所述磷脂包括靶向分子修饰的磷脂；

步骤3)中所述载光敏药物的脂质体相对于所述载药的海藻酸钙微胶囊是过量的。

Images