CN108752597B - 一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料及其制备方法与应用。该方法包括以下步骤：（1）将含有缩醛键的二醇和三乙胺溶于溶剂，再在冰浴下加入三氯氧磷，搅拌反应；（2）反应结束后，加入甲氧基聚乙二醇，搅拌反应，得缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料。本发明的超支化聚磷酸酯材料具有良好的生物相容性和可降解性。该超支化聚磷酸酯材料自组装形成纳米颗粒，在肿瘤细胞内的内涵体/溶酶体酸性环境中，缩醛键断裂变成两个羟基，使颗粒内核磷酸酯由疏水性向亲水性转变，颗粒崩解，使光敏剂药物快速释放出来，增加肿瘤细胞内游离的光敏剂的浓度，在特定波长光源激发下产生大量活性氧杀死肿瘤细胞提高PDT疗效，具有巨大的临床应用潜能。

Description

一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及聚磷酸酯材料领域，具体涉及一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料及其制备方法与应用。
背景技术
目前，光动力疗法(photodynamic Therapy,PDT)是光敏剂(Photosensitizer,PS)吸收适当波长的光能量发生能量转移，将氧分子激发生成具有细胞毒性的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)，是一种临床认可的治疗各种局部和表面癌症的治疗方法。PDT是一种非侵入性治疗手段，可以对治疗时间及治疗部位的精准控制，降低对正常组织的毒副作用。在过去几十年的相关研究中，主要是通过增加肿瘤细胞内PS的含量来提高PDT治疗效果。
近年来，基于纳米递送系统的光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)可以有效的将光敏剂输送至肿瘤细胞，提高PS在肿瘤细胞部位及肿瘤细胞内的浓度，从而提高PDT疗效。但是PS包埋于纳米颗粒内核会限制PS吸收光能。后将能量转移至氧气的过程，造成ROS产生率降低，导致PDT疗效降低。另外，由于ROS的扩散距离(<20nm)及作用时间(<40ns)极短，导致在纳米颗粒中PS产生的ROS杀伤力差。因此，如何实现纳米载体在肿瘤细胞内充分释放包载的光敏剂，从而提高细胞内活性氧(ROS)的产生效率，已成为提高PDT治疗效果的重要策略之一。
pH敏感响应型纳米载体作为抗肿瘤药物载体，被广泛用于实现胞内药物快速释放的目的。在本次设计中，我们基于pH敏感的缩醛键合成了一种超支化聚磷酸酯材料用做纳米载体输送光敏剂，能提高PS在肿瘤细胞内的浓度，并且实现胞内快速释放PS。在肿瘤细胞内的溶酶体/内涵体等酸性环境下，酸响应的超支化载药纳米颗粒发生酸响应而崩解，快速释放出颗粒内核中的光敏剂，在特定波长光照条件下能产生大量活性氧，从而有效提高PDT疗效。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料及其制备方法。
本发明的缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料按照下述方法合成：通过缩聚反应，2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇(2,2’-(propane-2,2-diylbis(oxy))diethanol)和三氯化磷(phosphorylchloride)以及mPEG1.0k-OH反应生成缩醛键连接的酸响应超支化聚磷酸酯材料。
Figure BDA0001680763380000021
本发明的另一个目的是提供一种超支化聚磷酸酯载药纳米颗粒。
本发明所提供的纳米颗粒，是由上述酸响应超支化聚磷酸酯材料制成。另外通过用1,6-己二醇替换2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇经相同的合成路线得到非酸响应的超支化聚磷酸酯材料作为对比。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将含有缩醛键的二醇和三乙胺溶解于有机溶剂中，然后在冰浴条件下加入三氯氧磷，继续搅拌，发生A2B3缩聚交联反应；
(2)反应结束后，加入甲氧基聚乙二醇，继续搅拌反应，终止缩聚反应过程及修饰超支化聚磷酸酯材料末端，得缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料。
优选的，步骤(1)所述含有缩醛键的二醇为2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇。
优选的，步骤(1)所述有机溶剂为四氢呋喃。
优选的，步骤(1)所述含有缩醛键的二醇和三乙胺。
优选的，步骤(1)所述含有缩醛键的二醇和三氯氧磷。
优选的，步骤(1)所述搅拌反应的时间为3～5h，进一步优选为4h。
优选的，步骤(2)所述甲氧基聚乙二醇为mPEG1.0k-OH。
优选的，步骤(2)所述搅拌反应的时间为3～5h，进一步优选为4h。
由以上所述的制备方法制得的一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料。
以上所述的一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料作为运输载体应用于制备载药纳米颗粒。
优选的，所述载药纳米颗粒的直径100nm左右。
本发明提供了基于缩醛键合成酸响应超支化聚磷酸酯材料的方法及其包载光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)自组装形成的载药纳米颗粒(S-hbPPE/Ce6)的应用。该超支化聚磷酸酯材料是由2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇和三氯氧磷发生A2B3缩聚反应，反应结束后用mPEG1.0k-OH终止缩聚反应过程及修饰超支化聚磷酸酯末端而得到酸响应的超支化聚磷酸酯材料。上述酸响应的超支化聚磷酸酯表示为S-hbPPE。同时，用1,6-己二醇代替2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇经相同的合成步骤可以得到非酸响应的超支化聚磷酸酯材料，表示为inS-hbPPE。
上述超支化聚磷酸酯材料可按照下述方法合成：由2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇和三氯氧磷发生A2B3缩聚交联反应，反应结束后用mPEG1.0k-OH终止缩聚反应过程及修饰超支化聚磷酸酯材料末端。用1,6-己二醇代替2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇经相同的合成步骤可以得到非酸响应的超支化聚磷酸酯材料。基于缩醛键的酸响应超支化聚磷酸酯载药纳米颗粒可实现胞内快速释放药物。胞内快速释放药物是指酸响应的超支化聚磷酸酯载药纳米颗粒内核含有大量缩醛键，在肿瘤细胞内的内涵体/溶酶体等酸性环境下能发生酸响应断裂，导致颗粒内核发生亲疏水性变化，颗粒发生崩解，使颗粒内核包埋的药物快速释放出来。这种超支化聚磷酸酯纳米颗粒可用于包载疏水性药物到其内核(疏水核)，在肿瘤细胞内实现药物快速释放，提高抗肿瘤效果。
本发明中亲水部分是聚乙二醇，为亲水性聚酯，其相对分子量为1000。
本发明中疏水部分是含有大量缩醛键的聚磷酸酯，为酸敏感聚磷酸酯，呈树枝状结构，它的优点在于①疏水性，通过疏水-疏水相互作用可包载疏水性药物自组装成纳米颗粒；②可生物降解，并且它的最终降解产物不会对生物体有不良影响；③合成简单且可控；④在酸性环境中能发生酸响应，缩醛键发生断裂，使颗粒崩解，药物快速释放。
本发明的超支化聚磷酸酯材料可在水相中自组装形成纳米颗粒并应用于疏水性抗癌药物的运输载体。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明得到的酸响应的超支化聚磷酸酯材料具有良好的生物相容性和可降解性。基于酸敏感的缩醛键构建的载药纳米颗粒，在肿瘤细胞内的内涵体/溶酶体酸性环境中，缩醛键能断裂变成两个羟基，使颗粒内核磷酸酯快速由疏水性向亲水性转变，颗粒崩解，使光敏剂药物快速释放出来，增加肿瘤细胞内游离的光敏剂的浓度，在特定波长光源激发下产生大量活性氧杀死肿瘤细胞提高PDT疗效，具有巨大的临床应用潜能。
附图说明
图1为酸响应的缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料S-hbPPE的合成路线。
图2为酸响应的缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料S-hbPPE的1H NMR。
图3为非酸响应的的超支化聚磷酸酯材料inS-hbPPE的1H NMR。
图4为两种超支化载药纳米颗粒在水溶液中的粒径及粒径分布。
图5为两种超支化载药纳米颗粒的透射电子显微镜图片。
图6为两种超支化载药纳米颗粒的稳定性图。
图7为两种超支化载药纳米颗粒在酸性环境中粒径的变化及透射电镜图片。
图8为两种超支化载药纳米颗粒在不同pH环境下的体外释放曲线图。
图9为流式细胞仪检测肿瘤细胞对两种超支化载药纳米颗粒的摄取情况图。
图10为激光共聚焦观察肿瘤细胞对两种超支化载药纳米颗粒的摄取情况图。
图11为两种超支化载药纳米颗粒胞内药物释放实验图。
图12为两种超支化载药纳米颗粒在660nm红光激发下的对BxPC-3细胞杀伤效果实验图。
图13为两种超支化载药纳米颗粒的药代动力学试验图。
图14为两种超支化载药纳米颗粒的体内治疗实验图。
图15为体内治疗实验中各实验组小鼠体重变化曲线图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1、超支化聚磷酸酯材料的合成与表征
一、酸响应的超支化聚磷酸酯S-hbPPE的合成
酸响应的超支化聚磷酸酯是由三氯氧磷、2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇和mPEG-OH通过缩聚反应得到。
S-hbPPE超支化聚磷酸酯材料的合成路线如图1所示。
所需组分的制备和预处理
1、纯化三氯氧磷及聚乙二醇除水
搭建一套常压蒸馏装置，除水汽。将冷凝管接上循环冷却水，在氮气保护下，向圆底烧瓶中加入三氯氧磷，将圆底烧瓶置于油浴锅中，油浴锅温度设置为110℃，打开搅拌。先收集蒸馏前组分(约3mL)，再转动转接管收集105℃的馏分。蒸馏结束后，将纯化后的三氯氧磷用橡胶塞封口，缠上封口膜置于干燥器中保存待用。
搭建一套共沸除水装置。称取3g(0.003mol)mPEG1.0k-OH于圆底烧瓶中，加入搅拌磁子，在加入适量的甲苯溶解mPEG1.0k-OH。冷凝管接上循环冷却水，将圆底烧瓶置于油浴锅中，油浴锅温度设为130℃。将甲苯与水的共沸物完全蒸出后，再将mPEG1.0k-OH用油泵在45℃下抽干过夜。
三乙胺(TEA)和四氢呋喃(THF)从各自的除水装置中直接收集使用。
2、酸响应超支化聚磷酸酯材料的合成
搭建一套无水反应装置，除水汽。利用双针头先向平衡分压漏斗中加入150mL无水THF，打开平衡分压漏斗阀门，将THF加入至底部圆底烧瓶(75mL)中。分别向圆底烧瓶中加入2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇(0.029mol,4.76g)和TEA(三乙胺，0.062mol,6.26g)。向平衡分压漏斗中加入三氯氧磷(0.02mol,3.07g)。将整个反应装置置于-5℃冷浴中，在搅拌条件下，打开平衡分压漏斗阀门，使三氯氧磷逐滴加入圆底烧瓶中。滴加结束后，继续搅拌反应4h。反应结束后，再向圆底烧瓶中加入10mL mPEG1.0k-OH(0.003mol,3.00g)的THF溶液，继续搅拌反应4h，以终止缩聚反应过程及修饰超支化聚磷酸酯末端。最后，在冰的乙醚/甲醛(10/1,v/v)沉淀两次得到酸响应的超支化聚磷酸酯材料，标记为S-hbPPE。其中，利用1,6-己二醇替换2,2’-(丙烷-2,2-二基双(氧))二乙醇经相同的合成路线得到非酸响应的超支化聚磷酸酯材料，标记为inS-hbPPE。
二、超支化聚磷酸酯材料S-hbPPE、inS-hbPPE的表征
对上述超支化聚磷酸酯进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其分子结构，S-hbPPE1H NMR谱见图2，inS-hbPPE 1H NMR谱见图3。
如图2所示，酸响应超支化聚磷酸酯S-hbPPE的1H NMR图谱字母标记了归属于超支化材料的质子氢。1.41ppm的峰归属于缩醛键的甲基，缩醛键侧邻的两个亚甲基峰由于存在不同的结构环境分别在3.11ppm、3.34ppm、4.19ppm和4.32ppm均有化学位移。而3.36ppm归属于聚乙二醇的末端甲基峰，3.66ppm归属于聚乙二醇的质子氢。
如图3所示，非酸响应超支化聚磷酸酯inS-hbPPE的1H NMR图谱字母标记了归属于超支化材料的质子氢。其中，1,6-己二醇的特征峰出现在1.23ppm、1.34ppm、1.42ppm、1.68ppm、3.51ppm、4.05ppm和4.15ppm。而3.36ppm归属于聚乙二醇的末端甲基峰，3.66ppm归属于聚乙二醇的质子氢。
实施例2、超支化聚磷酸酯的纳米颗粒化及应用
一、超支化载药纳米颗粒的制备
酸敏感聚合物材料用于药物传递载体已被广泛研究。在这些敏感的纳米材料中，酸敏感超支化聚合物(Hyperbranched Polymers,HBPs)具有特定的优势，因为它们具有高度支化的拓扑结构和许多敏感的化学键，具有多个触发胞内药物快速释放的位点。到目前为止，只有少量的HBPs纳米材料被用作PSs的输送载体。
通过纳米沉淀法(Nano precipitation method)制备超支化聚磷酸酯的纳米颗粒，具体方法如下：
称取S-hbPPE(10.0mg)和光敏剂Ce6(1.0mg)溶解DMSO(1.0mL)中，然后在搅拌过程中逐渐向上述材料混合液中加入10mL超纯水。随后，继续搅拌2h之后，将颗粒溶液转移到透析袋(MWCO 3500)中，在超纯水中透析24h除去DMSO。透析结束后，将颗粒溶液用0.45μm过滤器过滤除去未被包载的Ce6，得到的纳米颗粒标记为S-hbPPE/Ce6。同样，将S-hbPPE替换为inS-hbPPE，经过相同的制备过程得到inS-hbPPE/ce6。
利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)测试颗粒溶液中Ce6的浓度，通过投料的总量减去未包载的Ce6的量算得载在纳米颗粒中的药物的含量。HPLC分析用Waters HPLC系统进行，包括Waters 1525泵、Waters 2475荧光检测器、1500色谱柱加热器与相应的C18反相色谱分离柱。HPLC流动相选择乙腈/水(50/50，v/v)混合溶剂，其中水用高氯酸调pH至2.7，检测时柱温和检测器的温度为30℃，流速为1.0mL min-1，荧光检测器设定激发波长为460nm，发射波长为660nm，并用Breeze software处理实验数据。
纳米颗粒包载Ce6的载药量(drug loading content，DLC)及包封效率(encapsulationefficiency，EE)通过以下公式算得：
Figure BDA0001680763380000061
Figure BDA0001680763380000062
二、超支化载药纳米颗粒的特性
经纳米沉淀法得到两种超支化载药纳米颗粒S-hbPPE/Ce6和inS-PPE/Ce6，动态光散射仪(Dynamic light scattering,DLS)检测载药纳米颗粒粒径。如图4所示，S-hbPPE/Ce6和inS-PPE/Ce6的粒径均为100nm左右。
如图5所示，在透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)下观察两种超支化载药纳米颗粒都有一个紧凑的球型形貌，大小在100nm左右，与DLS检测结果一致。
如图6所示，两种超支化载药纳米颗粒具有一个较好的稳定性。在含10％胎牛血清的1×PBS(pH＝7.4)溶液中共培养120h后，两种超支化载药纳米颗粒粒径均无明显变化。这可能是由于PEG能够为颗粒提供一个惰性的表面，从而提高颗粒的稳定性。
三、超支化载药纳米颗粒的酸响应性
1、超支化载药纳米颗粒的酸响应
S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6两种超支化载药纳米颗粒分别在pH＝5.5的0.02MPBS(模拟内涵体/溶酶体酸性微环境)共同孵育培养12h。如图7所示，可以清楚地观察到的S-hbPPE/Ce6尺寸减小到42±3.7nm；而在相同酸性环境中，inS-hbPPE/Ce6不存在颗粒尺寸变小现象。
2、载药纳米颗粒的体外药物释放
Ce6从两种超支化载药纳米颗粒中的释放在含有0.02mol L-1的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，pH＝7.4或5.5)中进行。做三组平行实验，分别取1mL的两种超支化载药纳米颗粒([Ce6]＝140.0μg mL-1)重悬与pH＝7.4或5.5的0.02M PBS中，将两种超支化载药纳米颗粒置于透析袋中(
Figure BDA0001680763380000071
Float-A-Lyzer，MWCO＝14000)，再将透析袋置于三组15mL的PBS缓冲液(pH＝7.4或5.5)中，释放于37℃摇床(80rpm)下进行。在指定的时间将释放外液全取出，并补充等量的新鲜缓冲液。通过HPLC分析释放外液中Ce6的浓度。如图8所示，inS-PPE/Ce6超支化载药纳米颗粒在两种pH环境下(pH＝7.4或5.5)培养72h后，Ce6的释放量分别只有28.3％和28.9％；S-hbPPE/Ce6在pH＝7.4的中性环境下培养72h后，药物的释放率也只有25.6％，而当在pH＝5.5的酸性环境下，在72h内S-hbPPE/Ce6的释放率达48.6％，药物释放量明显增加。这些实验结果表明了S-hbPPE/Ce6具有酸响应性释放，我们推测是S-hbPPE/Ce6载药纳米颗粒具有大量的缩醛键，在pH＝5.5酸性环境下能发生断裂，导致颗粒内核疏水性磷酸酯变为亲水性，最终导致颗粒崩解快速释放出药物。
四、超支化载药纳米颗粒的体外细胞实验
1、肿瘤细胞对超支化载药纳米颗粒的摄取
我们选取了人胰腺癌细胞系(BxPC-3)用于探究超支化聚磷酸酯纳米颗粒对光敏剂Ce6的输送效果。我们分别设置free Ce6、S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6([Ce6]＝2.0μg/mL)三组实验组。分别将上述三种颗粒组分溶液与BxPC-3肿瘤细胞系共同培养2h，洗去未被摄取的颗粒或药物，用流式细胞仪检测细胞内Ce6的含量。如图9所示，与free Ce6实验组对比，两种超支化载药颗粒实验组细胞内的Ce6荧光强度都明显增强，并且两者荧光强度无明显区别，表明两种超支化聚磷酸酯纳米颗粒均能有效的输送Ce6，并且能提高肿瘤细胞内的Ce6的富集。
2、超支化载药纳米颗粒的细胞内吞实验
我们利用激光共聚焦扫描显微镜观察两种超支化纳米颗粒递送Ce6在细胞内的分布。和流式细胞摄取实验一样，将细胞和S-hbPPE/Ce6、inS-hbPPE/Ce6以及free Ce6共培养摄取2h([Ce6]＝2.0μg/mL)。分别用鬼笔环肽(Alexa Fluor 488phalloidin)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞骨架的F-肌动蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)。如图10所示，在三个实验组中Ce6(红色)主要在细胞核(蓝色)周围富集，且S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6组中的红色荧光明显强于free Ce6组，证明了两种超支化纳米颗粒能够有效输送Ce6并增强肿瘤细胞对Ce6的摄取，使Ce6在肿瘤细胞内富集。
3、肿瘤细胞内的药物释放
为了了解肿瘤细胞摄取超支化载药纳米颗粒后，胞内药物释放的行为。我们分别将freeCe6、S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6([Ce6]＝2.0μg/mL)三种组分与BxPC-3肿瘤细胞系共同培养2h，摄取结束后，用1×PBS洗涤肿瘤细胞三遍除去未被摄取的超支化载药纳米颗粒或Ce6，然后将细胞置于培养箱中继续培养12h，培养结束后用流式细胞仪检测细胞内Ce6荧光强度。如图11所示，free Ce6实验组胞内荧光强度最低，inS-hbPPE/Ce6组荧光强度高于free Ce6实验组，而S-hbPPE/Ce6组胞内Ce6荧光强度最强。基于上述的实验结果，我们可以得出结论：肿瘤细胞对free Ce6摄取能力较差，inS-hbPPE/Ce6和S-hbPPE/Ce6能够有效被肿瘤细胞摄取，并且S-hbPPE/Ce6在肿瘤细胞内能快速释放出Ce6，使肿瘤细胞内荧光强度明显增强。这是由于S-hbPPE/Ce6内核的缩醛键在肿瘤细胞内涵体/溶酶体的酸性环境下能发生酸响应断裂，使颗粒发生崩解，导致颗粒内核中的Ce6快速释放出来。
4、超支化载药纳米颗粒对BxPC-3细胞的杀伤效果实验
以free Ce6组做对照组，将BxPC-3细胞和不同Ce6浓度梯度(0.20，040，0.60，0.80μg/mL)的两种超支化载药纳米颗粒(S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6)共同培养12h，摄取结束后洗去未被摄取的药物或颗粒，将细胞置于0.5W/cm2的660nm红光下照射30min，光照结束后将细胞继续培养24h。最后用MTT法检测各实验组肿瘤细胞活性。如图12所示，在四个浓度梯度的Ce6浓度下，free Ce6实验组在660nm红光照射下对BxPC-3细胞杀伤效果并不好，肿瘤细胞活性均在80％以上。inS-hbPPE/Ce6随着Ce6浓度的增加，在光照条件下对BxPC-3细胞的杀伤效果逐渐增加，但BxPC-3细胞仍保持较高的活性。而S-hbPPE/Ce6对BxPC-3细胞的杀伤效果最佳，在低浓度的Ce6和660nm红光照射下能杀伤大部分的BxPC-3肿瘤细胞，达到显著的PDT治疗效果。
五、动物水平实验
1、药代动力学实验
选取15只ICR小鼠随机均等的分成3个小组，通过尾静脉分别注射不同组成的颗粒溶液(free Ce6、S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6，[Ce6]＝2.5mg/kg)。在预先设定的时间点从小鼠眼眶取血、离心后取血清、再萃取血清中的Ce6，用HPLC检测各个时间点小鼠体内的Ce6浓度。如图13所示，free Ce6在小鼠体内快速被清除代谢，而S-hbPPE/Ce6和inS-hbPPE/Ce6在小鼠体内能够实现良好的长循环，延长Ce6在小鼠体内的循环时间。
2、体内抗肿瘤治疗试验
取30只植有BxPC-3皮下肿瘤模型的BALB/C裸鼠，随机分为6组，每组5只小鼠。分别尾静脉注射200μL的PBS、free Ce6、inS-hbPPE/Ce6和S-hbPPE/Ce6([Ce6]＝2.5mg/kg)，其中inS-hbPPE/Ce6和S-hbPPE/Ce6实验组设置光照组和非光照组，每周给药两次，并在尾静脉给药12h时，给予小鼠肿瘤部位0.5W/cm2的660nm红光照射30min，对小鼠进行为期18d的治疗实验。在整个治疗过程中，每两天是用卡尺对肿瘤的体积进行测量，并检测各实验组小鼠体重变化。肿瘤体积的计算公式如下：体积(mm3)＝0.5×长×宽2。
如图14所示，PBS组以及非光照的inS-hbPPE/Ce6和S-hbPPE/Ce6实验组，肿瘤生长迅速。free Ce6组在660nm红光照射下对肿瘤生长具有一定的抑制效果，这是由于Ce6在660nm红光照射条件下，产生了PDT治疗效果。而inS-PPE/Ce6和S-hbPPE/Ce6在660nm红光照射下对肿瘤生长都具有明显的抑制作用，且S-hbPPE/Ce6的抑制效果最佳。这是由于两种超支化载药纳米颗粒均能有效输送Ce6，提高肿瘤细胞内Ce6浓度，在660nm红光照射下增强PDT治疗效果。与inS-hbPPE/Ce6相比，S-hbPPE/Ce6在肿瘤细胞内可发生酸响应导致颗粒崩解过程，触发Ce6快速释放，在660nm红光照射下能产生更多的活性氧，从而取得更好的PDT治疗效果。如图15所示，在整个治疗过程中，各组小鼠体重未出现明显变化，证明了各实验组组分未对小鼠造成严重的全身毒性，也反映了两种超支化聚磷酸酯材料具有良好的生物相容性。

Claims (9)

1.一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有缩醛键的二醇和三乙胺溶解于有机溶剂中，然后在冰浴条件下加入三氯氧磷，继续搅拌,发生A2B3缩聚交联反应；
（2）反应结束后，加入甲氧基聚乙二醇，继续搅拌反应，终止缩聚反应过程及修饰超支化聚磷酸酯材料末端，得缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述含有缩醛键的二醇为2,2’-（丙烷-2,2-二基双（氧））二乙醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述三氯氧磷与三乙胺的摩尔比为1:3-6。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述含有缩醛键的二醇和三氯氧磷的摩尔比为1:0.67-0.80。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反应的时间为3~5 h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述搅拌反应的时间为3~5h。
8.由权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料。
9.权利要求8所述的一种缩醛键骨架的超支化聚磷酸酯材料作为运输载体应用于制备载药纳米颗粒。
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