CN112625252B - 一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学材料的技术领域，公开了一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物及其制备与应用。所述改性树枝状PAMAM聚合物的结构：(PEG‑O‑C(O)‑HN)_m‑PAMAM‑(NH‑C(O)‑O‑R)_n，R为叔胺基团取代的烷基，NH来自PAMAM聚合物末端的胺基，PEG‑O中O来自PEG中羟基，m,n为接枝数。本发明还公开了聚合物的制备方法。本发明的改性树枝状PAMAM聚合物具有pH响应性，显著增加聚合物的渗透性。本发明的聚合物用于制备药物，在肿瘤微酸环境下实现颗粒的尺寸转变，由利于血液循环的大尺寸颗粒转变成利于肿瘤组织渗透的小尺寸颗粒，增强化疗药物的渗透，改善抗肿瘤效果。

Description

一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物及其制备 与应用

技术领域

本发明属于医学材料的技术领域，具体涉及一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物及其制备方法与应用。所述pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物用于制备纳米药物，特别是抗肿瘤纳米药物，该聚合物能够增强药物在肿瘤组织中的渗透与治疗效果。

背景技术

癌症，又名恶性肿瘤，已成中国首要的死亡原因。与手术治疗和放疗手段相比，化疗可通过血液循环至全身进行治疗，特别是针对于中晚期癌症患者而言，化疗还是目前主要的治疗手段。在过去的几十年里，纳米药物通过增强的渗透和保留(EPR)效应可以选择性地积累在肿瘤部位，纳米药物治疗已成为递送化疗药物至肿瘤组织重要手段之一。然而，肿瘤组织独特的生理病理学特性(肿瘤组织内部较高的间质压力和致密的细胞外基质)阻碍了纳米药物在肿瘤组织的渗透与扩散。因此，纳米颗粒在肿瘤组织的有限渗透是一个严峻的挑战。已有多篇文献报道通过改善肿瘤组织内部较高的间质压力和致密的细胞外基质来解决纳米药物在肿瘤组织的渗透与扩散，但是改善肿瘤组织内部较高的间质压力和致密的细胞外基质会带来EPR效应减弱以及加速肿瘤转移等不利后果。已有文献证明，尺寸较大的纳米药物(60-100nm)适合发挥EPR效应，并易于在肿瘤血管附近积聚，但在致密的肿瘤组织中难以渗透。相反，较小的纳米颗粒(1-10nm)具有更大的肿瘤渗透性，但通常具有较差的循环半衰期和肿瘤积累。与改善肿瘤间质压和细胞外基质相比，改变纳米药物尺寸大小是一种更加安全有效的手段。

Polyamidoamine(PAMAM，聚酰胺胺)是一类在生物医用材料领域常用的树枝状聚合物大分子。它化学结构明确、三维空间结构规整，表面含有大量伯胺基团，为物理包载及化学键合药物分子提供了可能。基于PAMAM树枝状聚合物的智能响应材料特别是针对于肿瘤微环境响应的鲜有报道。

本发明的改性PAMAM树枝状聚合物，获得了肿瘤微环境酸响应性能，并且在肿瘤微酸环境(pH 6.5-7.0)条件下实现颗粒的尺寸转变，由利于血液循环的100nm大尺寸颗粒转变成利于肿瘤组织渗透的小于10nm的小尺寸颗粒，从而增加了纳米药物的渗透性能，改善化疗药物的治疗效果，为拓展其在生物医学领域的应用奠定了基础。

发明内容

为了克服纳米药物在肿瘤组织中渗透能力不足等缺点，本发明的目的在于提供一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物及其制备方法。本发明将含有羟基的叔胺小分子和PEG聚乙二醇改性PAMAM(聚酰胺-胺)，获得改性树枝状PAMAM聚合物。所获得的改性树枝状PAMAM聚合物具有pH响应，如：在pH≥6.9条件下粒径在100nm左右，而在pH≤6.8条件下粒径小于10nm，在5nm左右，并且粒径转换速度迅速。这种pH响应能够增强该改性聚合物及其制备的药物在细胞中、肿瘤组织中的渗透性。

本发明的另一目的在于提供上述改性树枝状PAMAM聚合物的应用。所述改性树枝状PAMAM聚合物用于制备药物，特别是抗肿瘤药物。本发明的改性树枝状PAMAM聚合物在肿瘤微酸环境条件下实现颗粒的尺寸转变，由利于血液循环的大尺寸颗粒转变成利于肿瘤组织渗透的小于10nm的小尺寸颗粒，从而增加了纳米药物的渗透性能，改善化疗药物的治疗效果。本发明的改性树枝状PAMAM聚合物通过pH响应性能显著增加其渗透性能，可用作化疗药物载体增强化疗药物的渗透性能和抗肿瘤效果。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物，其结构式为：

(PEG-O-C(O)-HN)_m-PAMAM-(NH-C(O)-O-R)_n，

其中R为叔胺基团取代的烷基，结构中-NH-来自PAMAM聚合物末端的胺基-NH₂，PEG-O中O来自PEG中羟基，m,n为接枝数，不为0。

PAMAM聚合物为第4代PAMAM聚合物。

m为1～5，优选为1～3；n为10～45，优选为25～35。

叔胺基团取代的烷基是指烷基中氢被叔胺基取代，优选C_2～5烷基中氢被叔胺基取代；所述叔胺基团取代的烷基更优选为-CH₂CH₂-N(R₁)₂、-CH₂CH₂CH₂-N(R₁)₂，R₁为C_1～5烷基。

所述叔胺基团取代的烷基为-CH₂CH₂-N(CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)₂，所述PEG的分子量为400～5000；所述PEG为未封端的PEG或单封端的PEG；单封端的PEG包括聚乙二醇单烷基醚、聚乙二醇单烷基酯等单封端的聚乙二醇，如：甲氧基聚乙二醇。

所述改性树枝状PAMAM聚合物的结构式(PEG-O-C(O)-HN)_m-PAMAM-(NH-C(O)-O-R)_n中NH-C(O)-O-R来自PAMAM聚合物末端的胺基-NH₂与

反应得到以及结构中PEG-O-C(O)-HN来自PAMAM聚合物末端的胺基-NH₂和C DI活化的PEG反应生成得到。

一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用CDI(N,N′-羰基二咪唑)活化小分子叔胺，获得活化的小分子叔胺；所述小分子叔胺为含有羟基的叔胺；所述小分子叔胺的结构为R-OH，R为叔胺基团取代的烷基；

(2)采用CDI(N,N′-羰基二咪唑)活化聚乙二醇PEG，获得活化PEG；

(3)在有机溶剂中，将活化PEG、活化的小分子叔胺与树枝状PAMAM聚合物反应，纯化，得到改性树枝状PAMAM聚合物。

步骤(1)中所述活化的小分子叔胺的结构为

所述N,N′-羰基二咪唑CDI与小分子叔胺的摩尔比为(1.5～5)：1；

步骤(1)中所述活化在有机溶剂中进行，有机溶剂优选为二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中一种以上；所述活化的温度为室温，活化的时间为10～72h；活化完后产物采用水洗涤，干燥剂干燥，旋蒸去除有机溶剂；小分子叔胺以滴加的方式加入。

步骤(2)中PEG与CDI间的的摩尔比为1：(1.5～5)：1，PEG为单封端的PEG；步骤(2)中所述活化在有机溶剂中进行，有机溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃中一种以上；所述活化的温度为室温，活化的时间为12-36小时。

步骤(3)中树枝状PAMAM聚合物为第四代PAMAM；

当树枝状PAMAM聚合物为第四代PAMAM时，树枝状PAMAM聚合物中末端的氨基与活化的小分子叔胺的摩尔比为1：(0.5～5)；活化PEG与树枝状PAMAM聚合物的摩尔比为(1.5～7)：1。

步骤(3)中所述有机溶剂优选为DMSO。

步骤(3)中所述树枝状PAMAM聚合物与有机溶剂的质量体积比为(10～30)mg：(1～5)mL。

步骤(3)的具体步骤为在有机溶剂中，将活化PEG与树枝状PAMAM聚合物反应，反应完后加入活化的小分子叔胺继续反应，纯化，得到改性树枝状PAMAM聚合物。此时，活化PEG与树枝状PAMAM的摩尔比为(1.5～5.5)：1，优选为(1.5～3.5)：1。树枝状PAMAM聚合物中末端的氨基与活化的小分子叔胺的摩尔比为1：(0.5～5)；优选为1：(0.7～3)。

步骤(3)还可以为在有机溶剂中，将活化的小分子叔胺与树枝状PAMAM反应，然后加入活化PEG继续反应；或者将活化的小分子叔胺和活化PEG同时加入树枝状PAMAM中进行反应，纯化。此时，活化PEG与树枝状PAMAM的摩尔比为(3～7)：1。树枝状PAMAM聚合物中末端的氨基与活化的小分子叔胺的摩尔比为1：(0.5～5)；优选为1：(0.7～3)。

步骤(3)中所述反应的温度为30-50℃，反应的时间为15-168h。步骤(2)中所述纯化是指采用Sephadex LH20凝胶柱分离纯化。

一种改性树枝状PAMAM聚合物纳米颗粒由上述pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物制备得到；

通过以下方法制备得到：

采用有机溶剂溶解pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物，然后加入水，搅拌，获得改性树枝状PAMAM聚合物纳米颗粒。

所述有机溶剂为氯仿、丙酮或二甲基甲酰胺中一种以上；所述有机溶剂与水的体积比为(1～1.5)：(6～8)；所述有机溶剂与pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物的体积质量比为(1～1.5)mL：(20～35)mg。

所述搅拌的转速为2000-3000rpm，所述搅拌是指搅拌至有机溶剂挥发完全，搅拌的时间优选为8～18h。

改性树枝状PAMAM聚合物具有pH响应，在pH≥6.9条件下粒径在100nm左右，而在pH≤6.8条件下粒径小于10nm。

通过上述方法制备的纳米颗粒为平均粒径100nm左右的纳米颗粒，如：80～200nm。

所述改性PAMAM聚合物和改性PAMAM聚合物颗粒用来制备药物，特别是抗肿瘤药物，通过pH响应调整粒径大小增强渗透性的抗肿瘤药物。

所述抗肿瘤药物中改性PAMAM聚合物包载药物，抗肿瘤药物的平均粒径为80～200nm，优选为100～130nm。

具体步骤为：将pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物和药物在有机溶剂中混合，改性树枝状PAMAM聚合物包载药物，加入水，乳化处理，去除有机溶剂，去除未包载的药物。

所述药物为用于增强能够包载进树枝状分子空腔的化疗药物。

本发明先在pH≥7的环境下制备大颗粒的抗肿瘤药物，注入体内后，通过血液循环富集在肿瘤部位，肿瘤部位的微酸环境，使得大颗粒的药物颗粒变为小颗粒的药物颗粒，从而渗透至肿瘤组织的内部。而粒径较小的颗粒在血液循环过程中容易被清除，而且粒径较小的颗粒不具备EPR效应或者EPR效应较差，从而导致在药物在肿瘤组织的富集减少。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明的改性树枝状PAMAM聚合物具有pH响应的性能，如：在pH≥6.9条件下粒径在100nm左右，pH 6.8条件下粒径在10nm以下，并且粒径转换速度迅速；

(2)本发明的聚合物通过pH响应性能显著增加在细胞球的渗透性能；

(3)本发明的聚合物用作化疗药物载体增强化疗药物如吉西他滨在体内的渗透以及治疗效果。

附图说明

图1为改性PAMAM树枝状聚合物的合成路线示意图；

图2为N，N-二戊基乙醇胺(DnPEA)的¹H NMR图；

图3(a)为CDI活化的N，N-二戊基乙醇胺(DnPEA-CDI)的¹H NMR图；

图3(b)为CDI活化的聚乙二醇2000(PEG-CDI)的¹H NMR图；

图4为PEG-G4-PAMAM-DnPEA₃₀的¹H NMR图；

图5为实施例2中SPN纳米颗粒的pH敏感实验结果图；

图6为实施例2中SPN纳米颗粒在pH为6.8和7.4下的粒径分布图；

图7为实施例2中SPN纳米颗粒在pH为6.8和7.4下的电镜图；

图8为实施例3中SPN纳米颗粒在3D细胞球不同pH条件下的渗透图；

图9为实施例4中SPN在小鼠体内的渗透图；

图10为实施例5中聚合物SPN包载吉西他滨在胰腺癌模型中的治疗效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中改性PAMAM树枝状聚合物的合成路线示意图如图1所示。

本发明的小分子叔胺可通过常规方法制备得到。如：

将乙醇胺与溴戊烷溶解在有机溶剂中(乙醇胺与溴代烷的摩尔比＝1：2)，向溶液中加入过量的碱性物质，室温密闭反应3～5天，过滤，旋蒸去除有机溶剂，然后用二氯甲烷溶解产物，再用饱和食盐水洗涤三次以除去粘稠度较大的反应物乙醇胺，将所得产物混合物进行减压蒸馏，蒸汽压在70℃左右有大量无色透明产物生产，无色透明液体N，N-二戊基乙醇胺(DnPEA)产率40％，在4℃冰箱中保存备用。所述有机溶剂为乙腈；碱性物质为碳酸钠或碳酸钾，其用量为乙醇胺物质量的2.5倍。N，N-二戊基乙醇胺(DnPEA)的¹H NMR图如图2所示。

改性树枝状PAMAM聚合物是由树枝状PAMAM聚合物与CDI活化的N，N-二戊基乙醇胺以及聚乙二醇反应得到；

所述聚乙二醇可以为聚乙二醇2000还可以为聚乙二醇5000，优选为PEG2000。

本发明的实施例中第四代PAMAM分子的分子量为14215g/mol；1mol四代PAMAM中含有64mol的氨基。

实施例1：酸响应载体SPN的合成

酸响应载体SPN(即pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物)是由G4-PAMAM表面氨基分别与CDI活化的PEG和CDI活化的N，N-二戊基乙醇胺(DnPEA-CDI)反应制备。

CDI活化的DnPEA-CDI(DnPEA-CDI)的制备：

DnPEA(N,N-二戊基乙醇胺)(0.02mol)溶于20mL二氯甲烷，获得DnPEA溶液；将CDI(0.05mol)溶于40mL二氯甲烷中，获得CDI溶液；将DnPEA溶液滴入CDI溶液中(30分钟内完成滴加)，滴加完成后，室温反应24小时；反应完成后，用去离子水洗涤产物三次(收集下层产物)，用无水硫酸镁除去少量水，旋蒸除去溶剂二氯甲烷，再用真空泵抽除少量未除去的二氯甲烷溶剂，获得CDI活化的DnPEA即DnPEA-CDI，产率为80％，DnPEA-CDI的核磁(¹H NMR图)结果如图3(a)所示。

CDI活化的PEG-CDI(PEG-CDI)的制备：

PEG(即甲氧基聚乙二醇)(0.02mol)溶于20mL二氯甲烷，获得PEG溶液；将PEG溶液滴入CDI溶液中(30分钟内完成滴加)，滴加完成后，室温反应24小时；反应完成后，用去离子水洗涤产物三次(收集下层产物)，用无水硫酸镁除去少量水，旋蒸除去溶剂二氯甲烷，再用真空泵抽除少量未除去的二氯甲烷溶剂，获得CDI活化的PEG即PEG-CDI，产率为86％，PEG-CDI的核磁(¹H NMR图)结果如图3(b)所示。

SPN的制备：

(1)在1.5ml无水DMSO中，将25mg四代PAMAM(G4-PAMAM)与9.2mg的PEG-CDI在40℃油浴锅中反应12h，PEG-CDI与G4-PAMAM的摩尔比为2.5︰1，反应结束后称取30.0mg的DnPEA-CDI在40℃油浴锅中反应24小时，DnPEA-CDI与G4-PAMAM摩尔比为60：1，获得产物；

(2)将产物用真空泵浓缩至0.5-1mL左右，过Sephadex LH20柱子，以甲醇为流动相，收集产物，通过旋转蒸发仪旋蒸除去溶剂，再用真空泵抽除少量溶剂，获得改性树枝状PAMAM聚合物即SPN。本发明先接枝PEG再接枝叔胺分子更容易控制接枝数目。

改性树枝状PAMAM聚合物(PEG-G4-PAMAM-DnPEA₃₀)即SPN的核磁结果(¹H NMR图)如图4所示。图4为PEG-G4-PAMAM-DnPEA₃₀的¹H NMR图。DnPEA接枝数为30(G4-PAMAM共有996个亚甲基H，且H的化学位移都在2-4ppm之间，如图4所示，靠近氧的第一个碳(b)上的氢为特征峰，且化学位移在4.2-4.5之间，而临近叔胺分子N旁边三个碳(c+d)的氢的化学位移在2-4ppm之间，以氨基甲酸酯键附近的质子信号作为特征峰，可由其峰面积计算得知接枝数为30)。

经核磁计算聚合物中聚乙二醇的接枝数为2。

SPN纳米颗粒的制备：

用少量的氯仿(1-1.5ml)溶解产物(30mg)，再加入(6-8mL)去离子水，搅拌过夜，直至氯仿被完全除去，用旋转蒸发仪浓缩至1.5-2mL左右，4℃冰箱保存。

实施例2：改性树枝状大分子pH敏感性能测试

pH响应性能的测定：配制浓度为5mg/mL的树枝状大分子SPN聚合物的纳米颗粒水溶液(实施例1中SPN纳米颗粒的水溶液)，同时配制pH＝6.4-7.4浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液。取多份50μL的SPN纳米颗粒溶液置于1mL EP管中，分别向EP管加入上述配制的不同pH的PBS缓冲液。将上述不同PB S调节溶液稀释成3mL，通过粒径仪测定发现：SPN纳米颗粒的pH敏感实验结果图如图5所示，在pH6.9及以上pH条件下粒径在120nm左右，而在pH 6.8及以下pH条件下粒径5nm左右，验证了本材料具有pH响应的性能；在pH为6.8和7.4下的粒径分布图如图6所示，在pH为6.8和7.4下的电镜图如图7所示。

实施例3：聚合物SPN在3D细胞球不同pH条件下的渗透能力检测

将2％低熔点琼脂糖(10mL)加入到T75细胞培养瓶中，冷却30分钟以凝胶化。将Panc02细胞以每瓶2×10⁶个细胞的密度与15mL DMEM培养基一起接种，并孵育2周以生长成球形即三维多细胞球体(MCS)。将MCS转移至低黏附24孔板中，并在pH 6.8和7.4的DMEM培养基中孵育。将荧光标记的RhB-SPN按实施例1中SPN纳米颗粒制备方式，制备成纳米颗粒，以0.2mg/mL的最终浓度添加到培养基中。孵育8小时后，收集细胞球体并用PBS(pH 7.4，0.01M)洗涤3次，并用Zeiss LSM 710倒置激光共聚焦扫描显微镜成像系统观察，所拍摄的摄取图如图8所示。图8为实施例3中SPN纳米颗粒在3D细胞球不同pH条件下的渗透图(上图为不同pH不同扫描深度下的渗透图；下图为不同pH同一扫描深度下放大的颗粒分布渗透图)。验证了与pH 7.4大颗粒条件下相比，RhB-SPN纳米颗粒在pH6.8条件下响应后能在MCS中有较强的渗透能力。

实施例4：RhB标记的聚合物SPN在小鼠体内肿瘤组织的渗透

将2×10⁶个Panc02细胞悬浮在100μLPBS(包含基质胶)中，注入C57B L/6小鼠的右侧腹。当肿瘤体积达到约300mm³时，小鼠尾静脉注射RhB标记的SPN纳米颗粒(15mg/kg)，12小时后牺牲小鼠，取下肿瘤组织，4％多聚甲醛固定24小时，50％蔗糖溶液脱水过夜，冷冻组织切片，共聚焦下观看颗粒的分布与渗透，结果图9所示，图9为实施例4中SPN在小鼠体内的渗透图。

实施例5：聚合物SPN包载吉西他滨(Gem)在胰腺癌模型中的治疗实验

对于皮下胰腺肿瘤模型，将2×10⁶个Panc02细胞悬浮在100μLPBS(包含基质胶)中，注入C57BL/6小鼠的右侧腹。当肿瘤体积达到约50mm³时，将具有胰腺肿瘤的C57BL/6小鼠随机分为三组(PBS，游离Gem，SPN/Gem)(每组6只小鼠)，通过静脉注射等剂量的Gem(5mg/kg)，其中SPN/Gem组按照Gem为5mg/kg进行定量。小鼠在第0、3、6、9和12天接受注射。在治疗期间每三天记录一次肿瘤体积。结果如图10所示，图10为实施例5中聚合物SPN包载吉西他滨在胰腺癌模型中的治疗效果图。通过切片发现，SPN纳米颗粒在肿瘤组织中有较好的分布与渗透。SPN/Gem治疗后，小鼠肿瘤体积显著下降。

酸响应载体包载吉西他滨组装成纳米颗粒(SPN/Gem)的制备。

将2.0mg的吉西他滨和10.0mg酸响应载体溶解在1.5mL氯仿中，在密闭条件下将混合物搅拌过夜，利用树枝状空腔包载吉西他滨。搅拌完成后，减压除去溶剂，再加入1.5mL氯仿使其溶解，然后加入6.0mL无菌水，超声处理1分钟使其完全乳化，旋蒸除去氯仿并除去少量水，并稀释至相应体积。3000rpm的速度离心30分钟以除去所有未封装的药物，紫外定量包载效率。

Claims (6)

1.一种pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物的应用，其特征在于：所述pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物用于制备药物；

所述药物为抗肿瘤药物，通过pH响应调整粒径大小增强渗透性的抗肿瘤药物；在pH≥6.9条件下粒径在100~130 nm，pH≤6.8条件下粒径在10 nm以下；

所述pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物，其结构式为：

(PEG-O-C(O)-HN)_m-PAMAM-(NH-C(O)-O-R)_n，

其中R为叔胺基团取代的烷基，结构中-NH-来自PAMAM聚合物末端的胺基-NH₂，PEG-O中O来自PEG中羟基，m,n为接枝数，m为2；n为30；PAMAM聚合物为第4代PAMAM聚合物；

所述叔胺基团取代的烷基为-CH₂CH₂-N(R₁)₂、-CH₂CH₂CH₂-N(R₁)₂，R₁为C₅烷基；

所述PEG的分子量为400~5000；所述PEG为未封端的PEG或单封端的PEG；

所述单封端的PEG包括聚乙二醇单烷基醚、聚乙二醇单烷基酯中一种以上。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用CDI活化小分子叔胺，获得活化的小分子叔胺；所述小分子叔胺为含有羟基的叔胺；所述小分子叔胺的结构为R-OH，R为叔胺基团取代的烷基；

（2）采用CDI活化聚乙二醇PEG，获得活化PEG；

（3）在有机溶剂中，将活化PEG、活化的小分子叔胺与树枝状PAMAM聚合物反应，纯化，得到改性树枝状PAMAM聚合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述活化的小分子叔胺的结构为

；

步骤（1）中所述CDI与小分子叔胺的摩尔比为（1.5~5）：1；

步骤（1）中所述活化在有机溶剂中进行；所述活化的温度为室温，活化的时间为10~72h；

步骤（2）中PEG与CDI的摩尔比为1：（1.5~5）：1，PEG为单封端的PEG；步骤（2）中所述活化在有机溶剂中进行；所述活化的温度为室温，活化的时间为12-36小时；

步骤（3）中树枝状PAMAM聚合物中末端的氨基与活化的小分子叔胺的摩尔比为1：（0.5~5）；活化PEG与树枝状PAMAM聚合物的摩尔比为（1.5~7）：1；

步骤（3）中所述有机溶剂为DMSO；

步骤（3）中所述树枝状PAMAM聚合物与有机溶剂的质量体积比为（10~30）mg：（1~5）mL；

步骤（3）的具体步骤为在有机溶剂中，将活化PEG与树枝状PAMAM聚合物反应，反应完后加入活化的小分子叔胺继续反应，纯化，得到改性树枝状PAMAM聚合物；

步骤（3）中所述反应的温度为30-50℃，反应的时间为15-168h。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物制备成改性树枝状PAMAM聚合物纳米颗粒，其具体制备方法：

采用有机溶剂溶解pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物，然后加入水，搅拌，获得改性树枝状PAMAM聚合物纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述有机溶剂为氯仿、丙酮或二甲基甲酰胺中一种以上；所述有机溶剂与水的体积比为（1~1.5）：（6~8）；所述有机溶剂与pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物的体积质量比为（1~1.5）mL：（20~35）mg；

所述搅拌是指搅拌至有机溶剂挥发完全。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述药物中pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物包载药物；

所述抗肿瘤药物的平均粒径为100~130nm；

所述药物的具体制备步骤为：将pH响应增强渗透性的改性树枝状PAMAM聚合物和药物在有机溶剂中混合，改性树枝状PAMAM聚合物包载药物，加入水，乳化处理，去除有机溶剂，去除未包载的药物；

所述药物为用于增强能够包载进树枝状分子空腔的化疗药物。

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