CN102612520A - 作为orl-1受体拮抗剂的螺哌啶化合物 - Google Patents

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Abstract

描述了下式I的ORL-1受体拮抗剂、它的用途和它的制备方法。ORL-1拮抗剂被认为可用于治疗抑郁症和/或治疗超重、和/或超重或肥胖治疗后体重的维持。通过动物模型已经证明某些化合物可用于治疗偏头痛。

Description

作为ORL-1受体拮抗剂的螺哌啶化合物
孤啡肽FQ(OFQ)/痛敏肽是对ORL1 G-蛋白偶联受体(GPCR)具有高度亲和力的17氨基酸肽。ORL1受体是A类GPCR，其主要在中枢神经系统和外周神经系统以及胃肠道、平滑肌和免疫系统中表达。尽管在结构上与阿片样肽类/受体相关，但是OFQ/痛敏肽系统未显示与典型阿片样肽类/受体的显著交叉反应性且显示体内抗阿片样物质活性(例如据报道ORQ/痛敏肽显示镇痛特性)。
痛敏肽/孤啡肽FQ受体(NOC/OFQ)拮抗剂即ORL-1受体的特异性拮抗剂已经在许多使用抑郁症和摄食行为动物模型的研究中显示抗抑郁药活性和厌食活性。照此，认为ORL-1拮抗剂用于治疗抑郁症和/或治疗超重、肥胖和/或超重或肥胖治疗后的体重维持。
WO 2003/095427描述了作为用作止痛药的ORL-1拮抗剂的一些螺哌啶基化合物。
Yoshizumi，Takashi等人(2008)在Design，synthesis和struture-activityrelationship study of a novel class of ORL-1 receptor antagonists based onN-biarylm乙基spriopiperidine，Bioorganic & Medicinal Chemistry Lettersvol.18，pg.3778-3782中描述了作为选择性ORL-1拮抗剂的一些N-双芳基甲基-螺哌啶化合物。
本发明提供了一族4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]化合物，其对ORL-1受体具有高拮抗活性并且在体内CNS中具有高ORL-1受体占有率。另外，一些化合物具有如超过hERG通道活性选择性所确定的有利的心脏毒理学特性和超过其他生理学重要受体的高度选择性(例如μ、κ和δ阿片样物质、5-羟色胺和多巴胺受体)。此外，本发明的一些化合物具有有利的生物药物和药代动力学特性(例如溶解性、口服暴露和CNS渗透性)。本发明的一些化合物显示减少的氧化性代谢，从而产生有利的口服生物利用度。一些化合物还通过动物模型显示，本发明的化合物可用于治疗偏头痛。
本发明提供了式I的化合物或其药学可接受的盐：
Figure BDA00001645704900021
其中
R1是氟或氯；
R2a和R2b各自是氢或各自是氟；
R3是氢、甲基、羟基甲基或(C1-C3)烷氧基甲基；
R4选自氟、氯、氰基、氰基甲基、(C1-C3)烷基、环丙基、羟基甲基、甲氧基、环丙基甲氧基、氨基羰基甲氧基、(C1-C3)烷氧基甲基、环丙基氧基甲基、环丙基甲氧基甲基、1-羟基-1-甲基乙基、氨基羰基氧基甲基、甲基氨基羰基氧基甲基、二甲基氨基羰基氧基甲基、氨基羰基、氨基羰基甲基、-CH2-NR5R6、羟基亚胺、甲氧基亚胺、吗啉-4-基、吗啉-4-基甲基、Ar1、-CH2Ar1、四氢呋喃-2-基、3-氧代吗啉-4-基甲基、2-氧代吡咯烷-1-基甲基和2-氧代哌啶-1-基甲基；
R5是氢、C1-C3烷基、氰基甲基、-C(O)CH3或氨基羰基甲基；
R6是氢或甲基；且
Ar1是选自咪唑-1-基、咪唑-2-基、2-甲基咪唑-1-基、吡唑-1-基、1，2，3-三唑-1-基；1，2，3-三唑-2-基；1，2，4-三唑-1-基、异噁唑-3-基、噁唑-5-基和3-甲基-1，2，4-噁二唑-5-基的部分。
本发明的另一个方面中提供了药物组合物，其包含式I的化合物或其药学可接受的盐与其药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明该方面的一个实施方案是，该药物组合物还包含至少另一种治疗成分，例如SSRI抗抑郁药，例如氟西汀。此外，本发明的该方面提供了适合于治疗抑郁症的药物组合物，其包含式I的化合物或其药学可接受的盐与其药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明的另一个方面中提供了适合于治疗超重、肥胖和/或维持体重的药物组合物，其包含式I的化合物或其药学可接受的盐与其药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。另一个实施方案提供了适合于治疗偏头痛的药物组合物，其包含式I的化合物或其药学可接受的盐与其药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了治疗哺乳动物抑郁症的方法，包括对有这种治疗需要的哺乳动物施用有效量的式I的化合物或其药学可接受的盐。另一个实施方案提供了治疗哺乳动物抑郁症的方法，包括对有这种治疗需要的哺乳动物施用有效量的式I的化合物或其药学可接受的盐和有效量的SSRI抗抑郁药或其药学可接受的盐例如氟西汀。本发明的其他实施方案提供了治疗超重和/或肥胖的方法和/或用于维持体重的方法，包括对有这种治疗需要的哺乳动物施用有效量的式I的化合物或其药学可接受的盐。在本发明这些方面的一个具体的实施方案中，所述的哺乳动物是人。
本发明还提供了式I的化合物或其药学可接受的盐，用于疗法。在该方面中，本发明提供了式I的化合物或其药学可接受的盐，用于治疗哺乳动物特别是人抑郁症。本发明还提供了式I的化合物或其药学可接受的盐与SSRI抗抑郁药或其药学可接受的盐例如氟西汀，用于治疗哺乳动物特别是人的抑郁症。此外，本发明的该方面还包括如下技术方案的任一种：式I的化合物或其药学可接受的盐，用于治疗超重；式I的化合物或其药学可接受的盐，用于治疗肥胖；式I的化合物或其药学可接受的盐，用于维持体重(维持体重)，特别是治疗超重或肥胖后；式I的化合物或其药学可接受的盐，用于治疗偏头痛。
本发明的另一个方面提供了式I的化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗抑郁症的药物中的用途。本发明的另一个方面提供了式I的化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗超重、肥胖和/或维持体重的药物中的用途。本发明的另一个方面提供了式I的化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗偏头痛的药物中的用途。
本发明的化合物是碱且由此与大量有机酸和无机酸反应，形成药学可接受的盐。本申请范围内关注本发明化合物各自的药学可接受的盐。本文所用的术语″药学可接受的盐″指对活生物体基本上无毒性的式I的化合物的任意的盐。这种盐包括Journal of Pharmaceutical Science，66，2-19(1977)中举出的那些，它们是本领域技术人员公知的。
本文所用的缩写定义如下：
“BSA”指牛血清白蛋白。
“mCPP”指间-氯苯基哌嗪，非选择性5-羟色胺受体激动剂。
“EDTA”指乙二胺四乙酸。
“EGTA”指乙二醇四乙酸。
“GTP”指鸟苷三磷酸。
“HEPES”指4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
“HPLC”指高压液相色谱法。
“IC50”指达到50％最大抑制时的浓度。
“LC/MS”指液相色谱法、然后是质谱法。
“LC/MS/MS”指液相色谱法、然后是质谱法、然后是二次电离质谱法。
“mFST”指小鼠强迫游泳试验；用于抗抑郁活性的动物模型。
“MS”指质谱法。
“MS(ES+)”指使用电喷雾电离的质谱法。
“NMR”指核磁共振。
“RO示踪物”指2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)-N，N-二甲基-丙酰胺。
“RO”指受体占有率。
“SCX柱”指强阳离子交换柱。
“SNAr”指亲核芳香取代。
“SSRI”指选择性5羟色胺再吸收抑制剂。
“tBu”指叔丁基部分。
“TLC”指薄层色谱法。
“XRD”指X-线衍射。
本发明的优选化合物是这样的化合物，其中：
1)R1是氯；
2)R2a和R2b各自是氟；
3)R1是氯且R2a和R2b各自是氟；
4)R1是氟且R2a和R2b各自是氢；
5)R3是氢、甲基、羟基甲基或甲氧基甲基；
6)R3是甲基；
7)R3是羟基甲基；
8)R1是氯，R2a和R2b各自是氟且R3是甲基；
9)R1是氯，R2a和R2b各自是氟且R3是羟基甲基；
10)R4是氟、羟基甲基、甲氧基甲基或吡唑-1-基甲基；
11)R4是氟；
12)R4是羟基甲基；
13)R4是甲氧基甲基；
14)R4是吡唑-1-基甲基；
15)优选实施方案1)-9)的任一项，其中R4是氟；
16)优选实施方案1)-9)的任一项，其中R4是羟基甲基；
17)优选实施方案1)-9)的任一项，其中R4是甲氧基甲基；
18)优选实施方案1)-9)的任一项，其中R4是吡唑-1-基甲基；
一些优选的化合物是
[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇；
2-氯-4，4-二氟-1′-[[3-甲基-1-[3-(吡唑-1-基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]；和
[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇；
或其药学可接受的盐(即实施例1、23、53、62和63)。
本发明的一种特别优选的化合物是[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇或其药学可接受的盐，例如L-酒石酸盐和/或HCl盐，以实施例1、62和63为典型。
其中R2a和R2b各自是氟的化合物是优选的，因为该化合物具有更有利的药代动力学特性，对氧化性代谢更稳定。它具有改善化合物的口服生物利用度的一般效应。
一般化学
可以根据如下合成方案，通过本领域众所周知和可以理解的方法制备本发明的化合物。用于这些方案步骤的适合的反应条件是本领域众所周知的且可以理解对溶剂和共同试剂的适当替换属于本领域技术人员的范围。同样，本领域技术人员将要理解的是，可以根据需要或期望通过各种众所周知的技术分离和/或纯化合成中间体，且通常能够在随后的步骤中几乎不经或不经纯化直接使用各种中间体。此外，本领域技术人员将要理解在一些情况中，引入部分的次序并非关键。生产式I化合物所需的步骤次序依赖于所合成的特定化合物、原料化合物和取代部分的相对不稳定性，正如熟练化学家充分理解的。除非另有指示，否则所有取代基如上述所定义且所有试剂是本领域众所周知和可以理解的。
方案1
Figure BDA00001645704900071
通过使用还原氨基化反应条件，使化合物III与适当取代的吡唑醛和还原试剂例如三乙酰氧基硼氢化钠在适合的溶剂例如四氢呋喃中在环境温度下反应，得到化合物II。在适合的偶合条件下，使化合物II与化合物IV偶合，其中Hal是氯、溴或碘，与适合的催化剂例如碘化亚铜、适合的碱例如碳酸钾在溶剂例如甲苯中在升温下反应，得到化合物I’，其中R4’是R4或R4的前体。当化合物IV上的Hal是F或Cl时，亲核芳香取代(SNAr)是制备化合物I，的可选方法。更具体地说，可以使化合物II与化合物IV在适合的溶剂例如含有适合的碱例如碳酸钾的二甲基甲酰胺中在升温下反应，得到化合物I’。还可以使化合物III与适当取代的醛化合物V在如上所述的还原氨基化条件下反应，得到期望的化合物I’。当R4’是R4的前体时，通过公知方法将其转化成R4。
方案2
Figure BDA00001645704900081
可以如方案2中示例的那样制备化合物IIIa、IIIb和IIIc。使化合物XIV和XV在适合的溶剂例如二氯甲烷中、在适合的酸例如三氟乙酸的存在下反应。用氢氧化钠水溶液碱化得到的三氟乙酸盐，得到化合物XIII，为游离碱。在环境温度下用磺酰氯的乙酸溶液处理在适合溶剂例如甲基叔丁基醚中的化合物XIII，得到化合物VIII，为盐酸盐。然后在本领域技术人员众所周知的条件下用氮保护基保护化合物VIII，得到化合物VII。(例如，参见：Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Chapters 2和7，John Wiley和Sons Inc.，(1999))。典型地，保护基是Boc(叔丁氧羰基)。使化合物VII与N-溴琥珀酰亚胺在适合的溶剂例如氯苯中借助于光源照射反应，得到溴化物化合物，然后用碱性溶液例如碳酸氢钠水溶液处理，得到羟基化合物。分离或不分离，可以在适合的氧化条件下例如在溴化钾、四甲基哌啶-N-氧化物和次氯酸钠水溶液中进一步氧化羟基化合物，得到期望的酮化合物VI。然后使化合物VI与三氟化(双(2-甲基乙基)氨基)硫在适合的溶剂例如四氢呋喃中在升温下反应，将得到的产物脱保护，得到化合物IIIa。
使用与制备化合物VII类似的方法保护式XIII的化合物，得到化合物XII。在降温下用适合的碱例如四甲基哌啶锂处理在适合溶剂例如四氢呋喃中的化合物XII，然后添加N-氟苯磺酰亚胺，得到氟化物化合物，用HCl水溶液脱保护，用NaOH水溶液碱化，得到化合物IIIb。
通过与上述制备化合物VI相同的方法，可以通过三步合成例如溴化、羟基化和氧化由化合物XII得到化合物IX。可以将每种中间体分离为纯化合物，用于进一步反应，或不分离如合成化合物VI所述进行反应。然后用适合的卤素-金属交换试剂例如适合的溶剂例如四氢呋喃中的丁基锂在降温下处理化合物IX，然后用氟化试剂例如N-氟-苯磺酰亚胺处理，得到期望的氟化产物，然后适当脱保护，得到期望的化合物IIIc。
方案3
Figure BDA00001645704900091
可以如方案3中所示制备式V的化合物。在上述用于将化合物II转化成化合物I’的SNAr或偶合条件下使化合物XVI与化合物XVII反应，得到式XV的化合物。当Z是酯基时，可以首先用适合的还原剂例如氢化铝锂在适合的溶剂例如四氢呋喃中还原。然后用适合的氧化试剂例如氧化锰(IV)在溶剂例如二氯甲烷中将醇氧化成醛。
当R4’是R4的前体时，将R4’转化成R4包括、但不限于反应例如还原氨基化以得到期望的新胺；将酯、酮或醛还原成醇，其可以进一步转化成烷氧基化合物或氨基甲酸酯；将腈还原成酰胺或胺；在适合条件下将酯转化成杂环例如噁二唑(更多实例，参见：Richard C.Larock，Comprehensive  Organic Transformations，第2版，第2章和第7章，John Wiley和SonsInc.，(1999))。
下列制备和实施例是用于合成本发明化合物的方法的示例。制备和实施例中示例的许多化合物的名称从使用‘Symyx Draw 3.1’或‘Autonom2000 Name’画出的结构中提供。
制备1：4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]
Figure BDA00001645704900101
将3-噻吩乙醇(123.03mL，1.11mol)加入到N-叔丁氧羰基-4-哌啶酮(185g，928.48mmol)在二氯甲烷(1300mL)中的溶液中，在室温搅拌。然后滴加三氟乙酸(280.82mL，3.71moles)(5min)，同时用冰/水浴冷却(内部温度＝14℃-30℃，注意：CO2放出)。将该反应混合物逐步温至环境温度，在该温度搅拌20hr。蒸发溶剂，真空冷却时得到浅褐色结晶固体。将该固体在甲基叔丁基醚(200mL)中搅拌成淤浆，过滤，用甲基叔丁基醚(2x1000mL)洗涤，真空干燥，得到4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-鎓三氟乙酸盐，为白色固体，95％收率。MS＝(m/z)：210(M+1)。将10M氢氧化钠(220.36mL，2.20mol)加入到搅拌的冷却的(冰/水浴)4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-鎓三氟乙酸盐(285g，881.44mmol)在二氯甲烷(1L)中的混悬液中，将得到的混合物搅拌至得到双相混合物。分离各相，用二氯甲烷(2x200mL)萃取水层。真空浓缩合并的有机层，得到浓稠油状物，其与水一起研磨，得到淡黄色沉淀。过滤沉淀，用(300mL)和己烷(200mL)洗涤，在35℃真空干燥20hr.，得到标题化合物，为淡黄色固体，86％收率。MS(m/z)：210(M+1)。
制备2：螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯
Figure BDA00001645704900111
将在2-甲基四氢呋喃(600mL)中的螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](60g，286.6mmol)在22℃搅拌10min。然后滴加在2-甲基四氢呋喃(300mL)中的叔丁氧基羰基叔丁基酯(65.6g，301mmol)。12hr后，加入氯化钠水溶液(250mL)，分离有机层。用2-甲基四氢呋喃(2x50mL)将水层洗涤2次，合并有机层，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物，99％收率。MS(m/z)：310(M+1)。
制备3：2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，2-c]吡喃-7，4’-哌啶]
Figure BDA00001645704900112
1.2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯
将2，2，6，6-四甲基哌啶(18.7mL，110.5mmol)加入到四氢呋喃(200mL)中，在-78℃在氮气气氛中冷却该溶液。加入2.5M丁基锂的己烷溶液(37.2mL，93mmol)，将该混合物在-78℃搅拌30min。在新鲜的2，2，6，6-四甲基哌啶锂溶液上加入螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯(20g，58.2mmol)在四氢呋喃(90mL)中的溶液，保持温度低于-70℃。20min.后，在-20℃在氮气气氛中通过套管加入预先冷却的N-氟苯磺酰胺(30.26g，93.07mmol)在四氢呋喃(200mL)中的溶液。1hr.搅拌后，加入水(20mL)和氯化铵水溶液(50mL)。然后分离有机层，用甲基叔丁基醚(2x25mL)将水层洗涤2次。合并有机层，减压蒸发溶剂。通过正相HPLC、使用己烷/甲基叔丁基醚作为溶剂纯化粗物质，得到2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯，50％收率。MS(m/z)：328(M+1)。
2.2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，2-c]吡喃-7，4’-哌啶]
在45℃将37％盐酸(11.75mL，125.22mmol)加入到2’-氟-4’，5’-二氢-1H-螺[哌啶-4，7’-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(8.2g，25.04mmol)在异丙醇(57.4mL)中的溶液中。将得到的溶液在45℃搅拌6.5hr。浓缩溶剂至黄色混悬液。加入水(50mL)，用5N氢氧化钠水溶液碱化该混合物。用乙酸乙酯(3x100mL)萃取水相，用盐水(50mL)洗涤合并的有机萃取物，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物，96％收率。MS(m/z)：228(M+1)。
制备4：2′-氯-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]盐酸盐
Figure BDA00001645704900121
将4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃](50g，238.88mmol)在乙酸(400mL)和甲基叔丁基醚(40mL)混合物中的溶液冷却至15℃。然后在该温度下在40min内滴加磺酰氯(21.20mL，262.77mmol)在乙酸(100mL)中的溶液(内部温度＝15℃-22℃)，将该混合物在室温搅拌20hr。然后在室温滴加磺酰氯(11.56mL，143.33mmol)在乙酸(50mL)中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌30min.，然后滴加(30min)在同时搅拌的用冰/水浴冷却的甲基叔丁基醚(1L)上。形成白色混悬液，过滤固体。为了得到第二批物质，浓缩滤液(通过旋转蒸发器再充甲基叔丁基醚)。将得到的固体混悬于甲基叔丁基醚(300mL)，回流搅拌混悬液(浴：100℃)，加入甲醇(30mL)，直到形成混浊混悬液。然后将该混悬液冷却至室温过夜。再用冰/水浴冷却该混悬液，过滤。用甲基叔丁基醚(50mL)洗涤固体，与第一批合并，得到标题化合物，60％收率。MS(m/z)：244(M+1)。
制备5：2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]
Figure BDA00001645704900131
1.2-氯螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4’-哌啶]-1’-甲酸叔丁酯
向2-氯螺[4，5-二氢噻吩并[2，2-c]吡喃-7，4’-哌啶]盐酸盐(140g，0.49moles)在二氯甲烷(1.12L)中的混悬液中分部分加入三乙胺(67.25mL，1.05mole)、4-吡啶胺、N，N-二甲基-(3.05g，0.025mole)和二叔丁基二碳酸酯(111.22g，0.509mole)，将得到的混合物在室温搅拌过夜。用1N HCl(2x)和水洗涤反应体系。用硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩，得到2-氯螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4’-哌啶]-1’-甲酸叔丁酯，53％收率。MS(m/z)：244(M+1-Boc)。
2.4′-氧代-2′-氯-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯
在5L加套反应器中，在rt下将N-溴琥珀酰亚胺(115.02g，639.77mmol)加入到2-氯螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4’-哌啶]-1’-甲酸叔丁酯(200g，581.61mmol)在氯苯(1.60L)中的溶液中。用几乎接触外部反应器壁的3X100w灯泡的灯等照射得到的混悬液，将反应器温度设定至45℃。4hr.后，加入N-溴琥珀酰亚胺(26.14g，145.40mmol)，将温度维持在40℃15hr.。将反应混合物冷却至0℃，加入甲基叔丁基醚(500mL)。过滤固体，将溶液浓缩至约1000mL氯苯溶液。然后加入甲基叔丁基醚(1000mL)，过滤固体，浓缩滤液，得到600mL的氯苯溶液。加入二甲亚砜(806.47mL，11.35mol)，在室温加入碳酸氢钠(95.38g，1.14mol)。在室温搅拌24hr.后，加入冰/水(1000mL)，分离各相。用水(2x1L)洗涤有机相，浓缩，得到氯苯的溶液。然后加入二氯甲烷(1.2L)，将该混合物冷却至5℃(冰/水浴)。加入溴化钾(20.27g，170.31mmol)和2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧化物(4.43g，28.38mmol)。然后在5℃将用碳酸氢钠调整至pH＝9的6％次氯酸钠水溶液(644.40mL，567.68mmol)加入到反应混合物中，将得到的混合物在5℃-室温搅拌1hr.。加入水(1L)，分离各相。用水(2x0.5L)洗涤有机相，用冰/水浴冷却。然后在5℃溴化钾(2.03g，17.03mmol)、2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧化物(0.05g，0.32mmoles)和将用碳酸氢钠固体调整至pH＝9的6％次氯酸钠水溶液(128.88mL，113.54mmol)加入到反应混合物中，将得到的混合物在5℃-室温搅拌1h。然后加入水(1L)，分离各相。用水(2x1L)洗涤有机相，干燥，浓缩，得到深棕色固体。
将固体与己烷(500mL)、甲基叔丁基醚/己烷5％(250mL)和甲基叔丁基醚/己烷10％(250mL)一起研磨，得到4′-氧代-2′-氯-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯，为浅棕色固体，66％收率。MS(m/z)：258(M+1(Boc))。
3.2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯
在加入了四氢呋喃(81mL)的500mL PFA烧瓶中加入三氟化(双(2-甲氧基乙基)氨基)硫(183.62g，829.94mmol)和4′-氧代-2′-氯-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(135g，377.24mmol)。将得到的混悬液在70℃搅拌24h。然后将其冷却至室温，在搅拌下缓慢倾倒在冰与饱和碳酸氢钠水溶液(4L)的混合物上(气体放出)。甲基叔丁基醚用于从烧瓶中转移其余物质。在气体放出停止后，在搅拌下加入固体碳酸氢钠至达到pH8。用甲基叔丁基醚(3x500mL)萃取得到的混合物，直到通过TLC在水相中未检测到产物为止。用水(3x500mL)和盐水(500mL)洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥，浓缩，得到深色浓稠油状物(250g)。将粗物质溶于二氯甲烷，通过硅胶垫过滤，用甲基叔丁基醚/己烷10％(6L)和甲基叔丁基醚/己烷(4L)洗脱。收集级分，直到通过TLC(20％甲基叔丁基醚/己烷UV，Rf＝0.5)未检测到产物为止。浓缩滤液，得到浅棕色固体，在40℃真空干燥至恒重，得到70％收率的2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯。MS(m/z)：324(M+1tBu)。
4.2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]
在45℃将37％盐酸(74.12mL，789.78mmol)加入到2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(60g，157.96mmol)在异丙醇(420mL)中的溶液中。将得到的溶液在45℃搅拌15h。然后将该混合物浓缩至1/4体积，得到白色混悬液。加入水(100mL)，用6N氢氧化钠水溶液碱化该混悬液，得到双层混合物，用甲基叔丁基醚(3x100mL)萃取。用盐水(50mL)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，浓缩，得到浅棕色固体，真空干燥至恒重，得到97％的标题化合物。MS(m/z)：280(M+1)。
制备6：2，4，4-三氟螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
Figure BDA00001645704900151
1.2-溴-4-羟基-螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯
将N-溴琥珀酰亚胺(2.2当量)加入到螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯(13.5g)在氯苯(108mL)中的溶液中。用260w灯泡的灯将得到的混悬液照射过夜。再将N-溴琥珀酰亚胺(1.7g)加入到该混合物中，用260w灯泡的灯将该混合物照射3小时。减压除去溶剂，得到残余物，溶于丙酮(650mL)，加入硝酸银(8.8g)的水(650mL)溶液。将该混合物在室温在暗处搅拌过夜。过滤出该混合物，蒸发丙酮，加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤有机层。用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化残余物(洗脱剂：己烷/乙酸乙酯15-60％)，得到叔丁基-2-溴-4-羟基-螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸酯，38％收率。MS(m/z)：426/428(M+23/M+2+23)。
2.2′-溴-4′-氢代-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯
在0℃将溴化钾(535.67mg，4.50mmol)加入到2-溴-4-羟基-螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-环己烷]-1′-甲酸叔丁酯(7.28g)和2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧化物(281.33mg，1.80mmol，)在二氯甲烷(70mL)中的溶液中。在另一个容器中，将碳酸氢钠加入到10％次氯酸钠水溶液(22.34mL，36.01mmol)中至pH9。在0℃滴加这种次氯酸钠-碳酸氢钠溶液，将得到的深色混悬液在0℃搅拌15min。加入二氯甲烷(20mL)和水(20mL)，分离各相。用水(20mL)洗涤有机相，用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，得到2′-溴-4′-氧代-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯，99％收率。MS(m/z)：346/348(M+1tBu/M+3-tBu)。
3.2-溴-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯
在100mL perfluoroalcoxy-烧瓶中将三氟化(双(2-甲氧基乙基)氨基)硫(5.16mL，27.96mmol)加入到干四氢呋喃(3.5mL)中。然后加入2′-溴-4′-氧代-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(4.5g，11.19mmol)。将该溶液在70℃搅拌过夜。此时加入甲基叔丁基醚(30mL)，将该反应混合物谨慎倾倒在用冰浴冷却的碳酸氢钠(饱和水溶液)上。观察到CO2放出，加入碳酸氢钠(饱和水溶液)至pH8。用甲基叔丁基醚萃取该混合物。滗析有机层，用盐水(2x)洗涤，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，用甲基叔丁基醚/己烷洗脱，得到3.2g的2-溴-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯。MS(m/z)：368/370(M+1-tBu/M+3-tBu)。
4.2，4，4-三氟螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯
在氮气气氛中、在-78℃将2.5M丁基锂的己烷(47mL)溶液加入到2-溴-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯(1.99g，4.69mmol)在四氢呋喃(50mL)中的溶液上。将该混合物在-78℃搅拌1小时，加入固体N-氟-苯磺酰胺(3.69g，11.73mmol)。将该混合物温至室温，在室温搅拌过夜。加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取水相，用硫酸钠干燥，减压除去溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗物质(己烷/乙酸乙酯3-12％)，得到1.3g的2，4，4-三氟螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯，再通过HPLC纯化，得到0.818g该化合物。MS(m/z)：308(M+1-tBu)。
5.2，4，4-二氟螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
将2，4，4-三氟螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯(2.00g，5.50mmol)溶于盐酸(4N二噁烷溶液)(10mL，40mmol)。将该混合物在室温搅拌1h，然后通过50g SCX柱(固体阳离子交换)，蒸发2N氨的甲醇级分溶液后得到1.3g标题化合物。MS(m/z)：264(M+1)。
制备7：2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
向2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶(105g，375mmol)在四氢呋喃(1.58L)中的溶液中加入3-甲基-1H-吡唑-4-醛(43.40g，394.12mmol)，将该混合物在室温搅拌1hr。然后分3部分加入粉状三乙酰氧基硼氢化钠(95.46g，450.42mmol)。将该混合物在室温搅拌15h。然后将该反应混合物倾倒在冰-碳酸氢钠饱和水溶液(400mL)上。分离各相，用乙酸乙酯(100mL)萃取水相。用50％盐水洗涤合并的有机层，固体沉淀在有机相中。浓缩有机相，得到170g的标题化合物。MS(m/z)：374(M+1)。
基本上如制备7中所述使用1，2-二氯乙烷作为溶剂制备制备8-11的化合物。
Figure BDA00001645704900181
制备12：2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛
Figure BDA00001645704900191
向250mL烧瓶中加入碘zx化亚铜(I)(1.91g，10.03mmol)、2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](25g，66.87mmol)、碳酸钾(19.60g，140.43mmol)、甲苯(50mL)和搅棒。通过5个真空/再填充循环给该反应混合物脱气。然后加入2-溴-3-甲酰基吡啶(18.66g，100.31mmol)和反式-N，N’-二甲基环己烷-1，2-二胺(3.16mL，20.06mmol)。将该反应体系在室温搅拌5分钟。然后将其浸入在115℃预加热的油浴，在该温度搅拌15h。将反应混合物冷却至室温，用300mL乙酸乙酯稀释，通过硅藻土过滤。用乙酸乙酯(100mL)和氢氧化铵水溶液(3％)(4x100mL)洗涤，以除去痕量铜，然后用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。用硫酸钠干燥溶液。真空蒸发溶剂，得到黄褐色固体。使固体通过硅胶垫过滤，使用2-丙醇/二氯甲烷(3％-5％的2-丙醇)作为洗脱剂，得到标题化合物，69％收率。MS(m/z)：479(M+1)。
制备13：2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛
Figure BDA00001645704900192
基本上如制备12中所述、通过使用2-溴吡啶-3-醛和2-氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]制备制备13的化合物。通过正相Isco色谱法纯化残余物，得到83％的标题化合物。MS(m/z)：427(M+1)。
制备14：N-[(2-氯-3-吡啶基)甲基]乙酰胺
Figure BDA00001645704900201
在室温向(2-氯-3-吡啶基)甲胺(300mg，2.10mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入乙酐(198.88μL，2.10mmol)和三乙胺(293.26μL，2.10mmol)。1h后，用饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止，用二氯甲烷萃取。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂，得到184mg的N-[(2-氯-3-吡啶基)甲基]乙酰胺。MS(m/z)：185(M+1)。
制备15：甲磺酸(2-溴-3-吡啶基)甲酯
1.(2-溴-3-吡啶基)甲醇
向包含2-溴-3-吡啶-甲醛(22.15g，119.08mmol)和甲醇(200mL)的2L圆底烧瓶(安装搅棒、在氮气气氛中、在0℃)中分3部分加入硼氢化钠(1.35g，35.72mmol)。在0℃1h后加入水(200mL)，减压浓缩反应体系，以除去甲醇。将得到的残余物溶于乙酸乙酯，用水(200mL)洗涤。用盐水洗涤有机萃取物，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到22g的(2-溴-3-吡啶基)甲醇，为白色固体。MS(m/z)：188(M+1)，190(M+3)。
2.甲磺酸(2-溴-3-吡啶基)甲酯
在0℃将三乙胺(8.90mL)加入到包含(2-溴吡啶-3-基)甲醇(8g，42.55mmol)在二氯甲烷(212mL)中的溶液的圆底烧瓶中，然后加入甲磺酰氯(3.95mL)，将该混合物在该温度下搅拌1.5h。此后用水洗涤该混合物，滗析有机层，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，得到10.4g标题化合物，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：266，268(M+1；M+3)。
制备16：2-(2-溴-3-吡啶基)丙-2-醇
Figure BDA00001645704900211
将二异丙基酰胺锂(2M，12.5mL，25mmol)溶于四氢呋喃(40mL)，冷却至-78℃。滴加2-溴吡啶(3.9g，25mmol)，将该反应体系搅拌3hr，然后加入丙酮(1mL，用新鲜活化的分子筛干燥)，温至室温。用饱和氯化铵使反应停止，用乙酸乙酯萃取。用硫酸镁干燥，蒸发。通过硅胶快速柱色谱法纯化残余物，用20％己烷/叔丁基甲基醚洗脱，得到标题化合物(1.4g，26％)。1H-NMR(d6-二甲亚砜)：8.23(dd，J＝1.9，4.5Hz，1H)，8.19(dd，J＝2.0，7.8Hz，1H)，7.44(dd，J＝4.5，7.7Hz，1H)，5.43(s，1H)，2.12(s，1H)，1.46(s，6H)。
制备17：3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
Figure BDA00001645704900212
将硫酸(18mL，337.69mmol)加入到1H-吡唑-4-甲酸，3-甲基-(10g，79.29mmol)在乙醇(90mL)中的混悬液中，将该混合物在85℃搅拌20h。此后，部分除去溶剂。用1M氢氧化钠溶液将残余物碱化至pH 6-7，用二氯甲烷萃取。滗析有机层，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，得到10.3g标题化合物，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：155(M+1)。
制备18：2-氟吡啶-3-甲酸甲酯
Figure BDA00001645704900221
在-78℃在氮气气氛中将2M二异丙基氨基锂(11.3mL，22.5mmol)缓慢加入到2-氟吡啶(2g，20.5mmol)在四氢呋喃(90mL)中的溶液中。在该温度4h后，加入氯甲酸甲酯(1.9mL，24.6mmol)，将该混合物在-78℃再搅拌1小时，使其达到室温过夜。将反应混合物缓慢倾倒在水上，用乙醚萃取。用盐水洗涤有机层，用硫酸钠干燥，真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化残余物，用己烷/乙醚(9/1)洗涤，得到495.2mg的标题化合物。MS(m/z)：156(M+1)。
制备19：1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛
将叔丁醇钾(29.25g，260.68mmol)加入到用水浴冷却的3-甲基-1H-吡唑-4-醛(26.00g，236.12mmol)在二甲基甲酰胺(250mL)中的溶液中。将该混合物在室温搅拌10min。然后加入2，3-二氟吡啶(25g，217.24mmol)，将该混合物在室温搅拌20hr。将该混合物倾倒在冰/水混合物上，用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。用硫酸镁干燥有机层，真空蒸发溶剂、通过硅胶色谱法纯化残余物，用己烷/异丙醇洗脱，得到含有残留二甲基甲酰胺的粗物质。然后将该物质溶于乙酸乙酯(100mL)，用水(3x20mL)洗涤。用乙酸乙酯(2x20mL)萃取水相。用硫酸钠干燥合并的有机相，浓缩，得到19g的标题化合物。MS(m/z)：206(M+1)。
制备20：2-(4-甲酰基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-腈
Figure BDA00001645704900231
基本上如制备19中所述，通过使用3-甲基-1H-吡唑-4-醛和2-氟吡啶-3-腈制备制备20的化合物。得到标题化合物，收率为23％。MS(m/z)：213(M+1)。
制备21：2-(4-甲酰基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-甲酸甲酯
Figure BDA00001645704900232
将3-甲基-1H-吡唑-4-醛(300mg，2.72mmol)、碳酸钾(565mg，4.08mmol)、2-氟吡啶-3-甲酸甲酯(507mg，3.27mmol)和二甲基甲酰胺(2mL)中的混合物在60℃搅拌16h。加入水，用乙酸乙酯萃取该化合物。用盐水洗涤有机层，用硫酸钠干燥，蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗混合物，使用己烷∶乙酸乙酯2∶1作为洗脱剂，得到422mg的标题化合物。MS(m/z)：246(M+1)。
可以基本上如制备21中所述、使用相应2-氯吡啶基试剂制备制备22-23的化合物。
Figure BDA00001645704900241
制备24：1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900242
1.1-[3-(二甲氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
基本上如制备7中所述、通过使用1-(3-甲酰基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯和二甲胺制备该化合物，95％收率，后处理后不经进一步纯化使用。MS(m/z)：289(M+1)。
2.[1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇
向冷却至0℃和在氮气气氛中的1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(217.7g，0.75mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液中加入1M氢化铝锂的四氢呋喃(0.9mL，0.9mmol)溶液，将该混合物在该温度下搅拌5分钟。用饱和氯化铵水溶液使反应停止，用乙酸乙酯萃取粗产物。分离有机层，用硫酸钠干燥，真空蒸发溶剂。在该具体实施例中，不分离有机萃取中的化合物，最终用SCX柱从水溶液中分离，得到146mg(78％)的[1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：247(M+1)。
3.1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛
在室温将3，3，3-三乙酰氧基-3-碘四氯苯酞(0.553g，1.3mmol)加入到[1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇(0.146g，0.59mmol)在二氯甲烷(4mL)中的溶液中。1小时后，通过添加2N碳酸钠溶液使反应停止，用二氯甲烷萃取化合物。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂，得到126mg的1-[3-(二甲基氨基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：245(M+1)。
制备25：1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900251
1.3-(溴甲基)-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-4-甲酸乙酯
在室温向1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(10.2g，40.9mmol)在氯苯(205mL)中的溶液中加入N-溴琥珀酰亚胺(8g)。搅拌该反应混合物，在室温用100W灯照射过夜。然后再加入N-溴琥珀酰亚胺(2g)，2hr.后，未检测倒原料。过滤固体，蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，得到5.3g的3-(溴甲基)-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：328；330(M+1；M+3)。
2.1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-甲酸异丙酯
向3-(溴甲基)-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-4-甲酸乙酯(1.5g，4.57mmol)在丙-2-醇(23mL)中的溶液中加入异丙醇锂(3.02g)，将该混合物在室温搅拌过夜。此后再分3部分每隔16小时加入异丙醇锂(4.5g)，每次1.5g。最后一次添加后，最终将该反应混合物在40℃搅拌16小时。蒸发溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，用盐水洗涤。滗析有机层，用硫酸钠干燥。蒸发溶剂，通过正相Isco色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，得到317mg的1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-甲酸异丙酯。MS(m/z)：322(M+1)。
3.[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇
向在氮气气氛中和冷却至0℃的1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-甲酸异丙酯(316mg，0.98mmol)在乙醚(4.9mL)中的溶液中加入1M氢化铝锂的四氢呋喃溶液(1.2mL)。将该混合物在0℃搅拌1小时。加入水(46μL)，搅拌5min，然后依次加入15％NaOH水溶液(46μL)和水(138μL)。过滤固体，蒸发溶剂，得到241mg的[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：266(M+1)。
4.1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-醛
将[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇(241mg；0.91mmol)和氧化锰(IV)(791mg)的混合物在室温在二氯甲烷(5mL)中搅拌过夜。此后，用硅藻土过滤该反应混合物，蒸发溶剂，得到197mg的标题化合物，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：264(M+1)。
制备26：1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900261
1.1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯
向3-溴甲基-1-(3-氟-吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.13g，3.44mmol)在丙酮(23mL)中的溶液中加入碘化钾(200.1mg)、碳酸钾(865.33mg)和甲醇(4.18mL)。将该混合物在室温搅拌48小时。检测期望化合物的甲酯和乙酯。蒸发溶剂，用二氯甲烷稀释残余物，用水洗涤。滗析有机层，用硫酸镁干燥，蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用乙酸乙酯和己烷作为洗脱剂，得到599mg的甲酯和乙酯的混合物。MS(m/z)：266(M+1)和280(M+1)。
2.[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇
基本上如制备25步骤3(还原步骤)中所述制备该化合物，并且使用1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯(在还包含甲酯的混合物中)作为原料，93％收率。不经进一步纯化使用[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇。MS(m/z)：238(M+1)。
3.1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-醛
基本上如制备25步骤4(氧化步骤)中所述制备该化合物，并且使用[1-(3-氟-吡啶-2-基)-3-甲氧基甲基-1H-吡唑-4-基]-甲醇作为原料，91％收率。不经进一步纯化使用标题化合物。MS(m/z)：236(M+1)。
制备27：3-甲基-1-(3-吗啉代-2-吡啶基)吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900271
将1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛(230mg，1.12mmol)和吗啉(2mL，22.93mmol)的混合物微波照射加热(温度160℃，跃升时间：2min，保持时间：10min，功率：250W)。真空除去过量的吗啉。用二氯甲烷稀释残余物，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化残余物，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂(50-100％的乙酸乙酯溶液)，得到72％的标题化合物。MS(m/z)：273(M+1)。
制备28：2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶
Figure BDA00001645704900281
在0℃在氮气气氛中向(2-溴吡啶-3-基)甲醇(20g，106.37mmoles)在140mL四氢呋喃中的溶液中加入60％氢化钠的矿物油溶液(6.38g，155.5mmol)。将溶液在0℃搅拌30分钟。将碘甲烷(7.95mL，127.6mmol)加入到该溶液上，将该混合物在室温搅拌过夜。通过添加水使该混合物猝灭，用乙酸乙酯萃取粗产物。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂，得到2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶，98％收率，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：202(M+1)，204(M+3)。
基本上如制备28中所述、使用相应的烷基碘试剂制备制备29-30的化合物。
Figure BDA00001645704900282
制备31：2-溴-3-(异丙氧基甲基)-吡啶
Figure BDA00001645704900292
1.2-溴-3-(溴甲基)-吡啶
向25mL Schlenk烧瓶中加入2-溴-3-吡啶苄醇(1g，5.32mmol)和二氯甲烷(15mL)。用盐-水/冰浴将得到的溶液冷却至0℃，同时进行剧烈磁搅拌。然后滴加三溴化磷(0.55mL，5.80mmol)以控制放热低于10℃。得到浓稠淤浆，添加后，除去浴，将该淤浆温至室温。然后逐步加热回流3h，然后达到室温过夜。
向预先在0℃冷却的该混合物中加入冰-水，然后通过加入2M碳酸钠溶液将pH调整至碱性。分离有机层，用二氯甲烷(2x10mL)将水溶液洗涤2次。合并全部有机层，用硫酸镁干燥，过滤，减压蒸发溶剂，得到1.2g的2-溴-3-溴甲基-吡啶，不经进一步纯化使用。
2.2-溴-3-(异丙氧基甲基)-吡啶
在0℃向异丙醇(7.31mL，95.65mmol)在二甲基甲酰胺(50mL)中的溶液中加入氢化钠(3.63g，90.87mmol)，将该混合物在室温搅拌30分钟(该反应使用防护罩作为专用保护进行)。然后通过注射器加入2-溴-3-溴甲基-吡啶(6g，23.91mmol)的10mL二甲基甲酰胺溶液，将该混合物在室温搅拌1h。加入水，用乙酸乙酯萃取该混合物，用盐水和水洗涤。用硫酸镁干燥，过滤，减压蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗物质，使用乙酸乙酯和己烷作为洗脱剂(梯度5-25％乙酸乙酯)，得到3.67g的标题化合物。MS(m/z)：230，232(M+1，M+3)。
制备32：2-(2-溴-3-吡啶基)乙腈
Figure BDA00001645704900301
搅拌2-溴-3-溴甲基-吡啶(840mg，3.35mmol)和氰化钠(187.99mg，3.68mmol)的混合物，在水(10mL)-乙醇(2mL)的混合物中回流1h。用二氯甲烷稀释该反应混合物，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂，得到83％标题化合物，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：197(M+1)，199(M+3)。
制备33：1-[3-(环丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛
1.1-[3-(羟基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
向1-(3-甲酰基-吡啶-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1g，3.9mmol)在甲醇(25mL)中的溶液中加入硼氢化钠(220.2mg，5.8mmol)。将该混合物在室温搅拌2hr。除去溶剂，将粗产物溶于乙酸乙酯，用饱和氯化铵水溶液洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发溶剂，得到1g的1-[3-(羟基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：262(M+1)。
2.3-甲基-1-[3-(乙酰氧基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-甲酸乙酯
将三氟乙酸钯(II)(5.1mg，15.3μmoles)和4，7-二苯基-菲咯啉(5.1mg，15.3μmoles)溶于正丁基乙烯基醚(6.1mL，61.2mmol)，加入1-(3-羟基甲基-吡啶-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(800mg，3.1mmol)和几滴三乙胺。密封烧瓶，在75℃搅拌24小时。然后将混合物冷却至24℃，通过硅藻土垫过滤。减压除去溶剂，通过正相Isco色谱法纯化残余物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱剂(5-20％的乙酸乙酯溶液)，得到605mg的3-甲基-1-[3-(乙烯基氧基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：288(M+1)。
3.1-[3-(环丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
在氮气气氛中将1.0M二乙基锌的己烷(365.7μL，3.5mmol)溶液加入到二氯甲烷(0.9mL)中。将该溶液冷却至0℃，极为缓慢地加入三氟乙酸(268.4μL，3.5mmol)在二氯甲烷(0.9mL)中的溶液。20min后，加入二碘甲烷(286.1μL，3.5mmol)在二氯甲烷(0.9mL)中的溶液。再过20min后，加入3-甲基-1-(3-乙烯基氧基甲基-吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(510mg，1.8mmol)在二氯甲烷(0.9mL)中的溶液。将该混合物在室温搅拌过夜。加入5％HCl，用乙酸乙酯萃取水层。分离有机层，用硫酸钠干燥，减压除去溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱剂(5-20％的乙酸乙酯溶液)，得到310mg的1-[3-(环丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：302(M+1)。
4.1-[3-(环丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛
在0℃在氮气气氛中向1-(3-环丙氧基甲基-吡啶-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(410mg，1.03mmol)在四氢呋喃(0.15M)中的溶液中加入1.0M氢化铝锂的四氢呋喃溶液(1.2当量)。将该混合物在室温搅拌1h，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取水层。分离有机层，用硫酸钠干燥，减压除去溶剂。将粗物质溶于二氯甲烷(14mL)，加入氧化锰(IV)(1.2g，13.9mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后通过硅藻土垫过滤，减压蒸发溶剂。使粗产物通过硅胶垫(洗脱剂：乙酸乙酯和二氯甲烷)。减压除去溶剂，得到90mg的标题产物。MS(m/z)：258(M+1)。
制备34：1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900321
1.1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
基本上如制备12中所述通过使用3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯和2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶制备该化合物，83％收率。MS(m/z)：276(M+1)。
2.[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇
基本上如制备24(步骤2)中所述通过使用1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯制备该化合物，88％收率。MS(m/z)：234(M+1)。
3.1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-醛
将[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇(2.2g，9.4mmol)和氧化锰(IV)(19g，188.8mmol)的混合物在二氯甲烷(20mL)中在室温搅拌过夜。用硅藻土过滤该反应混合物，减压蒸发溶剂，得到1.8g标题化合物，不经进一步纯化使用。MS(m/z)：232(M+1)。
制备35：2-溴-3-(咪唑-1-基甲基)吡啶
Figure BDA00001645704900322
在室温向甲磺酸(2-溴-3-吡啶基)甲酯(2.5g，9.39mmol)在乙醇(46.97mL)中的溶液中加入碳酸钾(2.62g)和1H-咪唑(1.31g)。将该混合物在50℃搅拌。形成稍显浓稠的乳剂，加入10mL乙醇，将这类乳剂在50℃搅拌过夜。加入水至全部固体溶解。然后减压浓缩，用乙酸乙酯稀释残余物，用碳酸氢钠(饱和水溶液)洗涤。滗析有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗物质，使用二氯甲烷和甲醇(98/2-90/10)作为洗脱剂，得到1.42g的标题化合物。MS(m/z)：238，240(M+1，M+3)。
基本上如制备35中所述，由相应的氮化杂环制备制备36-40的化合物。
Figure BDA00001645704900331
a)在同一反应中得到两种化合物。
制备41：2-[(2-溴-3-吡啶基)氧基]乙酰胺
Figure BDA00001645704900341
在0℃向2-溴-3-吡啶醇(1.5g，8.49mmol)在四氢呋喃(15mL)中的溶液中加入60％氢化钠的矿物油溶液(509.44mg，12.74mmol)。将该混合物在该温度下搅拌30min。然后加入乙酰胺，2-氯-(16.98mmol)，将该混合物在室温搅拌1周以上。用水使该混合物猝灭，用乙酸乙酯萃取，分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂，得到标题化合物，75％收率。将该化合物不经任何进一步纯化使用。MS(m/z)：231(M+1)，233(M+3)。
制备42：2-溴-3-(环丙基甲氧基)吡啶
Figure BDA00001645704900342
在0℃向2-溴-3-吡啶醇(500mg，2.83mmol；)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中加入60％氢化钠的矿物油(169.81mg，4.25mmol)溶液。将该混合物在该温度下搅拌15min，加入溴甲基环丙烷(329.66μL，3.40mmol)。然后将该反应体系在室温搅拌1h，用水猝灭，用乙酸乙酯萃取，分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂。使粗产物通过短硅胶垫，用二氯甲烷洗脱化合物，得到23％的标题化合物。MS(m/z)：228(M+1)，230(M+3)。
制备43：1-(3-氟-2-吡啶基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯
Figure BDA00001645704900343
1.4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
给100mL圆底烧瓶中加入氨基脲盐酸盐(2g，17.93mmol)、丙酮酸乙酯(11.8mL)和乙醇钠(2.97g)。然后加入水(9mL)。将该混合物在室温搅拌90分钟，然后过滤，再用水洗涤固体。真空烘箱(40℃)干燥白色固体过夜。得到2.66g纯的乙基-2-(氨基甲酰基亚肼基)-丙酸酯。
在0℃将磷酰氯(3.28mL)滴加到二甲基甲酰胺(7.13mL)中。除去冷却浴以达到室温。然后将该混合物加热至40℃，在15-20min内分几部分加入预先得到的乙基-2-(氨基甲酰基亚肼基)丙酸酯(2.66g，15.36mmol)(在添加过程中有气体放出)。当内部温度是55℃时，除去加热浴，由此将内部温度维持在60-70℃。然后将该混合物加热至80℃。一旦反应体系稳定在80℃，则几乎不再观察到气体放出。将得到的混悬液在80℃搅拌2h。将反应混合物倾倒在冰/水(30mL)混合物上，搅拌得到混悬液。滴加50％的氢氧化钠溶液至达到pH10。将该溶液在50℃搅拌5min。然后用冰/水浴冷却溶液，加入35％的盐酸水溶液至pH7。用乙酸乙酯萃取该混合物。滗析有机层，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。将残余物与己烷和几滴二氯甲烷一起研磨，得到1.6g的4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯，不经进一步纯化用于下一步。MS(m/z)：169(M+1)。
2.1-(3-氟-2-吡啶基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯
加热4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(1.6g，9.52mmol)、2，3-二氟吡啶(1.20g)和碳酸钾(1.97g)在二甲基甲酰胺(8mL)中的混合物，在100℃搅拌1.5h。然后将该反应混合物在室温搅拌过夜。加入水，用乙酸乙酯萃取有机相，滗析，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过使用乙酸乙酯和己烷的正相Isco色谱法纯化粗产物，得到711mg的标题化合物。MS(m/z)：264(M+1)。
制备44：3-甲基-1-(3-(四氢呋喃-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900361
1.3-(2，5-二氢呋喃-2-基)-2-氟吡啶
在氮气气氛中向包含在干二甲基甲酰胺(1.8mL)中的乙酸钾(440mg，4.5mmol)、溴化四丁基铵(1.4g，4.5mmol)和4A分子筛的螺口试管中加入2-氟-3-碘吡啶(400mg，1.8mmol)、2，3-二氢呋喃(1.4mL，18mmol)和乙酸钯(20mg，0.09mmol)。快速密封反应试管，在室温搅拌过夜。用乙醚稀释该混合物，用硅藻土过滤该混合物。用水洗涤滤液，用硫酸镁干燥，过滤，真空蒸发溶剂。通过使用正相Isco色谱法的硅胶纯化得到的残余物，用己烷：丙酮(梯度5-30％的丙酮溶液)洗脱，得到170mg的3-(2，5-二氢呋喃-2-基)-2-氟吡啶。MS(m/z)：166(M+1)。
2.2-氟-3-(四氢呋喃-2-基)吡啶
在真空中将包含3-(2，5-二氢呋喃-2-基)-2-氟吡啶(170mg，1mmol)和10％Pd/C的甲醇溶液(3.1mL)的圆底烧瓶抽真空，借助于气囊充氢气。将该反应体系在室温搅拌过夜，用硅藻土过滤。真空蒸发溶剂，得到148mg的2-氟-3-(四氢呋喃-2-基)吡啶。MS(m/z)：168(M+1)。
3.3-甲基-1-(3-(四氢呋喃-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-醛
向包含在二甲基甲酰胺(2.2mL)中的2-氟-3-(四氢呋喃-2-基)吡啶(148mg，0.88mmol)的螺口试管中加入3-甲基-1H-吡唑-4-醛(81mg，0.74mmol)和碳酸钾(152mg，1.1mmol)。快速密封反应试管(注意：有可能提高压力；使用防护罩)，在预热的油浴中在110℃借助于磁搅拌器搅拌18h。用水稀释该混合物，用乙酸乙酯萃取。分离有机层，用硫酸镁干燥，过滤，真空蒸发溶剂。通过使用正相Isco色谱法的硅胶纯化得到的残余物，用己烷：丙酮(梯度5-20％的丙酮溶液)洗脱，得到116mg的标题化合物。MS(m/z)：258(M+1)。
制备45：3-(2-溴-吡啶-3-基)异噁唑
Figure BDA00001645704900371
1.2-溴吡啶-3-醛肟
向2-溴吡啶-3-醛(2.04g)在乙醇(25mL)中的溶液中加入羟基胺盐酸盐(948mg，13.16mmol)和乙醇钠(1.09g，13.16mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。减压蒸发溶剂，使残余物分配在二氯甲烷与水之间。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，真空蒸发溶剂，得到2g的2-溴吡啶-3-醛肟。MS(m/z)：201/203(M+1/M+3)。
2.[3-(2-溴-3-吡啶基)异噁唑-5-基]-三甲基-硅烷
在0℃向搅拌的2-溴吡啶-3-醛肟(400mg，1.99mmol)在二氯甲烷(3.98mL)中的混悬液中加入吡啶(201.13μl，2.49mmol)，然后分部分加入N-氯琥珀酰亚胺(337.19mg，2.49mmol)，然后加入三甲基甲硅烷基)乙炔(350.60μl，2.49mmol)，然后加入三乙胺(346.68μL，2.49mmol)。将该混合物在0℃-室温搅拌。2小时后，再加入吡啶(321.81μL，3.98mmol)和N-氯琥珀酰亚胺(539.51mg，3.98mmol)，将该混合物在室温搅拌16小时。然后用饱和氯化铵溶液使该反应混合物猝灭。分离各层，用硫酸镁干燥有机层，过滤，减压浓缩，得到[3-(2-溴-3-吡啶基)异噁唑-5-基]-三甲基-硅烷，为定量收率。MS(m/z)：297/299(M+1/M+3)。
3.3-(2-溴-3-吡啶基)异噁唑
向[3-(2-溴-3-吡啶基)异噁唑-5-基]-三甲基-硅烷(620mg，2.09mmol)在甲醇(18mL)中的溶液中一次性加入碳酸钾(29.12mg，208.59μmoles)。将该混合物在室温搅拌24h。真空除去溶剂。使粗产物分配在乙酸乙酯与饱和氯化铵溶液之间。用水相洗涤有机层，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用己烷/乙酸乙酯66/33-50/50作为洗脱剂，得到140mg的标题化合物，为白色固体。MS(m/z)：225/227(M+1/M+3)。
制备46：1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900381
在室温向3-甲基-吡唑-4-醛(0.5g，4.5mmol)在干燥二甲基甲酰胺(15mL)中的溶液中加入碳酸钾(2.5g，18mmol)。将该反应混合物在40℃搅拌30min，然后加入1-氟-2-氯吡啶(0.77g，6mmol)。将该反应混合物在70℃加热16h。完成后，将该反应混合物冷却至室温，用水稀释，然后用乙酸乙酯萃取。用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗品混合物，用己烷/乙酸乙酯(75∶25，65∶35)洗脱，得到0.525g(52％)的标题化合物。MS(m/z)：222(M+1)。
制备47：1-(3-环丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛
Figure BDA00001645704900382
1.1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
在室温向3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(2.0g，13mmol)在干燥二甲基甲酰胺(30mL)中的溶液中加入碳酸钾(7.2g，52mmol)。将该反应混合物在40℃搅拌30min，然后加入1-氟-2-溴吡啶(3.0g，17mmol)。将该反应混合物在70℃搅拌4h。将该反应混合物冷却至室温，用水稀释，然后用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗混合物，用己烷/乙酸乙酯(85∶15，80∶20)洗脱，得到3.2g(79％)的1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：312(M+3)，310(M+1)。
2.1-(3-环丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
用氮气给1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(1.5g，5.5mmol)、磷酸钾(4.0g，19.2mmol)、环丙基硼酸(0.7g，8.2mmol)和甲苯/水(2∶1，15mL)的混合物脱气，加入三环己基磷杂环戊二烯(0.153g，0.54mmol)和乙酸钯(0.061g，0.27mmol)。用氮气给该混合物脱气，密封反应容器，在100℃加热16h。浓缩该反应混合物，用水稀释，用乙酸乙酯萃取。用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗混合物，用己烷/乙酸乙酯(85∶15)洗脱，得到1.6g(93％)的1-(3-环丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：272(M+1)。
3.[1-(3-环丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-基]-甲醇
在氮气气氛中在-78℃向搅拌的氢化铝锂(0.44g，11.7mmol)在干四氢呋喃(25mL)中的混悬液中加入1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(1.6g，5.8mmol)在干四氢呋喃(5mL)中的溶液。添加完成后，将该反应混合物温至室温，然后搅拌过夜。用1N氢氧化钠使该反应混合物猝灭，然后通过硅藻土过滤。分离有机层，用乙酸乙酯萃取水层。用水和盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到1.1g(84％)的[1-(3-环丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-基]-甲醇。MS(m/z)：230(M+1)。
4.1-(3-环丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛
在氮气气氛中向[1-(3-环丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-基]-甲醇(1.1g，5.0mmol)在干二氯甲烷(15mL)中的溶液中加入氯甲酸(chlorocromate)吡啶鎓(1.2g，5.5mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2h，然后通过硅藻土过滤。减压浓缩滤液。用硅胶纯化粗混合物，用己烷/乙酸乙酯(90∶10，80∶20)洗脱，得到0.2g(20％)的标题化合物。MS(m/z)：228(M+1)。
制备48：4-[(2-溴-3-吡啶基)甲基]吗啉-3-酮
Figure BDA00001645704900401
在0℃向2-溴-3-溴甲基-吡啶(0.68g，2.36mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中加入氢化钠(0.11g，60％混悬液，2.82mmol)、吗啉-3-酮(0.20g，1.97mmol)和碘化四丁基铵(催化剂)。将该混合物在室温搅拌16小时。完成后，使该反应混合物分配在乙酸乙酯(25mL)与水(25mL)之间。用乙酸乙酯(2x25mL)萃取水层，用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩，通过硅胶柱色谱法纯化粗物质，用己烷/乙酸乙酯(55∶45)洗脱，得到0.35g(66％)的标题化合物。MS(m/z)：271/273(M+1，M+3)。
基本上如制备48中所述由相应的内酰胺试剂制备制备49-50的化合物。
Figure BDA00001645704900402
制51：1-(3-氯-2-吡啶基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯
Figure BDA00001645704900403
向4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯(1.70g，10.1mmol)和3-氯-2-氟吡啶(1.99g，15.1mmol)在二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中加入碳酸钾(2.80g，20.2mmol)，将该混合物在100℃搅拌16小时。完成后，使该反应混合物分配在水(25mL)与乙酸乙酯(25mL)之间。用乙酸乙酯(3x25mL)萃取水层，用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩，通过硅胶柱色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯(50∶50)洗脱，得到1.5g(54％)的标题化合物。MS(m/z)：280(M+1)。
制备52：1-(3-甲基-2-吡啶基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯
Figure BDA00001645704900411
用氮气给1-(3-氯-2-吡啶基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯(1.0g，3.5mmol)、三甲基环三硼氧烷(0.44g，3.50mmol)和碳酸钾(1.4g，10.1mmol)在二噁烷(18mL)和水(2mL)中的混合物脱气10min，然后加入三苯膦钯(0.40g，0.3mmol)，在110℃搅拌16h。完成后，使该反应混合物分配在二氯甲烷(50mL)与水(25mL)之间。用二氯甲烷(2x25mL)萃取水层，用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物，用己烷/乙酸乙酯(70∶30)洗脱，得到0.12g(13％)的标题化合物。MS(m/z)：260(M+1)。
实施例1：[2-[4-[2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900421
在0℃向2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛(12.50g，26.10mmol)在二氯甲烷(125mL)中的溶液中加入硼氢化钠(0.395g，10.44mmol)和甲醇(37.50mL)。除去冰浴，将该反应体系在室温搅拌30min。加入水(50mL)，将该混合物浓缩至一半体积，得到白色浓稠固体沉淀。加入二氯甲烷(100mL)，分离双相混合物。用水(50mL)洗涤有机层，用硫酸钠干燥，浓缩至一半体积(约100mL)。加入甲基叔丁基醚(100mL)，浓缩该溶液，得到沉淀。过滤固体，真空干燥，得到12g的[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇。MS(m/z)：481(M+1)。
将标题化合物的游离碱(0.48g，1mmol)溶于3mL甲醇，加入(L)-酒石酸(0.15g，1mmol)的甲醇溶液。将该混合物搅拌10分钟。蒸发溶剂，真空干燥残余物过夜，得到[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(L)-酒石酸盐，为定量收率。MS(m/z)：481(M+1)。
实施例2：2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-[3-(4H-咪唑-2-基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
将40％乙二醛水溶液(4.69mL，40.71mmol)和2N氨的甲醇(54.29mL，108.57mmol)溶液加入到2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛(6.50g，13.57mmol)在甲醇(10mL)中的混悬液中。将该反应混合物在0℃搅拌5分钟，然后在40℃搅拌1hr。将二氯甲烷(10mL)加入到该混悬液中，溶解几乎全部物质。将该混合物搅拌4hr，得到浅褐色溶液。将该溶液在40℃搅拌8hr。加入40％乙二醛水溶液(2.34mL，20.36mmol)和2N氨的甲醇(27.14mL，54.29mmol)溶液，将该混合物在40℃搅拌15hr。将该混合物浓缩至约100mL，倾倒在冰/水(400mL)上，形成浅褐色固体沉淀。过滤固体，用水洗涤，真空干燥(7g)。将该固体与其他基本上通过相同方法制备的粗物质(10g)合并。将合并的固体溶于二氯甲烷，通过硅胶垫过滤，用二氯甲烷/甲醇(96/4)洗脱。合并包含产物的级分，浓缩，得到淡黄色固体(11g)。用10％己烷/二氯甲烷在回流下萃取固体，浓缩滤液。再通过硅胶色谱法纯化固体，用2N氢氧化铵的甲醇/二氯甲烷混合物溶液洗脱，得到6.5g标题化合物。MS(m/z)：518(M+1)。
实施例3：2-氟-1′-[[1-[3-(1H-咪唑-2-基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
Figure BDA00001645704900441
基本上如实施例2中所述、通过使用2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛制备该化合物。通过正相Isco色谱法纯化残余物，得到32％标题化合物：质谱(m/z)：465(M+1)。
实施例4：5-(2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)噁唑
在氮气气氛中向包含在甲醇(2.5mL)中的2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)烟醛(0.120g，0.25mmol)的螺口试管中加入碳酸钾(0.104g，0.75mmol)和对-甲磺酰基甲基异氰化物(0.054g，0.28mmol)。快速密封反应试管(注意：可能提高压力；使用防护罩)，在预热的油浴中在65℃借助于磁搅拌器搅拌3hr。用甲醇稀释该混合物，使用2g SCX柱纯化。真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化得到的残余物，用己烷/乙醇(5-30％)洗脱，得到0.093g的标题化合物。MS(m/z)：518(M+1)。
实施例5：2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900451
向2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](19.99g，64.33mmol)在1，2-二氯乙烷(120mL)中的溶液中加入1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛(12g，58.48mmol)，将该混合物在室温搅拌15min。然后加入粉状三乙酰氧基硼氢化钠(18.59g，87.72mmol)(内部温度25-35°)，将得到的混悬液在室温搅拌15hr。在搅拌下分部分加入在冰混合物中的饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)。分离各相。用叔丁基甲基醚(30mL)萃取水相。用水(50mL)和50％盐水(50mL)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，浓缩，得到浓稠油状物，通过硅胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇混合物作为洗脱剂，得到18g浓稠油状物，与己烷和10％叔丁基甲基醚/己烷一起研磨，得到16.5g的2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]。MS(m/z)：469(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：469(M+1)。
基本上如实施例5中所述、使用相应的醛制备实施例6-15的化合物。
Figure BDA00001645704900471
a反应使用四氢呋喃作为溶剂进行。
实施例16：2-氯-4，4-二氟-1′-[[3-甲基-1-(3-四氢呋喃-2-基-2-吡啶基)吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
Figure BDA00001645704900481
向包含3-甲基-1-(3-(四氢呋喃-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-醛(192mg，0.75mmol)、2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃(209mg，0.75mmol)和乙酸(43μL，0.75mmol)在1，2-二氯乙烷(2.6mL)中的混合物中的螺口试管中加入三乙酰氧基硼氢化钠(238mg，1.1mmol)。密封反应试管，在室温借助于磁搅拌器搅拌18hr。用甲醇稀释该混合物，使用10gSCX柱纯化。真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法进一步纯化得到的残余物，用己烷∶丙酮(梯度5-30％的丙酮溶液)洗脱，得到113mg的标题化合物，为外消旋混合物。MS(m/z)：521(M+1)。
在SCF(超临界流体色谱法)条件下、使用Chiralpak
Figure BDA00001645704900482
(ChiralTechnologies，Inc.，West Chester，Pennsylvania，USA)作为固定相和二氧化碳/甲醇/二甲基乙胺(0.2％)作为流动相进行对映异构体拆分。第一种洗脱液是期望的对映体。
实施例17：2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](L)-酒石酸盐
向2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](170mg，0.61mmol)在二氯甲烷(2.4mL)中的溶液中加入1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-醛(192mg)。将该混合物在室温搅拌10min。然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(268.3mg)，将该反应体系在室温搅拌过夜。用二氯甲烷稀释该混合物，用碳酸氢钠(饱和溶液)缓慢地使反应停止。然后再用二氯甲烷萃取有机相，滗析，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过反相HPLC纯化残余物，得到67.9mg的2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(异丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]。MS(m/z)：527(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：527(M+1)。
实施例18：2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](L)-酒石酸盐
向螺口试管中加入碘化亚铜(I)(1.15g，6.02mmol)、2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](15g，40.12mmol)、碳酸钾(11.76g，84.26mmol)、15mL甲苯(预先用氮气发泡20分钟)和搅棒。用氮气使该反应混合物再发泡10min，然后加入2-溴-3-甲氧基甲基-吡啶(10.54g，52.16mmol)和反式-N，N′-二甲基环己烷-1，2-二胺(1.90mL，12.04mmol)。快速密封反应试管(注意：可能提高压力；使用防护罩)，在室温搅拌5min，浸入在115℃预热的油浴中24h。将样品冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，通过硅藻土过滤。真空蒸发溶剂。通过使用己烷/乙酸乙酯(30-70％)的正相Isco色谱法纯化残余物。收集期望的级分，蒸发。通过正相Isco色谱法再纯化一些不纯的级分(＜2g)，使用己烷/乙酸乙酯(20-60％的乙酸乙酯溶液)作为洗脱剂。合并包含最终化合物的全部级分，真空蒸发至干。将残余物溶于二氯甲烷，用10％氢氧化铵水溶液洗涤以除去铜残余物。蒸发有机溶剂，干燥化合物过夜，得到13g的2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]。MS(m/z)：495(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：495(M+1)。
基本上如实施例18中所述，由相应的2-溴-3-取代的吡啶(实施例19-32和34-35)或2-碘-3-取代的吡啶(实施例33)制备实施例19-35的化合物。
Figure BDA00001645704900501
Figure BDA00001645704900511
Figure BDA00001645704900531
Figure BDA00001645704900541
实施例36：2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-(3-甲氧基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
Figure BDA00001645704900551
向螺口试管中加入碘化亚铜(I)(23.74mg，0.125mmol)、2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](233，00mg，0.623mmol)、碳酸钾(182.71mg，1.31mmol)、甲苯(2mL)(预先用氮气发泡20分钟)和搅棒。用氮气使该反应混合物再发泡20分钟，然后加入2-碘-3-甲氧基吡啶(302.01mg，1.25mmol)和反式-N，N′-二甲基环己烷-1，2-二胺(39.31μL，0.25mmol)。快速密封反应试管(注意：可能提高压力；使用防护罩)，在室温搅拌5min，借助于磁搅拌器浸入在110℃预热的油浴中24小时。然后将该混合物倾倒在SCX柱(25g)上，用甲醇、然后用2N氨的甲醇溶液洗脱。浓缩碱性级分，通过碱性-HPLC纯化得到的残余物，得到162mg的标题化合物。MS(m/z)：481(M+1)。
实施例37：2-氯-4，4-二氟-1′-[[1-(3-异噁唑-3-基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]
Figure BDA00001645704900552
基本上如实施例36中所述、通过使用2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]和3-(2-溴-吡啶-3-基)异噁唑作为原料制备该化合物。通过正相Isco色谱法纯化残余物(乙酸乙酯用作洗脱剂)，得到45％标题化合物：质谱(m/z)：518(M+1)。
实施例38：2-(2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)丙-2-醇
在氮气气氛中向包含在干二甲基甲酰胺(3.2mL)中的2-(2-溴-3-吡啶基)丙-2-醇(520mg，2.41mmol)的螺口试管中加入4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑(600mg，1.6mmol)、氧化亚铜(I)(23mg，160μmoles)、(R，R)-(-)-N，N′-二甲基-1，2-环己烷二胺(68mg，480μmoles)和碳酸铯(1040mg，3.2mmol)。快速密封反应试管(注意：可能提高压力；使用防护罩)，借助于磁搅拌器在110℃预热的油浴中搅拌16h。用水稀释该混合物，用乙酸乙酯萃取。分离有机层，用硫酸镁干燥，过滤，真空蒸发溶剂。通过使用正相Isco色谱法的硅胶纯化得到的残余物，使用己烷∶乙醇(梯度2-15％的乙醇溶液)洗脱，得到310mg的标题化合物。MS(m/z)：509(M+1)。
实施例39：1-[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]-N-甲基-甲胺(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900571
基本上如制备7所述、使用2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛和甲胺制备标题化合物的游离碱，51％收率。MS(m/z)：494(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：551(M+1)。
基本上如实施例39中所述、由相应的醛和胺制备实施例40-44的化合物(实施例43使用1，2-二氯乙烷作为溶剂制备)。
Figure BDA00001645704900572
Figure BDA00001645704900581
实施例45：2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛肟(L)-酒石酸盐
向2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛(0.210g，0.438mmol)在乙醇(3mL)中的溶液中加入羟基胺盐酸盐(0.038g，0.526mmol)和乙醇钠(0.044g，0.526mmol)，将该混合物回流搅拌1h。蒸发溶剂，用乙酸乙酯和水萃取残余物。分离有机层，用硫酸镁干燥，过滤，真空蒸发溶剂。通过碱性反相HPLC纯化残余物，得到0.110g的2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛肟。MS(m/z)：494(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：494(M+1)。
基本上如实施例45中所述、由相应的醛和羟基胺制备实施例46-47的化合物。
Figure BDA00001645704900592
实施例48：[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲胺(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900602
1.2-[[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲 基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]异二氢吲哚-1，3-二酮
在0℃将偶氮二甲酸二异丙酯(0.105mL，0.54mmol)加入到[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(0.173g，0.36mmol)、邻苯二甲酰亚胺(0.079mg，0.54mmol)和三苯膦(0.142g，0.54mmol)在甲苯(3mL)中的溶液中。将该混合物在室温搅拌过夜。除去溶剂，首先使用2g SCX柱纯化残余物，蒸发2N氨的甲醇溶液后，通过正相Isco色谱法纯化级分，使用己烷/乙醇(3％-30％)洗脱，得到0.201g的2-[[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]异二氢吲哚-1，3-二酮。MS(m/z)：610(M+1)。
2.[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲 基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲胺(L)-酒石酸盐
向包含2-[[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]异二氢吲哚-1，3-二酮(0.201g，0.33mmol)和24μl水在乙醇(2.5mL)中的溶液的烧瓶中加入一水合肼(0.04g，0.79mmol)。将该反应混合物回流2.5hr，然后用甲醇稀释，使用2g SCX柱纯化。蒸发2N氨的甲醇溶液级分后，通过正相Isco色谱法纯化得到的产物，用乙醇和15％氢氧化铵(7N的甲醇溶液)的乙醇溶液(梯度25-90％碱性洗脱剂)洗脱，得到129mg的标题化合物。MS(m/z)：480(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：480(M+1)。
实施例49：2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲酰胺(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900611
1. 2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲 基-吡唑-1-基]吡啶-3-腈：
基本上如制备7中所述、通过使用2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]和2-(4-甲酰基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-腈制备该化合物。通过SCX纯化残余物，得到2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-腈，32％收率。MS(m/z)：424(M+1)。
2. 2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲 基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲酰胺(L)-酒石酸盐
向2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-腈(0.71mmol，0.30g)在二甲亚砜(7.5mL)中的溶液中加入碳酸钾(0.049g，0.35mmol)，将该混合物冷却至0-5℃，然后加入33％过氧化氢水溶液(0.39mL，3.78mmol)。将该混合物在室温搅拌2h。然后谨慎加入水，用乙酸乙酯萃取该反应混合物。滗析有机层，用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷/甲醇混合物作为洗脱剂，得到0.252g，再通过反相HPLC纯化，得到0.198g的2-[4-[(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲酰胺。MS(m/z)：442(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：442(M+1)。
实施例50：2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲酰胺(L)-酒石酸盐
基本上如实施例49所述、通过使用2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]和2-(4-甲酰基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-腈作为原料制备标题化合物，总收率15％(第一步收率22％，第二步收率66％)。MS(m/z)：494(M+1)。
实施例51：2-[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]乙酰胺(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900631
向2-[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]乙腈(170mg，346.96μmoles)在二甲亚砜(4mL)中的溶液中加入碳酸钾(23.98mg，173.48μmoles)，将该混合物冷却至0-5℃。加入33％过氧化氢水溶液(189.54μL，1.84mmol)。将该混合物在室温搅拌16hr，然后再加入33％过氧化氢水溶液(189.54μL，1.84mmol)和碳酸钾(23.98mg，173.48μmoles)。加入水，用乙酸乙酯萃取该混合物。分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化化合物，使用二氯甲烷和2N氨的甲醇溶液作为洗脱剂(1.5-6％的2N的氨的甲醇溶液)，得到19％收率的标题化合物的游离碱。MS(m/z)：508(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：508(M+1)。
实施例52：[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基N-甲基氨基甲酸酯(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900641
在室温下将异氰酸甲酯(5.80μL，0.096mmol)加入到2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(0.042g，0.087mmol)在二氯甲烷(1mL)中的溶液中。1h通过LC/MS观察无反应进行后，加入三乙胺(12.17μL，87.32μmoles)和异氰酸甲酯(5.8μL，0.096mmol)，将该反应体系搅拌过夜。再加入三乙胺(12.17μL，87.32μmoles)和异氰酸甲酯(5.8μL，0.096mmol)，24h后，蒸发溶剂，通过正相Isco色谱法纯化残余物，用二氯甲烷/2N氢氧化铵的甲醇溶液(0-5％的2N氢氧化铵的甲醇溶液)作为洗脱剂，得到0.041g的[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基N-甲基氨基甲酸酯。MS(m/z)：538(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：538(M+1)。
实施例53：[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900642
1.4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3- 氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯
向1-(3-氟-2-吡啶基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯(342-5mg)在1，2-二氯乙烷(6-7mL)中的溶液中加入2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](280mg，1mmol)。将该混合物搅拌10min。然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(442mg)，将该混合物在室温搅拌过夜。加入碳酸氢钠(饱和水溶液)，用二氯甲烷萃取有机相，用硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用乙酸乙酯和己烷作为洗脱剂，得到450mg的4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯。MS(m/z)：527(M+1)。
2.[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3- 氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇(L)-酒石酸盐
向在氮气气氛中和冷却至0℃的4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯(250mg，0.47mmol)在四氢呋喃(2.37mL)中的溶液中缓慢加入1M氢化铝锂的四氢呋喃(569.3μL)溶液。将该混合物在该温度下搅拌30分钟。然后加入22μL水，除去冷却浴，将该混合物在室温搅拌5min，然后加入22μL的15％氢氧化钠水溶液和65μL水。过滤出固体，蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，得到141mg标题化合物，为游离碱。MS(m/z)：485(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：485(M+1)。
制备实施例53游离碱的可选方法：
1.4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲 基]-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
向2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶(18.3g，65.42mmol)在四氢呋喃(0.2L)中的混悬液中加入4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(10g，59.47mmol)，将该混合物在室温搅拌10min。然后加入粉状三乙酰氧基硼氢化钠(16.39g，77.31mmol)。将该混合物在室温搅拌1.5h。然后将该反应混合物倾倒在冰-碳酸氢钠饱和水溶液(200mL)上。分离各相。用NaHCO3饱和溶液碱化水相，用乙酸乙酯(100mL)萃取。用NaHCO3饱和溶液洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，浓缩，得到22.5g的标题化合物。MS(m/z)：432(M+1)。
2.4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲 基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯
Figure BDA00001645704900662
向4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(22.5g，52.10mmoles)在二甲基甲酰胺(225.00mL)中的溶液中加入碳酸钾(10.80g，78.14mmoles)和2，3-二氟吡啶(7.19g，62.52mmoles)，将得到的混悬液在60℃搅拌15h。然后将该反应混合物倾倒在冰/盐水(30mL)上，将CH2Cl2(50mL)加入到得到的混悬液中。用H2O(2x50mL)洗涤溶液。用硫酸钠干燥有机层，浓缩，得到粗产物，通过SiO2过滤纯化，用2-丙醇/CH2Cl2混合物洗脱，得到18g的标题化合物。MS(m/z)：527(M+1)。
3.[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲 基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
向在N2气气氛中和冷却至-10℃的4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯(2.6g，4.93mmoles)在四氢呋喃(26.00mL)中的溶液中缓慢滴加氢化二异丁基铝的1M甲苯(23.68mL，23.68mmoles)溶液。然后将该反应混合物在该温度搅拌15min，然后除去冷却浴，将该混合物温至室温。然后在-10℃滴加H2O(100mL)。用EtOAc(2x30mL)萃取得到的混悬液。用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，浓缩，得到淡棕色油状物，将其溶于甲基叔丁基醚(10mL)，白色晶体结晶。搅拌形成的混悬液，滴加己烷(10mL)，同时搅拌。过滤固体，得到2g的标题化合物。MS(m/z)：485(M+1)。
实施例54：2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基-1，2，4-噁二唑-5-基)-吡啶
Figure BDA00001645704900681
1.2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲 基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-烟酸甲酯
向螺口试管中加入氧化亚铜(I)(11mg，0.08mmol)、2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](300mg，0.8mmol)、碳酸铯(523mg，1.6mmol)、干二甲基甲酰胺(1.6mL)和搅棒。用氮气使该反应混合物发泡20分钟，然后加入2-碘吡啶-3-甲酸甲酯(511mg，1.9mmol)和反式-N，N′-二甲基环己烷-1，2-二胺(0.24mmol；34mg)。快速密封反应试管(注意：有可能提高压力；使用防护罩)，在110℃预热的油浴中借助于磁搅拌器浸入16小时。然后将该混合物倾倒在SCX柱(10g)上，用甲醇、然后用2N氨的甲醇溶液洗脱。浓缩碱性级分，通过使用正相Isco色谱法的硅胶纯化得到的残余物，用己烷∶乙醇(梯度2-15％的乙醇溶液)洗脱，得到307mg的2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-烟酸甲酯。MS(m/z)：309(M+1)。
2.2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲 基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基-1，2，4-噁二唑-5-基)-吡啶
在氩气气氛中向乙酰胺肟(154mg，2.1mmol)在7mL四氢呋喃中的溶液中加入139mg的磨碎的4A分子筛和氢化钠(2.1mmol；84mg的作为60％的矿物油溶液)。将该混合物在50℃搅拌30min。冷却至室温后，加入2-(4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-烟酸甲酯(309mg，0.6mmol)，然后将该混合物在50℃加热40min。用水冷却后猝灭，用二氯甲烷萃取。用硫酸镁干燥有机相和蒸发溶剂后，用甲醇稀释残余物，使用5g SCX柱纯化。通过半制备型反相HPLC_MS使用XBridge柱(5um，19x100mm)和梯度60-80％的B的A溶液、5min、以25mL/min流速(碱性条件A：碳酸氢铵20mM pH9和B：乙腈)进一步纯化得到的残余物，得到71mg的标题化合物。MS(m/z)：533(M+1)。
实施例55：2-氯-1′-[[1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900691
向2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃](0.2g，0.71mmol)在1，2-二氯乙烷(5mL)中的溶液中加入1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛(0.19g，0.86mmol)和几滴乙酸。将该反应混合物在室温搅拌1小时。加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.315g，1.43mmol)，在室温搅拌14小时。完成后，用二氯甲烷稀释该反应混合物，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机相，真空浓缩。通过HPLC纯化粗混合物，得到0.195g(56％)的2-氯-1′-[[1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]。MS(m/z)：485(M+1)。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：485(M+1)。
实施例56：2-氯-1′-[[1-(3-环丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900701
基本上如实施例55所述、通过使用2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]和1-(3-环丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-醛作为原料制备标题化合物，41％收率。MS(m/z)：491(M+1)。
实施例57：4-[[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]吗啉-3-酮
通过氩气发泡给2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](0.20g，0.53mmol)、4-[(2-溴-3-吡啶基)甲基]吗啉-3-酮(0.21g，0.77mmol)、碘化亚铜(I)(0.015g，0.078mmol)和碳酸铯(0.36g，1.10mmol)在二甲基甲酰胺(5mL)中的混合物脱气15分钟。加入(1R，2R)-N，N′-二甲基环己烷-1，2-二胺(0.02g，0.14mmol)，同时脱气15分钟，然后加热至130℃持续16小时。完成后，将该反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤。用乙酸乙酯(2x25mL)洗涤残余物，用水(30mL)洗涤滤液。用乙酸乙酯(2x25mL)萃取水层，用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物，用二氯甲烷/甲醇(96∶4)洗脱，得到0.09g(30％)标题化合物。MS(m/z)：564(M+1)。
基本上如实施例57中所述、分别由制备49和50中所述的中间体制备
实施例58-59的化合物。
Figure BDA00001645704900711
实施例60：[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氯-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
Figure BDA00001645704900712
1.4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲 基)-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
向2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]盐酸盐(0.35g，1.1mmol)和1-(3-氯吡啶-2-基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸乙酯(0.3g，1.0mmol)在1，2-二氯乙烷(20mL)中的溶液中加入N-甲基吗啉(0.33g，3.2mmol)和分子筛(0.10g)。将该反应混合物在室温搅拌1h。加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.58g，2.7mmol)，在室温搅拌16h。完成后，通过硅藻土过滤该反应混合物，使其分配在二氯甲烷(15mL)与水(15mL)之间。用二氯甲烷(3x30mL)萃取水相，用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物，用二氯甲烷/甲醇(98∶2)洗脱，得到0.4g(67％)的4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯。MS(m/z)：543(M+1)。
2.[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3- 氯-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
在0℃向4-((2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基)-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(0.4g，0.73mmol)在四氢呋喃(5mL)和乙醇(5mL)中的溶液中加入硼氢化锂(1.80mL，2.0M的四氢呋喃溶液，3.68mmol)，在室温搅拌16h。完成后，用水(10mL)使该反应混合物猝灭，用乙酸乙酯(2x25mL)萃取。用硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物，用二氯甲烷/甲醇(97∶3)洗脱，得到0.14g(39％)的标题化合物。MS(m/z)：500(M+1)。
实施例61：[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-甲基-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
Figure BDA00001645704900731
基本上如实施例60中所述、通过使用2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]盐酸盐和1-(3-甲基吡啶-2-基)-4-甲酰基-吡唑-3-甲酸酯作为原料制备标题化合物，14％收率。MS(m/z)：481(M+1)。
实施例62：[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇
1.2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3- 甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛
在室温给2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶](168.4g，451mmol)、CuI(12.9g，67.7mmol)和碳酸钾(131g，947mmol)在无水甲苯(340mL)中的混合物脱气30min。依次加入2-溴-吡啶-3-甲醛(125g，677mmol)和反式-N，N′-二甲基环己烷-1，2-二胺(21.3mL，135.4mmol)。给内含物脱气30min，然后在105℃加热，同时搅拌18hr。反应混合物的LC/MS分析揭示出2-氯-4，4-二氟-1′-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]完全耗尽。将该反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯(1.5L)稀释，搅拌，通过硅藻土垫过滤。依次用10％氢氧化铵(5x100mL)、水(3x100mL)和盐水洗涤母液。然后干燥(硫酸钠)，过滤，减压浓缩。通过使用包含1％三乙胺的50％乙酸乙酯的己烷溶液的硅胶纯化残余物，得到2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛，为固体(156g，72％收率)。MS(m/z)：479(M+1)。
2.[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3- 甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇
在0℃向2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-醛(180g，377mmol)在无水二氯甲烷(1.5L)中的溶液中依次加入硼氢化钠(7.2g，188.5mmol)和无水甲醇(0.5L)，将内含物达到室温，同时搅拌30min。反应混合物的LC/MS分析揭示出完成。减压除去挥发性物质，使得到的残余物分配在二氯甲烷(2L)与水(300mL)之间。分离各层，依次用1N氢氧化钠水溶液(300mL)、水(3x300mL)、盐水洗涤有机层，干燥(硫酸钠)，过滤，减压浓缩。通过使用包含1％三乙胺的50％-55％乙酸乙酯的己烷溶液的硅胶纯化残余物，得到[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇，为固体(167g，92％收率)。MS(m/z)：481(M+1)。
实施例63[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇盐酸盐
Figure BDA00001645704900751
将在乙酸乙酯(1.5L)中的[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(157-4g，328mmol)在80℃加热至得到澄清溶液。向包含游离碱的热溶液中缓慢加入5-6N HCl的异丙醇(65-6mL，328mmol)溶液，将内含物剧烈搅拌，同时使该混合物在2hr内达到室温。通过添加HCl的方式到一半时观察到沉淀。过滤得到的白色固体，用乙醚(3x1L)洗涤，在50℃真空干燥3天，得到[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇盐酸盐，为黄白色固体(165g，97％收率)。MS(m/z)：481(M+1)。
受体存留期间示踪物化合物：2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)-N，N-二甲基-丙酰胺(L)-酒石酸盐
Figure BDA00001645704900752
1.3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)丙酸叔丁酯
将2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，2-c]吡喃-7，4’-哌啶](2.7g，11.9mmol)溶于甲醇(60mL)。然后加入三乙胺(2.65mL)和丙烯酸叔丁酯(3.55mL，23.76mmol)，将该混合物加热至65℃持续5h。除去加热，将反应混合物在室温搅拌过夜。蒸发溶剂，通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用乙酸乙酯/己烷1/1作为洗脱剂，得到4.2g期望的化合物，为无色油状物。MS(m/z)：356(M+1)。
2.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌 啶]-1′-基)丙酸叔丁酯
向在N2气气氛中和冷却至-78℃的搅拌的3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)丙酸叔丁酯(4.9g，13.78mmol)在四氢呋喃(41mL)中的溶液中滴加1M双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(41，35mL，41.45mmol)。将得到的混合物在该温度搅拌3小时。然后加入1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(1.33mL，11.03mmol)，将得到的溶液在相同温度搅拌30min。向得到的混合物中加入在干四氢呋喃(1mL)中的2-氟苄基溴(2.33mL，19.3mmol)，持续搅拌。使温度从-78℃升至室温过夜。用饱和氯化铵水溶液使粗反应混合物猝灭，用乙酸乙酯萃取。滗析有机层，用硫酸镁干燥，蒸发溶剂，通过正相Isco色谱法纯化得到的粗产物，使用乙酸乙酯/己烷5/95-20/80洗脱，得到5.06g标题化合物，为无色油状物。MS(m/z)：464(M+1)。
3.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌 啶]-1′-基)丙酸三氟乙酸盐
将2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)丙酸叔丁酯(5.06g，10.91mmol)和三氟乙酸(26.20mL，218mmol)的混合物在室温搅拌过夜。蒸发溶剂至干，将粗产物不经进一步纯化使用。
4.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′- 基)-N，N-二甲基-丙酰胺
将2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)丙酸三氟乙酸盐(5.68g，10.89mmol)溶于二氯甲烷(218mL)，然后在0℃向该溶液中依次加入三乙胺(12.14mL，87.13mmol)、二甲胺盐酸盐(1.80g，21.78mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.18g，21.78mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(3.34g，21.78mmol)。将该混合物在室温搅拌5小时。用饱和碳酸氢钠水溶液处理该反应混合物，用二氯甲烷(3x 20mL)萃取。用硫酸镁干燥合并的有机层，减压蒸发溶剂。通过正相Isco色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷/2N氨的甲醇溶液100/0-90/10作为洗脱剂，得到4.0g(84.5％)的标题化合物。MS(m/z)：435(M+1)。
5.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′- 基)-N，N-二甲基-丙酰胺(L)-酒石酸盐
外消旋2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)-N，N-二甲基-丙酰胺(2.3g，5.29mmol)的对映体拆分使用Chiralpak
Figure BDA00001645704900771
柱(Chiral Technologies，Inc.，West Chester，Pennsylvania，USA)、使用己烷/0.2％二甲基乙胺的乙醇溶液9/1进行。得到期望的化合物，36％收率，为首先洗脱的对映体。
酒石酸盐基本上如实施例1中所述制备。MS(m/z)：435(M+1)。
X-射线粉末衍射
用安装了CuKα源
Figure BDA00001645704900772
和Vantec检测器的在35kV和50mA运行的Bruker D4Endeavor X-射线粉末衍射计得到结晶固体的XRD图案。在4-40°2θ扫描样品，步长为0.0087°2θ，扫描速率为0.5秒/步，0.6mm发散狭缝，5.28固定防散射和9.5mm检测器狭缝。给石英样品保持器填充干粉，使用载玻片得到平滑面。在环境温度和相对湿度采集晶型衍射图案。在取峰前除去背景。在晶体学领域众所周知，对任何指定的晶型而言，衍射峰的相对强度可以因例如结晶形态和晶癖这样因素产生的优选方向的不同而改变。如果存在优选方向的效应，则峰强度改变，而多晶型物的特征峰位不变。例如，参见The United States Pharmacopeia#23，NationalFormulary#18，1843-1844页，1995。此外。在晶体学领域还众所周知，对任何指定的晶型而言，角度峰位可以轻微改变。例如，峰位可以因温度或湿度的变化而移动(在分析样品时，样品移动或存在或不存在内标)。在目前的情况中，±0.1°2θ峰位的变异性考虑到了这些可能的变化，而不会妨碍所示晶型的明确鉴定。晶型的证实可以基于任意独特的差别峰(以°2θ单位计)的组合进行，典型地是更突出的峰。
因此，制备的(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇游离碱结晶样品的特征在于如下表1中所述的使用CuKα射线作为具有衍射峰(2-θ值)的XRD图案。使用一小组来自完整衍射图案的不同峰证实独特的晶型。因此，一个实施方案中，在本发明提供了(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇的晶型，其特征在于使用在11.1与一个或多个选自5.5、13.5、17.8和22.3±0.1°2θ的峰的组合的具有衍射峰的CuKα射线的XRD图案。在另一个实施方案中，本发明提供了(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇盐酸盐的晶型，其特征在于使用在5.5、11.1、13.5、17.8和22.3±0.1°2θ具有衍射峰的CuKα射线的XRD图案。
  峰  角(°2θ)   强度％
  1   5.5   53.2
  2   11.1   100
  3   12.3   9.9
  4   13.5   12
  5   15.4   5.1
  6   16.6   4.8
  7   17.0   5.5
  8   17.8   12.1
  9   19.3   4.2
  10   19.5   5.5
  11   19.7   5.6
  12   21.0   11.1
  13   22.3   25.8
  14   23.3   10.3
  15   23.9   5.7
  16   26.5   7.2
  17   27.0   7.1
表1：(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇游离碱的X-射线粉末衍射峰
类似地，制备的(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇HCl盐结晶样品的特征在于如下表2中所述的使用CuKα射线作为具有衍射峰(2-θ值)的XRD图案。可以使用一小组来自完整衍射图案的不同峰证实独特的晶型。因此，在一个实施方案中，本发明提供了(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇盐酸盐的晶型，其特征在于使用在16.2与一个或多个选自10.8、12.1和21.1±0.1°2θ的峰的组合的具有衍射峰的CuKα射线的XRD图案。在另一个实施方案中，本发明提供了(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇盐酸盐的晶型，其特征在于使用在10.8、12.1、16.2和21.2°±0.1°2θ具有衍射峰的CuKα射线的XRD图案。
  峰  角(°2θ)   强度％
  1   10.8   70.5
  2   12.1   41.4
  3   16.2   80.1
  4   18.7   60.8
  5   19.5   38.6
  6   20.6   49.5
  7   21.1   64.9
  8   22.3   33.1
  9   23.0   89.6
  10   23.5   100
  11   24.0   43.8
表2：(2-{4-[(2′-氯-4′，4′-二氟-4′，5′-二氢-1H-螺[哌啶-4，7′-噻吩并[2，3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇HCl盐的X-射线粉末衍射峰
文献数据(Przydzial和Heisler，2008，上文；Reinscheid，2006，上文)和非临床动物研究中生成的数据支持痛敏肽拮抗剂在治疗抑郁症、肥胖和进食障碍和偏头痛中的作用。特别地，发现痛敏肽受体拮抗剂单独和与三环或选择性5羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)抗抑郁药的组合在啮齿动物抑郁症模型、抑制摄食过度啮齿动物模型、抑制预先体重减轻后体重恢复啮齿动物模型和偏头痛模型中是有效的。此外，在痛敏肽受体敲除小鼠中进行的研究已经证实，痛敏肽拮抗剂在强迫游泳试验(抗抑郁活性测定)和在禁食诱发的饲喂(减肥活性)中的作用是基因型依赖性的，从而支持了痛敏肽拮抗剂在这些动物模型中的特异性机制。如上所述的障碍代表了常见的共病临床情况，痛敏肽拮抗剂可以在这些具体患者群体中特别有效，例如具有严重抑郁障碍、贪吃症、超重、肥胖和具有临床情绪障碍共病的肥胖的患者。
为了进一步证实本发明化合物的特征，在如下体外和体内测定中试验有代表性的化合物：
体外受体结合
放射性配体结合测定常用于测定化合物结合特定受体或靶蛋白的亲和力(Ki)或效力。基于上述测定方式(Ardati A，Henningsen RA，Higelin J，Reinscheid RK，Civelli O，Monsma FJ Jr.Mol Pharmacol. 1997年5月；51(5)：816-24.)与少量修改研发基于过滤的[3H]-OFQ/痛敏肽受体结合测定。在深-孔96-孔培养板上进行[3H]-OFQ/痛敏肽结合测定。使用5-10μg膜蛋白(分离自表达克隆的人ORL1受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))在包含20mM HEPES、pH7.4，5mM MgCl2、1mM EGTA、100mMNaCl、0.1％牛血清白蛋白的最终测定体积0.5mL缓冲液中进行[3H]OFQ(最终测定浓度0.2nM)竞争性研究。在室温将样品温育60min.，发现对竞争性测定是最佳的。用Tometc细胞采集器通过经玻璃纤维滤器(Wallacfiltermat A)[用0.3％聚乙烯亚胺(Sigma)预处理1hr]过滤终止测定，用5mL冰-冷50mM Tris·HCl，pH 7.4将滤器洗涤3次。然后干燥Filtermats，用Meltilex闪烁体A包埋，用Wallac Microbeta闪烁计数器计数放射性。通过用100nM未标记的痛敏肽置换测定特异性结合。将曲线绘制为特异性结合百分比，使用S形剂量响应曲线与可变斜率测定IC50值。通过Cheng和Prusoff方程、由IC50计算Ki值(Cheng，Y.C.和Prusoff，W.H.，Biochem.Pharmacol.22，3099-3108(1973))，其中Ki＝IC50x(1+DxKd -1)-1。
类似地，可以使用表达期望受体/转运蛋白/通道的膜和适合的相应放射性配体竞争分子测定μ阿片样物质、κ阿片样物质和δ阿片样物质、5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素能受体、毒蕈碱受体和组胺受体的Ki以及结合去甲肾上腺素转运蛋白、钠通道、氯通道和钙通道的Ki。
基本上如上所述测试实施的化合物，发现对ORL-1受体具有高度亲和力。发现实施的化合物的ORL-1受体的Ki低于2nM，而发现测试的其他受体/转运蛋白/通道的Ki明显较大。基本上如上所述测试实施例62、23和53的化合物，发现具有如下表3中所示的亲和力。
表3.选择性数据
  Ki(nM)   实施例62   实施例23   实施例53
  ORL-1   0.18   0.79   0.45
  μ阿片样物质   ＞451   ＞451   ＞451
  κ阿片样物质  ＞430  ＞430  ＞430
  δ阿片样物质  ＞479  ＞479  ＞479
  5-HT1A ＞3180   ND ＞3180
  5-HT1B ＞3580   ND ＞3580
  5-HT1C ND   ND  ND
  5-HT1D ＞8550   ND ＞8550
  5-HT1E ＞5370   ND ＞5370
  5-HT1F ＞8520   ND ＞8520
  5-HT2A ＞5000   ND ＞5000
  5-HT2B 693   ND  220
  5-HT2C ＞5650   ND ＞5650
  5-HT4 ＞4120   ND ＞4120
  5-HT5 ＞9090   ND ＞9090
  5-HT6 ND   ND ＞5830
  5-HT7 ＞3980   ND ＞3980
  D1多巴胺 ＞5000   ND ＞5000
  D2多巴胺 ＞5000   ND ＞5000
  腺苷A3 ＞5000   ND ＞5000
  肾上腺素能α1 ＞5000   ND ＞5000
  肾上腺素能α2 ＞5000   ND ＞5000
  肾上腺素能β1 ＞5000   ND ＞5000
  肾上腺素能β2 ＞5000   ND ＞5000
  组胺H1 ＞5000   ND ＞5000
  毒蕈碱M2  ＞500   ND ＞5000
  毒蕈碱M3 ＞5000   ND ＞5000
  去甲肾上腺素转运蛋白  ＞500   ND  ＞500
  Na+通道  235   ND  ＞500
  Cl-通道  ＞500   ND  ＞500
  Ca+2通道(DHP位点) ＞5000   ND ＞5000
  Ca+2通道(地尔硫卓位点)  ＞500   ND  ＞500
  Ca+2通道(维拉帕米位点)  ＞500   ND ＞5000
ND＝未测定
因此，预计本发明化合物的生理学相关剂量基本上不会与体内的这些位点发生相互作用且由此预计可避免与这种活性相关的不良的作用。
激动剂-介导的G-蛋白活化-GTPγ-[35S]结合的体外功能性阻滞
激动剂-介导的G-蛋白偶联受体刺激导致膜关联Gαββ-蛋白异三聚体复合物活化并且代表了胞外信号转导至胞内途径改变中的第一步。Gαβγ-蛋白异三聚体的受体-介导的活化的活化第一步是Gα亚单位结合的鸟苷二磷酸(GDP)交换鸟苷三磷酸(GTP)。GTP结合Gα亚单位导致异三聚体亚单位Gβ和Gγ分离，导致几种胞内信号传导级联调节。受体-介导的G-蛋白活化的测量使用GTP的不可水解的放射性类似物GTP-γ-[35S]测定。使用这种方法，使用GTP-γ-[35S]结合测定、根据上述方案与少量修改测定表达克隆的人ORL1/痛敏肽受体的膜中的拮抗剂亲和力(Kb)(DeLapp等人，J Pharmacol Exp Ther.1999May；289(2)：946-55；Ozaki等人，Eur JPharmacol.2000年8月18日；402(1-2)：45-53)。使用如下缓冲液组成在200-μl体积中进行测定：100mM NaCl、20mM HEPES、5mM MgCl2、1mM EDTA、0.1％BSA、3μM GDP、0.5nM[35S]GTPγS。以20μg蛋白/孔的浓度加入ORL1受体膜混悬液，使用300nM痛敏肽/OFQ进行受体刺激。以1mg/孔将麦胚凝集素包被的SPA珠(Amersham，Arlington Hts.，IL)加入以检测膜结合的[35S]GTPγS。密封培养板，在室温温育2hr.。然后在4℃将培养板静置过夜，以使SPA珠沉降，然后用Wallac Microbeta计数。将特异性[35S]GTPγS结合测定为不存在和存在10μM未标记的GTPγS下观察到的CPM差异。将数据绘制为特异性[35S]GTPγS结合百分比。将曲线绘制为特异性结合百分比，使用S形剂量响应曲线与可变斜率测定IC50值。使用改变的Cheng和Prusoff方程(1973)、根据DeLapp等人1999估计拮抗剂亲和力(Kb)，其中Kb＝IC50x(1+DxEC50-1)-1。
基本上如上所述测试实施的化合物，发现是ORL-1受体的有效拮抗剂。发现实施的化合物的ORL-1受体的Kb低于6nM。基本上如上所述测试实施例1、23和53的化合物，发现ORL-1受体具的Kb分别为0.20、1.52和0.62nM。
体内受体占有率
已经建立使用LC/MS/MS测定的受体占有率(RO)作为测定推定ORL-1拮抗剂体内中心靶标衔接的方式。使用新专利痛敏肽/ORL1拮抗剂RO示踪物2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4，5-二氢噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)-N，N-二甲基-丙酰胺(RO示踪物)测定下丘脑中痛敏肽/ORL1受体占有率(RO)，下丘脑为包含位于血脑屏障内部的高密度痛敏肽/ORL1结合位点的结构。无需上述使用修改的对其他受体公布的放射性示踪物进行这些测定(Chernet E，Martin LJ，Li D，Need AB，Barth VN，Rash KS，Phebus LA.Use of LC/MS to assess brain tracer distribution in preclinical，in vivo receptor occupancy studies：dopamine D2，serotonin 2A和NK-1receptors as examples.Life Sci.78(4)：340-6，2005.)。
在啮齿动物中在中枢痛敏肽/ORL1 RO与在调节摄食行为和强迫游泳试验中效力之间建立正相关性。在对大鼠口服施用测试化合物后6或24小时时测定中枢痛敏肽/ORL1RO。用测试化合物或媒介物(20％Captisol，25mM磷酸盐缓冲液，pH2.0)口服治疗雄性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)。在口服施用测试化合物/媒介物后6或24小时，对全部动物静脉内施用3μg/kg剂量的RO示踪物。在施用RO示踪物时，视为测定RO。RO示踪物施用后40分钟，通过颈椎脱处死大鼠，取出下丘脑。测定每一组织样品中的RO示踪物水平。
中枢活性的文献参比标准品(-)-顺式-1-甲基-7-[[4-(2，6-二氯苯基)哌啶-1-基]甲基]-6，7，8，9-四氢-5H-苯并环庚烯-5-醇(SB612111，参见Magdalena和Heisler，上文)，即有效的痛敏肽/ORL1受体选择性拮抗剂用作阳性对照，以建立与100％痛敏肽/ORL1 RO相关的RO示踪物水平。在RO示踪物前1小时，通过静脉内施用30mg/kg剂量(产生约100％RO下丘脑痛敏肽/ORL1受体的剂量)的SB612111。
在包含0.1％甲酸的4个体积(w/v)的乙腈中匀化下丘脑样品，以14,000RPM离心16min。采集上清液，用无菌水稀释至终体积0.3mL。使用Agilent型号1200HPLC(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)和API 4000质谱仪测定RO示踪物。色谱分离使用2.1X50mm C18柱(Agilent零件号971700-907)和由38％乙腈水溶液与总计0.1％甲酸含量组成的流动相。通过监测具有435：239质量-电荷比(m/z)的前体-产物离子过渡检测RO示踪物，其中通过与用脑组织匀化物制备的标准品比较定量水平。将0％RO计算为媒介物-预治疗动物下丘脑中的RO示踪物水平，它代表了非特异性结合和特异性结合的总和(可结合示踪物的全部受体)。用极高静脉内剂量的SB612111预治疗的动物中的较低RO示踪物水平即阳性对照组代表了非特异性结合并且指定为100％占有率值(无受体可结合示踪物)。在来自测试化合物治疗组的下丘脑中发现的RO示踪物水平在这两点之间呈线性插入以计算测试化合物的RO。
基本上如上所述测试实施的化合物，发现在ORL-1受体上具有高受体占有率。发现实施的化合物的受体占有率在3mg/kg剂量下在6hr.后约为40-约130％或在3mg/kg剂量下在24hr后约为20-约96％RO。在6h r.后，在3mg/kg剂量下，基本上如上所述测定实施例62、23和53化合物的受体占有率，发现分别为104、80和83％RO。照此，预计本发明的化合物具有有利的生物利用度和穿透入CNS达到靶向的ORL-1受体。
hERG通道活性
心脏内K+-通道电导阻滞与QT-波延长形式的心脏毒性相关。使用hERG通道拮抗剂放射性配体[3H]阿司咪唑(2nM最终测定浓度)、根据众所周知的方法(例如，参见Finlayson K，等人（Eur J Pharmacol.412(3)：203-12，2001)测定表达克隆的hERG的HEK293细胞中实施例的痛敏肽受体拮抗剂对人ERG(hERG)K+通道的亲和力(Ki)。根据标准方法在合约研究公司Cerep(Paris France)进行[3H]阿司咪唑结合测定。
基本上如上所述测定实施例62、23和53，发现具有低活性，其中Ki分别为6.08、1.21和8.6μM。对实施例62的化合物而言，比较体内血浆浓度以产生CNS中80％RO(EC80RO)的痛敏肽/ORL1受体约为41nM。照此，在产生生理学相关体内痛敏肽/ORL1受体的受体占有率所需的浓度与hERG K+-通道活性所需的浓度之间存在巨大的距离。因此，预计本发明化合物的生理学相关剂量基本上不会与体内hERG位点发生相互作用，且由此预计对QT延长不具有主要作用。
小鼠强迫-游泳试验(mFST)
建立用于抗抑郁活性的体内mFST测定(Li等人J Pharmacol Exp Ther.319(1)：254-9，2006.)。用已知临床有效的抗抑郁药治疗的小鼠(选择性5-羟色胺再摄取抑制剂和/或三环抗抑郁剂)显示放入水槽后花费不动的时间减少行为，即与绝望相关的行为。mFST用于根据在先公布的方法(Li等人JPharmacol Exp Ther.319(1)：254-9，2006.)评价新痛敏肽/ORL1拮抗剂的潜在抗抑郁药-样活性。简言之，使用体重25-30g的雄性NIH-Swiss小鼠(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)。从动物饲养所取出组寄居动物运到测试区的其各自的笼中，使其适应新环境至少1小时，然后测试。或者，雄性129S6野生型和痛敏肽/ORL1受体敲除小鼠用于证实对化合物的响应依赖性是痛敏肽/ORL1受体依赖的。在使用当天制备20％Captisol、25mM磷酸盐缓冲液pH 2.0的全部化合物溶液。将小鼠放入充入6cm水(22-25℃)的圆筒(直径：10cm；高：25cm)6min。给在测试的6min.期限的最后4min.过程中的不动期限评分。当飘浮不活动或仅那些保持其头部高出水面所必需的运动时，将小鼠记录为不动。
基本上如上所述测试有代表性的化合物，发现它们显著地减少野生型小鼠的不动时间。基本上如上所述测定实施例62、23和53的化合物，发现分别具有24.9、9.5和12.9mg/Kg的ED60，其中在不动时间中的最大减少效应分别为45％、58％和54％。因此，预计本发明的化合物具有体内抗抑郁症活性。
此外，本发明的化合物可以用于与其他已知抗抑郁药联用以产生增强的效力。基本上如上所述测试实施例62的化合物与10mg/kg氟西汀的组合，发现比单独的氟西汀或实施例62化合物显著地减少了不动时间。参见下表4。
表4小鼠强迫游泳试验-与氟西汀联合治疗
Figure BDA00001645704900871
＊与媒介物、单独的实施例62和单独的氟西汀相比具有统计学显著性减少。
此外，当使用ORL-1敲除小鼠即一种改造以缺乏ORL-1受体的品系时，未观察到这些不动时间减少的效应，显示这种效应实际上由ORL-1受体介导。基本上如上所述、使用一组研究中的野生型小鼠和第二组研究中的ORL-1敲除小鼠测试实施例62的化合物，发现在野生型小鼠中显著地减少了不动时间，而在敲除小鼠中未显示效应。作为阳性对照试验去甲肾上腺素再摄取抑制剂抗抑郁药丙米嗪，发现它在野生型和敲除小鼠中都减少了不动时间至等同的程度，显示去甲肾上腺素再摄取机制介导的行为效应在敲除小鼠品系中是完整的。
禁食-诱导的小鼠摄食过度阻滞
在啮齿动物中阻断禁食诱导的摄食过度是用于摄食过度障碍的可接受的模型(Hollopeter G，Erickson JC，Seeley RJ，Marsh DJ，Palmiter RD.Response of neuropeptide Y-deficient mice to feeding effectors.Regul Pept.1998Sep 25；75-76：383-9.)。全部实验对维持在129S6近亲交配背景下的首次用于试验的12周龄雄性野生型和ORL敲除小鼠进行。在测试开始前使小鼠分别寄居最少3天，以消除任何因从组到个体寄居的改变导致的应激效应。在测试当天将3只小鼠/基因型随机分配至每一治疗组。在禁食前取体重测量值，然后从笼取出过夜。将小鼠禁食约15hr。第二天早晨，在得到食物的机会前30min.，通过口腔管饲法给予小鼠三分之一剂量的药物或媒介物。将药物溶于溶于25mM磷酸盐缓冲液pH 2.0的20％Captisol。在药物治疗前即刻取体重测量值或得到食物后24hr.恢复。值得注意的是，所有不依赖于基因型的小鼠在禁食过夜后失去了～5-10％体重。如根据1hr时遗留的食物重量所示的，在得到食物后1hr记录摄食测量值。应注意，测定的摄食是在光照阶段即典型地小鼠休息过程的时间和非通常摄食时。最初测试后，使小鼠休息1周，可不受限制地取食。在休息周后，根据表5中所示的拉丁方设计再测试小鼠。
表5.拉丁方设计用于确定野生型和ORL敲除小鼠中新ORL拮抗剂的厌食作用的剂量响应曲线
Figure BDA00001645704900881
基本上如上所述测定有代表性的化合物，发现显著地减少了小鼠中禁食诱导的摄食过度。基本上如上所述测定实施例62、23和53，发现基本上阻断了禁食诱导的摄食过度。在ORL-1敲除小鼠品系中未观察到这种效应，显示这种效应通过ORL-1受体介导。5-HT2C激动剂mCPP用作阳性对照，发现等同地显著减少了禁食诱导的野生型和ORL-1敲除小鼠品系中禁食诱导的摄食过度。照此，预计本发明的化合物用于治疗超重和/或肥胖和/或体重维持例如治疗摄食过度。
大鼠硬脑膜血浆蛋白外渗(PPE)模型-口服给药方案
制备全部测试化合物在包含2.0％Captisol的25mM磷酸盐缓冲液(pH2.0)的溶液的媒介物中的溶液。将阳性对照化合物舒马普坦溶于盐水。使用测试化合物、舒马普坦或媒介物、通过口腔管饲法(2mL/kg)给予来自Harlan Laboratories(250-350g)的禁食过夜的雄性Sprague-Dawley大鼠。剂量后50min.，用戊巴比妥(60mg/kg，ip)麻醉大鼠，放入具有设定在-2.5mm的切开棒的立体定位架。中线弧矢头皮切开后，通过颅骨钻2对双侧孔3.2mm向后，1.8和3.8mm侧面，全部坐标涉及冠矢点)。除在顶部外绝缘的不锈钢刺激电极对(Rhodes Medical Systems Inc)通过两侧半球降至低于硬膜下9.2mm深度。
在电极刺激三叉神经节前2分钟将异硫氰酸荧光素(FITC)染料-标记的牛血清白蛋白(BSA)(FITC-BSA)(20mg/kg，iv)溶液注入股静脉以起到蛋白质外渗标记的作用。给予测试化合物或媒介物后6分钟，以1.0mA的电流强度(5Hz，5分钟期限)将左侧三叉神经节电刺激5分钟。
刺激后5分钟，通过放血处死大鼠，同时还用40mL盐水冲洗血管外残留的FITC/BSA。取出颅骨顶部以采集硬膜。从两侧半球中取出膜样品，用水冲洗，在显微镜载玻片上展平。用载物片加温器将载玻片干燥15分钟，用70％甘油/水溶液覆盖-润滑。
安装光栅单色光镜和分光光度计的荧光显微镜用于对每一硬膜样品中FITC-BSA染料的量进行定量。给显微镜安装与个人计算机有界面接口的动力化平台。这有利于计算机控制的平台运动，其中在每一硬膜样品上的25个点(500μm阶梯)处进行荧光测定。三叉神经节的电刺激诱导的外渗是同侧效应(仅在其中刺激三叉神经节的硬膜的一侧上发生)。这使得硬膜的另一(未刺激的)半用作对照组。计算外渗比(是来自刺激侧的硬膜中的外渗量与未刺激侧的外渗量之比)。单独给予媒介物或非有效剂量测试化合物的动物具有的外渗比约为2，而完全有效治疗产生的比值约为1。
将结果表示为平均值与平均值的标准误差(±SEM)。使用ANOVA、然后通过Dunnett法与对照组比较进行全部统计学评价。当p＜0.05时推定具有统计学显著性。使用JMP统计学分析软件(SAS Research Institute，6.0.2版)进行统计学分析。
基本上如上所述测试实施例62的化合物，发现以剂量依赖性方式阻断外渗(参见下表5)。作为结果，预计本发明的化合物用于治疗偏头痛。
  治疗(po)   外渗比(平均值)   s.e.m.   n
  媒介物   1.91   0.04   4
  实施例62(0.1mg/kg)   1.83   0.06   3
  实施例62(1.0mg/kg)   1.44＊   0.08   3
  实施例62(10.0mg/kg)   1.20＊   0.03   3
  实施例62(30.0mg/kg)   1.14＊   0.05   3
  舒马普坦(1.0mg/kg)   1.06＊   0.01   3
表5.实施例62的化合物的大鼠硬脑膜血浆蛋白外渗测定(PPE)。
＊与媒介物相比的统计学显著性。
对反应代谢物形成的稳定性
在先的文献启示反应性代谢物形成与称作特异性药物反应(IDR)的临床毒性之间的相关性，不过，尚未建立直接的原因作用。推断反应性代谢物可能在临床IDR中起作用，从而将氧化性生物活化的可能性降至最低被指定为改善包含与这种反应性相关的结构特征的化合物的总体安全性的方式(参见Baillie，Thomas A.，Approaches to the Assessment of Stable andChemically Reactive Drug Metabolites in Early Clinical Trials，ChemicalResearch in Toxicology，vol 22(2)2009.)。为了这一目的，使用大鼠肝微粒体俘获测定筛选本发明的有代表性的化合物和相关化合物，使用谷胱甘肽作为内源性亲核体，以理解噻吩基部分的氧化性生物活化的可能性。在测试的化合物中，发现那些其中R2a和R2b是氢的化合物显示谷胱甘肽缀合物形成的证据，启示噻吩基部分上氧化。在测试的化合物中，发现那些其中R2a和R2b是氟的化合物未显示谷胱甘肽缀合物形成(参见下表3)。对包含孪位二氟的分子而言缺乏谷胱甘肽缀合物形成启示包含孪位二氟的取代基在本测定中减少了所测试的生物活化的固有化学习性。
表3.在肝微粒体同源物中谷胱甘肽缀合物形成
Figure BDA00001645704900911
尽管能够不经任何配制直接施用用于本发明方法的化合物，但是通常将该化合物以药物组合物的形式施用，所述的药物组合物包含至少一种式I的化合物或其药学可接受的盐作为活性成分和至少一种药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。可以通过各种途径施用这些组合物，包括口服、鼻内、透皮、皮下、静脉内、肌内和肺。这种药物组合物及其制备方法是本领域众所周知的。例如，参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy(University of the Sciences in Philadelphia，ed.，第21版，Lippincott Williams & Wilkins Co.，2005)。
优选将组合物配制成单位剂型，每一剂量包含约0.1-约500mg、更通常地约1.0-约200mg，例如约5-50mg的活性成分。术语″单位剂型″指适合于作为用于人体个体和其他哺乳动物的物理分散单元，每一单元包含预定量的经计算产生期望的治疗效果的活性物质与至少一种适合的药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
式I的化合物一般在宽剂量范围内是有效的。例如，每天剂量通常在约0.01-约50mg/kg、更通常地约0.05-5.0mg/kg和例如0.1-1.0mg/kg体重的范围。在一些情况中，低于上述范围下限的剂量水平可能超出了足够的水平，而在其他情况中，仍然可以使用较大的剂量，但不会导致任何有害副作用，且由此上述剂量范围并非预以以任何方式限制本发明的范围。将要被理解的是实际施用的化合物的量由临床医师根据相关情况确定，包括所治疗的病症、选择的施用途径、实际化合物或施用的化合物、个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重性。

Claims (15)

1.下式的化合物或其药学可接受的盐：
Figure FDA00001645704800011
其中
R1是氟或氯；
R2a和R2b各自是氢或各自是氟；
R3是氢、甲基、羟基甲基或(C1-C3)烷氧基甲基；
R4选自氟、氯、氰基、氰基甲基、(C1-C3)烷基、环丙基、羟基甲基、甲氧基、环丙基甲氧基、氨基羰基甲氧基、(C1-C3)烷氧基甲基、环丙基氧基甲基、环丙基甲氧基甲基、1-羟基-1-甲基乙基、氨基羰基氧基甲基、甲基氨基羰基氧基甲基、二甲基氨基羰基氧基甲基、氨基羰基、氨基羰基甲基、-CH2-NR5R6、羟基亚胺、甲氧基亚胺、吗啉-4-基、吗啉-4-基甲基、Ar1、-CH2Ar1、四氢呋喃-2-基、3-氧代吗啉-4-基甲基、2-氧代吡咯烷-1-基甲基和2-氧代哌啶-1-基甲基；
R5是氢、C1-C3烷基、氰基甲基、-C(O)CH3或氨基羰基甲基；
R6是氢或甲基；且
Ar1是选自咪唑-1-基、咪唑-2-基、2-甲基咪唑-1-基、吡唑-1-基、1，2，3-三唑-1-基；1，2，3-三唑-2-基；1，2，4-三唑-1-基、异噁唑-3-基、噁唑-5-基和3-甲基-1，2，4-噁二唑-5-基的部分。
2.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中R1是氯。
3.权利要求1或2的化合物或其药学可接受的盐，其中R2a和R2b各自是氟。
4.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中R1是氟，且R2a和R2b各自是氢。
5.权利要求1-4的任意一项的化合物或其药学可接受的盐，其中R3是甲基。
6.权利要求1-5的任意一项的化合物或其药学可接受的盐，其中R4是氟、羟基甲基、甲氧基甲基或吡唑-1-基甲基。
7.根据权利要求1的化合物，其是
[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇；
2-氯-4，4-二氟-1′-[[3-甲基-1-[3-(吡唑-1-基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]；或
[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇；或其药学可接受的盐。
8.根据权利要求1的化合物，其是[2-[4-[(2-氯-4，4-二氟-螺[5H-噻吩并[2，3-c]吡喃-7，4′-哌啶]-1′-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇或其药学可接受的盐。
9.药物组合物，其包含根据权利要求1-8的任意一项的化合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.权利要求9的药物组合物，其还包含至少一种其他的治疗成分。
11.权利要求10的药物组合物，其中另一种治疗成分是SSRI抗抑郁药。
12.根据权利要求1-8的任意一项的化合物或其药学可接受的盐，其用于疗法。
13.根据权利要求1-8的任意一项的化合物或其药学可接受的盐，其用于治疗人的肥胖或超重。
14.根据权利要求1-8的任意一项的化合物或其药学可接受的盐，其用于治疗偏头痛。
15.根据权利要求1-8的任意一项的化合物或其药学可接受的盐，其用于治疗抑郁症。
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