TWI465453B - 作為ｏｒｌ－１受體拮抗劑之螺哌啶化合物 - Google Patents

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Description

作為ORL-1受體拮抗劑之螺哌啶化合物
孤啡肽FQ(Orphanin FQ)(OFQ)/痛敏肽(Nociceptin)係具有17個胺基酸之肽，其對ORL1 G蛋白偶聯受體(GPCR)具有高親和力。ORL1受體係A類GPCR，其主要在中樞神經系統及周圍神經系統、以及胃腸道、平滑肌及免疫系統中表現。儘管在結構上與阿片樣肽/受體有關，但OFQ/痛敏肽系統在體內與典型阿片樣肽/受體不表現顯著交叉反應性，且表現抗阿片樣物質活性(例如，已報導ORQ/痛敏肽可表現抗痛敏特性)。
在使用抑鬱症及攝食行為動物模型之多種研究中，痛敏肽/孤啡肽FQ受體(NOC/OFQ)拮抗劑、尤其ORL-1受體之拮抗劑已顯示抗抑鬱活性及厭食活性。因此，業內認為ORL-1拮抗劑可用於治療抑鬱症及/或治療超重、肥胖症，及/或在超重或肥胖症治療後維持體重。
WO 2003/095427闡述某些作為ORL-1拮抗劑之螺哌啶基化合物，其用作鎮痛藥。
Yoshizumi,Takashi等人(2008),Design,synthesis,and structure-activity relationship study of a novel class of ORL-1 receptor antagonists based on N-biarylmethyl spiropiperidine,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters第18卷，第3778-3782頁闡述某些作為選擇性ORL-1拮抗劑之N-聯芳基甲基-螺哌啶化合物。
本發明提供4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]化合物家族，其對ORL-1受體具有高拮抗劑效能且在CNS中具有高體內ORL-1受體佔有率。另外，某些化合物具有有利的心臟毒性特徵，如藉由相對於hERG通道活性的選擇性所確定，且具有相對於其他生理上重要之受體(例如μ、κ及δ阿片樣物質受體、血清素受體及多巴胺受體)之高選擇性。此外，某些本發明化合物具有有利的生物醫藥及藥代動力學特性(例如溶解度、經口暴露及CNS滲透性)。某些本發明化合物表現降低之氧化代謝，從而獲得有利的經口生物利用度。某些化合物已經由動物模型證實，本發明化合物可用於治療偏頭痛。
本發明提供式I化合物：
其中R1 　係氟或氯；R2a 及R2b 各自為氫或各自為氟；R3 　係氫、甲基、羥甲基、或(C1 -C3 )烷氧基甲基；R4 　選自由以下組成之群：氟、氯、氰基、氰基甲基、(C1 -C3 )烷基、環丙基、羥甲基、甲氧基、環丙基甲氧基、胺基羰基甲氧基、(C1 -C3 )烷氧基甲基、環丙氧基甲基、環丙基甲氧基甲基、1-羥基-1-甲基乙基、胺基羰氧基甲基、甲基胺基羰氧基甲基、二甲基胺基羰氧基甲基、胺基羰基、胺基羰基甲基、-CH2 -NR5 R6 、羥基亞胺、甲氧基亞胺、嗎啉-4-基、嗎啉-4-基甲基、Ar1 、-CH2 Ar1 、四氫呋喃-2-基、3-側氧基嗎啉-4-基甲基、2-側氧基吡咯啶-1-基甲基及2-側氧基哌啶-1-基甲基；R5 　係氫、C1 -C3 烷基、氰基甲基、-C(O)CH3 、或胺基羰基甲基；R6 　係氫或甲基；且Ar1 係選自由以下組成之群之部分：咪唑-1-基、咪唑-2-基、2-甲基咪唑-1-基、吡唑-1-基、1,2,3-三唑-1-基、1,2,3-三唑-2-基、1,2,4-三唑-1-基、異噁唑-3-基、噁唑-5-基及3-甲基-1,2,4-噁二唑-5-基；或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥上可接受之鹽以及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在本發明此態樣之一實施例中，該醫藥組合物進一步包含至少一種額外治療性成份，如例如SSRI抗抑鬱藥，如例如氟西汀(fluoxetine)。此外，本發明此態樣提供適於治療抑鬱症之醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及一或多種其醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在本發明此態樣之另一實施例中，提供適於治療超重、肥胖症及/或維持體重之醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及一或多種其醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。另一實施例提供適於治療偏頭痛之醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及一或多種其醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
本發明亦提供治療哺乳動物之抑鬱症之方法，其包含向需要該治療之哺乳動物投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。另一實施例提供治療哺乳動物之抑鬱症之方法，其包含向需要該治療之哺乳動物投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽及有效量之SSRI抗抑鬱藥或其醫藥上可接受之鹽，如例如氟西汀。本發明其他實施例提供治療超重及/或肥胖症之方法，及/或維持體重之方法，其包含向需要該治療之哺乳動物投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。在本發明該等態樣之一具體實施例中，哺乳動物係人類。
本發明亦提供用於治療之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。在此態樣內，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療哺乳動物、尤其人類之抑鬱症。本發明亦提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及SSRI抗抑鬱藥或其醫藥上可接受之鹽(如例如氟西汀)，其用於治療哺乳動物、尤其人類之抑鬱症。此外，本發明此態樣包括以下中之任一者：式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療超重；式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療肥胖症；式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其尤其在超重或肥胖症治療後用於體重之維持(用於維持體重)；式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療偏頭痛。
本發明另一態樣提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療抑鬱症之藥物。本發明另一實施例提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療超重、肥胖症及/或維持體重之藥物。本發明另一實施例提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療偏頭痛之藥物。
本發明化合物係鹼，且因此可與多種有機酸及無機酸反應而形成醫藥上可接受之鹽。本申請案範圍內涵蓋每種本發明化合物之醫藥上可接受之鹽。本文所用術語「醫藥上可接受之鹽」係指式I化合物之對活有機體實質上無毒性之任何鹽。該等鹽包括彼等列示於Journal of Pharmaceutical Science ,66,2-19(1977)中且為熟習此項技術者已知者。
本文所用縮寫定義如下：「BSA」意指牛血清白蛋白。
「mCPP」意指間氯苯哌嗪，其係一種非選擇性血清素受體激動劑。
「EDTA」意指乙二胺四乙酸。
「EGTA」意指乙二醇四乙酸。
「GTP」意指鳥苷三磷酸。
「HEPES」意指4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
「HPLC」意指高壓液相層析。
「IC50 」意指達成最大抑制之50%時的濃度。
「LC/MS」意指依次實施液相層析及質譜。
「LC/MS/MS」意指依次實施液相層析及質譜及二次電離質譜。
「mFST」意指小鼠強迫游泳測試；抗抑鬱藥活性之動物模型。
「MS」意指質譜。
「MS(ES+)」意指使用電噴霧電離實施之質譜。
「NMR」意指核磁共振。
「RO示蹤劑」意指2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)-N,N-二甲基-丙醯胺。
「RO」意指受體佔有率。
「SCX管柱」意指強陽離子交換管柱。
「SNAr」意指芳香族親核取代。
「SSRI」意指選擇性血清素再吸收抑制劑。
「tBu」意指第三丁基部分。
「TLC」意指薄層層析。
「XRD」意指X-射線繞射。
本發明較佳化合物係如下化合物，其中：
1)　R1 係氯；
2)　R2a 及R2b 各自為氟；
3)　R1 係氯且R2a 及R2b 各自為氟；
4)　R1 係氟且R2a 及R2b 各自為氫；
5)　R3 係氫、甲基、羥甲基或甲氧基甲基；
6)　R3 係甲基；
7)　R3 係羥甲基；
8)　R1 係氯，R2a 及R2b 各自為氟，且R3 係甲基；
9)　R1 係氯，R2a 及R2b 各自為氟，且R3 係羥甲基；
10) R4 係氟、羥甲基、甲氧基甲基或吡唑-1-基甲基；
11) R4 係氟；
12) R4 係羥甲基；
13) R4 係甲氧基甲基；
14) R4 係吡唑-1-基甲基；
15)較佳實施例1)至9)中之任一項，其中R4 係氟；
16)較佳實施例1)至9)中之任一項，其中R4 係羥甲基；
17)較佳實施例1)至9)中之任一項，其中R4 係甲氧基甲基；
18)較佳實施例1)至9)中之任一項，其中R4 係吡唑-1-基甲基。
某些較佳化合物係[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇；2-氯-4,4-二氟-1'-[[3-甲基-1-[3-(吡唑-1-基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]；及[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇；或其醫藥上可接受之鹽(即實例1、23、53、62及63)。
本發明一尤佳化合物係[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇或其醫藥上可接受之鹽，如例如L-酒石酸鹽及/或HCl鹽，如實例1、62及63中所例示。
R2a 及R2b 各自為氟之化合物較佳，此乃因該等化合物具有更有利之藥代動力學特徵，其對氧化代謝更穩定。此具有改良化合物之經口生物利用度之整體效果。
通用化學方法
本發明化合物可藉由業內熟知且瞭解之方法根據以下合成方案來製備。該等方案中各步驟之適宜反應條件為業內所熟知，且溶劑及共試劑之適當取代為業內所熟知。同樣，熟習此項技術者應瞭解，根據需要或期望可藉由各種熟知技術來分離及/或純化合成中間體，且各種中間體經常可經很少純化或不經純化即直接用於後續合成步驟中。此外，熟習此項技術者應瞭解，在一些情形下，引入各部分之順序並不重要。製造式I化合物所需步驟之特定順序取決於所合成之特定化合物、起始化合物及經取代部分之相對不穩定性，該等因素為熟習此項技術者所熟知。除非另有說明，否則所有取代基皆如先前所定義且所有試劑皆為業內所熟知且瞭解。
藉由使用還原性胺化反應條件，使化合物III與經適當取代之吡唑甲醛及諸如三乙醯氧基硼氫化鈉等還原劑在諸如四氫呋喃等適宜溶劑中於環境溫度下反應，以提供化合物II。在適宜偶聯條件下，用諸如碘化銅等適宜觸媒、諸如碳酸鉀等適宜鹼在諸如甲苯等溶劑中於升高溫度下使化合物II與化合物IV(其中Hal係氯、溴或碘)偶聯，從而獲得化合物I'，其中R4' 係R4 或R4 之前體。在化合物IV上之Hal為F或Cl時，親核芳香族取代(SNAr)係製備化合物I'之替代性方法。更具體而言，可在諸如二甲基甲醯胺等適宜溶劑中用諸如碳酸鉀等適宜鹼於升高溫度下使化合物II與化合物IV反應，從而提供化合物I'。化合物III亦可與經適宜取代之醛化合物V在上述還原性胺化條件下反應，從而獲得期望化合物I'。在R4' 係R4 之前體時，隨後藉由已知方法使其轉化為R4 。
化合物IIIa、IIIb及IIIc可如方案2中所示來製備。在諸如二氯甲烷等適宜溶劑中在諸如三氟乙酸等適宜酸存在下使化合物XIV與XV反應。用氫氧化鈉水溶液鹼化所得三氟乙酸鹽以獲得呈游離鹼形式之化合物XIII。在環境溫度下用磺醯氯存於乙酸中之溶液處理存於諸如甲基第三丁基醚等適宜溶劑中之化合物XIII，從而獲得呈鹽酸鹽形式之化合物VIII。然後在熟習此項技術者熟知之條件下用氮保護基團保護化合物VIII，從而獲得化合物VII。(舉例而言，參見：Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis ，第三版，第2及7章，John Wiley and Sons公司，(1999))。通常，保護基團係Boc(第三丁氧基羰基)基團。在諸如氯苯等適宜溶劑中用光源輻照使化合物VII與N-溴琥珀醯亞胺反應，從而獲得溴化物化合物，然後用諸如碳酸氫鈉水溶液等鹼溶液處理，從而提供羥基化合物。可在適宜氧化條件下(例如在溴化鉀、四甲基哌啶-N-氧化物及次氯酸鈉水溶液中)進一步氧化經分離或未經分離之羥基化合物，從而提供期望酮化合物VI。然後在諸如四氫呋喃等適宜溶劑中於升高溫度下使化合物VI與(雙(2-甲基乙基)胺基)三氟化硫反應，使所獲得產物去保護，從而提供化合物IIIa。
用與製備化合物VII所用之方法類似之方法來對式XIII化合物進行保護以獲得化合物XII。在諸如四氫呋喃等適宜溶劑中於降低溫度下用諸如四甲基哌啶鋰等適宜鹼處理化合物XII，之後添加N-氟二苯磺醯胺以提供氟化物化合物，用HCl水溶液使其去保護並用NaOH水溶液進行鹼化，從而提供化合物IIIb。
可藉由與上文製備化合物VI所用相同之方法經由三步式合成(例如溴化、羥基化及氧化)自化合物XII獲得化合物IX。可將各中間體分離為純淨化合物以供進一步反應，或如合成化合物VI中所述不經分離即使其反應。然後用諸如丁基鋰等適宜鹵素-金屬交換試劑在諸如四氫呋喃等適宜溶劑中於降低溫度下處理化合物IX，之後用諸如N-氟二苯磺醯胺等氟化試劑處理以提供期望氟化產物，然後用適宜方式使其去保護，從而獲得期望化合物IIIc。
式V化合物可如方案3中所述來製備。在SNAr或上述用於將化合物II轉化為化合物I'之偶聯條件下，使化合物XVI與化合物XVII反應，從而提供式XV化合物。在Z為酯基時，可首先在諸如四氫呋喃等適宜溶劑中，用諸如氫化鋁鋰等適宜還原劑還原為醇。然後在諸如二氯甲烷等溶劑中，用諸如氧化錳(IV)等適宜氧化劑，將該醇氧化為醛。
在R4' 為R4 之前體時，將R4' 轉化為R4 之反應可包括(但不限於)諸如以下反應：還原性胺化，以提供所需新胺；將酯、酮或醛還原為醇，可將該醇進一步轉化為烷氧基化合物或胺基甲酸酯；將腈還原為醯胺或胺；在適宜條件下將酯轉化為諸如噁二唑等雜環。(更多實例參見：Richard C. Larock,Comprehensive Organic Transformations ，第二版，第2及7章，John Wiley and Sons公司，(1999))。
以下製備及實例闡釋可用於合成本發明化合物之方法。該等製備及實例中所述多種化合物之名稱係按照根據'Symyx Draw3.1'或'Autonom 2000 Name'繪製之結構來提供。
製備1： 4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]
將3-噻吩乙醇(123.03 mL,1.11 mol)添加至N-第三丁氧基羰基-4-哌啶酮(185 g,928.48 mmol)存於二氯甲烷(1300 mL)中之溶液中並在室溫下攪拌。然後逐滴(5 min)添加三氟乙酸(280.82 mL,3.71莫耳)，同時用冰/水浴(內部溫度=14℃-30℃，注意：CO2 排放)冷卻。使反應混合物逐漸升溫至環境溫度並在該溫度下攪拌20 hr。蒸發溶劑，以在真空中冷卻後提供淺褐色結晶固體。固體在甲基第三丁基醚(200 mL)中形成漿液，過濾，用甲基第三丁基醚(2×1000 mL)洗滌並在真空中乾燥，從而提供呈白色固體形式之4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-鎓三氟乙酸鹽，產率為95%。MS=(m/z): 210(M+1)。在冷卻(冰/水浴)的同時，將10 M氫氧化鈉(220.36 mL,2.20 mol)添加至4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-鎓三氟乙酸鹽(285 g,881.44 mmol)存於二氯甲烷(1 L)中之攪拌懸浮液中，且攪拌所得混合物直至獲得二相混合物。分離各相且用二氯甲烷(2×200 mL)萃取水性層。在真空下濃縮經合併之有機層，獲得濃稠油，將其與水一起研磨，獲得淡黃色沉澱。過濾沉澱，用水(300 mL)及己烷(200 mL)洗滌並在真空及35℃下乾燥20 hr，從而產生呈淡黃色固體形式之標題化合物，產率為86%。MS(m/z): 210(M+1)。
製備2： 螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯
在22℃下將螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](60 g,286.6 mmol)在2-甲基四氫呋喃(600 mL)中攪拌10 min。然後，逐滴添加存於2-甲基四氫呋喃(300 mL)中之第三丁氧基羰基第三丁基碳酸酯(65.6 g,301 mmol)。在12 hr後，添加氯化鈉水溶液(250 mL)並分離有機層。用2-甲基四氫呋喃(2×50 mL)將水性層洗滌兩次，且合併有機層並用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮以獲得標題化合物，產率為99%。MS(m/z): 310(M+1)。
製備3： 2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,2-c]吡喃-7,4'-哌啶]
1.2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯
將2,2,6,6-四甲基哌啶(18.7 mL,110.5 mmol)添加至四氫呋喃(200 mL)中，且在氮及-78℃下冷卻溶液。添加丁基鋰存於己烷(37.2 mL,93 mmol)中之2.5 M溶液，且在-78℃下將混合物攪拌30 min。在新鮮的2,2,6,6-四甲基哌啶鋰溶液中添加螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯(20 g,58.2 mmol)存於四氫呋喃(90 mL)中之溶液並將溫度保持在-70℃以下。在20 min後，經由套管添加預先在氮及-20℃下冷卻之N-氟二苯磺醯胺(30.26 g,93.07 mmol)存於四氫呋喃(200 mL)中之溶液。在攪拌1 hr後，添加水(20 mL)及氯化銨(50 mL)水溶液。然後，分離有機層並用甲基第三丁基醚(2×25 mL)將水性層洗滌兩次。合併有機層並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相HPLC使用己烷/甲基第三丁基醚作為溶劑來純化粗材料，從而獲得2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯，產率為50%。MS(m/z): 328(M+1)。
2.2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,2-c]吡喃-7,4'-哌啶]
在45℃下將37%鹽酸(11.75 mL,125.22 mmol)添加至2'-氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯(8.2 g,25.04 mmol)存於異丙醇(57.4 mL)中之溶液中。在45℃下將所得溶液攪拌6.5 hr。將溶劑濃縮為黃色懸浮液。添加水(50 mL)並用5 N氫氧化鈉水溶液鹼化混合物。用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取水性相並用鹽水(50 mL)洗滌經合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮，從而獲得標題化合物，產率為96%。MS(m/z):228(M+1)。
製備4： 2'-氯-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]鹽酸鹽
將4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃](50 g,238.88 mmol)存於乙酸(400 mL)與甲基第三丁基醚(40 mL)之混合物中之溶液冷卻至15℃。然後，在40 min內於該溫度(內部溫度=15℃-22℃)下逐滴添加磺醯氯(21.20 mL,262.77 mmol)存於乙酸(100 mL)中之溶液，並在室溫下將混合物攪拌20 hr。然後，在室溫下逐滴添加磺醯氯(11.56 mL,143.33 mmol)存於乙酸(50 mL)中之溶液。在室溫下將反應混合物攪拌30 min，且隨後將其逐滴添加(30 min)至甲基第三丁基醚(1 L)中，同時用冰/水浴冷卻且攪拌。形成白色懸浮液並過濾固體。為獲得第二批材料，濃縮濾液(經由rotavap再填充甲基第三丁基醚)。使所得固體懸浮於甲基第三丁基醚(300 mL)中，在回流(浴溫：100℃)下攪拌懸浮液並添加甲醇(30 mL)直至形成混濁懸浮液。然後，使懸浮液冷卻至室溫並保持過夜。在冰/水浴中進一步冷卻懸浮液並過濾。用甲基第三丁基醚(50 mL)洗滌固體並將其與第一批產物合併，從而獲得標題化合物，產率為60%。MS(m/z): 244(M+1)。
製備5： 2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]
1.　2-氯螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯
向2-氯螺[4,5-二氫噻吩并[2,2-c]吡喃-7,4'-哌啶]鹽酸鹽(140 g,0.49莫耳)存於二氯甲烷(1.12 L)中之懸浮液中逐份添加三乙胺(67.25 mL,1.05莫耳)、N,N-二甲基-4-吡啶胺(3.05 g,0.025莫耳)及二碳酸二第三丁基酯(111.22 g,0.509莫耳)，且在室溫下將所得混合物攪拌過夜。用1 N HCl(2 x)及水洗滌反應物。經硫酸鎂乾燥有機相，過濾並在減壓下濃縮，從而提供2-氯螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯，產率為53%。MS(m/z): 244(M+1-Boc)。
2.　4'-側氧基-2'-氯-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯
在5 L加套反應器中，在室溫下將N-溴琥珀醯亞胺(115.02 g,639.77 mmol)添加至2-氯螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯(200 g,581.61 mmol)存於氯苯(1.60 L)中之溶液中。用位置幾乎與反應器外壁接觸之3X100 w球泡燈輻照所得懸浮液並將反應器溫度設定為45℃。在4 hr後，添加N-溴琥珀醯亞胺(26.14 g,145.40mmol)並將溫度在40℃下維持15 hr。使反應混合物冷卻至0℃並添加甲基第三丁基醚(500 mL)。過濾固體並將溶液濃縮為約1000 mL氯苯溶液。然後，添加甲基第三丁基醚(1000 mL)，過濾固體並濃縮濾液以提供600 mL氯苯溶液。添加二甲亞碸(806.47 mL,11.35 mol)並在室溫下添加碳酸氫鈉(95.38 g,1.14 mol)。在室溫下攪拌24 hr後，添加水/冰(1000 mL)並分離各相。用水(2×1 L)洗滌有機相並將其濃縮以提供氯苯溶液。然後，添加二氯甲烷(1.2 L)並使混合物冷卻至5℃(冰/水浴)。添加溴化鉀(20.27 g,170.31 mmol)及2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物(4.43 g,28.38 mmol)。然後，在5℃下將用碳酸氫鈉調節為pH=9之6%次氯酸鈉水溶液(644.40 mL,567.68 mmol)添加至反應混合物中，且將所得混合物攪拌1 hr，使之自5℃達到室溫。添加水(1 L)並分離各相。用水(2×0.5 L)洗滌有機相並用冰/水浴冷卻。然後，在5℃下將溴化鉀(2.03 g,17.03 mmol)、2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物(0.05 g,0.32 mmol)及用固體碳酸氫鈉調節為pH=9之6%次氯酸鈉水溶液(128.88 mL,113.54 mmol)添加至反應混合物中，且將所得混合物攪拌1 h，使之自5℃達到室溫。然後，添加水(1 L)並分離各相。用水(2×1 L)洗滌有機相，將其乾燥並濃縮以提供深褐色固體。
將固體與己烷(500 mL)、甲基第三丁基醚/己烷5%(250 mL)及甲基第三丁基醚/己烷10%(250 mL)一起研磨，從而獲得呈淺褐色固體形式之4'-側氧基-2'-氯-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯，產率為66%。MS(m/z): 258(M+1(Boc))。
3.2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯
在裝填有四氫呋喃(81 mL)之500 mL PFA燒瓶中添加(雙(2-甲氧基乙基)胺基)三氟化硫(183.62 g,829.94 mmol)及4'-側氧基-2'-氯-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯(135 g,377.24 mmol)。在70℃下將所得懸浮液攪拌24 h。然後，使其冷卻至室溫並在攪拌下(氣體排放)緩慢傾倒至冰與飽和碳酸氫鈉水溶液(4 L)之混合物中。使用甲基第三丁基醚自燒瓶轉移剩餘材料。在氣體排放停止後，在攪拌下添加固體碳酸氫鈉直至達到pH 8。用甲基第三丁基醚(3×500 mL)萃取所得混合物直至藉由TLC在水性相中檢測不到產物為止。用水(3×500 mL)及鹽水(500 mL)洗滌經合併有機相，經硫酸鈉乾燥並濃縮以提供深色濃稠油(250 g)。使粗材料溶於二氯甲烷並經由矽膠噻過濾，其中用甲基第三丁基醚/己烷10%(6 L)及甲基第三丁基醚/己烷(4 L)洗脫。收集流份直至藉由TLC(20%甲基第三丁基醚/己烷UV，Rf=0.5)檢測不到產物。濃縮濾液以獲得淺褐色固體，在真空及40℃下乾燥直至達到恒重，從而以70%產率提供2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯。MS(m/z): 324(M+1 tBu)。
4.2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]
在45℃下將37%鹽酸(74.12 mL,789.78 mmol)添加至2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯(60 g,157.96 mmol)存於異丙醇(420 mL)中之溶液中。在45℃下將所得溶液攪拌15 h。然後，將混合物濃縮至1/4體積以提供白色懸浮液。添加水(100 mL)並用6 N氫氧化鈉水溶液鹼化懸浮液以獲得二層混合物，用甲基第三丁基醚(3×100 mL)對其進行萃取。用鹽水(50 mL)洗滌經合併有機層，經硫酸鈉乾燥並濃縮以提供淺褐色固體，在真空下乾燥至恒重，從而以97%之產率提供標題化合物。MS(m/z): 280(M+1)。
製備6： 2,4,4-三氟螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
1.2-溴-4-羥基-螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯
將N-溴琥珀醯亞胺(2.2當量)添加至螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯(13.5 g)存於氯苯(108 mL)中之溶液中。用260 w球泡燈過夜輻照所得懸浮液。將更多N-溴琥珀醯亞胺(1.7 g)添加至混合物中並用260 w球泡燈將混合物輻照3小時。在減壓下去除溶劑以獲得殘餘物，使其溶於丙酮(650 mL)中並添加硝酸銀(8.8 g)之水溶液(650 mL)。在室溫及暗環境下將混合物攪拌過夜。過濾混合物並蒸發丙酮。添加乙酸乙酯並用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌有機層。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析(洗脫液：己烷/乙酸乙酯15-60%)純化殘餘物，從而提供2-溴-4-羥基-螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯，產率為38%。MS(m/z)：426/428(M+23/M+2+23)。
2.2'-溴-4'-側氧基-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯
在0℃下將溴化鉀(535.67 mg,4.50 mmol)添加至2-溴-4-羥基-螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-環己烷]-1'-甲酸第三丁基酯(7.28 g)及2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物(281.33 mg,1.80 mmol)存於二氯甲烷(70 mL)中之溶液中。在另一容器中將碳酸氫鈉添加至10%次氯酸鈉水溶液(22.34 mL,36.01 mmol)中直至pH 9。在0℃下逐滴添加此次氯酸鈉-碳酸氫鈉溶液且在0℃下將所得深色懸浮液攪拌15 min。添加二氯甲烷(20 mL)及水(20 mL)並分離各相。用水(20 mL)洗滌有機相並經硫酸鈉乾燥。在減壓下去除溶劑以提供2'-溴-4'-側氧基-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯，產率為99%。MS(m/z)：346/348(M+1 tBu/M+3-tBu)。
3.2-溴-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯
在100 mL過氟烷氧基燒瓶中將(雙(2-甲氧基乙基)胺基)三氟化硫(5.16 mL,27.96 mmol)添加至無水四氫呋喃(3.5mL)中。然後添加2'-溴-4'-側氧基-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁基酯(4.5 g,11.19 mmol)。在70℃下將溶液攪拌過夜。之後，添加甲基第三丁基醚(30 mL)，且將反應混合物小心地傾倒在於冰浴中冷卻之碳酸氫鈉(飽和水溶液)中。觀察到CO2 排放且添加碳酸氫鈉(飽和水溶液)直至pH 8。用甲基第三丁基醚萃取混合物。傾析有機層，用鹽水(2 x)洗滌，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析(用甲基第三丁基醚/己烷洗脫)純化粗材料，從而產生3.2 g 2-溴-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯。MS(m/z)：368/370(M+1-tBu/M+3-tBu)。
4.2,4,4-三氟螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯
在氮及-78℃下將存於己烷中之2.5 M丁基鋰(47 mL)添加在2-溴-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯(1.99 g,4.69 mmol)存於四氫呋喃(50 mL)中之溶液中。在-78℃下將混合物攪拌1小時並添加固體N-氟二苯磺醯胺(3.69 g,11.73 mmol)。使混合物升溫至室溫並在室溫下攪拌過夜。添加飽和氯化銨水溶液並用乙酸乙酯萃取有機相，經硫酸鈉乾燥並在減壓下去除溶劑。藉由正相Isco層析(己烷/乙酸乙酯3-12%)純化粗材料，從而產生1.3 g 2,4,4-三氟螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯，藉由HPLC進一步純化以獲得0.818 g該化合物。MS(m/z): 308(M+1-tBu)。
5.2,4,4-三氟螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
使2,4,4-三氟螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-甲酸第三丁基酯(2.00g,5.50 mmol)溶於鹽酸(4 N，存於二噁烷中)(10 mL,40 mmol)中。在室溫下將混合物攪拌1 h且隨後使其流經50 g SCX藥筒(固體陽離子交換)，從而在蒸發甲醇流份中之2 N氨後產生1.3 g標題化合物。MS(m/z): 264(M+1)。
製備7： 2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
向2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶(105 g,375 mmol)存於四氫呋喃(1.58 L)中之溶液中添加3-甲基-1H-吡唑-4-甲醛(43.40 g,394.12 mmol)並在室溫下將混合物攪拌1 hr。然後，分3份添加三乙醯氧基硼氫化鈉(95.46 g,450.42 mmol)粉末。在室溫下將混合物攪拌15 h。然後，將反應混合物傾倒在冰-碳酸氫鈉飽和水溶液(400 mL)中。分離各相。用乙酸乙酯(100 mL)萃取水性相。用50%鹽水洗滌經合併有機層且在有機相中沉澱出固體。濃縮有機相以獲得170 g標題化合物。MS(m/z): 374(M+1)。
製備8-11之化合物基本上係如製備7中所述使用1,2-二氯乙烷作為溶劑來製備。
製備12： 2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛
向250 mL燒瓶中添加碘化銅(I)(1.91 g,10.03 mmol)、2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](25 g,66.87 mmol)、碳酸鉀(19.60 g,140.43　mmol)、甲苯(50 mL)及攪拌棒。藉由5個真空/再填充循環來使反應混合物脫氣。然後，添加2-溴-3-甲醯基吡啶(18.66 g,100.31 mmol)及反-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(3.16 mL,20.06 mmol)。在室溫下將反應物攪拌5分鐘。然後，將其浸沒於預加熱之115℃油浴中並在該溫度下攪拌15 h。使反應混合物冷卻至室溫，用300 mL乙酸乙酯稀釋並經由矽藻土過濾。用乙酸乙酯(100 mL)及氫氧化銨水溶液(3%)(4×100 mL)洗滌以移除痕量銅，且隨後用水(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥溶液。在真空中蒸發溶劑以獲得褐色固體。使用2-丙醇/二氯甲烷(3%至5% 2-丙醇)作為洗脫液經由矽膠墊過濾固體，從而獲得標題化合物，產率為69%。MS(m/z): 479(M+1)。
製 備13： 2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛
製備13之化合物基本上係如製備12中所述使用2-溴吡啶-3-甲醛及2-氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]來製備。藉由正相Isco層析純化殘餘物，從而以83%獲得標題化合物。MS(m/z): 427(M+1)。
製備14： N-[(2-氯-3-吡啶基)甲基]乙醯胺
在室溫下向(2-氯-3-吡啶基)甲胺(300 mg,2.10 mmol)存於二氯甲烷(2 mL)中之溶液中添加乙酸酐(198.88 μL,2.10 mmol)及三乙胺(293.26 μL,2.10 mmol)。在1 h後，用飽和碳酸氫鈉水溶液使反應物驟冷並用二氯甲烷萃取。分離有機層，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑，從而提供184 mg N-[(2-氯-3-吡啶基)甲基]乙醯胺。MS(m/z): 185(M+1)。
製備15： 甲磺酸(2-溴-3-吡啶基)甲基酯
1.　(2-溴-3-吡啶基)甲醇
向含有2-溴-3-吡啶-甲醛(22.15 g,119.08 mmol)及甲醇(200 mL)之2L圓底燒瓶(配備有攪拌棒，在氮及0℃下)中分三份添加硼氫化鈉(1.35 g,35.72 mmol)。在1 h後，在0℃下添加水(200 mL)並在減壓下濃縮反應物以移除甲醇。使所得殘餘物溶於乙酸乙酯中並用水(200 mL)洗滌。用鹽水洗滌有機萃取物，經硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮以提供呈白色固體形式之22 g(2-溴-3-吡啶基)甲醇。MS(m/z): 188(M+1),190(M+3)。
2.　甲磺酸(2-溴-3-吡啶基)甲基酯
在0℃下將三乙胺(8.90 mL)添加至含有(2-溴吡啶-3-基)甲醇(8 g,42.55 mmol)存於二氯甲烷(212 mL)中之溶液之圓底燒瓶中，然後添加甲磺醯氯(3.95 mL)並在該溫度下將混合物攪拌1.5 h。之後用水洗滌混合物並傾析有機層，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑，從而產生10.4 g標題化合物，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z)：266,268(M+1；M+3)。
製備16： 2-(2-溴-3-吡啶基)丙-2-醇
使二異丙基醯胺鋰(2 M,12.5 mL,25 mmol)溶於四氫呋喃(40 mL)中並冷卻至-78℃。逐滴添加2-溴吡啶(3.9 g,25 mmol)並將反應物攪拌3 hr，之後添加丙酮(1 mL，經剛活化之分子篩乾燥)並使其升溫至室溫。用飽和氯化銨中之反應並用乙酸乙酯萃取。經硫酸鎂乾燥有機層並蒸發。經由急驟管柱層析(用20%己烷/第三丁基甲基醚洗脫)在二氧化矽上純化殘餘物，從而獲得標題化合物(1.4 g,26%)。1 H-NMR(d6 -二甲亞碸)：8.23(dd,J=1.9,4.5 Hz,1H),8.19(dd,J=2.0,7.8 Hz,1H),7.44(dd,J=4.5,7.7 Hz,1H),5.43(s,1H),2.12(s,1H),1.46(s,6H)。
製備17： 3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
將硫酸(18 mL,337.69 mmol)添加至1H-吡唑-4-甲酸3-甲基酯(10 g,79.29 mmol)存於乙醇(90 mL)中之懸浮液中，並在85℃下將混合物攪拌20 h。之後，部分移除溶劑。用1 M氫氧化鈉溶液將殘餘物鹼化至pH 6-7並用二氯甲烷萃取。傾析有機層，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑，從而獲得10.3 g標題化合物，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 155(M+1)。
製備18： 2-氟吡啶-3-甲酸甲酯
在氮氣氛及-78℃下將2 M二異丙基醯胺鋰(11.3 mL,22.5 mmol)緩慢添加在2-氟吡啶(2 g,20.5 mmol)存於四氫呋喃(90 mL)中之溶液中。在4 h後，在該溫度下添加氯甲酸甲酯(1.9 mL,24.6 mmol)並在-78℃下將混合物再攪拌1小時，且使其達到室溫並保持過夜。將反應混合物緩慢傾倒在水中並在二乙醚中萃取。用鹽水洗滌有機層，經硫酸鈉乾燥並在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析(用己烷/二乙醚(9/1)洗脫)純化殘餘物，從而獲得495.2 mg標題化合物。MS(m/z): 156(M+1)。
製備19： 1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛
將第三丁醇鉀(29.25 g,260.68 mmol)添加至3-甲基-1H-吡唑-4-甲醛(26.00 g,236.12 mmol)存於二甲基甲醯胺(250 mL)中之經水浴冷卻之溶液中。在室溫下將混合物攪拌10 min。然後，添加2,3-二氟吡啶(25 g,217.24 mmol)並在室溫下將混合物攪拌20 hr。將混合物傾倒在冰/水混合物中並在乙酸乙酯(3×20 mL)中萃取。經硫酸鎂乾燥有機層並在真空中蒸發溶劑。藉由矽膠層析使用己烷/異丙醇作為洗脫液來純化殘餘物，從而提供含有殘餘二甲基甲醯胺之粗材料。然後使材料溶於乙酸乙酯(100 mL)中並用水(3×20 mL)洗滌。用乙酸乙酯(2×20 mL)萃取水性相。經硫酸鈉乾燥經合併有機層並濃縮，從而獲得19 g標題化合物。MS(m/z): 206(M+1)。
製備20： 2-(4-甲醯基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-甲腈
製備20之化合物基本上係如製備19中所述使用3-甲基-1H-吡唑-4-甲醛及2-氟吡啶-3-甲腈來製備。以23%之產率獲得標題化合物。MS(m/z): 213(M+1)。
製 備21： 2-(4-甲醯基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-甲酸甲酯
在60℃下將3-甲基-1H-吡唑-4-甲醛(300 mg,2.72 mmol)、碳酸鉀(565 mg,4.08 mmol)、2-氟吡啶-3-甲酸甲酯(507 mg,3.27 mmol)與二甲基甲醯胺(2 mL)之混合物攪拌16 h。添加水並在乙酸乙酯中萃取化合物。用鹽水洗滌有機層，經硫酸鈉乾燥並蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用己烷：乙酸乙酯(2:1)作為洗脫液來純化粗混合物，從而產生422 mg標題化合物。MS(m/z): 246(M+1)。
製備22-23之化合物基本上可如製備21中所述使用相應的2-氯吡啶基試劑來製備。
製備24： 1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛
1.1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯
此化合物基本上係如製備7中所述使用1-(3-甲醯基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯及二甲胺以95%之產率來製備，且在聚集後不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 289(M+1)。
2.2.[1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇
在氮下向1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(217.7 g,0.75 mmol)存於四氫呋喃(5 mL)中之冷卻至0℃之溶液中添加存於四氫呋喃(0.9 mL,0.9 mmol)中之1 M氫化鋁鋰，且在該溫度下將混合物攪拌5分鐘。使用氯化銨飽和水溶液使反應物驟冷且使用乙酸乙酯萃取粗材料。分離有機層，經硫酸鈉乾燥並在真空中蒸發溶劑。在此具體實例中，化合物在有機萃取中並未分離，且最終用SCX藥筒自水溶液分離，從而提供146 mg(78%)[1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 247(M+1)。
3.1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛
在室溫下將3,3,3-三乙氧基-3-碘代四氯苯酞(0.553 g,1.3 mmol)添加至[1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇(0.146 g,0.59 mmol)存於二氯甲烷(4 mL)中之溶液中。在1小時後，藉由添加2 N碳酸鈉溶液來使反應物驟冷並在二氯甲烷中萃取化合物。分離有機層，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑，從而提供126 mg 1-[3-(二甲基胺基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 245(M+1)。
製備25： 1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-甲醛
1.3-(溴甲基)-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-4-甲酸乙酯
在室溫下向1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(10.2 g,40.9 mmol)存於氯苯(205 mL)中之溶液中添加N-溴琥珀醯亞胺(8 g)。在室溫下攪拌反應混合物並在100 W燈下輻照過夜。然後添加更多N-溴琥珀醯亞胺(2 g)，且在2 hr後，未檢測到起始材料。過濾固體並蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用二氯甲烷及甲醇作為洗脫液來純化粗材料，從而獲得5.3 g 3-(溴甲基)-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：328；330(M+1；M+3)。
2.1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-甲酸異丙酯
向3-(溴甲基)-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-4-甲酸乙酯(1.5 g,4.57 mmol)存於丙-2-醇(23 mL)中之溶液中添加異丙醇鋰(3.02 g)且在室溫下將混合物攪拌過夜。之後分三份(每份1.5 g，每16小時一份)添加更多異丙醇鋰(4.5 g)。在最後一次添加後，最後在40℃下將反應混合物攪拌16小時。蒸發溶劑並使殘餘物溶於乙酸乙酯中並用鹽水洗滌。傾析有機層並經硫酸鈉乾燥。蒸發溶劑並藉由正相Isco層析使用二氯甲烷及甲醇作為洗脫液純化殘餘物，從而獲得317 mg 1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-甲酸異丙酯。MS(m/z): 322(M+1)。
3.[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇
在氮下向1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-甲酸異丙酯(316 mg,0.98 mmol)存於二乙醚(4.9 mL)中之冷卻至0℃之溶液中添加存於四氫呋喃(1.2 mL)中之1 M氫化鋁鋰。在0℃下將混合物攪拌1小時。添加水(46 μL)並攪拌5 min，隨後依次添加15% NaOH水溶液(46 μL)及水(138 μL)。過濾固體並蒸發溶劑，從而獲得241 mg[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 266(M+1)。
4.1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-甲醛
在室溫下將[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇(241 mg；0.91 mmol)與氧化錳(IV)(791 mg)之混合物在二氯甲烷(5 mL)中攪拌過夜。之後，經矽藻土過濾反應混合物並蒸發溶劑，從而獲得197 mg標題化合物，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 264(M+1)。
製備26： 1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-甲醛
1.　1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯
向3-溴甲基-1-(3-氟-吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.13 g,3.44 mmol)存於丙酮(23 mL)中之溶液中添加碘化鉀(200.1 mg)、碳酸鉀(865.33 mg)及甲醇(4.18 mL)。在室溫下將混合物攪拌48小時。檢測到期望化合物之甲基酯及乙基酯。蒸發溶劑。用二氯甲烷稀釋殘餘物並用水洗滌。傾析有機層，經硫酸鎂乾燥並蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用乙酸乙酯及己烷作為洗脫液來純化粗材料，從而產生599 mg甲基酯與乙基酯二者之混合物。MS(m/z)：266(M+1)及280(M+1)。
2.　[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇
此化合物基本上係如製備25之步驟3(還原步驟)中所述以93%之產率使用1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯(存於亦含有甲基酯之混合物中)作為起始材料來製備。[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-基]甲醇不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 238(M+1)。
3.　1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(甲氧基甲基)吡唑-4-甲醛
此化合物基本上係如製備25之步驟4(氧化步驟)中所述以91%之產率且使用[1-(3-氟-吡啶-2-基)-3-甲氧基甲基-1H-吡唑-4-基]-甲醇作為起始材料來製備。標題化合物不經進一步純化即使用。MS(m/z): 236(M+1)。
製備27： 3-甲基-1-(3-嗎啉基-2-吡啶基)吡唑-4-甲醛
在微波輻照下(溫度為160℃，升溫時間：2 min，維持時間：10 min，效能：250 W)加熱1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛(230 mg,1.12 mmol)與嗎啉(2 mL,22.93 mmol)之混合物。在真空中去除過量嗎啉並在二氯甲烷中稀釋殘餘物且在飽和碳酸氫鈉水溶液中洗滌。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，並在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用己烷/乙酸乙酯(50%至100%，存於乙酸乙酯中)作為洗脫液純化殘餘物，從而以72%之產率產生標題化合物。MS(m/z): 273(M+1)。製備28： 2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶
在0℃及氮氣氛下向(2-溴吡啶-3-基)甲醇(20 g,106.37 mmol)存於140 mL四氫呋喃中之溶液中添加存於礦物油中之60%氫化鈉(6.38 g,155.5 mmol)。在0℃下將溶液攪拌30分鐘。將碘甲烷(7.95 mL,127.6 mmol)添加在溶液中並在室溫下將混合物攪拌過夜。藉由添加水來使混合物驟冷並用乙酸乙酯萃取粗材料。分離有機層，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑，從而以98%之產率提供2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 202(M+1),204(M+3)。
製備29-30之化合物基本上係如製備28中所述使用相應碘代烷基試劑來製備。
製備31： 2-溴-3-(異丙氧基甲基)-吡啶
1.2-溴-3-(溴甲基)-吡啶 向25 mL Schlenk燒瓶中裝填2-溴-3-吡啶苯甲醇(1 g,5.32 mmol)及二氯甲烷(15 mL)。在鹽水/冰浴中在劇烈機械攪拌下使所得溶液冷卻至0℃。然後逐滴添加三溴化磷(0.55 mL,5.80 mmol)以將溫升控制在10℃以下。得到濃稠漿液，且在添加後移除浴並使漿液升溫至室溫。然後將混合物逐漸加熱至回流並保持3 h，且隨後冷卻至室溫並保持過夜。在預先冷卻至0℃之混合物中添加冰水，且隨後藉由添加2 M碳酸鈉溶液將pH調節至鹼性。分離有機層並用二氯甲烷(2×10 mL)將水溶液洗滌兩次。合併所有有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下蒸發溶劑，從而產生1.2 g 2-溴-3-溴甲基-吡啶，其不經進一步純化即可使用。2.2-溴-3-(異丙氧基甲基)-吡啶 在0℃下向異丙醇(7.31 mL,95.65 mmol)存於二甲基甲醯胺(50 mL)中之溶液中添加氫化鈉(3.63 g,90.87 mmol)，並在室溫下將混合物攪拌30分鐘(在此反應進行時使用護罩作為特殊保護)。然後，經由注射器添加存於10 mL二甲基甲醯胺中之2-溴-3-溴甲基-吡啶(6 g,23.91 mmol)，並在室溫下將混合物攪拌1 h。添加水並用乙酸乙酯萃取混合物，用鹽水及水洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用乙酸乙酯及己烷作為洗脫液(梯度為5%至25%乙酸乙酯)來純化粗材料，從而產生3.67 g標題化合物。MS(m/z)：230,232(M+1,M+3)。
製備32： 2-(2-溴-3-吡啶基)乙腈
攪拌2-溴-3-溴甲基-吡啶(840 mg,3.35 mmol)與氰化鈉(187.99 mg,3.68 mmol)之混合物並在水(10 mL)-乙醇(2 mL)混合物中使其回流1 h。用二氯甲烷稀釋反應混合物並用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。分離有機層，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑，從而獲得83%標題化合物，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 197(M+1),199(M+3)。製備33： 1-[3-(環丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛
1.1-[3-(羥甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯 向1-(3-甲醯基-吡啶-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1 g,3.9 mmol)存於甲醇(25 mL)中之溶液中添加硼氫化鈉(220.2 mg,5.8 mmol)。在室溫下將混合物攪拌2 hr。去除溶劑並將粗材料溶於乙酸乙酯中，並用飽和氯化銨水溶液來洗滌。分離有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下蒸發溶劑，從而獲得1 g 1-[3-(羥甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z): 262(M+1)。2.3-甲基-1-[3-(乙烯氧基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-甲酸乙酯 使三氟乙酸鈀(II)(5.1 mg,15.3 μmol)及4,7-二苯基-菲咯啉(5.1 mg,15.3 μmol)溶於正丁基乙烯基醚(6.1 mL,61.2 mmol)中並添加1-(3-羥甲基-吡啶-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(800 mg,3.1 mmol)及數滴三乙胺。密封燒瓶並在75℃下攪拌24小時。然後使混合物冷卻至24℃並經由矽藻土墊過濾。在減壓下去除溶劑並藉由正相Isco層析使用己烷及乙酸乙酯作為洗脫液(5-20%，存於乙酸乙酯中)來純化殘餘物，從而獲得605 mg 3-甲基-1-[3-(乙烯氧基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z): 288(M+1)。3.1-[3-(環丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯 在氮下將存於己烷(365.7 μL,3.5 mmol)中之1.0 M二乙基鋅添加至二氯甲烷(0.9 mL)中。使溶液冷卻至0℃並極緩慢地添加三氟乙酸(268.4 μL,3.5 mmol)存於二氯甲烷(0.9 mL)中之溶液。在20 min後添加二碘甲烷(286.1 μL,3.5 mmol)存於二氯甲烷(0.9 mL)中之溶液。在另外20 min後，添加3-甲基-1-(3-乙烯氧基甲基-吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(510 mg,1.8 mmol)存於二氯甲烷(0.9 mL)中之溶液。在室溫下將混合物攪拌過夜。添加5% HCl並用乙酸乙酯萃取水性層。分離有機層，經硫酸鈉乾燥並在減壓下去除溶劑。藉由正相Isco層析使用己烷及乙酸乙酯作為洗脫液(5-20%，存於乙酸乙酯中)來純化粗材料，從而獲得310 mg 1-[3-(環丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z): 302(M+1)。4.1-[3-(環丙氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛 在0℃及氮下向1-(3-環丙氧基甲基-吡啶-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(410 mg,1.03 mmol)存於四氫呋喃(0.15 M)中之溶液中添加存於四氫呋喃(1.2當量)中之1.0 M氫化鋁鋰。在室溫下將混合物攪拌1 h並添加飽和氯化銨水溶液，且用乙酸乙酯萃取水性層。分離有機層，經硫酸鈉乾燥有機相且在減壓下去除溶劑。使粗材料溶於二氯甲烷(14 mL)中並添加氧化錳(IV)(1.2 g,13.9 mmol)。在室溫下將混合物攪拌過夜且隨後經由矽藻土墊過濾，並在減壓下蒸發溶劑。使粗材料流經矽膠墊(洗脫液：乙酸乙酯及二氯甲烷)。在減壓下去除溶劑，從而產生90 mg標題產物。MS(m/z): 258(M+1)。製備34： 1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛
1.1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯 此化合物基本上係如製備12中所述使用3-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯及2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶來製備，產率為83%。MS(m/z): 276(M+1)。2.[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇 此化合物基本上係如製備24(步驟2)中所述使用1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯來製備，產率為88%。MS(m/z): 234(M+1)。3.1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-甲醛 在室溫下將[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲醇(2.2 g,9.4 mmol)與氧化錳(IV)(19 g,188.8 mmol)之混合物在二氯甲烷(20 mL)中攪拌過夜。經矽藻土過濾反應混合物並在減壓下蒸發溶劑，從而產生1.8 g標題化合物，其不經進一步純化即可使用。MS(m/z): 232(M+1)。製備35： 2-溴-3-(咪唑-1-基甲基)吡啶
在室溫下向甲磺酸(2-溴-3-吡啶基)甲基酯(2.5 g,9.39 mmol)存於乙醇(46.97 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(2.62 g)及1H-咪唑(1.31 g)。在50℃下攪拌混合物。形成濃稠類乳液並添加10 mL乙醇，且將該類乳液在50℃下攪拌過夜。添加水直至所有固體溶解。然後，在減壓下將其濃縮並用乙酸乙酯稀釋殘餘物且用碳酸氫鈉(飽和水溶液)洗滌。傾析有機層，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用二氯甲烷及甲醇作為洗脫液(98/2至90/10)來純化粗材料，從而產生1.42 g標題化合物。MS(m/z)：238,240(M+1,M+3)。製備36-40之化合物基本上係如製備35中所述自相應的氮化雜環來製備。
a)　兩種化合物皆係在相同反應中獲得。製備41： 2-[(2-溴-3-吡啶基)氧基]乙醯胺
在0℃下向2-溴-3-吡啶酚(1.5 g,8.49 mmol)存於四氫呋喃(15 mL)中之溶液中添加存於礦物油中之60%氫化鈉(509.44 mg，12.74 mmol)，且在該溫度下將混合物攪拌30 min。然後添加2-氯-乙醯胺(16.98 mmol)並在室溫下經週末攪拌混合物。用水使混合物驟冷並用乙酸乙酯萃取。分離有機層，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑，從而獲得標題化合物，產率為75%。該化合物不經任何進一步純化即可使用。MS(m/z): 231(M+1),233(M+3)。
製備42： 2-溴-3-(環丙基甲氧基)吡啶
在0℃下向2-溴-3-吡啶酚(500 mg,2.83 mmol)存於二甲基甲醯胺(3 mL)中之溶液中添加存於礦物油中之60%氫化鈉(169.81 mg,4.25 mmol)。在該溫度下將混合物攪拌15 min且添加溴甲基環丙烷(329.66 μL,3.40 mmol)。然後在室溫下將反應物攪拌1 h並用水驟冷且用乙酸乙酯萃取。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑。使粗材料流經短矽膠塞並用二氯甲烷洗脫化合物，從而產生23%標題化合物。MS(m/z): 228(M+1),230(M+3)。製備43： 1-(3-氟-2-吡啶基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯
1.4-甲醯基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯 向100 mL圓底燒瓶中裝填鹽酸胺基脲(2 g,17.93 mmol)、丙酮酸乙酯(11.8 mL)及乙酸鈉(2.97 g)。然後添加水(9 mL)。在室溫下將混合物攪拌90分鐘，然後將其過濾並用更多水洗滌固體。在烘箱中(40℃)於真空下乾燥白色固體過夜。獲得2.66 g純淨2-(胺甲醯基亞肼基)-丙酸乙酯。在0℃下將磷醯氯(3.28 mL)逐滴添加至二甲基甲醯胺(7.13 mL)中。移除冷卻浴以達到室溫。然後，將混合物加熱至40℃並經15-20 min分數份添加預先獲得之2-(胺甲醯基亞肼基)丙酸乙酯(2.66 g,15.36 mmol)(在添加期間排放氣體)。在內部溫度為55℃時，移除加熱浴，從而將內部溫度維持在60-70℃範圍內。然後，將混合物加熱至80℃。一旦將反應物穩定在80℃，幾乎不再觀察到氣體排放。在80℃下將所得懸浮液攪拌2 h。將反應混合物傾倒在冰/水(30 mL)混合物中並攪拌以獲得懸浮液。逐滴添加50%氫氧化鈉溶液直至達到pH 10。在50℃下將溶液攪拌5 min。然後用冰/水浴冷卻溶液並添加35%鹽酸水溶液直至pH 7。用乙酸乙酯萃取混合物。傾析有機層，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑。將殘餘物與己烷及數滴二氯甲烷一起研磨，從而獲得1.6 g 4-甲醯基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯，其不經進一步純化即用於下一步驟中。MS(m/z)：169(M+1)。2.1-(3-氟-2-吡啶基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯 在100℃下將4-甲醯基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(1.6 g,9.52 mmol)、2,3-二氟吡啶(1.20 g)與碳酸鉀(1.97 g)存於二甲基甲醯胺(8 mL)中之混合物加熱並攪拌1.5 h。然後，在室溫下將反應混合物攪拌過夜。添加水，並用乙酸乙酯萃取有機相，傾析，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用乙酸乙酯及己烷來純化粗材料，從而獲得711 mg標題化合物。MS(m/z): 264(M+1)。
製備44： 3-甲基-1-(3-(四氫呋喃-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲醛
1.　3-(2,5-二氫呋喃-2-基)-2-氟吡啶 在氮下向含有存於無水二甲基甲醯胺(1.8 mL)中之乙酸鉀(440 mg,4.5 mmol)、四丁基溴化銨(1.4 g,4.5 mmol)及4A分子篩之螺旋蓋試管中添加2-氟-3-碘吡啶(400 mg,1.8 mmol)、2,3-二氫呋喃(1.4 mL,18 mmol)及乙酸鈀(20 mg,0.09 mmol)。快速密封反應管並在室溫下攪拌過夜。用二乙醚稀釋混合物並經矽藻土過濾混合物。用水洗滌濾液，經硫酸鎂乾燥，過濾並在真空中蒸發溶劑。藉由矽膠使用正相Isco層析(用己烷：丙酮洗脫(梯度為5%至30%，存於丙酮中))來純化所得殘餘物，從而獲得170 mg 3-(2,5-二氫呋喃-2-基)-2-氟吡啶。MS(m/z): 166(M+1)。2.　2-氟-3-(四氫呋喃-2-基)吡啶 在真空下排空含有3-(2,5-二氫呋喃-2-基)-2-氟吡啶(170 mg,1 mmol)及存於甲醇(3.1 mL)中之10% Pd/C之圓底燒瓶，並藉助氣囊填充氫。在室溫下將反應物攪拌過夜並經矽藻土過濾。在真空中蒸發溶劑，從而獲得148 mg 2-氟-3-(四氫呋喃-2-基)吡啶。MS(m/z): 168(M+1)。3.　3-甲基-1-(3-(四氫呋喃-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲醛 向含有存於二甲基甲醯胺(2.2 mL)中之2-氟-3-(四氫呋喃-2-基)吡啶(148 mg,0.88 mmol)之螺旋蓋試管中添加3-甲基-1H-吡唑-4-甲醛(81 mg,0.74 mmol)及碳酸鉀(152 mg,1.1 mmol)。快速密封反應管(注意：可能積累壓力；使用安全護罩)並在預加熱油浴中於110℃下藉助磁性攪拌棒攪拌18 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾並在真空中蒸發溶劑。藉由矽膠使用正相Isco層析(用己烷：丙酮洗脫(梯度為5%至20%，存於丙酮中))來純化所得殘餘物，從而獲得116 mg標題化合物。MS(m/z): 258(M+1)。製備45： 3-(2-溴-吡啶-3-基)異噁唑
1.2-溴吡啶-3-甲醛肟 向2-溴吡啶-3-甲醛(2.04 g)存於乙醇(25 mL)中之溶液中添加鹽酸羥胺(948 mg,13.16 mmol)及乙酸鈉(1.09 g,13.16 mmol)。在室溫下將混合物攪拌過夜。在減壓下蒸發溶劑並在二氯甲烷與水之間分配殘餘物。分離有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中蒸發溶劑，從而獲得2 g 2-溴吡啶-3-甲醛肟。MS(m/z)：201/203(M+1/M+3)。2.[3-(2-溴-3-吡啶基)異噁唑-5-基]-三甲基-矽烷 在0℃下向2-溴吡啶-3-甲醛肟(400 mg,1.99 mmol)存於二氯甲烷(3.98 mL)中之攪拌懸浮液中依次逐份添加吡啶(201.13 μl,2.49 mmol)及N-氯琥珀醯亞胺(337.19 mg,2.49 mmol)。然後，依次添加三甲基甲矽烷基乙炔(350.60 μl,2.49 mmol)及三乙胺(346.68 μL,2.49 mmol)。攪拌混合物使之自0℃達到室溫。在2小時後，添加更多吡啶(321.81 μL,3.98 mmol)及N-氯琥珀醯亞胺(539.51 mg,3.98 mmol)，並在室溫下將混合物攪拌16小時。然後用飽和氯化銨溶液使反應混合物驟冷。分離各層並經硫酸鎂乾燥有機層，過濾並在減壓下濃縮，從而以定量產率獲得[3-(2-溴-3-吡啶基)異噁唑-5-基]-三甲基-矽烷。MS(m/z)：297/299(M+1/M+3)。3.3-(2-溴-3-吡啶基)異噁唑 向[3-(2-溴-3-吡啶基)異噁唑-5-基]-三甲基-矽烷(620 mg,2.09 mmol)存於甲醇(18 mL)中之溶液中以一份添加碳酸鉀(29.12 mg,208.59 μmol)。在室溫下將混合物攪拌24 h。在真空中移除溶劑。在乙酸乙酯與飽和氯化銨溶液之間分配粗材料。用水洗滌有機層且經硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮。藉由正相Isco層析使用己烷/乙酸乙酯(66/33至50/50)作為洗脫液來純化粗材料，從而獲得140 mg呈白色固體形式之標題化合物。MS(m/z)：225/227(M+1/M+3)。製備46： 1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛
在室溫下向3-甲基-吡唑-4-甲醛(0.5 g,4.5 mmol)存於無水二甲基甲醯胺(15 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(2.5 g,18 mmol)。在40℃下將反應混合物攪拌30 min且隨後添加1-氟-2-氯吡啶(0.77 g,6 mmol)。在70℃下將反應混合物加熱16 h。在完成後，使反應混合物冷卻至室溫，用水稀釋且隨後用乙酸乙酯萃取。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用己烷/乙酸乙酯(75:25,65:35)洗脫來純化粗混合物，從而獲得0.525 g(52%)標題化合物。MS(m/z): 222(M+1)。製備47： 1-(3-環丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛
1.1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯 在室溫下向3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(2.0 g,13 mmol)存於無水二甲基甲醯胺(30 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(7.2 g,52 mmol)。在40℃下將反應混合物攪拌30 min且隨後添加1-氟-2-溴吡啶(3.0 g,17 mmol)。在70℃下將反應混合物攪拌4 h。使反應混合物冷卻至室溫，用水稀釋且隨後用乙酸乙酯萃取。經無水硫酸鈉乾燥有機層，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用己烷/乙酸乙酯(85:15,80:20)洗脫來純化粗混合物，從而獲得3.2 g(79%) 1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z)：312(M+3),310(M+1)。2.1-(3-環丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯 用氮使1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(1.5 g,5.5 mmol)、磷酸鉀(4.0 g,19.2 mmol)、環丙基硼酸(0.7 g,8.2 mmol)與甲苯/水(2:1,15 mL)之混合物脫氣，並添加三環己基膦(0.153 g,0.54 mmol)及乙酸鈀(0.061 g,0.27 mmol)。再次用氮使混合物脫氣，且密封反應容器並在100℃下加熱16 h。濃縮反應混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用己烷/乙酸乙酯(85:15)洗脫來純化粗混合物，從而獲得1.6 g(93%)1-(3-環丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯。MS(m/z): 272(M+1)。3.[1-(3-環丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-基]-甲醇 在氮氣氛及-78℃下向氫化鋁鋰(0.44 g,11.7 mmol)存於無水四氫呋喃(25 mL)中之經攪拌懸浮液中添加1-(3-溴-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-甲酸乙酯(1.6 g,5.8 mmol)存於無水四氫呋喃(5 mL)中之溶液。在完成添加後使反應混合物升溫至室溫，隨後攪拌過夜。用1 N氫氧化鈉使反應混合物驟冷，隨後經由矽藻土過濾。分離有機層並用乙酸乙酯萃取水性層。用水及鹽水洗滌經合併有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，從而產生1.1 g(84%)[1-(3-環丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-基]-甲醇。MS(m/z): 230(M+1)。4.1-(3-環丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛 在氮氣氛下向[1-(3-環丙基-吡啶-2-基)-3-甲基-吡唑-4-基]-甲醇(1.1 g,5.0 mmol)存於無水二氯甲烷(15 mL)中之溶液中添加氯鉻酸吡啶鎓(1.2 g,5.5 mmol)。在室溫下將反應混合物攪拌2 h切碎後經由矽藻土過濾。在減壓下濃縮濾液。在矽膠上用己烷/乙酸乙酯(90:10,80:20)洗脫來純化粗混合物，從而產生0.2 g(20%)標題化合物。MS(m/z): 228(M+1)。製備48： 4-[(2-溴-3-吡啶基)甲基]嗎啉-3-酮
在0℃下向2-溴-3-溴甲基-吡啶(0.68 g,2.36 mmol)存於二甲基甲醯胺(10 mL)中之溶液中添加氫化鈉(0.11 g，60%懸浮液，2.82 mmol)、嗎啉-3-酮(0.20 g,1.97 mmol)及四丁基碘化銨(催化性)。在室溫下將混合物攪拌16小時。在完成後，在乙酸乙酯(25 mL)與水(25 mL)之間分配反應混合物。用乙酸乙酯(2×25 mL)萃取水性層並經硫酸鈉乾燥經合併有機萃取物並在真空中濃縮。藉由矽膠管柱層析用己烷/乙酸乙酯(55:45)洗脫來純化粗材料，從而產生0.35 g(66%)標題化合物。MS(m/z)：271/273(M+1,M+3)。製備49-50之化合物基本上係如製備48中所述自相應的內醯胺試劑來製備。
製備51： 1-(3-氯-2-吡啶基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯
向4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯(1.70 g,10.1 mmol)及3-氯-2-氟吡啶(1.99 g,15.1 mmol)存於二甲基甲醯胺(20 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(2.80 g,20.2 mmol)且在100℃下將混合物攪拌16小時。在完成後，在水(25 mL)與乙酸乙酯(25 mL)之間分配反應混合物。用乙酸乙酯(3×25 mL)萃取水性層並經硫酸鈉乾燥經合併有機萃取物，在真空中濃縮並藉由矽膠管柱層析用己烷/乙酸乙酯(50:50)洗脫來純化，從而產生1.5 g(54%)標題化合物。MS(m/z): 280(M+1)。製備52： 1-(3-甲基-2-吡啶基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯
用氮氣將1-(3-氯-2-吡啶基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯(1.0 g,3.5 mmol)、三甲基環三硼氧烷(0.44 g,3.50 mmol)與碳酸鉀(1.4 g,10.1 mmol)存於二噁烷(18 mL)及水(2 mL)中之混合物脫氣10 min，且隨後添加三苯膦鈀(0.40 g,0.3 mmol)並在110℃下攪拌16 h。在完成後，在二氯甲烷(50 mL)與水(25 mL)之間分配反應混合物。用二氯甲烷(2×25 mL)萃取水性層並經硫酸鈉乾燥經合併有機萃取物且在真空中濃縮。藉由矽膠管柱層析用己烷/乙酸乙酯(70:30)洗脫來純化粗混合物，從而產生0.12 g(13%)標題化合物。MS(m/z): 260(M+1)。實例1： [2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(L)-酒石酸鹽
在0℃下向2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛(12.50 g,26.10 mmol)存於二氯甲烷(125 mL)中之溶液中添加硼氫化鈉(0.395 g,10.44 mmol)及甲醇(37.50 mL)。移除冰浴並在室溫下將反應物攪拌30 min。添加水(50 mL)並將混合物濃縮至一半體積，從而獲得白色黏性固體沉澱。添加二氯甲烷(100 mL)並分離二相混合物。用水(50 mL)洗滌有機層，經硫酸鈉乾燥並濃縮至一半體積(約100 mL)。添加甲基第三丁基醚(100 mL)並濃縮溶液以提供沉澱。過濾固體並在真空下乾燥，從而獲得12 g[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇。MS(m/z): 481(M+1)。使標題化合物之游離鹼(0.48 g,1 mmol)溶於3 mL甲醇中並添加(L)-酒石酸(0.15 g,1 mmol)存於甲醇中之溶液。將混合物攪拌10分鐘。蒸發溶劑並在真空中過夜乾燥殘餘物，從而以定量產率獲得[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(L)-酒石酸鹽。MS(m/z): 481(M+1)。實例2： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-[3-(4H-咪唑-2-基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
將40%乙二醛水溶液(4.69 mL,40.71 mmol)及2 N氨之甲醇溶液(54.29 mL,108.57 mmol)添加至2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛(6.50 g,13.57 mmol)存於甲醇(10 mL)中之懸浮液中。在0℃下將反應混合物攪拌5分鐘，且隨後在40℃下攪拌1 hr。將二氯甲烷(10 mL)添加至懸浮液中，從而溶解幾乎所有材料。將混合物攪拌4 hr，從而獲得淺褐色溶液。在40℃下將溶液攪拌8 hr。添加40%乙二醛之水溶液(2.34 mL,20.36 mmol)及2 N氨之甲醇溶液(27.14 mL,54.29 mmol)並在40℃下將混合物攪拌15 hr。將反應混合物濃縮至約100 mL並將其傾倒在冰/水(400 mL)中，且形成淺褐色固體沉澱。過濾固體，用水洗滌並在真空中亁燥(7 g)。將該固體與基本上藉由相同方法製備之其他粗材料(10 g)合併。使經合併固體溶於二氯甲烷中並經由矽膠墊過濾，其中用二氯甲烷/甲醇(96/4)洗脫。合併含有產物之流份並濃縮，從而提供淡黃色固體(11 g)。在回流下用10%己烷/二氯甲烷萃取固體並濃縮濾液。經由矽膠層析用存於甲醇/二氯甲烷混合物中之2 N氫氧化銨洗脫來進一步純化固體，從而提供6.5 g標題化合物。MS(m/z): 518(M+1)。實例3： 2-氟-1'-[[1-[3-(1H-咪唑-2-基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
此化合物基本上係如實例2中所述使用2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛來製備。藉由正相Isco層析純化殘餘物，從而產生32%標題化合物：質譜(m/z)：465(M+1)。實例4： 5-(2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)噁唑
在氮下向含有存於甲醇(2.5 mL)中之2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)煙醛(0.120 g,0.25 mmol)之螺旋蓋試管中添加碳酸鉀(0.104 g,0.75 mmol)及對甲苯磺醯甲基異氰化物(0.054 g,0.28 mmol)。快速密封反應管(注意：可能積累壓力；使用安全護罩)並在預加熱油浴中於65℃下藉助磁性攪拌棒攪拌3 h。用甲醇稀釋混合物並使用2 g SCX藥筒來純化。在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析用己烷/乙醇(5-30%)洗脫來純化所得殘餘物，從而獲得0.093 g標題化合物。MS(m/z): 518(M+1)。實例5： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](L)-酒石酸鹽
向2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](19.99 g,64.33 mmol)存於1,2-二氯乙烷(120 mL)中之溶液中添加1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛(12 g,58.48 mmol)並在室溫下將混合物攪拌15 min。然後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉粉末(18.59 g,87.72 mmol)(內部溫度25-35℃)並在室溫下將所得懸浮液攪拌15 hr。在攪拌下逐份添加存於冰混合物中之飽和碳酸氫鈉水溶液(200 mL)。分離各相。用第三丁基甲基醚(30 mL)萃取水性相。用水(50 mL)及50%鹽水(50 mL)洗滌經合併有機層，經硫酸鈉乾燥並濃縮以提供濃稠油，經由矽膠層析使用二氯甲烷/甲醇混合物作為洗脫液對其進行純化，從而獲得18 g濃稠油，將其與己烷及10%第三丁基甲基醚/己烷一起研磨，從而提供16.5 g 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]。MS(m/z): 469(M+1)。
酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：469(M+1)。
實例6-15之化合物基本上係如實例5中所述使用相應醛來製備。
a 反應是使用四氫呋喃作為溶劑來進行。實例16： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[3-甲基-1-(3-四氫呋喃-2-基-2-吡啶基)吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
向含有3-甲基-1-(3-(四氫呋喃-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲醛(192 mg,0.75 mmol)、2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃(209 mg,0.75 mmol)與乙酸(43 μL,0.75 mmol)存於1,2-二氯乙烷(2.6 mL)中之混合物之螺旋蓋試管中添加三乙醯氧基硼氫化鈉(238 mg,1.1 mmol)。密封反應罐並藉助磁性攪拌棒在室溫下攪拌18 hr。用甲醇稀釋混合物並使用10 g SCX藥筒進行純化，且在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析用己烷：丙酮(梯度為5%至30%，存於丙酮中)洗脫來進一步純化所得殘餘物，從而獲得113 mg呈外消旋混合物形式之標題化合物。MS(m/z): 521(M+1)。對映異構體拆分係在SCF(超臨界流體層析)條件下使用Chiralpak AD-H(Chiral Technologies公司，West Chester,Pennsylvania,USA)作為固定相且使用二氧化碳/甲醇/二甲基乙胺(0.2%)作為流動相來實施。第一洗脫液係期望對映異構體。
實例17： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](L)-酒石酸鹽
向2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](170 mg,0.61 mmol)存於二氯甲烷(2.4 mL)中之溶液中添加1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-甲醛(192 mg)。在室溫下將混合物攪拌10 min。然後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉(268.3 mg)，且在室溫下將反應物攪拌過夜。用二氯甲烷稀釋混合物且用碳酸氫鈉(飽和溶液)使其緩慢冷卻。然後用更多二氯甲烷萃取有機相，傾析，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑。藉由反相HPLC純化殘餘物，從而獲得67.9 mg 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-(3-氟-2-吡啶基)-3-(異丙氧基甲基)吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]。MS(m/z): 527(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：527(M+1)。實例18： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](L)-酒石酸鹽
向螺旋蓋試管中添加碘化銅(I)(1.15 g,6.02 mmol)、2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](15 g,40.12 mmol)、碳酸鉀(11.76 g,84.26 mmol)、15 mL甲苯(預先經氮鼓泡20分鐘)及攪拌棒。用氮對反應混合物再鼓泡10 min且隨後添加2-溴-3-甲氧基甲基-吡啶(10.54 g,52.16 mmol)及反-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(1.90 mL,12.04 mmol)。快速密封反應管(注意：可能積累壓力；使用安全護罩)，在室溫下攪拌5 min且在預加熱油浴中於115℃下浸沒24 h。使樣品冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋並經由矽藻土墊過濾。在真空下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用己烷/乙酸乙酯(30-70%)來純化殘餘物。收集期望流份並蒸發。藉由正相Isco層析使用己烷/乙酸乙酯(20-60%，存於乙酸乙酯中)作為洗脫液再次純化一些不純淨流份(<2 g)。合併所有含有最終化合物之流份並在真空中蒸發至乾燥。使殘餘物溶於二氯甲烷中並用10%氫氧化銨水溶液洗滌以移除銅殘留。蒸發有機溶劑並過夜乾燥化合物，從而產生13 g 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-[3-(甲氧基甲基)-2-吡啶基]-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]。MS(m/z): 495(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：495(M+1)。
實例19-35之化合物基本上係如實例18中所述自相應的2-溴-3-取代吡啶(實例19-32及34-35)或2-碘-3-取代吡啶(實例33)來製備。
實例36： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-(3-甲氧基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
向螺旋蓋試管中添加碘化銅(I)(23.74 mg,0.125 mmol)、2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](233.00 mg,0.623 mmol)、碳酸鉀(182.71 mg,1.31 mmol)、甲苯(2 mL)(預先用氮鼓泡20 min)及攪拌棒。將反應混合物用氮鼓泡20分鐘且隨後添加2-碘-3-甲氧基吡啶(302.01 mg,1.25 mmol)及反-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(39.31 μL,0.25 mmol)。快速密封反應管(注意：可能積累壓力；使用安全護罩)且在預加熱油浴中於110℃中藉助磁性攪拌棒浸沒24小時。然後，將混合物傾倒在SCX管柱(25 g)上並依次用甲醇及氨之2 N甲醇溶液洗脫。濃縮鹼性流份並藉由鹼性HPLC來純化所得殘餘物，從而獲得162 mg標題化合物。MS(m/z): 481(M+1)。實例37： 2-氯-4,4-二氟-1'-[[1-(3-異噁唑-3-基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]
此化合物基本上係如實例36中所述使用2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]及3-(2-溴-吡啶-3-基)異噁唑作為起始材料來製備。藉由正相Isco層析(使用乙酸乙酯作為洗脫液)純化殘餘物，從而產生45%標題化合物：質譜(m/z)：518(M+1)。實例38： 2-(2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)丙-2-醇
在氮下向含有存於無水二甲基甲醯胺(3.2 mL)中之2-(2-溴-3-吡啶基)丙-2-醇(520 mg,2.41 mmol)之螺旋蓋試管中添加4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑(600 mg,1.6 mmol)、氧化銅(I)(23 mg,160 μmol)、(R,R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-環己烷二胺(68 mg,480 μmol)及碳酸銫(1040 mg,3.2 mmol)。快速密封反應管(注意：可能積累壓力；使用安全護罩)並在預加熱油浴中於110℃下藉助磁性攪拌棒攪拌16 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾並在真空中蒸發溶劑。藉由矽膠正相Isco層析用己烷：乙醇(梯度為2%至15%，存於乙醇中)洗脫來純化所得殘餘物，從而獲得310 mg標題化合物。MS(m/z): 509(M+1)。實例39： 1-[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]-N-甲基-甲胺(L)-酒石酸鹽
標題化合物之游離鹼基本上係如製備7中所述使用2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛及甲胺來製備，產率為51%。MS(m/z): 494(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：551(M+1)。實例40-44之化合物基本上係如實例39中所述自相應的醛及胺來製備。(實例43係使用1,2-二氯乙烷作為溶劑來製備)
實例45： 2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛肟(L)-酒石酸鹽
向2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛(0.210 g,0.438 mmol)存於乙醇(3 mL)中之溶液中添加鹽酸羥胺(0.038 g,0.526 mmol)及乙酸鈉(0.044 g,0.526 mmol)且在回流下將混合物攪拌1 h。蒸發溶劑並用乙酸乙酯及水萃取殘餘物。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾並在真空中蒸發溶劑。藉由鹼性反相HPLC純化殘餘物，從而產生0.110 g 2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛肟。MS(m/z): 494(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：494(M+1)。實例46-47之化合物基本上係如實例45中所述自相應的醛及羥胺來製備。
實例48： [2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲胺(L)-酒石酸鹽
1.2-[[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]異吲哚啉-1,3-二酮
在0℃下將偶氮二甲酸二異丙酯(0.105 mL,0.54 mmol)添加至[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(0.173 g,0.36 mmol)、酞醯亞胺(0.079 mg,0.54 mmol)及三苯基膦(0.142 g,0.54 mmol)存於甲苯(3 mL)中之溶液中。在室溫下將混合物攪拌過夜。移除溶劑並首先使用2 g SCX藥筒純化殘餘物，且在蒸發存於甲醇流份中之2 N氨後藉由正相ISCO 層析用己烷/乙醇(3%-30%)洗脫來純化殘餘物，從而獲得0.201 g 2-[[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]異吲哚啉-1,3-二酮。MS(m/z): 610(M+1)。2.[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲胺(L)-酒石酸鹽 向含有2-[[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]異吲哚啉-1,3-二酮(0.201 g,0.33 mmol)及存於乙醇(2.5 mL)中之24 μl水之燒瓶中添加一水合肼(0.04 g,0.79 mmol)。將反應混合物回流2.5 hr且隨後用甲醇稀釋並使用2 g SCX藥筒純化。在蒸發存於甲醇流份中之2 N氨後，藉由正相ISCO 層析用乙醇及氫氧化銨(7 N，存於甲醇中)存於乙醇中之15%溶液(梯度為25-90%鹼性洗脫液)洗脫來純化所得產物，從而產生129 mg標題化合物。MS(m/z): 480(M+1)。
酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：480(M+1)。實例49： 2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醯胺(L)-酒石酸鹽
1.2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲腈： 此化合物基本上係如製備7中所述使用2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]及2-(4-甲醯基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-甲腈來製備。藉由SCX純化殘餘物，從而獲得2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲腈，產率為32%。MS(m/z): 424(M+1)。2.2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醯胺(L)-酒石酸鹽 向2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲腈(0.71 mmol,0.30 g)存於二甲亞碸(7.5 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(0.049 g,0.35 mmol)且使混合物冷卻至0-5℃，之後添加33%過氧化氫水溶液(0.39 mL,3.78 mmol)。在室溫下將混合物攪拌2 h。然後，謹慎地添加水並用乙酸乙酯萃取反應混合物。傾析有機層，經硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用二氯甲烷/甲醇混合物作為洗脫液來純化粗材料，從而獲得0.252 g材料，藉由反相HPLC進一步純化，從而產生0.198 g 2-[4-[(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醯胺。MS(m/z): 442(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：442(M+1)。實例50： 2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醯胺(L)-酒石酸鹽
標題化合物基本上係如實例49中所述使用2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]及2-(4-甲醯基-3-甲基-吡唑-1-基)吡啶-3-甲腈作為起始材料來製備，總產率為15%(第一步驟之產率為22%且第二步驟之產率為66%)。MS(m/z): 494(M+1)。實例51： 2-[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]乙醯胺(L)-酒石酸鹽
向2-[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]乙腈(170 mg,346.96 μmol)存於二甲亞碸(4 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(23.98 mg,173.48 μmol)且使混合物冷卻至0-5℃。添加33%過氧化氫水溶液(189.54 μL,1.84 mmol)。在室溫下將混合物攪拌16 hr且隨後添加更多33%過氧化氫水溶液(189.54 μL,1.84 mmol)及碳酸鉀(23.98 mg,173.48 μmol)。添加水並用乙酸乙酯萃取混合物。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用二氯甲烷及存於甲醇中之2 N氨作為洗脫液(1.5%至6%，存於氨之2 N甲醇溶液中)來純化化合物，從而產生19%標題化合物之游離鹼。MS(m/z): 508(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：508(M+1)。實例52： [2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基N-甲基胺基甲酸酯(L)-酒石酸鹽
在室溫下將異氰酸甲酯(5.80 μL,0.096 mmol)添加至2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(0.042 g,0.087 mmol)存於二氯甲烷(1 mL)中之溶液中。在1 h後藉由LC/MS未觀察到反應進展，添加三乙胺(12.17 μL,87.32 μmol)及異氰酸甲酯(5.8 μL,0.096 mmol)並將反應物攪拌過夜。添加更多三乙胺(12.17 μL,87.32 μmol)及異氰酸甲酯(5.8 μL,0.096 mmol)且在24 h後蒸發溶劑並藉由正相Isco層析用二氯甲烷/存於甲醇中之2N氫氧化銨(0至5%，存於氫氧化銨之2 N甲醇溶液中)作為洗脫液來純化殘餘物，從而產生0.041 g N-甲基胺基甲酸[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲酯。MS(m/z): 538(M+1)。
酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：538(M+1)。實例53： [4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇(L)-酒石酸鹽
1.　4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯 向1-(3-氟-2-吡啶基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯(342.5 mg)存於1,2-二氯乙烷(6.7 mL)中之溶液中添加2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](280 mg,1 mmol)。將混合物攪拌10 min。然後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉(442 mg)並在室溫下將混合物攪拌過夜。添加碳酸氫鈉(飽和水溶液)並用二氯甲烷萃取有機相，經硫酸鎂乾燥並在真空中蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用乙酸乙酯及己烷作為洗脫液來純化粗材料，從而獲得450 mg 4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯。MS(m/z): 527(M+1)。2.　[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌 啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇(L)-酒石酸鹽 在氮氣氛下向4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯(250 mg,0.47 mmol)存於四氫呋喃(2.37 mL)中之冷卻至0℃之溶液中緩慢添加存於四氫呋喃(569.3 μL)中之1 M氫化鋁鋰。在該溫度下將混合物攪拌30分鐘。然後，添加22 μL水並移除冷卻浴，且在室溫下將混合物攪拌5 min，之後添加22 μL 15%氫氧化鈉水溶液及65 μL水。過濾出固體並蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用二氯甲烷及甲醇作為洗脫液來純化粗材料，從而獲得141 mg呈游離鹼形式之標題化合物。MS(m/z): 485(M+1)。酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：485(M+1)。製備實例53 之游離鹼之替代方法：1.4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
向2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶(18.3 g,65.42 mmol)存於四氫呋喃(0.2 L)中之懸浮液中添加4-甲醯基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(10 g,59.47 mmol)，並在室溫下將混合物攪拌10 min。然後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉粉末(16.39 g,77.31 mmol)。在室溫下將混合物攪拌1.5 h。然後，將反應混合物傾倒在冰-碳酸氫鈉飽和水溶液(200 mL)中。分離各相。用飽和NaHCO3 溶液鹼化水性相且用乙酸乙酯(100 mL)萃取。用飽和NaHCO3 溶液洗滌經合併有機層，經硫酸鈉乾燥並濃縮，從而獲得22.5 g標題化合物。MS(m/z): 432(M+1)。
2.4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯
向4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(22.5 g,52.10 mmol)存於二甲基甲醯胺(225.00 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(10.80 g,78.14 mmol)及2,3-二氟吡啶(7.19 g,62.52 mmol)且在60℃下將所得懸浮液攪拌15 h。然後，將反應混合物傾倒在冰/鹽水(30 mL)中並將CH2 Cl2 (50 mL)添加至所得懸浮液中。用H2 O(2×50 mL)洗滌溶液。經硫酸鈉乾燥有機層並濃縮以獲得粗材料，經由SiO2 過濾用2-丙醇/CH2 Cl2 混合物洗脫將其純化，從而獲得18 g標題化合物。MS(m/z): 527(M+1)。3.[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
在N2 氣氛下向4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-甲酸乙酯(2.6 g,4.93 mmol)存於四氫呋喃(26.00 mL)中之冷卻至-10℃之溶液中緩慢逐滴添加存於甲苯(23.68 mL,23.68 mmol)中之1 M氫化二異丁基鋁。然後，在該溫度下將反應混合物攪拌15 min，且隨後移除冷卻浴並使混合物升溫至室溫。然後，在-10℃下逐滴添加H2 O(100 mL)。用EtOAc(2x30 mL)萃取所得懸浮液。用H2 O(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌經合併有機層，經Na2 SO4 乾燥並濃縮以提供淺褐色油，使其溶於甲基第三丁基醚(10 mL)中並結晶出白色晶體。攪拌所形成懸浮液並在攪拌的同時逐滴添加己烷(10 mL)。過濾固體，從而獲得2 g標題化合物。MS(m/z): 485(M+1)。實例54： 2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基-1,2,4-噁二唑-5-基)-吡啶
1.2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-煙酸甲酯 向螺旋蓋試管中添加氧化銅(I)(11 mg,0.08 mmol)、2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](300 mg,0.8 mmol)、碳酸銫(523 mg,1.6 mmol)、無水二甲基甲醯胺(1.6 mL)及攪拌棒。將反應混合物用氮鼓泡20分鐘且隨後添加2-碘吡啶-3-甲酸甲酯(511 mg,1.9 mmol)及反-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(0.24 mmol；34 mg)。快速密封反應管(注意：可能積累壓力；使用安全護罩)且在預加熱油浴中於110℃中藉助磁性攪拌棒浸沒16小時。然後，將混合物傾倒在SCX管柱(10 g)上並依次用甲醇及氨之2 N甲醇溶液洗脫。濃縮鹼性流份並藉由矽膠正相Isco層析用己烷：乙醇(梯度為2%至15%，存於乙醇中)洗脫來純化所得殘餘物，從而獲得307 mg 2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-煙酸甲酯。MS(m/z): 309(M+1)。
2.2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基-1,2,4-噁二唑-5-基)-吡啶
在氬下向乙醯胺肟(154 mg,2.1 mmol)存於7 mL四氫呋喃中之溶液中添加139 mg碎4A分子篩及氫化鈉(2.1 mmol；84 mg 60%礦物油溶液)。在50℃下將混合物攪拌30 min。在冷卻至室溫後，添加2-(4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑-1-基)-煙酸甲酯(309 mg,0.6 mmol)且隨後在50℃下將混合物加熱40 min。在冷卻後用水終止反應並用二氯甲烷萃取。在用硫酸鎂乾燥有機相並蒸發溶劑後，在甲醇中稀釋殘餘物並使用5 g SCX藥筒來純化。藉由半製備型反相HPLC_MS使用Xbridge管柱(5 μm,19×100 mm)及在5 min內存於A中之介於60%與80%之間之B的梯度以25 mL/min之流速(鹼性條件，A：碳酸氫銨，20 mM，pH 9，及B：乙腈)來進一步純化所得殘餘物，從而獲得71 mg標題化合物。MS(m/z): 533(M+1)。
實例55： 2-氯-1'-[[1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](L)-酒石酸鹽
向2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃](0.2 g,0.71 mmol)存於1,2-二氯乙烷(5 mL)中之溶液中添加1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛(0.19 g,0.86 mmol)及數滴乙酸。在室溫下將反應混合物攪拌1小時。添加三乙醯氧基硼氫化鈉(0.315 g,1.43 mmol)並在室溫下攪拌14小時。在完成後，用二氯甲烷稀釋反應混合物，並用飽和碳酸氫鈉溶液及鹽水洗滌。經硫酸鈉乾燥有機相並在真空中濃縮。藉由HPLC純化粗混合物，從而產生0.195 g(56%)2-氯-1'-[[1-(3-氯-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]。MS(m/z): 485(M+1)。
酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：485(M+1)。
實例56： 2-氯-1'-[[1-(3-環丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-基]甲基]-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](L)-酒石酸鹽
標題化合物基本上係如實例55中所述使用2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]及1-(3-環丙基-2-吡啶基)-3-甲基-吡唑-4-甲醛作為起始材料來製備，產率為41%。MS(m/z): 491(M+1)。
實例57： 4-[[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲基]嗎啉-3-酮
藉由用氬鼓泡15分鐘來使2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](0.20 g,0.53 mmol)、4-[(2-溴-3-吡啶基)甲基]嗎啉-3-酮(0.21 g,0.77 mmol)、碘化銅(I)(0.015 g,0.078 mmol)與碳酸銫(0.36 g,1.10 mmol)存於二甲基甲醯胺(5 mL)中之混合物脫氣。添加(1R,2R)-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(0.02 g,0.14 mmol)同時經15分鐘脫氣，且隨後將混合物加熱至130℃並保持16小時。在完成後，使反應混合物冷卻至室溫並經由矽藻土過濾。用乙酸乙酯(2×25 mL)洗滌殘餘物並用水(30 mL)洗滌濾液。用乙酸乙酯(2×25 mL)萃取水性層並經硫酸鈉乾燥經合併有機萃取物且在真空中濃縮。藉由矽膠管柱層析用二氯甲烷/甲醇(96:4)洗脫來純化粗混合物，從而產生0.09 g(30%)標題化合物。MS(m/z): 564(M+1)。
實例58-59之化合物基本上係如實例57中所述分別自製備49及50中所述之中間體來製備。
實例60： [4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氯-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
1.4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
向2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]鹽酸鹽(0.35 g，1.1 mmol)及1-(3-氯吡啶-2-基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸乙酯(0.3 g,1.0 mmol)存於1,2-二氯乙烷(20 mL)中之溶液中添加N-甲基嗎啉(0.33 g,3.2 mmol)及分子篩(0.10 g)。在室溫下將反應混合物攪拌1 h。添加三乙醯氧基硼氫化鈉(0.58 g,2.7 mmol)並在室溫下攪拌16 h。在完成後，經由矽藻土過濾反應混合物並在二氯甲烷(15 mL)與水(15 mL)之間進行分配。用二氯甲烷(3×30 mL)萃取水性相並經硫酸鈉乾燥經合併有機萃取物且在真空中濃縮。藉由矽膠管柱層析用二氯甲烷/甲醇(98:2)洗脫來純化粗混合物，從而產生0.4 g(67%) 4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯。MS(m/z): 543(M+1)。
2.[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氯-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
在0℃下向4-((2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基)-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(0.4 g,0.73 mmol)存於四氫呋喃(5 mL)及乙醇(5 mL)中之溶液中添加硼氫化鋰(1.80 mL，2.0 M四氫呋喃溶液，3.68 mmol)並在室溫下攪拌16 h。在完成後，用水(10 mL)使反應物驟冷並用乙酸乙酯(2×25 mL)萃取。經硫酸鈉乾燥經合併有機萃取物並在真空中濃縮。藉由矽膠管柱，層析用二氯甲烷/甲醇(97:3)洗脫來純化粗混合物，從而產生0.14 g(39%)標題化合物。MS(m/z): 500(M+1)。
實例61： [4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-甲基-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇
標題化合物基本上係如實例60中所述使用2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]鹽酸鹽及1-(3-甲基吡啶-2-基)-4-甲醯基-吡唑-3-甲酸酯作為起始材料來製備，產率為14%。MS(m/z): 481(M+1)。
實例62： [2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇
1.2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛
在室溫下經30 min使2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](168.4 g,451 mmol)、CuI(12.9 g,67.7 mmol)與碳酸鉀(131 g,947 mmol)存於無水甲苯(340 mL)中之混合物脫氣。依序添加2-溴-吡啶-3-甲醛(125 g,677 mmol)及反-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(21.3 mL,135.4 mmol)。使內含物脫氣30 min，之後在105℃及攪拌下加熱18 hr。對反應混合物之LC/MS分析揭示，2-氯-4,4-二氟-1'-[(3-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]完全耗光。使反應混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯(1.5 L)稀釋，攪拌並經由矽藻土墊過濾。依序用10%氫氧化銨(5×100 mL)、水(3×100 mL)及鹽水洗滌母液。隨後將其乾燥(硫酸鈉)，過濾並在減壓下濃縮。在矽膠上使用存於含有1%三乙胺之己烷中之50%乙酸乙酯來純化殘餘物，從而提供成固體形式之2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛(156 g，產率為72%)。MS(m/z): 479(M+1)。
2.[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇
在0℃下向2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]吡啶-3-甲醛(180 g,377 mmol)存於無水二氯甲烷(1.5 L)中之溶液中依序添加硼氫化鈉(7.2 g,188.5 mmol)及無水甲醇(0.5 L)，且在攪拌下經30 min使內含物達到室溫。對反應混合物之LC/MS分析揭示反應完成。在減壓下移除揮發性物質並在二氯甲烷(2 L)與水(300 mL)之間分配所得殘餘物。分離各層並依序用1 N氫氧化鈉水溶液(300 mL)、水(3×300 mL)鹽水洗滌有機層，乾燥(硫酸鈉)，過濾並在減壓下濃縮。在矽膠上使用存於含有1%三乙胺之己烷中之50-55%乙酸乙酯來純化殘餘物，從而提供呈固體形式之[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(167 g，產率為92%)。MS(m/z): 481(M+1)。
實例63 [2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇鹽酸鹽
在80℃下加熱存於乙酸乙酯(1.5 L)中之[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇(157.4 g,328 mmol)直至獲得澄清溶液。向含有游離鹼之熱溶液中緩慢添加存於異丙醇(65.6 mL,328 mmol)中之5-6 N HCl，且劇烈攪拌內含物，同時經2 hr使混合物達到室溫。在HCl添加到一半時觀察到沉澱。過濾所得白色固體，用二乙醚(3×1L)洗滌，在真空及50℃下乾燥3天，從而提供呈灰白色固體形式之[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇鹽酸鹽(165 g，產率為97%)。MS(m/z): 481(M+1)。
受體佔有率示蹤劑化合物： 2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)-N,N-二甲基-丙醯胺(L)-酒石酸鹽
1.3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)丙酸第三丁基酯
使2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,2-c]吡喃-7,4'-哌啶](2.7 g,11.9 mmol)溶於甲醇(60 mL)中。然後，添加三乙胺(2.65 mL)及丙烯酸第三丁基酯(3.55 mL,23.76 mmol)且將混合物加熱至65℃並保持5 h。移除加熱器並在室溫下將反應混合物攪拌過夜。蒸發溶劑並藉由正相Isco層析使用乙酸乙酯/己烷1/1作為洗脫液純化粗材料，從而產生4.2 g呈無色油形式之期望化合物。MS(m/z): 356(M+1)。
2.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)丙酸第三丁基酯
在N2 下向3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)丙酸第三丁基酯(4.9 g,13.78 mmol)存於四氫呋喃(41 mL)中之冷卻至-78℃之經攪拌溶液中逐滴添加1 M雙(三甲基甲矽烷基)醯胺鋰(41,35 mL,41.45 mmol)。在該溫度下將所得混合物攪拌3小時。然後，添加1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(1.33 mL,11.03 mmol)，且在同一溫度下將所得溶液攪拌30 min。向所得混合物中添加存於無水四氫呋喃(1 mL)中之2-氟溴苄(2.33 mL,19.3 mmol)並繼續攪拌。過夜使溫度自-78℃達到室溫。用飽和氯化銨水溶液使粗反應混合物驟冷並用乙酸乙酯萃取。傾析有機層，經硫酸鎂乾燥，蒸發溶劑並藉由正相Isco層析使用乙酸乙酯/己烷(5/95至20/80)純化所得粗材料，從而產生5.06 g以無色油形式獲得之標題化合物。MS(m/z): 464(M+1)。
3.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)丙酸三氟乙酸鹽
在室溫下將2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)丙酸第三丁基酯(5.06 g,10.91 mmol)與三氟乙酸(26.20 mL,218 mmol)之混合物攪拌過夜。將溶劑蒸發至乾燥且不經進一步純化即使用粗產物。
4.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)-N,N-二甲基-丙醯胺
使2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)丙酸三氟乙酸鹽(5.68 g,10.89 mmol)溶於二氯甲烷(218 mL)中，隨後在0℃下將三乙胺(12.14 mL,87.13 mmol)、二甲胺鹽酸鹽(1.80 g,21.78 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.18 g,21.78 mmol)及1-羥基苯并三唑水合物(3.34 g,21.78 mmol)依次添加至溶液中。在室溫下將混合物攪拌5小時。用飽和碳酸氫鈉水溶液處理反應混合物並用二氯甲烷(3 x 20 mL)萃取。經硫酸鎂乾燥經合併有機層並在減壓下蒸發溶劑。藉由正相Isco層析使用二氯甲烷/存於甲醇中之2 N銨(100/0至90/10)作為洗脫液來純化粗材料，從而獲得4.0 g(84.5%)標題化合物。MS(m/z): 435(M+1)。
5.2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)-N,N-二甲基-丙醯胺(L)-酒石酸鹽
外消旋2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)-N,N-二甲基-丙醯胺(2.3 g,5.29 mmol)之對映異構體拆分係以Chiralpak AD管柱(Chiral Technologies公司，West Chester,Pennsylvania,USA)使用己烷/存於乙醇中之0.2%二甲基乙胺(9/1)來實施。以36%之產率獲得作為第一洗脫對映異構體之期望化合物。
酒石酸鹽基本上係如實例1中所述來製備。MS(m/z)：435(M+1)。
X-射線粉末繞射
結晶固體之XRD圖案係用Bruker D4 Endeavor X-射線粉末繞射儀獲得，其配備有CuKα源(λ=1.54060)及Vantec檢測器，且係在35 kV及50 mA下作業。在4°與40°之2θ之間掃描樣品，其中步長為0.0087°之2θ且掃描速率為0.5秒/步，且使用0.6 mm散度，5.28固定抗散射及9.5 mm檢測器狹縫。將乾燥粉末填塞在石英樣品架上並使用載玻片獲得光滑表面。晶形繞射圖係在環境溫度及相對濕度下收集。在標峰之前移除背景。晶體學領域熟知，對於任一給定晶形而言，繞射峰之相對強度可因諸如晶體形態及習性等因素導致之擇優取向而變化。倘若存在擇優取向效應，則峰強度改變，但多晶型體之特徵峰位置不變。例如，參見美國藥典第23號，國家處方集第18號，第1843-1844頁，1995。此外，晶體學領域亦熟知，對於任一給定晶形而言，角度峰位置可稍微改變。舉例而言，峰位置可因分析樣品時之溫度或濕度變化、樣品置換或存在或不存在內標而改變。在當前情形下，±0.1°之2θ之峰位置變異性可慮及該等可能的變化而不妨礙所示晶形之明確鑑別。可根據區別性峰(單位為°2θ)、通常更顯著峰之任一獨特組合來確認晶形。
因此，使用CuKα輻射藉由XRD圖案來表徵所製備(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇之游離鹼之結晶樣品，其特徵在於具有如下表1中所述之繞射峰(2θ值)。可根據來自此完整繞射圖之不同峰亞組來確認獨特晶形。因此，在一個實施例中，本發明提供(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇之晶形，其使用CuKα輻射藉由XRD圖案來表徵，其特徵在於在11.1處具有繞射峰以及一或多個選自由以下組成之群之峰：5.5、13.5、17.8及22.3±0.1°之2θ處。在另一實施例中，本發明提供(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇鹽酸鹽之晶形，其使用CuKα輻射藉由XRD圖案來表徵，其特徵在於在5.5、11.1、13.5、17.8及22.3±0.1°之2θ處具有繞射峰。
表1：(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇之游離鹼之X-射線繞射峰
類似地，使用CuKα輻射藉由XRD圖案來表徵所製備(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇HCl鹽之結晶樣品，其特徵在於具有如下表2中所述之繞射峰(2θ值)。可根據來自此完整繞射圖之不同峰亞組來確認獨特晶形。因此，在一實施例中，本發明提供(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇鹽酸鹽之晶形，其使用CuKα輻射藉由XRD圖案來表徵，其特徵在於在16.2處具有繞射峰，且具有一或多個選自由以下組成之群之峰：10.8、12.1及21.1±0.1°之2θ處。在另一實施例中，本發明提供(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇鹽酸鹽之晶形，其使用CuKα輻射藉由XRD圖案來表徵，其特徵在於在10.8、12.1、16.2及21.2°±0.1°之2θ處具有繞射峰。
表2：(2-{4-[(2'-氯-4',4'-二氟-4',5'-二氫-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-基)甲基]-3-甲基-1H-吡唑-1-基}吡啶-3-基)甲醇HCl鹽之X-射線繞射峰
文獻數據(Przydzial及Heisler,2008，上述文獻；Reinscheid,2006，上述文獻)及在非臨床動物研究中獲得之數據證實了痛敏肽拮抗劑在抑鬱症、肥胖症及進食障礙以及偏頭痛治療中之作用。具體而言，人們發現，痛敏肽受體拮抗劑自身及與三環類或選擇性血清素能性再吸收抑制劑(SSRI)抗抑鬱藥之組合在抑鬱症之齧齒類動物模型中有效，該等痛敏肽受體拮抗劑在齧齒類動物模型中可有效抑制攝食過多、抑制先前體重減少後之體重回升，且在偏頭痛模型中有效。此外，在痛敏肽受體敲除小鼠中實施之研究已證實，痛敏肽拮抗劑在強迫游泳測試(量測抗抑鬱藥活性)及禁食誘導之進食(抗肥胖症活性)中之作用具有基因型依賴性，從而證實了痛敏肽拮抗劑在該等動物模型中之作用的具體機制。由於先前所述病症代表常見的共病性臨床病況，痛敏肽受體拮抗劑在該等特定患者群中可能尤其有效，例如患有嚴重抑鬱障礙、暴食症、超重、肥胖症及伴隨共病性臨床情緒障礙之肥胖症之患者。
為進一步展現本發明化合物之特徵，在以下體外及體內分析中分析代表性化合物：
體 外受體結合
放射性配體結合分析常用於測定化合物結合特定受體或靶蛋白之親和力(Ki )或效能。基於過濾之[3H]-OFQ/痛敏肽受體結合分析係基於先前分析模式(Ardati A、Henningsen RA、Higelin J、Reinscheid RK、Civelli O、Monsma FJ Jr. Mol Pharmacol. 1997年5月；51(5):816-24)來研發，僅進行少量修改。[3H]-OFQ/痛敏肽結合分析係在深孔96孔板中實施。[3 H]OFQ(最終分析濃度0.2 nM)競爭性研究係用5-10 μg膜蛋白(自表現經選殖人類ORL1受體之中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)分離)在最終分析體積為0.5 mL之含有20 mM HEPES(pH 7.4)、5 mM MgCl2 、1 mM EGTA、100 mM NaCl、0.1%牛血清白蛋白之緩衝液中實施。在室溫下將樣品培育60 min，人們發現此溫度最適於競爭性分析。在分析結束時，在Tometc細胞採集器上經由玻璃纖維濾膜(Wallac濾墊A)[經0.3%聚乙烯亞胺(Sigma)預處理1 hr]過濾，且用5 mL冰冷50 mM Tris‧HCl，pH 7.4將濾膜洗滌三次。然後乾燥濾墊並用Meltilex閃爍體A包埋，且在Wallac Microbeta閃爍計數器中計數放射性。藉由用100 nM未標記痛敏肽置換來測定特異性結合。以特異性結合百分比形式繪製曲線且使用具有可變斜率之S形劑量反應曲線來測定IC50 值。根據IC50 藉由Cheng及Prusoff之方程(Cheng,Y.C.及Prusoff,W.H.，Biochem. Pharmacol. 22,3099-3108(1973))來計算Ki 值，其中Ki =IC50 ×(1+D x Kd -1 )-1 。
類似地，μ、κ及δ阿片樣物質、血清素、多巴胺、腎上腺素能藥、毒蕈鹼及組胺受體之Ki 以及與去甲腎上腺素轉運蛋白、鈉通道、氯離子通道及鈣通道之結合可使用表現期望受體/轉運蛋白/通道之膜及適宜的相應放射性配體競爭劑分子來測定。
基本上如上所述來測試例示性化合物，且發現其對ORL-1受體具有高親和力。人們發現例示性化合物對ORL-1受體之Ki 小於2 nM，同時發現對所測試其他受體/轉運蛋白/通道之Ki 顯著較高。基本上如上所述測試實例62、23及53之化合物，且發現其具有如下表3中所示之親和力。
表3.　選擇性數據
ND=未測定
因此，預期生理相關劑量之本發明化合物與該等體內位點並無實質性相互作用，且因此預期可避免與該活性有關之不期望效應。
激動劑介導之G蛋白活化之體外功能性阻斷-GTPγ-[35S]結合
對G蛋白偶聯受體之激動劑介導刺激導致膜相關Gαβγ蛋白異三聚體複合體活化，且代表改變細胞內路徑之細胞外信號傳導之第一步。Gαβγ蛋白異三聚體之受體介導活化之第一步活化係將Gα亞單元結合之鳥苷二磷酸(GDP)交換為鳥苷三磷酸(GTP)。GTP與Gα亞單元之結合引起異三聚體亞單元Gβ及Gγ解離，從而導致調整若干細胞內信號轉導級聯。受體介導G蛋白活化之量測可使用GTP之不可水解放射性標記類似物GTP-γ-[35S]來量測。採用此方法，在表現經選殖人類ORL1/痛敏肽受體之膜中根據經少量修改之先前所述方案(DeLapp等人，J Pharmacol Exp Ther. 1999年5月；289(2):946-55；Ozaki等人，Eur J Pharmacol. 2000年8月18日；402(1-2):45-53)使用GTP-γ-[35S]結合分析來量測拮抗劑親和力(Kb)。以200-μl體積用以下緩衝液組合物實施分析：100 mM NaCl、20 mM HEPES、5 mM MgCl2 、1 mM EDTA、0.1% BSA、3 μM GDP、0.5 nM[35 S]GTPγS。以20 μg蛋白質/孔之濃度添加ORL1受體膜懸浮液且使用300 nM痛敏肽/OFQ達成受體刺激。以1 mg/孔添加經麥胚凝集素塗佈之SPA珠粒(Amersham,Arlington Hts.,IL)以檢測膜結合[35 S]GTPγS。密封板並在室溫下培育2 hr。然後將板在4℃下放置過夜以使得SPA珠粒沉降，且隨後在Wallac Microbeta中計數。以在不存在及存在10 μM未標記GTPγS時觀察到之CPM中之差異來測定特異性[35 S]GTPγS結合。以經結合特異性[35 S]GTPγS之百分比來繪製數據。以特異性結合百分比來繪製曲線，且使用具有可變斜率之S形劑量反應曲線來測定IC50 值。根據DeLapp等人(1999)使用Cheng及Prusoff(1973)之方程之修改形式來估算拮抗劑親和力(Kb )，其中Kb =IC50 x(1+D x EC50-1 )-1 。
基本上如上所述來測試例示性化合物，且發現其係ORL-1受體之有效拮抗劑。人們發現例示性化合物對ORL-1受體之Kb 小於6 nM。實例1、23及53之化合物基本上係如上文所述來測試，且發現其對ORL-1受體之Kb 分別為0.20、1.52及0.62 nM。
體內受體佔有率
業內已將使用LC/MS/MS測定受體佔有率(RO)確立為量測體內假定ORL-1拮抗劑之中樞靶接合之方式。痛敏肽/ORL1受體佔有率(RO)係使用新穎專利性痛敏肽/ORL1拮抗劑RO示蹤劑2-[(2-氟苯基)甲基]-3-(2-氟螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)-N,N-二甲基-丙醯胺(RO示蹤劑)在下丘腦中量測，該結構在血腦屏障內側含有高密度之痛敏肽/ORL1結合位點。該等量測之實施不需要如先前針對其他變型受體所公開之放射性標記示蹤劑(Chernet E、Martin LJ、Li D、Need AB、Barth VN、Rash KS、Phebus LA. Use of LC/MS to assess brain tracer distribution in preclinical,in vivo receptor occupancy studies: dopamine D2,serotonin 2A and NK-1 receptors as examples. Life Sci. 78(4):340-6,2005)。
已確認在中樞痛敏肽/ORL1 RO與齧齒類動物之攝食行為及強迫游泳測試之調整效能之間存在正相關。中樞痛敏肽/ORL1 RO係在向大鼠經口投與測試化合物後6或24小時量測。用測試化合物或媒劑(20% Captisol，25 mM磷酸鹽緩衝液，pH 2.0)經口處理雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague-Dawley,Indianapolis,IN)。在投與測試化合物/媒劑後6或24小時，向所有動物靜脈內投與3 μg/kg劑量之RO示蹤劑。考慮在投與RO示蹤劑時量測RO。在投與RO示蹤劑後40分鐘，藉由頸椎脫位殺死大鼠並移除下丘腦。在每個組織樣品中量測RO示蹤劑含量。
使用具有中樞活性之文獻參照標準物(-)-順-1-甲基-7-[[4-(2,6-二氯苯基)哌啶-1-基]甲基]-6,7,8,9-四氫-5H-苯并環庚-5-醇(SB612111，參見Magdalena及Heisler，上述文獻，其係有效痛敏肽/ORL1受體選擇性拮抗劑)作為陽性對照來確認與100%痛敏肽/ORL1 RO相關之RO示蹤劑含量。在投與RO示蹤劑之前1 hr以30 mg/kg之劑量投與SB612111(該劑量使下丘腦痛敏肽/ORL1受體達成約100%RO)。
將下丘腦樣品均質化於4體積(w/v)含有0.1%甲酸之乙腈中且以14,000 RPM離心16 min。收集上清液並用無菌水稀釋至0.3 mL之最終體積。RO示蹤劑之量測係使用Agilent 1200型HPLC(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)及API 4000質譜儀來實施。層析分離使用2.1 X 50 mm C18管柱(Agilent零件號971700-907)且流動相係由存於水中之38%乙腈與總含量為0.1%之甲酸組成。RO示蹤劑之檢測係藉由監測前體至產物離子之轉變來完成，其中質荷比(m/z)為435至239，且藉由與在腦組織勻漿物中製備之標準品比較來對示蹤劑含量進行定量。將RO示蹤劑在媒劑預處理動物之下丘腦中之含量計算為0%之RO，其代表非特異性及特異性結合之總和(所有受體皆可用於該示蹤劑)。RO示蹤劑在經極高靜脈內劑量之SB612111預處理之動物(陽性對照組)中之較低含量代表非特異性結合且指定為100%佔有率之值(無受體可用於該示蹤劑)。RO示蹤劑在測試化合物處理組之下丘腦中發現之含量係計算測試化合物之RO之該兩點之間的線性插值。
基本上如上所述來測試例示性化合物，且發現其對ORL-1受體具有高受體佔有率。人們發現在3 mg/kg劑量下在6 hr後，例示性化合物之受體佔有率介於約40%與約130%之間；或在3 mg/kg劑量下在24 hr後，受體佔有率介於約20%與約96% RO之間。實例62、23及53之化合物之受體佔有率基本上係如上文針對3 mg/kg劑量在6 hr後之情形所述來分析，且發現RO分別為104%、80%及83%。因此，預期本發明化合物具有有利的生物利用度及進入CNS到達靶向ORL-1受體之穿透性。
hERG通道活性
心臟中K+ 通道傳導之阻斷與呈QT波延長形式之心臟毒性有關。在表現經選殖hERG之HEK293細胞中使用hERG通道拮抗劑放射性配體[3H]阿司咪唑(astemizole)(2 nM最終分析濃度)根據熟知程序(例如，參見Finlayson K,等人，Eur J Pharmacol. 412(3):203-12,2001)來測定例示性痛敏肽受體拮抗劑對人類ERG(hERG) K+ 通道之親和力(Ki )。[3H]阿司咪唑結合分析係在承辦研究公司Cerep(Paris France)根據標準程序來實施。
實例62、23和53基本上係如上文所述來分析，且發現其具有較低活性，Ki 分別為6.08、1.21及8.6 μM。相比之下，實例62之化合物在CNS中使痛敏肽/ORL1受體達到80% RO(EC80 RO)所需之體內血漿濃度為約41 nM。因此，使痛敏肽/ORL1受體達到生理相關體內受體佔有率所需濃度與hERG K+ 通道活性所需濃度之間有較大差異。因此，預期生理相關劑量之本發明化合物與體內hERG位點無實質性相互作用，且因此預期其對QT延長無顯著效應。
小鼠強迫游泳測試(mFST)
mFST係一種已確立的抗抑鬱藥活性之體內分析(Li等人，J Pharmacol Exp Ther. 319(1):254-9,2006)。經已知臨床有效抗抑鬱藥(選擇性血清素再吸收抑制劑及/或三環抗抑鬱藥)治療之小鼠在置於水箱中後表現不動時間縮短之行為，該行為與絕望有關。根據先前公開之方法(Li等人，J Pharmacol Exp Ther. 319(1):254-9,2006)使用mFST來評估新穎痛敏肽(nociceptin)/ORL1拮抗劑之可能類似抗抑鬱藥之活性。簡言之，使用體重介於25-30 g之間之雄性NIH-Swiss小鼠(Harlan Sprague-Dawley,Indianapolis,IN)。將分群圈養之動物自動物飼養所移出至其飼養籠中之測試區域，且在測試前使其在新環境中適應至少1小時。或者，使用雄性129S6野生型及敲除痛敏肽/ORL1受體之小鼠，來確認該反應對化合物之依賴性係痛敏肽/ORL1受體依賴性。使用當天，在20% Captisol、25 mM磷酸鹽緩衝液(pH 2.0)中製備所有化合物。將小鼠在填充有6 cm水(22-25℃)之圓筒(直徑：10 cm；高度：25 cm)中置放6 min。在6 min測試時間之後段4 min期間記錄不動持續時間。在小鼠靜止漂浮或僅做出彼等使其頭部保持在水面上所需之移動時，將小鼠記錄為不動。
代表性化合物基本上係如上文所述來測試，且發現其可顯著縮短野生型小鼠之不動時間。實例62、23及53之化合物基本上係如上文所述來分析，且發現其ED60 分別為24.9、9.5及12.9 mg/Kg，且最大效應分別為使不動時間縮短45%、58%及54%。因此，預期本發明化合物具有體內抗抑鬱藥活性。
此外，本發明化合物可與其他已知抗抑鬱藥組合使用，以產生增強之效能。實例62之化合物基本上係如上文所述，與10 mg/kg氟西汀組合測試，且發現其相對於氟西汀或單獨使用之實例62化合物可進一步顯著縮短不動時間。參見下表4。
表4　小鼠強迫游泳測試-與氟西汀之組合治療
*　相對於媒劑、單獨使用之實例62及單獨使用之氟西汀，在統計學上顯著縮短。
此外，在使用ORL-1敲除小鼠(改造後缺少ORL-1受體之小鼠品系)時未觀察到該等縮短不動時間之效應，從而表明該效應實際上係由ORL-1受體來介導。實例62之化合物基本上係如上文所述來測試，在研究之一個分支中使用野生型小鼠，且在研究之另一分支中使用ORL-1敲除小鼠，且發現其在野生型小鼠中可顯著縮短不動時間，但在敲除小鼠中不顯示任何效應。去甲腎上腺素再吸收抑制劑抗抑鬱藥丙咪嗪係作為陽性對照來運行，且發現其可在野生型小鼠及敲除小鼠二者中同等程度地縮短不動時間，從而表明由去甲腎上腺素再吸收機制介導之行為效應在敲除小鼠品系中仍完整。
小鼠中禁食誘導之攝食過多之阻斷
在齧齒類動物中阻斷禁食誘導之攝食過多係公認的貪食性進食障礙模型。(Hollopeter G、Erickson JC、Seeley RJ、Marsh DJ、Palmiter RD. Response of neuropeptide Y-deficient mice to feeding effectors. Regul Pept. 1998年9月25日；75-76:383-9)。所有實驗皆係在初次用於實驗之十二週齡雄性野生型小鼠及維持在129S6同系繁殖背景中之雄性ORL敲除小鼠中實施。在開始測試前將小鼠單獨飼養至少3天，以消除自圈養變為單獨飼養產生之任何應激效應。在測試當天將每種基因型之三個小鼠隨機分配至每個治療組中。進行禁食前體重量測，且隨後自籠中移出食物並保持過夜。使小鼠禁食約15 hr。第二天早晨，經由經口強飼法給予小鼠三個藥物或媒劑劑量中之一者，在30 min後使其可獲取食物。使藥物溶於20% Captisol(溶於25 mM磷酸鹽緩衝液中，pH 2.0)中。在即將進行藥物治療前或在恢復食物獲取後24 hr量測體重。值得注意的是，所有小鼠不論何種基因型在禁食過夜後體重皆降低約5-10%。在獲取食物後1 hr量測食物攝取，如在1 hr時剩餘食物之重量所示。應注意，食物攝取係在光照階段期間量測，此時小鼠通常正在休息且通常不進食。在初始測試後，使小鼠休息1週且不限制食物獲取。在休息一週後，根據表5中所示之拉丁方格設計再次對小鼠進行測試。
表5.　使用拉丁方格設計來測定劑量反應曲線新穎ORL拮抗劑在野生型小鼠及ORL敲除小鼠中之厭食作用。
代表性化合物基本上係如上文所述來測試，且發現其在小鼠中可顯著降低禁食誘導之攝食過多。實例62、23及53基本上係如上文所述來分析，且發現其可顯著阻斷禁食誘導之攝食過多。在ORL-1敲除小鼠品系中未觀察到該效應，表明該效應係經由ORL-1受體來介導。使用5-HT2C 激動劑mCPP作為陽性對照，且發現其在野生型小鼠及ORL-1敲除小鼠品系二者中可同等程度地顯著降低禁食誘導之攝食過多。因此，預期本發明化合物可用於治療超重及/或肥胖症及/或用於維持體重，如例如治療暴食症。
大鼠硬膜血漿蛋白外滲(PPE)模型-經口給藥方案
所有測試化合物皆係在含有20% Captisol(存於25 mM磷酸鹽緩衝液中(pH 2.0))之媒劑溶液中製備。使陽性對照化合物舒馬普坦(sumatriptan)溶於鹽水中。藉由經口強飼法給予已禁食過夜之來自Harlan實驗室之雄性Sprague-Dawley大鼠(250 g至350 g)測試化合物、舒馬普坦或媒劑(2 mL/kg)。在給藥後50 min用戊巴比妥(Nembutal)(60 mg/kg，腹膜內)麻醉大鼠且將其置於門齒杆設定為約2.5 mm之立體定位架中。在中線徑向頭皮切口後，穿過顱骨鑽2對左右對稱孔(向後3.2 mm，向兩側1.8 mm及3.8 mm，所有坐標皆參照前囟點)。將除尖端以外皆絕緣之不銹鋼刺激電極對(Rhodes Medical Systems公司)穿過該等孔在兩個半球中下降至硬腦膜以下9.2 mm之深度。
在對三叉神經節實施電刺激之前2分鐘，將經螢光素異硫氰酸酯(FITC)染料標記之牛血清白蛋白(BSA)(FITC-BSA)溶液(20 mg/kg，靜脈內)注射至股靜脈中以用作蛋白質外滲之標記物。在給予測試化合物或媒劑後60分鐘，以1.0 mA之電流強度對左三叉神經節電刺激5分鐘(5 Hz，5分鐘持續時間)。
在刺激後5分鐘，藉由用40 mL鹽水實施驅血法來殺死大鼠，該鹽水亦將殘留FITC/BSA沖洗出血管。移除顱骨頂部以收集硬膜。自兩個半球移出膜樣品，用水沖洗，且在顯微鏡載玻片上展平。在載玻片加熱器上將載玻片乾燥15分鐘，且用70%甘油/水溶液實施蓋片。
使用配備有光柵單色鏡及分光光度計之螢光顯微鏡來對各硬膜樣品中之FITC-BSA染料進行定量。顯微鏡配備有與個人電腦相接之電控載物台。此有助於電腦控制載物台移動，且在各硬膜樣品上之25個點(500 μm步長)量測螢光。藉由電刺激三叉神經節誘導之外滲係同側效應(僅在硬腦膜上三叉神經節受刺激之一側發生)。從而使得可使用另一半(未受刺激)硬腦膜作為對照。計算外滲比(即硬腦膜中受刺激側之外滲量與未受刺激側之比率)。單獨給予媒劑或無效劑量之測試化合物之動物之外滲比為約2，而完全有效治療所產生比率為約1。
結果表示為平均值及平均值的標準誤差(±SEM)。所有統計學評估皆係利用ANOVA且隨後藉由Dunnett's方法與對照組比較來實施。假定在p<0.05時具有統計學顯著性。統計學分析係使用JMP統計學分析軟體(SAS Research Institute，6.0.2版)來實施。
實例62基本上係如上文所述來測試，且發現其可以劑量依賴性方式有效阻斷外滲。(參見下表5)。因此，預期本發明化合物可用於治療偏頭痛。
表5.　實例62之化合物之大鼠硬膜血漿蛋白外滲分析(PPE)。
*　相對於媒劑在統計學上顯著。
對反應性代謝產物形成之穩定性
文獻中之先例表明，在反應性代謝產物形成與稱作特質性藥物反應(IDR)之臨床毒性之間存在關聯，但直接原因效應尚未確認。假定反應性代謝產物可在臨床IDR中發揮一定作用，已有人提出使氧化生物活化之可能性降至最低係提高含有與該反應性相關之結構特徵之化合物的總體安全特徵之一方式。(參見Baillie、Thomas A.，Approaches to the Assessment of Stable and Chemically Reactive Drug Metabolites in Early Clinical Trials,Chemical Research in Toxicology，第22(2)卷，2009)。為達成此目的，使用大鼠肝臟微粒體捕捉分析以麩胱甘肽作為內源親核試劑來篩選本發明代表性化合物及相關化合物，從而理解噻吩基部分氧化生物活化之可能性。在所測試化合物中，發現彼等R2a 及R2b 為氫者顯示形成麩胱甘肽偶聯物之證據，從而表明在噻吩基部分上發生氧化。在所測試化合物中，發現彼等R2a 及R2b 為氟者顯示不形成麩胱甘肽偶聯物。(參見下表3)。含偕二氟分子不形成麩胱甘肽偶聯物表明，偕二氟取代基降低生物活化之固有化學傾向，如分析中所測試。
表3.　肝臟微粒體勻漿物中之麩胱甘肽偶聯物形成
儘管可不經任何調配直接投與本發明方法中所用化合物，但通常以醫藥組合物形式投與化合物，該等組合物包含至少一種式I化合物或其醫藥上可接受之鹽作為活性成份，且包含至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。該等組合物可藉由多種途徑投與，包括經口、鼻內、經皮、皮下、靜脈內、肌內及經肺。該等醫藥組合物及其製備方法為業內所熟知。例如，參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy(University of the Sciences in Philadelphia編輯，第21版，Lippincott Williams & Wilkins公司，2005)。
組合物較佳以單位劑型來調配，各劑量含有約0.1至約500 mg、更通常約1.0至約200 mg、例如介於約5與約50 mg之間之活性成份。術語「單位劑型」係指適合作為人類個體及其他哺乳動物之單一劑量之物理離散單位，各單位含有經計算可產生期望治療效應之預定量之活性材料，以及至少一種醫藥上可接受之適宜載劑、稀釋劑及/或賦形劑。
式I化合物一般在寬劑量範圍內有效。舉例而言，每日劑量通常在約0.01 mg/kg至約50 mg/kg體重範圍內，更通常為約0.05 mg/kg至5.0 mg/kg，且例如介於0.1 mg/kg與1.0 mg/kg之間。在一些情況下，低於上述範圍下限之劑量水平可能為過量的，而在其他情形下可採用更大劑量而不會引起任何有害副作用，且因此以上劑量範圍並非意欲以任何方式限制本發明之範圍。應理解，化合物之實際投與量將由內科醫師根據包括下列之相關情況來確定：欲治療之病況、所選投與途徑、實際投與之化合物、個別患者之年齡、體重及反應、以及患者症狀之嚴重程度。

Claims (27)

  1. 一種下式之化合物： 其中R1 係氟或氯；R2a 及R2b 各自為氫或各自為氟；R3 係氫、甲基、羥甲基、或(C1 -C3 )烷氧基甲基；R4 選自由以下組成之群：氟、氯、氰基、氰基甲基、(C1 -C3 )烷基、環丙基、羥甲基、甲氧基、環丙基甲氧基、胺基羰基甲氧基、(C1 -C3 )烷氧基甲基、環丙氧基甲基、環丙基甲氧基甲基、1-羥基-1-甲基乙基、胺基羰氧基甲基、甲基胺基羰氧基甲基、二甲基胺基羰氧基甲基、胺基羰基、胺基羰基甲基、-CH2 -NR5 R6 、羥基亞胺、甲氧基亞胺、嗎啉-4-基、嗎啉-4-基甲基、Ar1 、-CH2 Ar1 、四氫呋喃-2-基、3-側氧基嗎啉-4-基甲基、2-側氧基吡咯啶-1-基甲基及2-側氧基哌啶-1-基甲基； R5 係氫、C1 -C3 烷基、氰基甲基、-C(O)CH3 或胺基羰基甲基；R6 係氫或甲基；且Ar1 係選自由以下組成之群之部分：咪唑-1-基、咪唑-2-基、2-甲基咪唑-1-基、吡唑-1-基、1,2,3-三唑-1-基；1,2,3-三唑-2-基；1,2,4-三唑-1-基、異噁唑-3-基、噁唑-5-基及3-甲基-1,2,4-噁二唑-5-基；或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其中R1 為氯，或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2之化合物，其中R2a 及R2b 各自為氟，或其醫藥上可接受之鹽。
  4. 如請求項1之化合物，其中R1 係氟且R2a 及R2b 各自為氫，或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 如請求項1或2之化合物，其中R3 為甲基，或其醫藥上可接受之鹽。
  6. 如請求項1或2中之化合物，其中R4 係氟、羥甲基、甲氧基甲基或吡唑-1-基甲基，或其醫藥上可接受之鹽。
  7. 如請求項1之化合物，其係[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇；2-氯-4,4-二氟-1'-[[3-甲基-1-[3-(吡唑-1-基甲基)-2-吡啶基]吡唑-4-基]甲基]螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]；或 [4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-1-(3-氟-2-吡啶基)吡唑-3-基]甲醇；或其醫藥上可接受之鹽。
  8. 如請求項1之化合物，其係[2-[4-[(2-氯-4,4-二氟-螺[5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]-1'-基)甲基]-3-甲基-吡唑-1-基]-3-吡啶基]甲醇，或其醫藥上可接受之鹽。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1或2之化合物或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其另外包含SSRI抗抑鬱藥。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其另外包含SSRI抗抑鬱藥。
  13. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療人類之肥胖症或超重。
  14. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療偏頭痛。
  15. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療抑鬱症。
  16. 如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療人類之肥胖症或超重。
  17. 如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療偏頭痛。
  18. 如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療抑鬱症。
  19. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造供治療肥胖症或超重之藥物。
  20. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造供治療偏頭痛之藥物。
  21. 如請求項1或2之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造供治療抑鬱症之藥物。
  22. 如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造供治療肥胖症或超重之藥物。
  23. 如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造供治療偏頭痛之藥物。
  24. 如請求項7或8之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其用於製造供治療抑鬱症之藥物。
  25. 一種如請求項1至8中任一項之化合物之用途，其用於製造供治療人類肥胖症或超重之藥物。
  26. 一種如請求項1至8中任一項之化合物之用途，其用於製造供治療偏頭痛之藥物。
  27. 一種如請求項1至8中任一項之化合物之用途，其用於製造供治療抑鬱症之藥物。
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