CN102516254A - 罗丹明衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通式为I的罗丹明衍生物，其制备方法和对Fe³⁺进行测定的应用。本发明化合物是以罗丹明B和乙二胺反应生成的中间体为原料在硝酸铈铵的催化作用下与乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯缩合来制备。本发明通过对该化合物抗混合离子干扰的铁离子特异性检测分析，和适应活体细胞条件的测定分析，获得结果为：本发明化合物对铁离子的专一性很强，抗其他阳性离子的能力很强，活体细胞适应性很强：如铁离子浓度的灵敏度为1x10^-6、反应稳定时间为20分钟、和Tris-HCl缓冲溶液的pH为5.5或6.0。本发明化合物可以用来在非损伤微测系统中做铁离子的感应剂，测定Fe³⁺浓度、流速及其运动方向。

Description

罗丹明衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种人工合成的罗丹明衍生物，及其制备方法和应用，特别是涉及一种用作检测Fe³⁺的荧光染色剂的罗丹明衍生物，适用于对活体的细胞、组织、器官的非损伤微检测。

背景技术

铁是人们最早发现的微量元素，发现至今已有两千多年的历史。铁在地球上现存的原核生物和真核生物的生命活动中具有不可替代的功能。植物中铁的研究可追溯至一个半世纪以前的1843年，Gris发现生长在石灰性土壤上的葡萄叶片失绿症与缺铁有关。后经植物学家Sachs和Molisch研究，将其确定为植物生长的必需微量元素，同时铁也是最早发现的植物必需营养元素。

Fe³⁺在人体中发挥着重要的功能：构成机体组织器官的成分；参与血红蛋白、肌红蛋白的合成，体内O₂的运输；参与体内某些酶的构成，参与呼吸、体内的氧化还原反应等。同时，在植物中，铁作为一种重要的微量元素参与了光合作用、呼吸作用、固氮作用、氮的同化等多种生理生化反应。在过去的几年中，对特定金属离子有高度选择性的中性粒子载体的合成与特征的研究已经相继展开，但是对于Fe³⁺的相关研究还不是很成熟，目前开发出的一些用于测定Fe³⁺浓度相关的产品(如PVC膜电极，sigma公司)，由于具有一些缺点，如1.对Fe³⁺的专一性差，其他离子的干扰过大；2.所必须的测试条件大都偏酸性(如pH3.0-4.0)，均不在正常细胞pH范围之内，所以不适合于活体细胞的实时定量研究；3.灵敏度低，主要表现在两方面，一方面是反应稳定所需要的时间过长(1h左右)，而应用于活细胞实时定量研究的感应剂，其反应稳定时间应该尽量短，另一方面，这些产品所测的浓度范围不大，尤其是不能直接应用于含铁量很少的活细胞。所以目前世界上还没有一种可以很好的应用于活细胞实时定量测定Fe³⁺的产品，本发明则在很大程度上解决了以上三个难题。将由本发明化合物制备的荧光染料制剂(电极感应剂)装备在非损伤微测系统中，即可检测特定铁金属离子的浓度和进出细胞的速度，这也一直是细胞电生理研究者的追求。

非损伤微测技术(Non-Invasive Micro-Test Technology，NMT)是一项具有世界尖端水平的特异离子/分子检测技术，主要是在电脑自动控制下，利用选择性微电极，在不接触被测样品的情况下获得进出样品的各种离子/分子浓度(μM级)、流速(10^-12moles.s^-1.cm^-2)及其三维运动方向的信息。被测样品可以是非生命物体，如金属；也可以是生物活体，如细胞器、单个或多个细胞、组织甚至器官。测量不仅方便、快捷、三维和实时，而且对被测对象不会产生任何伤害。近几年，各种离子的Lix(Liquid IonExchanger，液体离子交换剂)的开发和利用极大地促进了非损伤微测系统在生物和化学等领域的利用，为生物研究者提供了一个全新的技术和思路。

罗丹明(Rhodamine)是一种生物荧光染色剂，由三苯甲烷衍生得到，可用于生物染色，目前罗丹明衍生物(Rhodamine derivatives)有罗丹明6G、罗丹明123、罗丹明B，其中罗丹明123可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细菌，广泛用作检测线粒体膜电位，也常用于细胞凋亡检测；罗丹明B(Rhodamine B)又称玫瑰红B，具有鲜桃红色。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是，提供一种通式为I的化合物，

式中，R为CH₃或O CH₂CH₃

该化合物为一种新型的罗丹明衍生物，由罗丹明B荧光团和金属螯合配体两部分组成。

上述通式为I的化合物代号为RA，当R表示CH₃，代号为RA1；当R表示O CH₂CH₃时，代号为RA2。

化合物RA1与Fe³⁺螯合后结构式如下式II所示，其最大激发光波长为560.0nm，在激发光下发出最大发射波长为579.0nm的特征荧光，RA2的最大激发光波长和最大发射波长与RA1相似。

本发明要解决的第二个技术问题是，提供化合物RA1、RA2的制备方法，该方法是以罗丹明B和乙二胺反应生成的中间体(E)-3’，6’-双(二乙氨基)-2-(2-(4-氧代戊-2-烯-2-基氨基)乙基)螺[异吲哚啉-1，9’-氧杂蒽]-3-酮为原料，在催化剂硝酸铈铵(CAN)的作用下与乙酰丙酮(若制备RA1)或乙酰乙酸乙酯(若制备RA2)缩合来制备。

RA1的制备方法可以用图1的合成路线概括，RA2的制备方法的合成路线基本同RA1。

本发明要解决的第三个技术问题是，提供本发明化合物的应用，其能够作为Fe³⁺荧光染料制剂或在检测Fe³⁺浓度中应用：通过在一定强度的激发光下测量发射光在579.0nm附近波段的强度(RA2的最大发射波长也在579nm附近)，并根据发射光强度和Fe³⁺浓度的标准曲线得出Fe³⁺浓度。

本发明要解决的第四个技术问题是，提供一种Fe³⁺荧光染料制剂，其包含所述化合物RA1或RA2和缓冲液，所述缓冲液为pH缓冲液，优选为Tris-HCl缓冲液。

所述缓冲液pH为5.0-6.5，优选为5.5-6.0，更优选pH为5.5或6.0，适用于待测生物样品的pH。

所述缓冲液中化合物RA1或RA2浓度为10^-3mol/L-10^-6mol/L，优选为10^-4mol/L或10^-6mol/L。

本发明Fe³⁺荧光染料制剂，优选由10^-4mol/L的所述化合物RA1或RA2和pH为5.5-6.0的Tris-HCl缓冲液组成。

本发明要解决的第五个技术问题是，提供一种所述Fe³⁺荧光染料制剂的应用，将其用于非损伤微测设备或其操作中，检测Fe³⁺流的流速和/或流向。Fe³⁺荧光染料制剂在使用时，化合物RA1或RA2的工作浓度为10^-4mol/L-10^-6mol/L，优选为10^-6mol/L。

本发明Fe³⁺荧光染料制剂能够在非损伤微测设备或其操作中应用，为非损伤微测系统提供Fe³⁺选择性，用于下列步骤的一种或多种：

1)非损伤微测系统Fe³⁺选择性微探头的制备(以测定荧光为主)；

2)Fe³⁺待测样品和/或其溶液环境的预处理，即Fe³⁺选择性可视染色剂的制备【除了荧光外，较高浓度的Fe³⁺染料制剂(10^-5--10^-4)可以看到玫瑰红色随铁浓度的不同而变化(见图4)】。

所述Fe³⁺待测样品为在溶液环境中的生物样品。

所述生物样品为细胞、组织或器官。

所述生物样品的来源为微生物、动物或植物。

所述生物样品还包括人工生物制品。

本发明要解决的第六个技术问题是，提供一种所述Fe³⁺荧光染料制剂的使用方法。通过在一定强度的激发光下测量发射光在579.0nm附近波段的强度，并根据发射光强度和Fe³⁺浓度的标准曲线得出Fe³⁺浓度，通过非损伤微测系统计算得出Fe³⁺流的流速和/或流向。

本发明要解决的第七个技术问题是，提供一种非损伤微测设备的Fe³⁺选择性微探头，所述微探头由探针体、Fe³⁺选择性探针填充试剂、光纤荧光传感器构成，所述Fe³⁺选择性探针填充试剂包含本发明化合物或所述Fe³⁺荧光染料制剂。

本发明具有以下有益效果：

1、Fe³⁺特异性强：Fe³⁺特异性是本研究的关键。生物待测样品的金属离子众多，尤其是Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺等对Fe³⁺的检测干扰很大，本发明化合物对Fe³⁺特异性强，能够在多金属混合液中抗其他金属离子干扰，其荧光可准确反映特异Fe³⁺浓度。

2、灵敏度高：本发明最低的Fe³⁺检测浓度达到10^-7mol/L，较现有技术中的Fe³⁺检测荧光染料灵敏度高。

3、pH值适中：本发明最适反应pH值可达6.0，接近生物活体检测所需pH值；

4、稳定速度快：本发明最适反应稳定时间可达16min，较Fe³⁺荧光染料现有技术中的反应稳定时间大大缩短，提高实验效率，并更适用于生物活体检测。

下面结合附图对本发明的化合物及其制备方法和应用作进一步说明。

附图说明

图1为本发明化合物的合成路线图；

图2为本发明化合物的核磁谱图谱；

图3为用荧光分光光度计对本发明化合物样品进行3D扫描图；

图4为浓度为10^-4mol/L的RA1及其分别与浓度为10^-4mol/L Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的特异性检测的实际样品颜色对比图；

图5a-5b为采用荧光分光光度计对本发明化合物进行铁特异性检测的柱状结果图；

(图5a为pH＝5.5时RA1分别与Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺的结合图；图5b为pH＝6.0时RA1分别与Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺的结合图)

图6a-6b为反应稳定时间的曲线图；

图7为铁离子浓度1*10^-4-1*10^-7时的荧光值分布图和铁离子浓度4*10^-5-1*10^-5时的荧光值分布局部放大图；

图8为不同混合金属离子反应体系中RA1对Fe³⁺的专一性比较；

图9为本发明化合物RA1的显色原理示意图。

具体实施方式

以下结合附图、实施例和试验数据，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例1

制备化合物1，即(E)-3’，6’-双(二乙氨基)-2-(2-(4-氧代戊-2-烯-2-基氨基)乙基)螺[异吲哚啉-1，9’-氧杂蒽]-3-酮。

将溶有罗丹明B(2.4g，5mmol)的60mL乙醇溶液加入到250ml圆底烧瓶中，室温搅拌下滴加0.43mL乙二胺。滴加完毕后，加热(乙醇的沸点温度78.5℃)回流12小时，反应体系变为澄清，直至用薄层色谱法(TLC)检测显示原料消失。冷却至室温，减压脱去溶剂-乙醇。加入大约1mol/L的100mLHCl溶液，除去未反应的乙二胺，再用NaOH缓慢中和至pH为9-10，用二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥，脱溶剂后所得固体用CHCl₃/MeOH(98∶2，V∶V)柱层析提纯(所用的“层析柱”是硅胶柱)，产率为75％。该化合物1的制备方法参照文献tetrahedron Letters，2007，48，9966-9969。

制备化合物RA1：

向溶有3mmol化合物1和3mmol乙酰丙酮的3mL乙醇溶液中加入5mmol％的硝酸铈铵(CAN)(5mmol％，即3mmol*5％＝0.15mmol的CAN)，室温搅拌直至TLC显示原料消失。反应混合物水洗，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥，脱溶剂(二氯甲烷)后所得固体用石油醚/乙酸乙酯柱层析(所用的“层析柱”是硅胶柱)提纯，产率为83％。

核磁共振参数(将本发明化合物RA1用氘代氯仿溶解，采用美国Varian公司的核磁共振波谱仪对其进行分析，核磁共振谱图如图2所示)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.14-1.25(m，12H，CH₂CH₃)，1.77(s，3H，CH₃)，1.92(s，3H，CH₃)，2.99(t，2H，J＝7.2Hz，CH₂CH₂)，3.22(t，2H，J＝7.2Hz，CH₂CH₂)，3.30-3.36(m，4H，CH₂CH₃)，4.87(s，1H，C＝CH)，6.26-6.43(m，6H，Ar)，7.07-7.09(m，1H，Ar)，7.41-7.44(m，2H，Ar)，7.89-7.91(m，1H，Ar)，10.56(t，1H，J＝6.4Hz，NH)；

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：12.6，18.1，28.7，40.3，40.7，44.4，64.7，95.6，97.7，105.0，108.1，122.7，123.8，128.1，131.0，132.5，148.8，153.3，153.4，163.1，167.9，194.7.

利用荧光分光光度计对样品进行3D扫描，发现本发明化合物RA1与Fe³⁺结合后的最大激发波长(Ex)为560.0nm，最大发射波长(Em)为579.0nm，如图3所示，纵坐标为激发光谱，横坐标为发射光谱，也称荧光光谱。

实施例2，制备化合物RA2，方法同实施例1，只是反应原料中用乙酰乙酸乙酯代替乙酰丙酮，其核磁共振参数为：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.15-1.19(m，15H，CH₂CH₃)，1.76(s，3H，CH₃)，2.95(t，2H，J＝4.4Hz，CH₂CH₂)，3.18(t，2H，J＝4.4Hz，CH₂CH₂)，3.30-3.36(m，4H，NCH₂CH₃)，4.02(q，2H，J＝7.2Hz，OCH₂CH₃)，4.34(s，1H，C＝CH)，6.24-6.43(m，6H，Ar)，7.08-7.10(m，1H，Ar)，7.43-7.45(m，2H，Ar)，7.89-7.91(m，1H，Ar)，8.38(t，1H，J＝6.4Hz，NH)；

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：12.5，18.2，19.5，28.6，40.2，41.6，44.5，64.6，95.5，97.6，105.1，108.2，122.6，123.7，128.3，131.1，132.4，148.9，153.2，153.5，163.2，167.8，194.6.

试验例(以化合物RA1为例)

0.01mol/L Tris-HCl缓冲溶液的配制

蒸馏水与酒精1∶1的体积混合，分别取蒸馏水500ml、酒精500ml，利用此混合液溶解三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.21g固体，待Tris溶解充分后，此时pH会偏碱，只能用HCl溶液进行pH的调节，调节到缓冲液的pH为5.5或6.0即可，调节过程中避免使用除HCl以外的溶液，以免引入其他离子，最终配成pH分别为5.5和6.0的0.01mol/L的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液。

10^-3mol/L RA1和10^-3mol/L金属离子母液的配制

量取上述制备好的0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液，准确称量化合物RA1(C₃₅H₄₂N₄O₃，分子量＝566.3g)，RA2(C₃₆H₄₄N₄O₄，分子量＝596.3g)，氯化铁(FeCl₃，分子量＝162.21g)，氯化铜(CuCl₂，分子量＝134.48g)，氯化锌(ZnCl₂，分子量＝136.3g)，氯化镉(CdCl₂，分子量＝158.48g)，将该化合物RA1或RA2和金属氯化物溶解在Tris-HCl缓冲液中，分别配制相应pH(5.5和6.0)值下，浓度均为10^-3mol/L的本发明化合物RA1母液和金属离子母液，金属离子母液分别为铁离子溶液、铜离子溶液、锌离子溶液、镉离子溶液。

试验例1，本发明化合物对铁离子的特异性检验分析

分别取上述10^-3mol/L RA1母液和上述各种金属离子母液，各自加入上述Tris-HCl缓冲液，分别配制成浓度为10^-4mol/L的溶液，将该浓度的化合物RA1溶液分别和浓度为10^-4mol/L的铁、铜、锌、镉离子溶液，按体积比1∶1(如10^-4mol/L的RA1与10^-4mol/L铁离子溶液各取3mL)混合，观察混合后溶液的颜色变化，并进行颜色对比，如图4所示；用F-7000荧光分光光度计测定各溶液的荧光值，如图5a-5b所示，图5a中溶液的pH值为5.5，图5b中溶液的pH值为6.0。由溶液颜色和柱状图中的荧光值可知，本发明化合物RA1对Fe离子具有很强的特异性螯合作用。

试验例2，本发明化合物与铁离子反应的稳定时间分析

将上述浓度为10^-4mol/L的化合物RA1溶液和浓度为10^-4mol/L的铁溶液，按体积比1∶1混合，在pH值分别为5.5和6.0下，分别测定反应稳定时间即根据荧光曲线(如图6a-6b所示，图6a中溶液pH为5.5，图6b中溶液pH为6.0)的高度，达到平稳值(即曲线不再上升或下降)时的时间，结果pH5.5时反应稳定时间约为24min左右，pH6.0时约为16min左右。

试验例3，本发明化合物检测铁离子浓度的灵敏度分析

将上述化合物RA1与铁离子的混合溶液(pH值为5.5和6.0)中保持化合物RA1的浓度10^-4mol/L不变，改变Fe³⁺的浓度从10^-4mol/L不断减少，测定不同浓度梯度下的荧光值，绘制反应梯度曲线。其最低检测浓度可以达到至少1*10^-6mol/L，尤其在pH为5.5时，其灵敏度更高可达1*10^-7，如表1所示，当铁离子浓度为1*10^-7时，pH为5.5的溶液仍能被检测出荧光值。

表1 pH5.5和pH6.0的RA1溶液与不同浓度的Fe离子螯合的相对荧光值

图7为FL-Solution程序截图；横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光值(用发射光谱的高度表示)，从图中可以看出，当pH＝5.5时RA1与铁离子的结合，Ex＝560时激发，在Em＝579nm时有最大荧光值(即发射光谱值)，且在一定浓度范围内，荧光值与铁浓度呈正相关关系(表1)，图7中的a部分为铁离子浓度1x10^-4～1x10^-7时的荧光值分布；b部分局部放大图，为铁离子浓度4x10^-5～1x10^-5时的荧光值分布。pH6.0时的图的趋势与pH5.5时大致相似。

试验例4，在混合金属离子溶液中本发明化合物对铁离子专一性的影响分析

取上述化合物RA1母液和金属离子母液进行RA1抗干扰性实验。固定RA1浓度为1x10^-4mol/L，金属离子为变量，设计了三种混合溶液：1)单一离子，铁离子与化合物RA1的混合溶液；2)三种离子，铁离子、铜离子、锌离子混合(Mix)与化合物RA的混合；3)二种离子，铁离子、铜离子和化合物RA1的混合，或者铁离子、锌离子和化合物RA1的混合。pH分别为5.5和6.0两组。每组pH条件下，1x10^-4mol/LRA1又分别与三组不同浓度的金属离子螯合。例如混合离子溶液中以Fe³⁺为标准，分别为1x10^-4、5x10^-5、1x10^-5mol/L，其他离子按比例【铁离子、铜离子、锌离子的摩尔比为1000∶60∶200(设计依据是仿植物细胞体内离子浓度比例)】，第一个体系中铁离子的浓度是1x10^-4，铜离子的浓度0.06x10^-4，锌离子0.2x10^-4，第二个体系中铁离子的浓度是5x10^-5，铜离子的浓度0.3x10^-5，锌离子1x10^-5，第三个体系中铁离子的浓度是1x10^-5，铜离子的浓度0.06x10^-5，锌离子0.2x10^-5。荧光值结果如表2所示和图8所示。

表2 不同混合金属离子反应体系RA1对Fe的专一性比较

(Mix是指Fe∶Cu∶Zn＝1000∶60∶200，设计依据是仿植物细胞体内离子浓度比例)

对表2中Fe与RA1的荧光值和Mix与RA1的荧光值数据进行无重复二因子方差分析，结果如表3所示。

表3 对表2中的相差最大的一组数据进行无重复二因子方差分析结果

(查表：F_0.01，1，2＝98.50 F_0.01，2，2＝99.00 F_0.05，1，2＝18.51 F_0.05，2，2＝19.00)

从此表可以看出离子类型与最终相应Fe³⁺浓度的荧光值无显著区别，而不同浓度梯度产生的差别是极显著的，所以RA1对Fe³⁺具有很强的特异性。

结果证明RA1结合Fe离子的专一性很强，抗其他阳性离子干扰的能力很强，可以用来做铁离子的染料制剂(感应剂)。

本发明化合物为一种新型的罗丹明衍生物，可用以检测出金属离子的浓度，其原理为：如图9所示，本发明化合物(如RA1)由罗丹明B荧光团(发光部分)和螯合配体(结合金属部分)两部分组成。当罗丹明B荧光团以螺环内酰胺形式存在时，是无颜色和无荧光的，当金属离子与螯合配体选择性结合后，罗丹明B荧光团形成开环结构，即可产生强的荧光，同时有颜色出现。这种荧光和颜色随着金属离子浓度的减少而减弱。根据荧光的强度与金属离子浓度的关系，就可以检测出金属离子的浓度。

从以上原理可以看出，罗丹明衍生物能够用于光谱法检测金属离子的浓度取决于螯合配体的设计。RA2和RA1具有相同的螯合位点，因此RA2同样结合Fe离子的专一性很强，抗其他阳性离子的能力很强，也可以用来做铁离子的染料制剂(感应剂)。通过和化合物RA1相同的试验过程也证明了这一点。

由上述实施例可知，本发明提供了一种Fe³⁺荧光染料制剂(即铁离子的感应剂)，其含有本发明化合物和Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl缓冲液的pH值为5.0-6.5，优选为5.5-6.0，化合物浓度为10^-3mol/L-10^-6mol/L，该制剂中最低的Fe³⁺检测浓度达到10^-7mol/L。

本发明上述Fe³⁺荧光染料制剂的应用，将其用于非损伤微测设备或其操作中，为非损伤微测系统提供Fe³⁺选择性，用于下列步骤的一种或多种：

1)非损伤微测系统Fe³⁺选择性微探头的制备；所述微探头由探针体、Fe³⁺选择性探针填充试剂、光纤荧光传感器构成，所述Fe³⁺选择性探针填充试剂含有本发明化合物或上述Fe³⁺荧光染料制剂。

2)Fe³⁺待测样品和/或其溶液环境的预处理，即Fe³⁺选择性可视染色剂的制备(如取待测样品溶液5ml，滴加10^-3mol或10^-4mol的RA1，观察颜色的变化。)，所述Fe³⁺待测样品为在溶液环境中的生物样品，所述生物样品为活体微生物、细胞、组织或器官。

本发明Fe³⁺荧光染料制剂的应用方法是，通过在一定强度的激发光下测量发射光强度，并根据发射光强度和Fe³⁺浓度的标准曲线得出Fe³⁺浓度，通过非损伤微测设备计算得出Fe³⁺流的流速和/或流向。本发明化合物可以用来在非损伤微测系统中做铁离子的染料制剂(感应剂)，测定Fe³⁺浓度、流速及其运动方向。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种通式为I的化合物：

式中，R为CH₃或O CH₂CH₃。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：其中R为CH₃。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：其与Fe³⁺螯合后的最大激发光波长为560.0nm，在激发光下发出最大发射波长为579.0nm的特征荧光。

4.权利要求1所述化合物的制备方法，是以罗丹明B和乙二胺反应生成的中间体(E)-3’，6’-双(二乙氨基)-2-(2-(4-氧代戊-2-烯-2-基氨基)乙基)螺[异吲哚啉-1，9’-氧杂蒽]-3-酮为原料，在催化剂作用下与乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯缩合来制备，其特征在于，所述催化剂为硝酸铈铵。

5.一种Fe³⁺荧光染料制剂，其特征在于，含有权利要求1所述化合物和Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液pH为5.0-6.5，优选为5.5-6.0，更优选pH为5.5或6.0，所述缓冲液中化合物浓度为10^-3mol/L-10^-6mol/L，优选10^-4mol/L或10^-6mol/L。

6.权利要求5所述Fe³⁺荧光染料制剂的应用，其特征在于，将其用于非损伤微测设备或其操作中，检测Fe³⁺流的流速和/或流向。

7.根据权利要求6所述Fe³⁺荧光染料制剂的应用，其特征在于：所述Fe³⁺荧光染料制剂为非损伤微测系统提供Fe³⁺选择性，用于下列步骤的一种或多种：

1)非损伤微测系统Fe³⁺选择性微探头的制备；

2)Fe³⁺待测样品和/或其溶液环境的预处理。

8.根据权利要求7所述Fe³⁺荧光染料制剂的应用，其特征在于，所述Fe³⁺待测样品为在溶液环境中的生物样品，所述生物样品为活体微生物、细胞、组织或器官。

9.根据权利要求6所述Fe³⁺荧光染料制剂的应用，通过在一定强度的激发光下测量发射光强度，并根据发射光强度和Fe³⁺浓度的标准曲线得出Fe³⁺浓度，通过非损伤微测设备计算得出Fe³⁺流的流速和/或流向。

10.一种非损伤微测设备的Fe³⁺选择性微探头，所述微探头由探针体、Fe³⁺选择性探针填充试剂、光纤荧光传感器构成，其特征在于，所述Fe³⁺选择性探针填充试剂含有权利要求1所述的化合物或权利要求5所述的Fe³⁺荧光染料制剂。

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