CN102796395B - 一类罗丹明荧光染料，其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

一类罗丹明荧光染料，其制备方法及应用。所述的罗丹明荧光染料具有如下结构通式I。本发明所述的罗丹明类荧光染料具有优异的光化学物理性质，高的摩尔小光系数、良好的光稳定性、高的荧光量子产率等优点。其特有的螺环“开-关”结构，对质子敏感，可用于对pH的检测，而且可以解决通常pH探针背景荧光较高的弊端。可用于溶酶体荧光特异性标记及监测细胞凋亡中的应用。

Description

一类罗丹明荧光染料,其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一类荧光探针化合物及其制备方法和用途，该化合物适用于精细化工领域中pH的检测。
背景技术
溶酶体是细胞内的一种非常重要的亚细胞器，其内包含能够分解废弃材料和细胞碎片的酸性水解酶，他们能够消化过量的或磨损的细胞器、食物粒子，并且能够吞没病毒或细菌，因此溶酶体被喻为细胞的胃部。
细胞内的pH是一个非常重要的生理参数。细胞内质子的浓度并不是均一分布的，如细胞质的pH大约在7.2左右，线粒体则更偏碱性一些，而溶酶体的pH为4.5-5.5。溶酶体内的酸度与细胞的很多生物功能密切相关，如水解酶的最佳活性，细胞自噬，细胞凋亡等。因此，检测溶酶体内的pH具有重要意义。
荧光探针具有非侵入性、易操作、能够实现可视化检测等特点，受到普遍的重视。目前许多溶酶体的定位染料都包含一条弱碱性链，可以使探针向酸性的溶酶体细胞器聚集。弱碱性的定位基团通常包含N,N-甲基或吗啉，而含氮的官能团往往容易对荧光团产生光诱导电子转移（PET）作用，使荧光团的荧光淬灭或降低，如Invitrogen公司设计的LysoSensor系列探针（LysoSensorTM Yellow/Blue DND-160除外）在中性或碱性条件下荧光信号微弱，而在pH较小的溶酶体环境中，PET作用被抑制，荧光增强，从而实现对溶酶体内pH的检测。但是此类探针的缺点是背景荧光较强，导致非特异性定位。除此之外，含氮定位基团的PET作用也限制了探针在溶酶体中对于其他被检测物的测定，如H2O2（Dayoung Song,Jung Mi Lim,Somin Cho,Su-Jin Park,Jaeheung Cho,Dongmin Kang,Sue Goo Rhee,Youngmin You,and Wonwoo Nam,Chem.Commun.,2012,48,5449-5451）。因此开发一种不依赖于含氮的溶酶体定位基团具有重要意义。
罗丹明类荧光染料具有优异的光化学物理性质，例如高的摩尔小光系数、良好的光稳定性、高的荧光量子产率等优点。其特有的螺环“开-关”结构，对质子敏感，可用于对pH的检测，而且可以解决通常pH探针背景荧光较高的弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一类带有新型溶酶体定位基团的pH探针的合成及应用。
本发明首先公开一类罗丹明荧光染料，具有如下结构通式I：
通式I中：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6烷基任意取代的苯基、C1-6烷基任意取代的萘基、卤素、OR8、N(R8)2、氰基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM和(CH2)mSO3M；
R5、R6和R7各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6烷基任意取代的苯基、C1-6烷基任意取代的萘基、卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、杂环基、卤代烷基、烷基氨基、酰氨基、OR8、N(R8)2、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM和(CH2)mSO3M；
R8为H、C1-6烷基、C1-6烷基任意取代的苯基、C1-6烷基任意取代的萘基、卤素、氰基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；
n、m各自为0-6的整数；
M为H、K、Na、Li、NH4、NH3R9、NH2(R9)2、NH(R9)3或N(R9)4；
R9为H、C1-6烷基或CH2CH2OH；
R10为H、乙氧基、2-甲氧基乙氧基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
本发明另一方面的目的在于提供上述本发明的罗丹明荧光染料的制备方法，是首先使用式II的化合物与通式为ClCOCH2R11的酰氯反应，然后以四氢呋喃为反应溶剂、在碱存在条件下与通式为HO-R12的醇按照摩尔比1：1~5反应所得；
其中，R11是H或氯；R12为乙氧基、2-甲氧基乙氧基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
本发明再一方面的目的在于提供本发明的罗丹明荧光染料在溶酶体荧光特异性标记及监测细胞凋亡中的应用。
上述本发明所提供的的结构通式I的罗丹明荧光探针的最大发射峰在578nm处，随着pH的减小，荧光逐渐增强，在pH为4.5-5.5（溶酶体pH范围）时，荧光变化明显，因此可用于活细胞溶酶体中pH的检测。用10μM浓度的I在37℃孵化12小时后细胞存活率可达96%，且光稳定性好。带有醚链结构的I与LysoSensorTM GreenDND-189（以下均简称为LysoSensor Green）在活细胞内溶酶体的染色位置基本相同，Pearson系数在0.95以上。
具体实施方式
本发明所述的罗丹明荧光染料，具有如下结构通式I：
Figure BDA00002026098600031
具体实施方式之一，所述的R10为H或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。优选2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
具体实施方式之二，所述的R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢或乙基；优选乙基。
进一步优选的具体实施方案，R5、R6和R7各自独立地选自氢或甲基；最优选H。
最为优选地，本发明所述的罗丹明荧光染料包括化合物R和化合物Rlyso：
Figure BDA00002026098600032
本发明进一步提供上述本发明罗丹明荧光染料的制备方法：是首先使用式II的化合物与通式为ClCOCH2R11的酰氯反应，然后以四氢呋喃为反应溶剂、在碱存在条件下与通式为HO-R12的醇按照摩尔比1：1~5反应所得；
其中，R11是H或氯；R12为乙氧基、2-甲氧基乙氧基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
上述本发明所述的制备方法相关技术方案的具体实施方式中，所述的碱选自氢化纳、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠、甲酸钠、丙酸钠、丙酸钾、草酸钠和草酸钾。优选氢化纳。
以下提供本发明方法更为具体的实施方式：
Figure BDA00002026098600041
（1）将中间体II与氯乙酰氯或乙酰氯反应制备中间体化合物III或化合物I（R10=H）：将中间体化合物II加入反应容器中，再加入二氯甲烷溶剂，冰浴下搅拌。量取化学计量稍过量的氯乙酰氯或乙酰氯溶于二氯甲烷中，滴加到反应液中。滴加完毕，冰水浴中搅拌1~5小时，蒸去溶剂，柱层析分离提纯，得到中间体III或化合物I（R10=H）。
该实施方案中的溶剂优选除水二氯甲烷，便于反应物的溶解、也便于反应后的脱除。
氯乙酰氯或乙酰氯优选采用市售产品。加入量优选稍过量于中间体II，以利于中间体II反应完全。
该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高。
反应时间优选2小时。
反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产物通过核磁和高分辨质谱进行表征。R11为H时：1.70(s,3H,CH3)；R11为Cl时：3.98(s,2H,CH2Cl),其他位置氢的化学位移因不同罗丹明类染料而不同。
（2）将步骤（1）中得到的中间体III与HO-R12反应，得到产物式I化合物（R10为乙氧基、2-甲氧基乙氧基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基）：将化学计量过量的碱溶于四氢呋喃中，冰水浴下搅拌。将化学计量过量的HO-R12溶于四氢呋喃中，逐渐滴加到反应液中。滴加完毕，再将III（R11为Cl）溶于四氢呋喃中滴加到反应液中。滴加完毕，冰水浴继续搅拌30分钟。然后撤去冰水浴，室温搅拌24小时。
该步骤中的溶剂优选新制除水四氢呋喃。
化合物III与醇的投料摩尔比为1：1~5；
化合物III与碱的投料摩尔比为1：1~10。
碱选自氢化纳、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠、甲酸钠、丙酸钠、丙酸钾、草酸钠和草酸钾，优选氢化纳。化合物III与碱的投料摩尔比优选1：8。
乙醇、乙二醇甲醚、二乙二醇甲醚优选采用市售产品。化合物III与醇的投料摩尔比优选1：2。
该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高。
反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产物通过核磁和高分辨质谱进行表征。R12为乙氧基时：3.37(q,J=8Hz,2H,OCH2),1.04(t,J=4Hz,3H,CH2CH3);R12为2-甲氧基乙氧基时：3.55(t,J=4Hz,2H,OCH2),3.37(t,J=4Hz,2H,CH2CH2),3.12(s,3H,OCH3);R12为2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基时：3.53(t,J=2Hz,4H),3.46(t,J=4Hz,2H),3.38(t,J=4Hz,2H),3.30(s,3H,OCH3),(其他位置氢的化学位移因不同罗丹明类染料而不同)。
所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有一些可在上述步骤进行之前或刚完成后，通过标准的芳族取代反应来引入或通过常规的官能团修饰来产生，这包括在本发明的方法步骤方面。这种反应和修饰包括例如取代基通过芳族取代反应的引入、取代基的还原、取代基的烷基化和取代基的氧化。用于这些过程的试剂和反应条件是化学领域公知的。芳族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，用例如酰卤和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入酰基，用烷基卤和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入烷基，和引入卤素基团。修饰的具体实例包括通过例如用镍催化剂进行催化氢化或者用铁在盐酸存在下进行加热处理，将硝基还原成氨基；将烷硫基氧化成烷基亚磺酰基或烷基磺酰基。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
附图说明
本发明附图10幅：
图1是对本发明的荧光探针化合物Rlyso和R进行pH荧光滴定测试。探针化合物Rlyso和R的浓度为10μM，测试体系为Britton-Robinson缓冲溶液（以下简称为B-R缓冲溶液）。图1a是Rlyso对pH的荧光滴定光谱和滴定曲线，激发波长为525nm；图1b是Rlyso对pH的滴定曲线，激发波长为559nm；图1c是R对pH的荧光滴定光谱和滴定曲线，激发波长为525nm；图1d是R对pH的滴定曲线，激发波长为559nm。
图2是本发明的荧光探针化合物Rlyso对质子的选择性荧光发射图。荧光探针化合物Rlyso的浓度为10μM，质子的浓度为50μM，其他常见阳离子的浓度是200μM。
图3是本发明的荧光探针化合物Rlyso在pH为4.8的B-R缓冲溶液中对常见阳离子的抗干扰荧光发射图。荧光探针化合物Rlyso的浓度是10μM，其他常见阳离子的浓度是200μM。
图4是用HCl及NaOH检验本发明的荧光探针化合物中Rlyso对质子识别的可逆过程。荧光探针化合物Rlyso的浓度为10μM。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。
图5是考察本发明荧光探针化合物Rlyso对质子检测的响应时间。选用不同pH（4.38,5.58,7.38）的B-R缓冲溶液作为测试体系。横坐标为加入10μM的Rlyso后的时间（min），纵坐标为荧光强度。
图6是本发明的探针化合物R和Rlyso与市售染料LysoSensor Green的光稳定性对比测试。
图7是本发明的探针化合物R和Rlyso在小鼠巨噬细胞中的荧光成像。荧光探针化合物R和Rlyso的浓度是10μM。
图8是本发明的探针化合物Rlyso用于荧光标记细胞溶酶体的图谱。选用三种细胞进行成像：人乳腺癌细胞MCF-7，人宫颈癌细胞Hela和小鼠巨噬细胞Raw264.7。探针化合物Rlyso的浓度是10μM，LysoSensor Green的浓度是1μM。
图9是本发明的探针化合物Rlyso和R的MTT细胞毒性测试。
图10是本发明的探针化合物Rlyso用于监测细胞凋亡过程的图谱。选用Hela细胞进行成像，探针化合物Rlyso的浓度是10μM。1,2,3分别为荧光图片，白光图片和叠加图片。a,b,c,d,e,f，g,h分别表示在被Rlyso染色的细胞中加入2μM的地塞米松0,2,4,6,8,10,30,60分钟后的图片。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.荧光探针化合物R的合成：
Figure BDA00002026098600071
荧光探针化合物R的合成：
将中间体1（0.91g，2.0mmol）加入30mL二氯甲烷的100mL单口烧瓶中，冰浴下搅拌，量取乙酰氯0.14mL，用10mL的二氯甲烷稀释后滴加到单口烧瓶中，滴加完毕后，冰浴搅拌2小时，减压蒸除溶剂。色谱柱分离得到白色固体R（78%）。1H NMR(400MHz,CD3SOCD3),δ:1.08(t,J=8Hz,12H),1.70(s,3H),3.32(q,J=8Hz,8H),6.31(m,4H),6.51(d,J=8Hz,2H),6.98(d,J=4Hz,1H),7.53(m,2H),7.80(d,J=4Hz,1H),9.46(s,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3),δ:12.62,18.91,20.92,44.42,65.91,66.74,97.57,98.18,107.92,123.48,123.59,124.03,124.62,128.21,128.80,129.31,129.47,133.15,133.80,148.94,149.20,150.30,151.76,153.67,154.20,165.30,166.31,167.87,175.09ppm;TOF MS:m/z calcd for C30H34N4O3Na+[M+Na]+:521.2529,found:521.2526.
实施例2.荧光探针化合物Rlyso的合成：
Figure BDA00002026098600081
（1）中间体2的合成
将中间体1（0.91g，2.0mmol）加入装有30mL二氯甲烷的100mL单口烧瓶中，剧烈搅拌，冰浴。量取氯乙酰氯0.1mL，用10mL的二氯甲烷稀释后滴加到单口烧瓶中。滴加完毕后，冰水浴搅拌2小时，减压蒸除溶剂。色谱柱分离得到白色目标产物中间体2（75%）。1H NMR(400MHz,CD3SOCD3),δ:1.08(t,J=16Hz,12H),3.31(m,8H),3.98(s,2H),6.33(d,J=4Hz,4H),6.50(t,J=8Hz,2H),7.02(d,J=8Hz,1H),7.56(m,2H),7.83(d,J=8Hz,1H);13C NMR(100MHz,CD3SOCD3),δ:12.90,41.01,44.11,65.55,97.55,104.50,108.13,123.13,124.32,128.95,133.83,148.87,152.29,153.48,163.90,165.13ppm;TOF MS:m/z calcd for C30H34ClN4O3 +[M+H]+:533.2319,found:533.2322.
（2）探针化合物Rlyso的合成：
氢化钠（0.12g，60%的矿油溶液，3.00mmol）加入到10mL无水四氢呋喃中，冰水浴中搅拌。将二乙二醇单甲醚（90mg，749.08μmol）溶于5mL无水四氢呋喃并逐渐滴加到上述悬浊液中，0℃下滴加60分钟。再将中间体2（200mg，375.19μmol）溶于5mL无水四氢呋喃中，0℃下滴加到上述溶液中，30分钟滴完。0℃条件下继续滴加30分钟，撤去冰水浴，常温继续搅拌24小时。减压整除溶剂，色谱柱分离得到白色探针化合物Rlyso（43%）。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:1.15(t,J=8Hz,12H),3.30(q,J=12Hz,11H),3.38(t,J=4Hz,2H),3.46(t,J=4Hz,2H),3.53(d,J=2Hz,4H),3.97(s,2H),6.29(d,J=8Hz,2H),6.34(s,2H),6.66(d,J=8Hz,2H),7.12(d,J=8Hz,1H),7.48(m,2H),7.95(d,J=4Hz,1H),8.01(s,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3),δ:12.63,44.31,58.95,65.99,70.10,70.21,70.40,70.85,71.92,97.49,104.40,107.92,123.45,124.07,128.23,129.20,129.45,133.06,148.95,151.61,153.74,164.72,167.69ppm;TOF MS:m/z calcd for C35H44N4O6Na+[M+Na]+:639.3159,found:639.3151.
实施例3.荧光探针化合物R和Rlyso对pH荧光滴定实验
将10μM的探针化合物Rlyso/R加入到B-R缓冲液（pH7.4）中，通过加入盐酸缓慢调节pH至4.5，记录响应的荧光强度，激发波长为525nm测试结果显示于图1a和图1c中。从图中可以看出，随着pH的下降，探针化合物最大发射峰578nm处的荧光强度逐渐增强，pH为4.5时基本饱和。同样条件下，激发波长调整为荧光共聚焦显微镜激发波长559nm，通过Sigmoidal得到Rlyso和R的pKa分别为5.47和5.59(图1b和图1d)。在pH为4.5-5.5（溶酶体pH范围）时，Rlsyo的荧光强度有明显变化，表明Rlyso可用于溶酶体内pH的检测。
实施例4.：荧光探针化合物Rlyso对常见阳离子的选择性
使用上述合成的化合物Rlyso评价对钯离子的选择性。将10μM的化合物Rlyso加到50μM的氢离子或200μM的各种常见阳离子的水溶液中，探针激发波长为559nm，探针发射波长578nm，测试结果显示于图2中。从图中可以看到，荧光探针化合物Rlyso对质子具有很高的选择性，质子的加入使得Rlyso的荧光强度明显增强，而其他常见阳离子的加入则无明显变化。横坐标为质子及常见阳离子，纵坐标为荧光强度。
实施例5.：常见阳离子对Rlyso检测质子的干扰研究
将10μM的化合物Rlyso加入到pH为4.8的含有200μM的各种常见阳离子的B-R缓冲液中，探针激发波长为559nm，探针发射波长578nm，测试结果显示于图3中。从图中可以看到，荧光探针化合物Rlyso对质子的检测不受常见阳离子的干扰。
实施例6.：探针化合物Rlyso对pH检测的可逆性测试
图4是用盐酸和氢氧化钠检验本发明的荧光探针化合物Rlyso对质子识别的可逆过程。荧光探针化合物Rlyso的浓度为10μM，测试体系为B-R缓冲溶液，通过加入盐酸和氢氧化钠来反复调节溶液pH为4.8和7.4，记录荧光探针化合物Rlyso在578nm处的荧光强度。从图4可以看出Rlyso对pH的检测具有很好地可逆性，可重复5次以上。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。
实施例7.：探针化合物Rlyso对pH检测的响应时间测试
图5是探针化合物Rlyso对pH检测的时间函数。探针化合物Rlyso的浓度为10μM，测试体系为pH分别为7.4,5.5,4.8的B-R缓冲溶液，记录Rlyso随时间在578nm处的荧光强度。从图5中可以看出Rlyso对质子的响应非常迅速，且在1分钟之内即可达到平衡。横坐标为时间（分钟），纵坐标为荧光强度。
实施例8.：探针化合物Rlyso和R与LysoSensor Green的光稳定性对比测试
将化合物Rlyso和R分别配成1×10-5M的pH为4.8的B-R缓冲溶液装入可以密封的比色皿中，将商业化溶酶体定位染料LysoSensor Green配成1×10-6M的PBS缓冲溶液装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品30cm处，通电光照，计时。隔10分钟，30分钟，1小时后，测量样品光照后的荧光强度。如图6所示，经过6小时光照后，化合物Rlyso，R和LysoSensor Green在B-R缓冲液和PBS缓冲液中分别褪色3%、3%和2％。结果显示，本发明设计的探针化合物Rlyso和R具有较强的光稳定性。
实施例9.：荧光显微镜下观察探针化合物Rlyso和R对Raw264.7活细胞内染色
Raw264.7细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入10(M的探针化合物Rlyso/R，保持在37℃及5%CO2条件下，孵育30分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。激发光为559nm激发，收集575-620nm波段。
图7a-c，d-e分别是R和Rlyso的活细胞染色照片，图7a/d是白光图，图7b/e是荧光成像图，图7c/f是图7a/d和图7b/e的叠加图。质子在细胞内并不是均一分布的，例如，细胞质的pH在7.2左右，线粒体则更偏向碱性一些，而溶酶体的pH在4.5-5.5的范围内。R和Rlyso的pKa均在5.50-5.60之间，因此二者在pH为4.5-5.5的环境中应发出较明显的荧光。从图7中可以看出，在加入R之后，并未发现明显荧光信号，而加入Rlyso之后，则产生明显荧光信号。表明，相比R，探针化合物Rlyso进入到了pH较低的酸性细胞器中。
实施例10.：荧光显微镜下观察探针化合物Rlyso与LysoSensor Green对Hela，MCF-7和Raw264.7活细胞的复染
LysoSensor Green是一种商品化线粒体绿色荧光探针，可以用于活细胞内溶酶体特异性荧光染色。将探针化合物Rlyso与LysoSensor Green分别对Hela，MCF-7和Raw264.7进行活细胞染色，比较它们对活细胞的染色位置，能够进一步确定Rlyso对溶酶体的特异性荧光标记。
Hela、MCF-7和Raw264.7细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入10μM的探针化合物Rlyso，保持在37℃及5%CO2条件下，孵育30分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍。再加入1μM的市售染料LysoSensor Green，保持在37℃及5%CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。Rlyso的激发光为559nm激发，收集575-620nm波段；LysoSensorGreen的激发波长为488nm，收集495-515nm波段。
从图8中可以看出，在Hela、MCF-7和Raw264.7细胞中，探针化合物Rlyso和LysoSensor Green的染色位置基本吻合，共区域化系数达到了0.95以上。表明Rlyso很好地定位于溶酶体细胞器中。
实施例11.：探针化合物R和Rlyso的细胞毒性测试
将要检测的HeLa和Raw264.7细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103~104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μL；将培养板移入孵箱中，37℃，5%CO2及饱和湿度下培育24小时后，加入染料浓度为10μM，继续培养12小时；每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，孵育4小时，终止培养，小心吸掉孔内培养上清液。然后，每孔加入150μL的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；在酶标仪上测定各孔550nm处的吸光度，计算细胞存活率：试验组光吸光度/对照组吸光度值×100%。
从图9中可以看出，探针化合物R和Rlyso对Hela和Raw264.7细胞无明显细胞毒性，孵育12小时后，细胞存活率可以达到96%以上。
实施例12.：荧光显微镜下观察在细胞凋亡过程中探针化合物Rlyso的荧光变化。
溶酶体与细胞的凋亡密切相关。溶酶体被称为细胞内的“自杀包”，一旦溶酶体膜的完整性受损，溶酶体内酶就可以通过水解生物大分子而导致细胞死亡及崩解。许多典型的凋亡刺激都会引发溶酶体膜通透性增加，进而引起细胞凋亡。本发明用地塞米松来引发细胞的凋亡。
Hela细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入10μM的探针化合物Rlyso，保持在37℃及5%CO2条件下，孵育30分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍，加入2μM的地塞米松后，每隔2分钟进行一次荧光成像，到1小时结束。发现探针化合物Rlyso的荧光信号随着时间的增加逐渐变弱，10分钟时荧光已基本消失，而细胞形态直至30分钟时才有明显变化。表明相比观察细胞形态，探针化合物Rlyso可以更早更明显地监测细胞凋亡过程。

Claims (9)

1.一类罗丹明荧光染料，具有如下结构通式I：
Figure FDA0000373551230000011
通式I中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地选自H和C1-6烷基；
R10为H、乙氧基、2-甲氧基乙氧基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
2.权利要求1所述的罗丹明荧光染料，其特征在于所述的R10为H或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
3.权利要求2所述的荧光染料，其特征在于所述的R10是2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
4.权利要求1～3中任一权利要求所述的罗丹明荧光染料，其特征在于所述的R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢或乙基；R5、R6和R7各自独立地选自氢或甲基。
5.权利要求4所述的罗丹明荧光染料，其特征在于所述的R1、R2、R3和R4均为乙基。
6.权利要求5所述的罗丹明荧光染料，其特征在于所述的R5、R6和R7均为H。
7.权利要求1所述的罗丹明荧光染料的制备方法，是：
a.使用式II的化合物与ClCOCH3反应，制备通式I的化合物，其中R10为H；或者，
b.首先使用式II的化合物与ClCOCH2Cl反应，然后以四氢呋喃为反应溶剂、在氢化钠存在条件下与通式为HO-R12的醇按照摩尔比1:1-5反应制备通式I的化合物，其中，R12为乙基、2-甲氧基乙基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙基；所述的通式II和I的结构式为：
Figure FDA0000373551230000021
式I中，R10为乙氧基、2-甲氧基乙氧基或2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基。
8.权利要求1所述的罗丹明荧光染料在溶酶体荧光特异性标记中的应用。
9.权利要求1所述的罗丹明荧光染料在监测细胞凋亡中的应用。
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