CN105121446B - 亚锡荧光探头 - Google Patents

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Abstract

本发明题为“亚锡荧光探头”。本发明提供了罗丹明B衍生物，其选择性螯合Sn2+以用作荧光探头。

Description

亚锡荧光探头
技术领域
选择性螯合Sn2+的荧光探头。
背景技术
将亚锡(Sn2+)加入到牙膏以防止牙斑和口腔疾病。发现Sn2+有效地抑制可造成人体间隙牙斑内牙齿蛀蚀的某些细菌。近来，对Sn2+的生物作用的关注渐增，因为锡是人体必需的微量矿物质，并且以最大量存在于肾上腺、肝脏、大脑、脾脏和甲状腺中。存在一些证据表明，锡涉及生长因子和防癌。缺锡可造成生长缓慢和听力损失，但是过量的锡积聚可不利地影响呼吸和消化系统。然而，锡离子生理作用和抑菌机制的研究受限于缺乏可应用于活细胞-真核或原核细胞的通用Sn2+检测方法。
需要在各种金属离子存在下对Sn2+具有高度选择性，并且在Sn2+螯合后显示出强荧光性的化学探头。还需要用于活细胞的此类探头。还需要使背景噪音最小化，同时在Sn2+存在于活细胞中的情况下，在所述细胞中提供一致的高荧光强度的探头。
具有在细胞内Sn2+积聚中起作用的细胞器内的pH条件下正常工作的探头是有利的。
具有合成相对容易和简单的探头也是有利的。
具有对生物细胞的毒性较低或至少使毒性最小化使得对于活细胞实施实验的探头是有利的。
发明内容
本发明通过令人惊奇地发现了Sn2+荧光探头，解决了该需求，所述探头包含罗丹明B衍生物部分作为荧光团，经由酰胺部分连接至肼基甲酸酯基团。此类探头化合物的用途表现为用于监测活细胞中Sn2+的成像探头，以研究Sn2+在生物体系中的生理功能。考虑到另外令人惊奇的发现，即在存在Sn浓度情况下溶酶体表现为细胞器，此类化合物是尤其可用的。并且考虑到该细胞器相当酸性的微环境，与以另外方式经受低pH引发的荧光的其它探头相比，本发明的探头表现出高荧光强度并且还使背景噪音最小化。换句话讲，考虑到溶酶体的酸性，对比性探头导致不可取地引发荧光发射(从而产生背景噪音)。
本发明的第一方面提供了具有下式(I)的化合物或其光学异构体或盐，所述光学异构体为式(I)的非对映体或对映体：
其中R1为未取代的支化或未支化的C1-C12烷基、烯基、或炔基；并且其中R2、R3、R4、R5、R6、和R7各自独立地为氢或烃基。
在一个实施例中，R1为未取代的支化或未支化的C1-C10烷基，优选C1-C8烷基。在另一个实施例中，R1选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、和己基，优选异丁基。
在一个实施例中，R2、R3、R4、R5、R6、和R7各自独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂芳基，并且其中上述那些可以是取代或未取代的。在另一个实施例中，R2、R3、R4、R5、R6、和R7各自独立地选自H、C1-C10烷基、烯基、或炔基，并且其中上述那些可以是取代或未取代的，优选未取代的。在另一个实施例中，R2和R7为氢，和/或R3、R4、R5、和R6各自独立地选自氢、或支化或未支化的C1至C5烷基，优选未取代的C1至C5烷基。在另一个实施例中，R3、R4、R5、和R6各自独立地选自未取代的C1至C3烷基。
本发明的另一个方面提供式(II)化合物或其光学异构体或盐，所述光学异构体为式(I)的非对映体或对映体：
其中R1为未取代的支化或未支化的C1-C12烷基或烯基。在一个实施例中，R1为未取代的C1-C10烷基，优选地，R1为未取代的支化或未支化的C1-C8烷基。在另一个实施例中，R1选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、和己基，优选异丁基。
在本发明的另一个方面中，提供了根据式(I)或(II)的化合物，其中所述化合物选自：
(a)叔丁氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-H)-基]-；
(b)叔丁氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；
(c)甲氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；
(d)乙氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；和
(e)甲氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；和
(f)乙氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-。
在另一个实施例中，所述化合物选自：N-(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)丙酰胺；N-(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)丁酰胺；和N-(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)戊酰胺。
本发明的又一个方面提供了检测生物细胞中荧光的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用上述化合物(例如式(I)或式(II)化合物，或所述式(I)或(II)范围内的优选或另选的化合物实施例)培养生物细胞；(b)用激发光照射所培养的细胞，优选地，其中所述照射光具有至少520至580nm，或560nm的波长；并且(c)检测来自化合物的560至660nm的光射线。在一个实施例中，所述方法还包括使所述生物细胞经受Sn2+，另选地，其中所述生物细胞选自口腔上皮细胞或链球菌(Streptococcus)属细菌，另选地，其中所述生物细胞为任何真核细胞。在另一个实施例中，光发射检测位于真核细胞溶酶体细胞器中。在又一个实施例中，用上文或本文先前所述的至少一种特定化合物实施所述方法。
附图说明
提供了图1–5。图1(a)和(c)为加入Sn2+后对照化合物R1和本发明化合物R2的荧光光谱；(b)和(d)分别为560nm激发的加入各种金属离子后化合物R1和R2的荧光光谱。化合物R1为螺[1H-异吲哚-1,9’-[9H]呫吨]-3(2H)-酮，2-[2-[双(2-羟基乙基)氨基]氨基]乙基]-3’,6’-双(二乙基氨基)。化合物R2为叔丁氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-H)-基]-。
图2a和2b分别示出对照化合物R1和本发明化合物R2(10μM)的580nm荧光在不同pH范围下的相关性。在560nm处激发。
图3a和3b为基于KB细胞(普遍存在的角蛋白形成肿瘤细胞系HeLa的亚系)CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)图像衍生的简化示图。(a1-c1)和(a2-c2)细胞分别用10μM对照化合物R1和本发明化合物R2培养30分钟，然后(d1-f1)和(d2-f2)用50μM SnF2进行培养30分钟。收集560–660nm的红色信道射线(b1、e1、b2、e2)；a1、d1、a2、d2分别为明视场图像，并且c1、f1、c2、f2分别为叠加图像(λex＝543nm)。任何观察到的荧光均是红色的。
图4为对比共定位实验中基于KB细胞CLSM图像衍生的简化示图。(a1-d1)细胞连续用50μM SnF2、10μM对照化合物R1和1μM Green DND各自培养30分钟；(a2-d2)连续用50μM SnF2、10μM本发明化合物R2和1μMGreen DND各自培养30分钟。收集560–660nm(λex＝543nm)的红色信道(b1，b2)或500-540nm(λex＝488nm)的绿色信道的射线；a1、a2分别为明视场图像，并且d1，d2分别为叠加图像。观察到的荧光为：b1、b2中的红色；c1、c2中的绿色；以及d1、d2中的黄色。
图5a和5b示出基于变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)CLSM图像衍生的简化示图。示图未按比例绘制，而且为了进行示意性的说明进行了放大。(a1-c1)和(a2-c2)细胞分别用10μM对照化合物R1和本发明化合物R2培养30分钟，然后(d1-f1)和(d2-f2)用50μM SnF2进行培养30分钟。收集560–660nm的红色信道射线(b1、e1、b2、e2)；a1、d1、a2、d2分别为明视场图像，并且c1、f1、c2、f2分别为叠加图像(λex＝543nm)。
具体实施方式
定义：
就本发明目的而言，本文术语“烃基”定义为由碳原子和氢原子构成的任何有机单元或部分。术语烃基中包括杂环。各种未取代的非杂环烃基单元的非限制性示例包括戊基、3-乙基辛基、1,3-二甲基苯基、环己基、顺式-3-己基、7,7-二甲基双环[2.2.1]-庚-1-基、和萘-2-基。“烃基”定义中包括芳族(芳基)和非芳族碳环环。术语“杂环”包括芳族(杂芳基)和非芳族杂环环。
术语“取代的”用于整个说明书中。本文术语“取代的”定义为“涵盖可置换烃基部分的一个氢原子、两个氢原子、或三个氢原子的部分或单元。取代的还可包括两个相邻碳上氢原子的置换以形成新的部分或单元。”例如，需要单个氢原子置换的取代单元包括卤素、羟基等。两个氢原子置换包括羰基、肟基等。相邻碳原子的两个氢原子置换包括环氧基等。三个氢置换包括氰基等。环氧单元是需要置换相邻碳上氢原子的取代单元示例。术语“取代的”用于本发明说明书中以表示，烃基部分，特别是芳族环、烷基链，可具有一个或多个被取代基取代的氢原子。当部分被描述为“取代的”时，可置换任何数目的氢原子。例如，4-羟基苯基为“取代的芳族碳环环”，(N,N-二甲基-5-氨基)辛基为“取代的C8烷基单元”，3-胍基丙基为“取代的C3烷基单元”，以及2-羰基吡啶基为“取代的杂芳基单元”。
在一个实施例中，其中2、R3、R4、R5、R6、和R7各自独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂芳基，并且其中上述这些可以是取代或未取代的。这些术语是本领域熟知的。详细定义参见美国专利6,919,346B2第2栏第61行至第9栏第53行，所述文献以引用方式并入本文。
叔丁氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫 吨]-H)-基]-(下文为“化合物R2”或简称“R2”)的合成路径
本发明的示例性化合物R2为经由酰胺部分连接至肼基甲酸叔丁酯基团的罗丹明B衍生部分。提供了该化合物的合成路径。
描述了化合物R2的合成。除非另有说明，否则材料得自商业供应商，并且无需进一步纯化即可使用。罗丹明(95％)得自Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd.(Shanghai)。其它化学试剂由Shanghai No.1chemical reagent提供。在硅胶(200-300目)上实施快速层析。在Bruker DRX-500光谱仪上记录1H NMR(500MHz)和13C NMR(125MHz)光谱。质子化学位移以距四甲基硅烷(TMS)低场的百万分之一来报导。在LTQ-Orbitrap质谱仪(ThermoFIsher，San Jose，CA)上记录HRMS。在热板熔点仪XT4-100A上测定熔点，并且未经校正。在Shimadzu UV-2250分光光度计上记录UV-Vis光谱。在Edinburgh FLS-920分光光度计上记录荧光光谱。所有pH测定均用Mettler-Toledo型计进行。
描述了(上文方案中)化学中间体M2的合成。0℃下将一水合肼(5.2g，100.0mmol)在20mL异丙醇中搅拌15分钟，并且滴加Boc2O(二碳酸二叔丁酯)(10.0g，45.8mmol)的10mL异丙醇溶液。加料后反应变浑浊，并且在室温下持续搅拌20分钟。经由旋转蒸发移除溶剂，并且将残余物溶于DCM(二氯甲烷)中，并且在MgSO4上干燥。经由旋转蒸发移除DCM，并且将剩余液体减压蒸馏，获得白色固体状肼基甲酸叔丁酯(M2)，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.42(s,1H),3.60(s,2H),1.37(s,9H)。
描述了上文方案中化学中间体R4的合成。将罗丹明B(442mg，1mmol)的Cl2SO(10mL)溶液在室温下保存过夜。减压蒸发反应混合物，并且用无水CH2Cl2(3×15mL)共蒸发，获得罗丹明B酰氯(R4)。将粗制的酰氯溶于无水CH2Cl2(10mL)中，并且滴加到Boc-NH-NH2(132mg，1mmol)和Et3N(200mL，2mmol)的无水CH2Cl2(15mL)溶液中。将反应混合物在室温下保持10分钟。蒸发溶剂，获得粗产物，使用石油醚/乙酸乙酯(3/1，v/v)，经由柱层析将其纯化，获得白色固体状R2(0.26g，50％收率)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.57–7.44(m,2H),7.16(d,J＝7.5Hz,1H),6.52(s,2H),6.38(d,J＝1.8Hz,2H),6.28(d,J＝8.4Hz,2H),3.34(q,J＝7.0Hz,8H),1.61(s,4H),1.26(s,9H),1.16(d,J＝14.1Hz,12H)。13CNMR(125MHz,CDCl3)δ168.92,153.56,152.87,148.92,132.58,131.45,129.05,128.32,123.80,123.09,108.24,105.41,97.68,59.49,57.65,54.48,44.13,39.49,12.31。C33H41N4O4 +(M+H+)的HRMS计算值：557.3122，测定值：557.3111。
比较例-化合物R1或“R1”
将不在本发明范畴之内的对照化合物R1与本发明化合物R2比较。化合物R1为：螺[1H-异吲哚-1,9’-[9H]呫吨]-3(2H)-酮，2-[2-[双(2-羟基乙基)氨基]氨基]乙基]-3’,6’-双(二乙基氨基)，并且具有CAS登记号1217892-36-8(C34，H44，N4，O4)。本文提供了化合物R1的结构及其合成：
描述了对照化合物R1的合成。描述了中间体R5的合成：将罗丹明B盐酸盐(5.0g，10.4mmol)和乙二胺(12.5g，208.8mmol)溶于EtOH(50mL)中并且回流12小时。通过蒸发移除大部分溶剂，并且在磁力搅拌下将残余物分散于水中。然后出现粉红色析出物，并且经由过滤回收，用水充分洗涤。最后，用石油醚洗涤粉红色析出物，然后真空干燥，获得粉红色粉末状化合物R5(3.6g，72％收率)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(d,J＝2.3Hz,1H),7.45(d,J＝2.5Hz,2H),7.14–7.05(m,1H),6.44(s,1H),6.42(s,1H),6.37(d,J＝2.3Hz,2H),6.28(d,J＝2.3Hz,1H),6.26(d,J＝2.4Hz,1H),3.33(q,J＝7.0Hz,9H),3.19(t,J＝6.6Hz,2H),2.40(t,J＝6.6Hz,2H),1.62(s,5H),1.16(t,J＝7.0Hz,13H)。参见Shiraishi，Y.；Miyamoto，R.；Zhang，X.；Hirai，T.Org.Lett.2007，9，3921-3924。
描述了由R5合成R1。将环氧乙烷(0.44g，10.0mmol)加入到冷却的(-5℃)R5(0.48g，0.1mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中。将溶液在-5℃下搅拌4小时，然后在室温下过夜，之后减压浓缩。使用二氯甲烷/甲醇(10/1，v/v)，经由柱层析纯化所得混合物，获得白色固体状化合物R1(0.2g，40％收率)：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.91(d,J＝2.9Hz,1H),7.46(dd,J＝5.5,3.1Hz,2H),7.13–7.06(m,1H),6.46(s,1H),6.44(s,1H),6.39(d,J＝2.4Hz,2H),6.30(d,J＝2.5Hz,1H),6.28(d,J＝2.5Hz,1H),3.54–3.45(m,4H),3.34(q,J＝7.0Hz,9H),3.22(t,J＝5.7Hz,2H),2.55(t,J＝7.5Hz,4H),2.23(t,J＝5.0Hz,2H),1.89(s,2H),1.17(t,J＝7.0Hz,13H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ153.96,150.99,148.86,133.12,129.67,129.32,128.31,124.24,123.41,107.85,104.52,97.76,44.10,27.81,12.59。C34H45N4O4(M+H+)的HRMS计算值：573.3435，测定值：573.3463。
化合物R2的衍生物
符合式(I)和(II)的化合物R2基本分子的许多其它衍生物可由本领域技术人员通过使用已知或可商购获得的起始物和中间体或经由已知方法将这些分子进一步改性制得。式(I)和/或式(II)范畴内的这些化合物的非限制性示例包括以下这些：
(1)(3',6'-二氨基-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C25H24N4O4)，(分子量：444.48)；
(2)(3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C29H32N4O4)，(分子量：500.59)；
(3)(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C33H40N4O4)，(分子量：556.70)；
(4)(3',6'-双(乙基氨基)-2',7'-二甲基-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C31H36N4O4)，(分子量：528.64)；
(5)(3',6'-二氨基-2',7'-二甲基-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C27H28N4O4)，(分子量：472.54)；
(6)(3-氧代-3',6'-二(吡咯烷-1-基)螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C33H36N4O4)，(分子量：552.66)；
(7)(3-氧代-3',6'-双(苯基氨基)螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C37H32N4O4)，(分子量：596.67)；
(8)(3-氧代-3',6'-二(哌啶-1-基)螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C35H40N4O4)，(分子量：580.72)；
(9)(3',6'-二吗啉代-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C33H36N4O6)，(分子量：584.66)；
(10)(2',7'-二丁基-3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C41H56N4O4)，(分子量：668.91)；
(11)(2',7'-二甲基-3-氧代-3',6'-二(哌啶-1-基)螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C37H44N4O4)，(分子量：608.77)；
(12)(3-氧代-1',2',3',4',10',11',12',13'-八氢螺[异吲哚啉-1,7'-吡喃并[2,3-f:6,5-f']联喹啉]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C31H32N4O4)，(分子量：524.61)；
(13)(3-氧代-1',2',3',4',8',9',10',11'-八氢螺[异吲哚啉-1,6'-吡喃并[3,2-g:5,6-g']联喹啉]-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化学式：C31H32N4O4)，(分子量：524.61)；
(14)N-(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)丙酰胺(化学式：C31H36N4O3)，(分子量：512.64)；
(15)N-(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)丁酰胺(化学式：C32H38N4O3)，(分子量：526.67)；和
(16)N-(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)戊酰胺；(化学式：C33H40N4O3)，(分子量：540.70)。
金属离子感测：
描述了金属离子感测方法。在去离子水中配制金属离子溶液(10.0mM)。各自配制化合物R1和R2(0.2mM)的乙醇原液，然后用乙醇–水(1:1，v/v，pH 7.04)稀释至20μM以供光谱测量。对于滴定实验，将2.0mL化合物R1和R2(20μM)的溶液分别填充到1cm光路长度的石英光学池中。经由微量吸移管将Sn2+原液逐渐加入到石英光学池中。加入后5分钟，记录光谱数据。在选择性实验中，通过将适量的金属离子原液放入到2.0mL R1、R2(20μM)溶液中，配制测试样品。对于荧光测试，在560nm处提供激发，同时收集565至700nm的射线。
描述了化合物R1和R2的pH滴定。分别将化合物R1和R2的原液加入到具有不同pH的磷酸钠缓冲液中，至10μM最终浓度。采用560nm处的λex，记录作为pH函数的荧光发射光谱。根据580nm处的荧光发射强度对pH，绘制滴定曲线。
描述了细胞培养物的制备。KB细胞系由Biochemistry and Cell Biology(China)提供。细胞在37℃下生长于增补10％FBS(胎牛血清)和5％CO2的MEM(改良伊格尔培养基)中。将细胞(5×10-8L-1)制片于18nm玻璃盖玻片上，并且使其附着24小时。通过自BHI(Brain-Heart Infusion)琼脂板将单个菌落接种到5mL BHI液体培养基中并且在37℃下培养48小时，制备变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)。
描述了荧光成像。用OLYMPUS IX81激光扫描显微镜和60倍油浸物镜镜，进行共聚焦荧光成像。显微镜配备有多条可见激光线(405、488、543nm)。图像用Olympus FV10-ASW软件采集和处理。就细胞内Sn2+荧光成像而言：将包含0.2％(v/v)DMSO(二甲基亚砜)的培养介质中的10μM化合物R1或R2加入到细胞中。将细胞在37℃下培养30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的探头，并且在PBS(2mL)中洗涤，然后成像。用PBS(2mL×3)洗涤以移除过量探头后，用50μM SnF2处理细胞30分钟。用半导体激光器在543nm下实施负载R1或R2的细胞激发，并且收集560–660nm处的射线(单波道)。另选地，将培养介质中的50μM SnF2加入到细胞中。将细胞在37℃下培养30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的SnF2。用PBS(2mL×3)洗涤以移除过量SnF2后，用10μM R1或R2分别处理细胞30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的探头，并且在PBS(2mL)中洗涤，然后成像。然后如前面一样实施细胞成像。
描述了共定位实验。将培养介质中的50μM SnF2加入到细胞中。将细胞在37℃下培养30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的SnF2。用PBS(2mL×3)洗涤以移除过量SnF2后，用10μM化合物R1或R2分别处理细胞30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的探头，并且在PBS(2mL)中洗涤，然后成像。然后如前面一样实施细胞成像。用PBS(2mL×3)洗涤以移除过量探头后，37℃下用1.0μMGreen DND处理细胞30分钟。然后如前面一样实施细胞成像。
描述了Sn2+在细菌中的荧光成像。分别在10μM化合物R1或R2的存在下，在37℃下，在400rpm的分离筛上将刚稀释的变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)接种60分钟。然后通过以8,000rpm速率离心2分钟收集细菌，并且用盐水(pH＝7.0)漂洗。将所述过程重复三次，然后成像。用盐水(2mL×3)洗涤以移除过量探头后，在50μM SnF2存在下，在37℃下，在400rpm的分离筛上将细菌培养60分钟。然后通过以8,000rpm速率离心2分钟收集细菌，并且用盐水(pH＝7.0)漂洗。将所述过程重复三次，然后成像。光源处于＝543nm，提供激发，并且收集范围＝560-660nm内的射线。
描述了金属离子响应。荧光‘打开’探头，有利于检测目标。化合物R1或R2(20μM)的乙醇–水(1:1，v/v，PH 7.04)溶液是无荧光的。加入Sn2+(0–20eq)，580nm处的荧光打开，并且由于Sn2+螯合引发的罗丹明开环反应，使得560nm激发下荧光显著增强(图1a和1c)。高度选择性对于优异的化学感应器而言是至关重要的。化合物R1和R2在感测Sn2+方面显示出选择性。仅在Sn2+和Cr3+存在下，R1和R2(20μM)的乙醇–水(1:1，v/v，PH 7.04)溶液开启，同时其它过渡金属离子和重金属离子如K+、Ag+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Hg2+在560nm激发下显示出最小的增强(图1b和1d)。R1和R2的金属离子响应适于检测活变异链球菌(Streptococcus)细胞中的Sn2+。
图1(a)和(c)示出，加入0–20eq的Sn2+后，对照化合物R1和本发明化合物R2(20μM)的乙醇–水(1:1，v/v，pH 7.04)溶液的荧光光谱。图1(b)和(d)示出在加入各种金属离子(20.0×10-5M)后，化合物R1和R2(2.0×10-5M)的乙醇–水(1:1，v/v，pH 7.04)溶液在560nm激发下的荧光光谱。
描述了pH值对荧光的影响。罗丹明衍生物的螺旋内酰胺(pirolactam)环在某些pH范围内将打开，并且示出罗丹明的荧光。因此，需要检查化合物R1和R2在具有不同pH值的溶液中的荧光特性。此外，在细胞中，不同细胞器的酸度可显著不同。例如，溶酶体的正常pH为4.5-5.5，这可引发R1或R2开环。考虑到Sn2+探头R1和R2细胞内或细胞外的应用可受pH的干扰，通过在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中，用NaOH和HCl的水溶液调节pH，实施酸–碱滴定实验(图2a和b)。滴定显示，引起化合物R1或R2荧光打开的pH范围分别为2.5-6或2-4.5。预计，R1将由不存在Sn2+的细胞中的溶酶体开启。图2a和2b示出PBS溶液中对照化合物R1和本发明化合物R2(10μM)在不同pH下的580nm荧光相关性。在560nm处激发。
描述了细胞内Sn2+荧光成像。通常将Sn2+加入到牙膏中，从而口腔上皮细胞最可能接触Sn2+。KB细胞是通过荧光成像，在细胞水平上研究Sn2+分布的优秀候选物。本文研究了R1和R2作为Sn2+探头在活KB细胞荧光成像中的实际适用性。首先，在37℃下分别用10μM化合物R1或R2将KB细胞染色30分钟。如激光扫描共聚焦显微镜法所测，无Sn2+存在下，R1在KB细胞位点中提供荧光发射(图3.b1)；R2几乎不提供荧光(图3.b2)。该结果与pH滴定实验相一致，即溶酶体酸性可引发R1荧光发射。R2由于其较低的pH响应而几乎不提供荧光。考虑到可使用R2的pH环境差异更大，随后的背景噪音更低，尤其是在更酸性的环境如溶酶体中，这展示了R2相对于R1的优异性。
此外，当细胞在37℃下，在PBS中用化合物R1或R2增补30分钟，然后在相同条件下用50μM Sn2+培养时，本发明化合物R2自某些细胞内区域提供显著的荧光增加(图3.c2、f2)，而对照化合物R1示出微弱的荧光强度变化(图3.c1，f1)。因此，细胞成像实验表明，R2更适于在细胞水平下检测Sn2+。此外，R1和R2可专门针对溶酶体，因为R1和R2带有与溶酶体目标锚定剂“二甲基乙基氨基”相类似的基团。
图3a和3b示出基于KB细胞(a1-c1)和(a2-c2)CLSM图像衍生的简化示图。细胞分别用10μM化合物R1和R2培养30分钟，然后(d1-f1)和(d2-f2)用50μM SnF2进行培养30分钟。收集560–660nm的红色信道射线(b1、e1、b2、e2)；a1、d1、a2、d2分别为明视场图像，并且c1、f1、c2、f2分别为叠加图像(λex＝543nm)。任何观察到的荧光为红色的。
图4示出对比共定位实验中基于KB细胞CLSM图像衍生的简化示图。首先，在37℃下用50μM Sn2+将KB细胞染色30分钟，然后在相同条件下，分别用10μM化合物R1和1μMGreen DND或化合物R2和1μMGreen DND培养。如激光扫描共聚焦显微镜法所测，R1和R2在KB细胞位点中提供荧光发射(图4b1，b2)，其非常好地与Green DND重叠(图4d1，b2)。其它细胞内位点没有荧光。该令人惊奇的结果表明，Sn2+内在化于细胞中，并且致使离子积聚于溶酶体中。这可能是Sn的传输路径。因此，在该应用中，本发明化合物R2优于R1。许多药剂，包括多种大分子和小分子，必须明确递送至特定的细胞细胞器中，以有效发挥它们的治疗作用。此类递送大体上仍是未解决的问题，但是目标检测是有用的尝试。
图4示出对比共定位实验(a1-d1)中基于KB细胞CLSM图像衍生的简化示图。细胞连续用50μM SnF2、10μM对照化合物R1和1μMGreen DND各自培养30分钟；(a2-d2)连续用50μM SnF2、10μM本发明化合物R2和1μMGreen DND各自培养30分钟。收集560–660nm(λex＝543nm)的红色信道(b1，b2)或500-540nm(λex＝488nm)的绿色信道的射线；a1、a2分别为明视场图像，并且d1，d2分别为叠加图像。
转向图5a和5b，描述了细菌中Sn2+的荧光成像。图5a和5b示出基于CLSM衍生的简化示图。示图未按比例绘制，而且为了进行示意性的说明进行了放大。已报导，Sn2+可抑制变异链球菌(Streptococcus)的代谢。研究了化合物R1和R2作为Sn2+探头在活变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)荧光成像中的实际适用性。首先，在37℃下分别用10μM化合物R1或R2将变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)染色60分钟。如由激光扫描共聚焦显微镜法所测，无Sn2+存在下，化合物R1和R2不提供荧光发射(图5a和5b；分别为b1和b2)。当变异链球菌(Streptococcus)在37℃下用化合物R1或R2的PBS溶液增补60分钟，然后在相同条件下用50μM Sn2+培养时，R1和R2提供显著的荧光增加(图5a和5b；分别为e1和e2)。将荧光和明视场图像叠加示出，荧光信号位于变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)(图5a和5b；分别为f1和f2)，表明Sn2+在细菌内起到其生理作用。该数据提供Sn2+抗菌机制的证据。
图5a和5b示出基于变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)CLSM图像衍生的简化示图。示图未按比例绘制，而且为了进行示意性的说明进行了放大。(a1-c1)和(a2-c2)细胞分别用10μM对照化合物R1和本发明化合物R2培养30分钟，然后(d1-f1)和(d2-f2)用50μM SnF2进行培养30分钟。收集560–660nm的红色信道射线(b1、e1、b2、e2)；a1、d1、a2、d2分别为明视场图像，并且c1、f1、c2、f2分别为叠加图像(λex＝543nm)。
概括地说，通过将KB细胞和变异链球菌(Streptococcus)(700610TM)中的Sn2+成像，展示了本发明化合物R2的生物应用。此外，由Sn2+在细胞和细菌中的分布，示出化合物R2为溶酶体示踪剂，这有助于研究药剂的递送和Sn2+的抗菌机制。
应当了解，本文所公开的量纲和值不旨在严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或换句话讲有所限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的引用不是对其作为本文所公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术，或其单独地或与任何其它参考文献的任何组合，或者参考、提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施例，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的实质和范围的情况下可做出多个其它改变和变型。因此，本文旨在所附权利要求中涵盖在本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (14)

1.一种具有下式(I)的化合物或其光学异构体或盐，所述光学异构体为式(I)的非对映体或对映体：
其中R1为未取代的支化或未支化的C1-C12烷基；并且其中R2、R3、R4、R5、R6、和R7各自独立地为氢或C1-C10烷基，其中所述烷基是未取代的。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R2为氢；
R3、R4、R5、和R6各自独立地选自氢、或未取代的支化或未支化的C1-C5烷基；并且
R7为氢。
3.根据前述权利要求1或2所述的化合物，其中R1为未取代的支化或未支化的C1-C10烷基。
4.一种具有下式(II)的化合物或其光学异构体或盐，所述光学异构体为式(II)的非对映体或对映体：
其中R1为未取代的支化或未支化的C1-C12烷基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中其R1为C1-C10烷基。
6.根据权利要求4或5所述的化合物，其中R1为C1-C8烷基。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
(a)叔丁氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-H)-基]-；
(b)叔丁氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；
(c)甲氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；
(d)乙氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；
(e)甲氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；
(f)乙氧基-酰胺，N-[3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[1H-异吲哚-1,9'-[9H]呫吨]-2(3H)-基]-；和
(g)(3',6'-二氨基-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯。
8.一种检测生物细胞中荧光的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用根据前述权利要求中任一项所述的化合物培养所述细胞；
(b)用激发光照射所述培养的细胞；
(c)检测来自所述化合物的560nm至660nm的光射线。
9.根据权利要求8所述的方法，使所述生物细胞经受Sn2+。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述生物细胞选自口腔上皮细胞或链球菌(Streptococcus)属细菌。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述生物细胞为真核细胞，并且其中所述发射检测优选为溶酶体。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物为权利要求7中的化合物。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述化合物为权利要求7中的化合物。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述化合物为权利要求7中的化合物。
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