CN102488762A

CN102488762A - 一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药组合物、片剂及制备方法

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Publication number: CN102488762A
Application number: CN2011104184636A
Authority: CN
Inventors: 韩晋; 袁海龙; 唐善令; 吴素体; 付珊珊; 丁晋彪; 周旭
Original assignee: 302th Hospital of PLA
Current assignee: Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: CN102488762B

Abstract

本发明一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药组合物、片剂及制备方法，属于中医药技术领域。所述中药组合物由原料药穿山甲、鳖甲、南五味子、桃仁、丹参、赤芍、黄芪、当归、防己、柴胡、连翘和甘草组成，其中各成分的重量比为穿山甲∶鳖甲∶南五味子∶桃仁∶丹参∶赤芍∶黄芪∶当归∶防己∶柴胡∶连翘∶甘草＝5∶5∶5∶3.3∶3.3∶2.5∶2.5∶2∶2∶1.7∶1.7∶1。所述片剂是由上述原料药制备的活性成分和药学上可接受的辅料组成。本发明提供了具有能对肝纤维化及早期肝硬化具有较好的治疗效果的有效治疗药物。

Description

一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药组合物、片剂及制备方法

技术领域

本发明属中药技术领域，具体涉及一种治疗肝纤维化及肝硬化的中药组合物、片剂及制备方法技术领域。

背景技术

我国是病毒性肝炎的高发区，平均年发病约140万人左右，居法定传染病第三位。各类型肝炎中，以乙型肝炎在我国最为常见，约1.2亿人携带乙型肝炎病毒，而20％的乙型肝炎及50～60％的急性丙型肝炎会发展为慢性肝炎，目前我国约有300万慢性肝炎病患者，继而发展为肝硬化、肝衰竭和肝癌，每年死于肝病的人数约有50万。目前全国大约有5000万人患有肝纤维化、早期肝硬化。

肝硬化的症状、体征等可归于中医的“积聚”、“鼓胀”、“胁痛”范畴。由情志抑郁、酒食不节、肝炎失治等外邪或内因引起。情志失调，郁怒伤肝，肝气不疏，经遂阻塞，气滞血瘀，血蕴于肝。酒食饥饱失宜，损伤脾胃，或肝病传脾，脾失健运，形成肝郁脾虚，气机失调，运化不能，气血失养，肝血不畅，积聚于肝。湿热毒邪侵入人体，损失肝脏，迁延失治，邪气缠绵不去，致肝郁气滞，阻络于肝。久病伤肾，脾虚气血生化不足，病损肝脾肾，终致血瘀、气滞、余毒羁留于肝，表现出虚实的错杂证局。早期多属气滞血瘀，晚期则正气虚弱。久病肝阴暗耗，肾精亏虚，虚火内炽而动血，若肝失疏泄，则气滞血瘀，壅遏络道，成为症积；症积凝滞，气血受阻，脾运不健，肾气虚解，不能温脾阳，终致水湿停聚，发生肿胀。其病机规律可概括为气滞-血瘀水停-气血水互结。层层相因，互为因果，形成病理上的恶性循环。《医碥》：“气、血、水三者，病常相因，有先病气滞而后血结者，有先病血结而后气滞者，有先病水肿而血随败者，有先病血结而水蓄者。”正合肝硬化病机。

《灵枢百病始生》篇指出：“卒然外中于寒，若内伤于忧怒，则气上逆，气上逆则六脉不通，温气不行，凝血蕴里而不散，津液涩渗。著而不去而积皆成矣。”“凝血蕴里”是贯穿本病的重要机理。肝为藏血之脏，瘀血蕴积则肝脾肿大、坚硬；血瘀症积，气血水搏结，三焦失司，甚则水泛络伤，形成腹水；瘀血热毒郁结于肝脾，见肝掌或蜘蛛痣、舌质暗或瘀斑；隧道壅塞，水湿壅聚，日久损伤元气，脾虚翰旋无力，致乏力、纳差、腹胀；水湿热毒缠绵、口苦、尿黄；气血肝肾亏虚，现脉沉细或舌质淡。

综合以上分析，血瘀是肝硬变的共同特点。多伴有气滞肝郁、气虚血亏、水湿毒邪未尽。中医治疗当以活血软肝为主，佐以疏肝益肾，补气养血，化水祛毒。既无伤正之弊，又无助邪之害，既不助阳升热，亦无寒凉伤脾之虞，符合肝硬变标实，本虚的病理特点。

发明内容

为了解决目前我国肝纤维化及肝硬化的问题，本发明根据传统中医药理论，公开了一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药组合物。

本发明的第二个目的在于公开了由上述中药组合物制备所得的片剂。

本发明的第三个目的在于公开了上述中药组合物和片剂的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药组合物，其中，所述中药组合物由穿山甲、鳖甲、南五味子、桃仁、丹参、赤芍、黄芪、当归、防己、柴胡、连翘和甘草组成，其中各成分的重量比为穿山甲∶鳖甲∶南五味子∶桃仁∶丹参∶赤芍∶黄芪∶当归∶防己∶柴胡∶连翘∶甘草＝5∶5∶5∶3.3∶3.3∶2.5∶2.5∶2∶2∶1.7∶1.7∶1。

上述技术方案中的中药组合物，其中，所述中药组合物中各原料药的重量配比为138.89g，鳖甲138.89g，南五味子138.89g，桃仁92.59g，丹参92.59g，赤芍69.44g，黄芪69.44g，当归55.56g，防己55.56g，柴胡46.30g，连翘46.30g，甘草27.78g。

一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药片剂，所述中药片剂包括活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述活性成分由上述技术方案中所述的中药组合物制备所得。

上述技术方案中所述的中药片剂，其中，所述活性成分是由上述技术方案所述的中药组合物通过下述方法制备：

(1)、称取所述重量比的原料药；

(2)、取步骤(1)中称取的原料药，其中穿山甲、鳖甲、南五味子三味药粉碎成细粉，过筛；

(3)、取步骤(1)中称取的原料药，其中桃仁∶丹参∶赤芍∶黄芪∶当归∶防己∶柴胡∶连翘∶甘草加水回流2次，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10-1.12的浸膏；

(4)、取步骤(2)所得药物细粉，加入到步骤(3)浸膏中，混匀，干燥，即得活性成分。

上述技术方案中所述的中药片剂，其中，所述步骤(3)中回流用水量为6～10倍水，回流时间为0.5～1.5小时。

上述技术方案中中任一技术方案所述的中药片剂，其中，辅料为羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁。

上述技术方案中中任一技术方案所述的中药片剂，其中，所述羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁的含量分别占片剂重量的3％和0.3％。

上述技术方案中中任一技术方案所述的中药片剂的制备方法，包括由活性成分和辅料制成中药片剂的步骤，其特征在于，所述中药片剂的制备方法还包括活性成分的制备步骤：

(1)、以重量比为穿山甲∶鳖甲∶南五味子∶桃仁∶丹参∶赤芍∶黄芪∶当归∶防己∶柴胡∶连翘∶甘草＝5∶5∶5∶3.3∶3.3∶2.5∶2.5∶2∶2∶1.7∶1.7∶1；

上述技术方案中所述的中药片剂的制备方法，其中，步骤(3)所述用水量为6～10倍水，回流时间为0.5～1.5小时。

上述技术方案中所述的中药片剂的制备方法，其中，所述辅料为含量占片剂重量3％羧甲基淀粉钠和0.3％的硬脂酸镁。

肝硬变以癥瘕痞块为主症，中医辨证从软坚消肿着手，本发明中药组合物中取穿山甲活血祛瘀、软坚散结、祛腐生新；配鳖甲滋阴养血、散结软坚，二药合用，活血软坚，而兼补养之性，攻不伤正，补不留滞，相辅相成，共奏软坚散结、养阴祛腐之力。因而取穿山甲、鳖甲消瘀化滞，消痞除癥，以为君药。

肝硬变以瘀血壅结，脉络阻滞，癥瘕痞块为主症，活血散瘀乃治病之要。赤芍、桃仁、丹参、当归能行血、破血、补血，助君药消瘀化滞，消痞除癥，以为臣药。肝硬变病程迁延，气血生化不足，病损肝、脾、肾，故取黄芪、南五味子二味，助君药补中气益元气以助血行，利阴气滋阴液以调肝肾。仍以为臣药。

本病源于肝，肝郁气滞、水气失运、余毒未清，乃以柴胡疏肝郁、防己泄水湿、连翘清余毒，免其助邪之害。以之为佐药。甘草调和诸药，以为使药。

本发明中药组合物是针对血瘀、气虚、湿热之证而设的中药方药，以活血软肝、疏肝益肾、补气养血、化水祛毒为主要治则，扶正、化瘀、祛邪并重，祛邪不伤正、破瘀不伤阴、扶正不留邪。用于肝硬变气滞血瘀、气虚血亏、水湿毒邪未尽之证，适用于肝硬变静止期或活动期，具有较好的抗肝纤维化及早期肝硬化功效。此外，临床上当肝硬化病人的转氨酶高于正常值2倍以上时，复方鳖甲软肝片将停用或减量，而本发明中药组合物和片剂中含有南五味子，有保肝降酶的功效，可以应用于转氨酶高的病人。再者，本发明中药组合物和片剂中的防己有利水之功效，对肝硬化腹水病人也有一定的治疗和缓解作用。

本发明的中药片剂口服，一次4片，一日3次。

本发明具有以下有益效果：本发明能对肝纤维化及早期肝硬化具有较好的治疗效果。

附图说明：

图1为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检阴性对照组(×100)；

图2为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检阴性对照组(×200)；

图3为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检模型对照组(×100)；

图4为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检模型对照组(×200)；

图5为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检阳性对照组(×100)；

图6为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检阳性对照组(×200)；

图7为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 4.2g/kg剂量组(×100)；

图8为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 4.2g/kg剂量组(×200)；

图9为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 2.8g/kg剂量组(×100)；

图10为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 2.8g/kg剂量组(×200)；

图11为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 1.4g/kg剂量组(×100)；

图12为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 1.4g/kg剂量组(×200)；

图13为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 0.7g/kg剂量组(×100)；

图14为四氯化碳所致大鼠肝纤维化肝组织病理HE染色镜检SWP 0.7g/kg剂量组(×200)；

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1：中药组合物的制备

称取穿山甲138.89g，鳖甲138.89g，南五味子138.89g，桃仁92.59g，丹参92.59g，赤芍69.44g，黄芪69.44g，当归55.56g，防己55.56g，柴胡46.30g，连翘46.30g，甘草27.78g。其中穿山甲、鳖甲、南五味子三味药粉碎成细粉，过筛；桃仁、丹参、赤芍、黄芪、当归、防己、柴胡、连翘、甘草加8倍量水回流2次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10-1.12的浸膏；取上述穿山甲、鳖甲、南五味子细粉，加入到浸膏中，混匀，70℃干燥，即得中药组合物。

实施例2：中药组合物片剂的制备

称取穿山甲138.89g，鳖甲138.89g，南五味子138.89g，桃仁92.59g，丹参92.59g，赤芍69.44g，黄芪69.44g，当归55.56g，防己55.56g，柴胡46.30g，连翘46.30g，甘草27.78g。其中穿山甲、鳖甲、南五味子三味药粉碎成细粉，过筛；桃仁、丹参、赤芍、黄芪、当归、防己、柴胡、连翘、甘草加8倍量水回流2次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10-1.12的浸膏；取上述穿山甲、鳖甲、南五味子细粉，加入到浸膏中，混匀，制粒，70℃干燥，加入3％羧甲基淀粉钠和0.3％硬脂酸镁，拌匀，压片，包薄膜衣，即得本发明中药组合物片剂。

实施例3：中药组合物片剂的制备

本实施例的操作步骤与实施例2基本相同，区别在于在制粒前加入3％羧甲基淀粉钠，混匀，制粒，70℃干燥，加入0.3％硬脂酸镁，过筛，压片，包薄膜衣，即得本发明中药组合物片剂。

以下通过本发明所述的治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药片剂[以下称十二味穿甲片(SWP)]的药效学试验来进一步阐述本发明所具有的有益效果。

试验例1：SWP抗四氯化碳所致大鼠肝纤维化的实验研究：

本试验例的目的在于探讨SWP对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用。方法：腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纤维化模型，观察SWP对大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)等生化指标和肝组织羟脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)和胶原含量的影响，并通过肝组织病理切片观察肝脏病理改变。结果：SWP能显著降低大鼠血清中ALT、AST活性，使肝组织变性明显减轻。结论：SWP对四氯化碳致大鼠肝纤维化具有显著的保护作用。

1、试验材料

1.1、仪器

AR1140电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，TG16-W微量高速离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)，OLYMPUS-AU 5400全自动生化分析仪(日本)，powerwave xs酶标仪(美国基因公司)，YD-2508III电脑快速恒温冷冻石蜡切片机(金华益迪医疗设备厂)，SYD-B病理石蜡包埋机(沈阳市高新区誉德病理设备厂)，SYD-PK漂烘烤片机(沈阳市高新区誉德病理设备厂生产)101-A电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2、药物与试剂

十二味穿甲片(SWP；规格：0.5g/片；本发明制备)，四氯化碳(CCL₄；规格：500ml/瓶；批号：20100419；上海国药集团化学制剂有限公司)，注射用大豆油(规格：200ml/瓶；批号：20080701；江西金海棠药用油有限公司)，秋水仙碱片(规格：0.5mg/片；批号：100509；西双版纳版纳药业有限责任公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na；批号：20080828；天津市科密欧化学试剂开发中心)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，总蛋白(TP)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，白蛋白(ALB)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，羟脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，其余试剂均为分析纯。

1.3、试验动物

健康SD大鼠，SPF级，98只，雌雄各半，体重(200±20)g(河南省实验动物中心，生产许可证号SCXK(豫)2010-0002)。

2、实验方法

2.1、动物分组与给药剂量

取经检疫合格的小鼠98只，准确称取体质量，用分组软件随机分为7组，每组14只，雌雄各半，填写“动物移动记录表”。即：

1组：秋水仙碱(阳性对照)组(0.1mg·kg^-1)；2组：SWP组(4.2g·kg^-1)；3组：SWP组(2.8g·kg^-1)；4组：SWP组(1.4g·kg^-1)；5组：SWP组(0.7g·kg^-1)；6组：模型对照组(等容量CMC-Na混悬液)；7组：阴性对照组(等容量CMC-Na混悬液)

2.2、造模

将CCL₄与注射用大豆油按400ML∶1L的比例配成40％的CCL₄油剂。各给药组(1、2、3、4、5)和模型组(6组)大鼠以40％CCL₄腹腔注射2ml·kg^-1体质量，每周2次，连续8周，阴性对照组(7组)腹腔注射同体积的注射用大豆油。

2.3、给药方法

大鼠经口途径灌胃(ig)。

给药组(1、2、3、4、5组)按所设剂量每日ig 1次，阴性对照组和模型对照组(6、7组)给予等容量的CMC-Na混悬液。每周停药1天。共给药8周。由于动物数量较大，为了便于安排解剖取材操作，在给药前将每组动物雌雄分两批(首次给药，第2批较第1批推后1天，末次给药，第2批较第1批提前1天)进行给药。

2.4、体质量、血清学检测、肝脏病理学检测

造模前，准确称量每只大鼠体质量，造模开始后，每3～4天测定1次体质量，每次测定均于给药前1h进行。于末次给药后，各组动物禁食不禁水12h，25％氨基甲酸乙酯(乌拉坦)麻醉，腹主动脉取血，3500r/min离心15min，取上清用于测定丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶，AST)、白蛋白(Albumin，ALB)和总蛋白(TP)含量。处死大鼠，分离肝脏，取肝右叶相同部位新鲜组织于10％中性甲醛溶液中固定至少24h，待做病理学检查。

2.5、肝脏Hyp含量测定和肝内胶原定量分析

取1g肝脏用无水乙醇脱水12小时，丙酮脱脂24(于12小时换液1次)小时后，110℃烘干，比色法测定肝脏中羟脯氨酸(Hyp)含量，按羟脯氨酸试剂盒说明操作。肝内胶原定量分析：肝组织胶原含量＝肝组织羟脯氨酸含量/0.13。

2.6、末次给药后动物存活率

目前作为文献及科研中CCL₄性肝纤维化造模的主要动物，以大鼠作为研究对象具有较好的重现性，缺点是动物个体差异较大，CCL₄肝毒作用迅速剧烈，动物死亡率高。因此，本实验末次给药后，计算比较各组动物存活率(存活动物数/本组动物总数×100％)。

2.7、数据的统计分析

实验数据用均数±标准差表示，统计方法为多重方差分析，用SPSS10.0统计软件处理。

3、实验结果

3.1、大鼠一般状况观察

阴性对照组大鼠生长良好，体重自然增长，行走正常，活动敏捷，黑褐色颗粒状大便，被毛润泽，除1只可能因给药操作失误死亡外，无大鼠死亡病例。

其余各组精神状态不佳，多表现有烦躁不安，典型者如造模后常见两两大鼠竖立相向呈搏状对峙持续1～3分钟不等，大便溏稀，随造模时间延长，个别出现厌食倦怠、消瘦、体重下降，腹部肿大，疑是腹水。

自造模第2周始有大鼠死亡病例，至实验末期统计结果显示，模型对照组死亡7只，存活率为50％。SWP大、中剂量组各死亡7只(存活率各为50％)，小剂量组死亡5只(存活率各为64.2％)，秋水仙碱组死亡5只(存活率各为64.2％)。

3.2、SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠体质量的影响

表中数据显示，给药第6天(造模第1周)时，除阴性对照组大鼠体质量呈逐天均衡上升趋势外，其余各组造模大鼠体重均有下降，并出现3只死亡病例，可能是由于造模初期动物对CCL4的剧烈刺激敏感所致。造模同时给药自第6天至第20天(造模第3周)阴性对照组大鼠体质量继续上升，而各组造模大鼠体重增长缓慢，与阴性对照组比较，差异具显著意义(P＜0.05或0.01)。自第20天至第45天(造模第6周)SWP 4.2g·kg^-1剂量组大鼠体重增长较缓慢且不均匀，与阴性对照组比较，差异具显著意义(P＜0.05或0.01)，其余各给药组大鼠体重与阴性对照组比较，差异无显著意义。自第20天至末次给药(造模第8周)各组存活造模大鼠体重与阴性对照组比较，差异无显著意义(p均＞0.05)。(见表1～5)

表1 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠体质量的影响

(n＝14)

注：与阴性对照组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01；与模型对照组比较，P均＞0.05。表中数据下标为该组动物存活只数。

表2 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠体质量的影响

(n＝14)

注：与阴性对照组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与模型对照组比较，P均＞0.05。表中数据下标为该组动物存活只数。

表3 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠体质量的影响

(n＝14)

表4 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠体质量的影响

(n＝14)

表5 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠体质量的影响

(n＝14)

3.3、SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量和胶原含量的影响

表6中数据显示，模型对照组大鼠肝脏Hyp含量显著上升，均值约为阴性对照组的2.8倍。与模型对照组比较，SWP4.2、1.4g·kg^-1剂量组和秋水仙碱组皆显著低于模型对照组(P均＜0.05)，而2.8g·kg^-1剂量组虽与模型对照组无统计学差异，但呈明显下降趋势。因此与模型对照组比较，SWP可明显降低肝组织Hyp含量。

并且，Hyp是胶原蛋白特有的氨基酸，肝脏羟脯氨酸的含量可反映肝脏胶原蛋白合成的量，经计算出的各组肝组织胶原含量数据与Hyp含量的变化水平一致，显示SWP具有明显降低肝组织胶原含量作用。

表6 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠肝脏Hyp和胶原含量的影响

注：与阴性对照组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01；与模型对照组比较，³⁾P＜0.05，⁴⁾P＜0.01。表中数据下标为该组动物存活只数。

3.4、SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALB、TP的影响

结果如表7所示，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清ALT、AST含量显著增高(P均＜0.01)；与模型对照组比较，秋水仙碱组、SWP 2.8、1.4、0.7g·kg^-1剂量组ALT、AST含量差异均具有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)，4.2g·kg^-1剂量组差异虽无统计学意义，但表明SWP与秋水仙碱均能显著降低CCL₄肝损伤大鼠血清ALT、AST水平。与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清ALB、TP水平稍有下降，但统计学意义不显著，其余各组变化不规律。

表7 SWP对CCL₄致肝纤维化大鼠血清生化指标的影响

(n＝14)

注：与阴性对照组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01；与模型对照组比较，³⁾P＜0.05，⁴⁾P＜0.01；与阳性对照组比较，⁵⁾P＜0.05。表中数据下标为该组动物存活只数。

3.5、肝组织病理观察

3.5.1、肉眼所见

阴性对照组大鼠解剖后肝脏呈紫红色，表面光滑匀质，质地柔软而有弹性；模型对照组大鼠解剖后腹腔有不同程度的腹水，肝脏表面粗糙，颜色暗黄，边缘变钝，表面密集有粟米大小暗黄色颗粒，质硬脆。SWP 2.8g·kg^-1剂量组和秋水仙碱组大鼠解剖后，腹水较少，肝脏红褐色，色泽较模型组光亮，黄色小斑点少，弹性较好。SWP 1.4g·kg^-1剂量组大鼠肝脏较高剂量略发暗黄，表面光滑但有黄色小斑点，有弹性。0.7g·kg^-1剂量组大鼠肝脏暗黄色，肝脏黄色斑点密集，质硬。

3.5.2、HE染色镜检

阴性对照组大鼠肝小叶结构清晰，细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，细胞核位于细胞中央，圆而清晰。肝细胞无变性、坏死改变。仅于门管区和中央静脉有少许胶原纤维存在，肝细胞结构正常，无炎性细胞浸润。模型对照组肝细胞肿胀，胞浆疏松并出现颗粒，可见核碎裂、肝细胞脂肪变性，汇管区炎性细胞浸润，结缔组织增生明显，纤维束分割肝组织，形成多个假小叶，原小叶结构破坏或消失，由门管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割、包绕肝小叶形成假小叶。纤维间隔内有大量单核、淋巴、嗜酸性细胞等炎症细胞及成纤维细胞浸润。阳性对照组大鼠肝小叶结构基本正常，肝细胞少见肿胀和坏死，汇管区只有少量细胞浸润，中央静脉及肝窦内仅可见轻微的胶原纤维分布。SWP 4.2g·kg^-1剂量组大鼠中央静脉及肝窦内可见明显的胶原纤维分布，包绕肝小叶形成假小叶，汇管区有明显的炎性细胞浸润，与模型比中度改善。SWP 2.8g·kg^-1剂量组大鼠肝小叶结构基本正常，胶原纤维仅轻度增生，肝细胞无变性、坏死改变，汇管区仅见少量炎性细胞浸润，与模型比改善显著。SWP 1.4g·kg^-1剂量组大鼠肝组织结缔组织增生明显，纤维束分割肝组织，形成多个假小叶。纤维间隔内有炎性细胞浸润，少数肝细胞点状坏死和嗜酸小体形成，与模型比改善不明显。SWP 0.7g·kg^-1剂量组大鼠肝组织结缔组织增生明显，纤维束分割肝组织，形成多个假小叶，改善不明显。纤维间隔内有炎性细胞浸润。与模型比改善不明显。见图1～14，图1、2所示，肝小叶结构清晰，细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，细胞核位于细胞中央，圆而清晰。肝细胞无变性、坏死改变。仅于门管区和中央静脉有少许胶原纤维存在，肝细胞结构正常，无炎性细胞浸润；图3、4所示，肝细胞肿胀，胞浆疏松并出现颗粒，可见核碎裂、肝细胞脂肪变性，汇管区炎性细胞浸润，结缔组织增生明显，纤维束分割肝组织，形成多个假小叶，原小叶结构破坏或消失，由门管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割、包绕肝小叶形成假小叶。纤维间隔内有大量单核、淋巴、嗜酸性细胞等炎症细胞及成纤维细胞浸润；图5、6所示，肝小叶结构基本正常，肝细胞少见肿胀和坏死，汇管区只有少量细胞浸润，中央静脉及肝窦内仅可见轻微的胶原纤维分布；图7、8所示，中央静脉及肝窦内可见明显的胶原纤维分布，包绕肝小叶形成假小叶，汇管区有明显的炎性细胞浸润，与模型比中度改善；图9、10所示，肝小叶结构基本正常，胶原纤维仅轻度增生，肝细胞无变性、坏死改变，汇管区仅见少量炎性细胞浸润，与模型比改善显著；图11、12所示，结缔组织增生明显，纤维束分割肝组织，形成多个假小叶。纤维间隔内有炎性细胞浸润，少数肝细胞点状坏死和嗜酸小体形成。与模型比改善不明显；图13、14所示，结缔组织增生明显，纤维束分割肝组织，形成多个假小叶，改善不明显。纤维间隔内有炎性细胞浸润。与模型比改善不明显。

4、结论

本研究结果表明，SWP 4.2和2.8g·kg^-1可明显降低CCL₄诱导肝损伤大鼠血清ALT和AST的水平，降低肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量和胶原含量，同时能减轻CCL₄引起肝损伤病理变化，使肝细胞水肿、气球样变及炎细胞浸润减少，SWP 2.8g·kg^-1剂量组改善作用较为明显。说明SWP预防性给药，能明显阻止大鼠慢性肝纤维化的形成过程。

试验例2：SWP对小鼠的急性毒性实验：

本试验例的目的在于研究十二味穿甲片对小鼠的急性毒性作用。方法：经预试确定按最大给药量法设计试验，以最大给药浓度和最大给药容积在24h内对小鼠灌胃给药3次，连续观察2周，观察14d内小鼠的毒性反应和死亡情况，判断药物的急性毒性。结果：小鼠灌胃给药后2周内无1只小鼠死亡，亦未见明显毒性反应；测得小鼠的最大给药量为60g·kg^-1，为成人每日用量的600倍。结论：在本实验条件下，十二味穿甲片对受试动物未见明显的急性毒性作用，初步确定十二味穿甲片具有较好的安全性。

1、试验材料

1.1、仪器与试剂

AR1140电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，DJ-5000C电子天平(中外合资亚太电子天平厂)。苦味酸(分析纯，批号：20070901，广东台山市众城化工有限公司)。

1.2、受试药物

十二味穿甲片(SWP；规格：0.5g/片；本发明制备)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na；批号：20080828；天津市科密欧化学试剂开发中心)。

1.3、试验动物

健康KM小鼠，SPF级，40只，雌雄各半，体重(20±2)g(河南省实验动物中心，生产许可证号SCXK(豫)2005-0001)。动物入室即以油性笔于鼠尾处做终身标记。于检疫室适应3d，适应期结束，取体质量合格小鼠用于实验。

2、方法与结果

2.1、确定给药剂量

根据预实验结果，确定正式试验的剂量。十二味穿甲片溶液以7号注射针头所能通过的最大浓度为0.5g·ml^-1，计算其最大给药剂量为20g·kg^-1，设40ml/kg为最大给药容量，于上午8:30、下午3:00和晚上9:00各灌胃1次，共给药1天。计算1日内累计的最大灌胃剂量为60g·kg^-1。

2.2、分组

采用随机分组软件将动物分为最大给药剂量组和阴性对照组2组，每组20只，雌雄各半。用苦味酸水溶液对各组小鼠进行体染标记，便于实验操作。

2.3、禁食

于给药前1日晚上11时左右，将待给药动物笼具中的饲料取出，开始禁食，禁食时间为8h。禁食过程中提供充足的饮用水供动物自由饮用。

2.4、各种指标检测频率、方法

2.4.1、一般状况观察

给药当日，于末次给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h时各观察1次动物的毒性反应和濒死动物剖检情况，于次日开始每日观察记录小鼠给药后的一般状况，包括行为状态、粪、尿、毛色及眼、口、鼻和肛门等有无异常分泌物，观察时间为每日上午9时，连续观察14d。一般观察项目指征参《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》【Z】GTP2-1[附录II]。记录小鼠在给药后异常反应、死亡数和死亡时间，可能情况下判断小鼠在给药后异常反应出现到恢复接近正常的时间。观察期结束脱颈椎处死存活动物进行尸检，对各组小鼠主要脏器如心、肝、脾、肺、肾等经肉眼观察并记录有无异常改变。

2.4.2、体质量观察

于给药前及给药后7d内每天早上9时左右称取小鼠体质量、第7d后每3天称1次小鼠体质量。计算给药14d后对照组及给药组小鼠体质量较给药前平均增长率(％)。

2.4.3、动物剖检

在实验过程中发现濒死动物及观察期满对动物进行剖检，肉眼观查小鼠心、肝、肾、肺、脑、脾、胸腺等重要器官的毒性反应情况，发现异常即行病理学检查，并结合中毒症状分析靶器官。

3、各指标测定结果

3.1、体质量

(1)、从两组小鼠间的体质量变化情况看，比较灌胃前两组小鼠的体质量无明显差异(p＞0.05)。给药后第2d开始，两组小鼠的体质量逐天呈均衡上升趋势，统计结果显示两组小鼠各天体质量增长均无显著性差异(p均＞0.05)。(见表8，9，10)

表8十二味穿甲片对实验小鼠体质量的影响

注：与阴性对照组比较，行方差分析，p均＞0.05。

表9十二味穿甲片对实验小鼠体质量的影响

注：与阴性对照组比较，行方差分析，p均＞0.05。

表10十二味穿甲片对实验小鼠体质量的影响

注：与阴性对照组比较，行方差分析，p均＞0.05。

(2)、从实验前后两组小鼠体质量变化来看，给药14d后阴性对照组和十二味穿甲片组小鼠体质量较给药前平均增长率分别为49.02％，47.96％，无明显差异(P＞0.05)。(见表11)。

表11十二味穿甲片对实验小鼠体质量平均增长率的影响

3.2、一般状态观察给药当天除见药物组个别小鼠活动减少，其余小鼠毛色光滑，粪便、摄食、活动均未见异常；第2天后小鼠活动、体重增长、粪便等均未见异常，与阴性对照组比较无明显差异；且14d内无死亡及其他异常发生。两组同时处死后进行尸检，各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)经肉眼观察未见异常改变，与阴性对照组比较无明显差异。结果见表12。

表12十二味穿甲片灌胃给药的小鼠死亡分布情况

4、结论

本实验条件下，十二味穿甲片以最大浓度和最大给药体积给小鼠灌胃给药，最大单次给药量达20g生药·kg^-1体质量，24h内给药3次，连续观察14d，累计最大给药量达60g生药·kg^-1体质量，相当于成人(60kg)推荐临床日用量的600倍。小鼠全部存活，未出现明显的急性毒性反应。一般认为，按体质量计算，小鼠1d最大给药量相当于临床日用量的100倍以上则较为安全，可以提供临床研究试用。提示十二味穿甲片口服给药的毒性很小。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由原料药穿山甲、鳖甲、南五味子、桃仁、丹参、赤芍、黄芪、当归、防己、柴胡、连翘和甘草组成，其中各成分的重量比为穿山甲∶鳖甲∶南五味子∶桃仁∶丹参∶赤芍∶黄芪∶当归∶防己∶柴胡∶连翘∶甘草＝5∶5∶5∶3.3∶3.3∶2.5∶2.5∶2∶2∶1.7∶1.7∶1。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：所述中药组合物中各原料药的重量配比为138.89g，鳖甲138.89g，南五味子138.89g，桃仁92.59g，丹参92.59g，赤芍69.44g，黄芪69.44g，当归55.56g，防己55.56g，柴胡46.30g，连翘46.30g，甘草27.78g。

3.一种治疗肝纤维化及早期肝硬化的中药片剂，所述中药片剂包括活性成分和药学上可接受的载体，其特征在于：所述活性成分由权利要求1或2所述的中药组合物制备所得。

4.根据权利要求3所述的中药片剂，其特征在于，所述活性成分是由权利要求1所述的中药组合物通过下述方法制备：

(1)、称取所述重量配比的原料药；

5.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于：所述步骤(3)中回流用水量为6～10倍水，回流时间为0.5～1.5小时。

6.根据权利要求3～5中任一权利要求所述的中药片剂，其特征在于：辅料为羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁。

7.根据权利要求3～5中任一权利要求所述的中药片剂，其特征在于：所述羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁的含量分别占片剂重量的3％和0.3％。

8.权利要求2～8中任一权利要求所述的中药片剂的制备方法，包括由活性成分和辅料制成中药片剂的步骤，其特征在于，所述中药片剂的制备方法还包括活性成分的制备步骤：

9.根据权利要求8所述的中药片剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述用水量为6～10倍水，回流时间为0.5～1.5小时。

10.根据权利要求8所述的中药片剂的制备方法，其特征在于：所述辅料为含量占片剂重量3％羧甲基淀粉钠和0.3％的硬脂酸镁。