KR20040056691A

KR20040056691A - 다슬기를 유효성분으로 하는 생약추출물을 함유하는간질환 치료용 약제조성물

Info

Publication number: KR20040056691A
Application number: KR1020020083233A
Authority: KR
Inventors: 장선일; 김형진; 황기명; 제갈승주; 정헌택; 권태오; 김윤철; 윤용갑; 최병민; 배현옥; 심재석
Original assignee: 임실생약영농조합법인
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2002-12-24
Publication date: 2004-07-01
Also published as: KR100563129B1

Abstract

본 발명은 다슬기를 유효성분으로 하는 생약 추출물을 함유하는 간질환 치료용 약제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 다슬기를 유효성분으로 하는 생약추출물이 간섬유화를 감소시키고, 간세포주(HepG2)에서 타크린으로 유발된 세포독성을 개선시키는 작용을 하는 간섬유화 및 간세포 손상치료용 약제 조성물에 관한 것이다.

Description

다슬기를 유효성분으로 하는 생약추출물을 함유하는 간질환 치료용 약제조성물{Pharmaceutical composition for Hepatoprotective against containing the phytomedicinal extract having melanian snail as an active principle}

산업이 고도화됨에 따라 경제인구가 특정분야에 적응하기 위해서 스트레스를 받게 되어 각종 인체질환을 야기하는데, 그 중에서도 간 질환은 경제활동에 있어 가장 왕성한 시기인 30-50대에 가장 높은 발병률과 사망률을 보이고 있어 현대 의학이 해결해야할 가장 큰 문제중의 하나이고 여러 원인들에 의해 발병률이 급속도로 증가하고 있다. 그러나, 지금까지 개발되어 사용중인 천연물 유래 간 질환 치료제는 실리마린(silymarin), 소시호탕 등에 한정되어 있고, 합성제제로는 에스-아데노실-엘-메싸이오닌(S-adenosyl-L-methionine), 폴리엔포스파티딜콜린 (polyenphosphatidylcholine)과 펜토톡씨필라인(pentoxifylline) 등에 불과하며 (Wu & Zern, 2000, J. Gastroenterol., 35: 665-672; Shimizu et al., 1999, Hepatology, 29: 149-160), 상기의 약물들은 완치에 도달할 수 없고 증상을 조절할 수 있을 정도의 효과만을 지니고 있다. 또한, 스테로이드 계통의 항염증제도 간 질환의 치료에 사용되는데, 이는 일시적으로 뛰어난 효과를 발휘하지만 장기간 사용시 인체의 다른 장기에 부작용을 초래한다. 따라서, 위험이 없고 생리적 부작용이 최소화된 약물의 개발이 절실히 요망된다(Wu & Zern, 2000, J. Gastroenterol., 35: 665-672; Poli G., 2000, Molecular Aspects of Medicine, 21: 49-98).

일반적으로, 간경화(cirrhosis)의 전 단계인 간 섬유화(hepatic fibrosis)는 만성 간질환을 가진 환자에서 세포외부 매개 단백질(extracellular matrix protein), 특히 콜라겐의 비정상적인 축적으로 발생된다. 손상 받은 간에서 세포외부 매개 단백질은 지방저장 세포라 불리우는 활성화된 스텔레트 세포(stellate cells)에서 합성되는데, 이 세포의 활성화는 글루타치온(glutathione, GSH)의 고갈에 의한 해독작용의 실패 또는 사이토크롬 C P450(cytochrome C P450, CYP450)의 발현 및 쿠퍼 세포(Kuffers cells)와 염증반응으로부터 유입된 면역세포에 의해 일산화질소(nitric oxide, NO), 슈퍼옥사이드 아나이온(superoxide anion, O₂ ^-), 퍼옥시나이트레이트(peroxynitrate)와 같은 자유 유리기(free radical)에 의해 간세포의 손상을 초래함은 물론, 각종 사이토카인(cytokines) 및 케모카인(chemokines)의 작용에 의해서 일어난다(Poli, G., 2000, Molecular Aspects of Medicine 21: 49-98; Ichiro et al., 1999, Hepatology, 29: 149-160). 이와 같이 생물학적인 지식이 발달됨에 따라 간 손상 및 간 섬유화의 원인이 보고되면서 간 질환의 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 상기에서 밝힌 바와 같이 지금까지 개발된 간 질환 치료제는 극히 한정되어 있어 이 질병에 대한 치료약물 또는 개선제의개발이 절실히 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 없으면서 간질환 치료효과가 우수한 천연물을 연구하고 검토한 결과, 다슬기 또는 다슬기를 유효성분으로 하는 생약추출물이 간기능 보호효과 뿐만 아니라, 간세포 손상을 개선시키는 효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유효성분으로서 다슬기 또는 다슬기를 유효성분으로 하는 생약추출물을 함유하여 간손상에 의한 간섬유화 및 간세포 손상에 대한 우수한 개선효과를 나타내는 간섬유화 및 간세포 손상치료용 약제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 약제조성물의 일산화질소 생성에 대한 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 약제조성물의 간 섬유화 및 간세포 병변억제의 효과를 나타낸 사진이다. 도 2에서 (가)는 생리식염수만 투여한 음성대조군, (나)는 사염화탄소와 생리식염수를 투여한 양성대조군, (다)는 사염화탄소화 다슬기를 투여한 실험군, (라)는 사염화탄소와 인진쑥을 투여한 실험군, (마)는 사염화탄소와 다슬기, 인진쑥을 혼합하여 투여한 실험군, (바)는 사염화탄소화 다슬기를 함유한 생약추출물을 투여한 실험군의 효과를 나타내는 사진이다.

도 3은 본 발명의 약제조성물의 간 섬유화 억제 효과를 나타낸 사진이다. 도 3에서 (가)는 생리식염수만 투여한 음성대조군, (나)는 사염화탄소와 생리식염수를 투여한 양성대조군, (다)는 사염화탄소화 다슬기를 투여한 실험군, (라)는 사염화탄소와 인진쑥을 투여한 실험군, (마)는 사염화탄소와 다슬기, 인진쑥을 혼합하여 투여한 실험군, (바)는 사염화탄소화 다슬기를 함유한 생약추출물을 투여한 실험군의 효과를 나타내는 사진이다.

도 4는 본 발명의 약제조성물의 간 섬유화 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 간질환 치료용 약제 조성물은 다슬기 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기의 약제조성물은 다슬기 추출물에 인진쑥, 지구자, 백작약, 당귀, 황정, 감초, 대추, 계피, 건강, 치자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 함유하는 것을 특징으로 한다. 특히, 생약성분으로 인진쑥을 포함하는 것이 보다 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 간질환 치료용 약제조성물은 조성물 총 중량에 대하여 10~80중량%의 다슬기, 5~30중량%의 인진쑥, 3~20중량%의 지구자, 1~30중량%의 백작약, 1~30중량%의 당귀, 1~20중량%의 황정, 3~20중량%의 감초, 1~20중량%의 대추, 1~20중량%의 계피, 0.1~20중량%의 건강, 및 0.1~20중량%의 치자로 이루어진다.

본 발명의 유효성분인 다슬기는 단백질(60.74%)과 탄수화물(17.9%)이 풍부한 반면, 총 지질양은 7.1%로 그 함량이 낮은 편이다. 특히, 단백질은 알기닌, 라이신을 비롯한 16종의 아미노산으로 구성되어 있다고 알려져 있으며, 그 중에서 알기닌 산이 총 아미노산 5,267㎎ 중 409.3㎎으로 7.74%으로 차지하고 있어 다른 어패류에 비해서 알기닌 산이 풍부하다고 알려졌다(김용휘 등, 1985, 전북대학교 농과대학 논문집 16: 101-105).

상기의 알기닌 산은 체내에서 일산화질소(nitric oxide, NO) 형성에 필수적인 요소로 알려져 있으며, NO는 알기닌으로부터 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 시투룰린으로 전환되면서 NO을 생성하여 생체 조절자의 역할을 한다. 즉, 대식세포에 의해서 분비되는 NO는 항균, 항종양 및 항암효과를 나타내고, 내피세포나 근육세포를 비롯한 생체 내 다른 세포에서 생성하는 소량의 NO는 혈관 확장 및 신경전달 물질로 그 역할을 수행하는 것으로 잘 알려졌다(Chung et al., 2001, Biochem Biophys Res Commun., 282:1075-1079; Hirata & Miyasaka, 1997, Life Sci. 61: 2073-2081).

그러나, 다슬기의 가용성 농축액이 간 질환의 보호효과가 있음은 지금까지 알려진 문헌적 근거가 없으며, 특히 사염화탄소와 같은 화학물질에 대한 간 손상의 보호에 대한 보고는 전무한 실정이다.

한편, 본 발명의 유효성분인 인진쑥은 쿠마린계열 화합물인 스코폴레틴을 다량함유하고 있어 강력한 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있으며(Park et al., 2000, J. Pharm. Pharmacol., 52: 875-881; 대한민국 특허 제 1003463340000), 지구자는 플라보노이드계열 항산화제가 풍부하고 알콜성 간질환(Yang, et al., 1997, Zhong, Yao Cai, 24: 126-128), 사염화탄소 또는 디-갈락토사민/리포폴리사카레이드(D-galactosamine/lipopolysaccharide) 처리시 간 손상으로부터 간 보호 효과가 있는 것으로 알려졌다(Namba et al., 1997, Biol Pharm Bull., 20: 381-385).

또한, 마늘은 다이아릴 설페이드(diallyl sulfate)와 에스-머캅토시스테인 (S-mecarptocysteine)이 풍부하게 들어있어 항암효과는 물론 화학물질에 의해 유도된 간 손상을 보호할 수 있는 기능이 있는 것으로 최근에 알려졌다(Yang et al., 1996, Food and Chemical Toxicology, 34: 963-969). 감초는 글리시리친 (glycyrrhizin)을 다량함유하고 있어 전립선암에 대한 항암효과(Wu, et al., 2002, J. Nutr., 132: 3513S-3517S), 기관지 확장 효과(Wang, et al., 1998, Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 21: 287-288), 간 손상 보호 효과(Kim et al., 2000, Planta Medica., 66: 40-43) 등이 보고되었다. 황정은 그 잎이 항암효과가 있음이 보고되었으며(Yoshkawa, A., 1976, Yakugaku Zasshi, 96: 1180-3), 당귀는 NO 생성경로를 경유하여 프로스타글란딘 E₂(prostaglandin E₂)의 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다(Yen et al., 2000, Life Sci., 67: 937-947). 또한, 대추는 일본에서 소시호탕의 구성성분중의 하나로 간암을 보호하는 효과가 있고(Nishno, et al., 2001, Nutr Cancer., 39: 96-101), 치자는 알칼로이드계 화합물이 풍부하여 항균효과가 있으며(Taguchi, et al., 1970, Yakugaku Zasshi, 90: 219-223), 생강은 면역기능 조절자로 알려졌다(Kittur, et al., 2002, Am Surg., 68: 860-864).

한편, 백작약은 아라키도닉산(arachidonic acid)의 형질전환을 유도하는 효과가 있고(Ogihara, et al., 1988, J. Ethnophamarcol., 23: 91-98), 계피는 사이클로옥시게네이즈-2(cyclooxiganse-2, COX-2)를 억제하는 효과가 뛰어나다고 알려져 있다(Lee, et al., J. Ethnophamarcol., 83: 153-159).

본 발명에 사용되는 다슬기를 유효성분으로 하는 생약추출물은 다슬기에 인진쑥, 지구자, 마늘, 백작약, 당귀, 황정, 감초, 대추, 계피, 치자 등의 생약성분을 혼합하여 전통적인 추출방법으로 용매를 이용하여 가온, 가압으로 추출하고 동결건조한 후, 분말화하여 얻는다.

상기의 용매는 에탄올, 부탄올 등의 유기용매 및 증류수를 포함하며, 에탄올, 부탄올 등의 유기용매는 200㎖이상, 증류수는 500㎖이상을 사용한다.

본 발명의 간섬유화 및 간세포 손상 치료제에서 유효성분인 다슬기 및 생약 추출물의 유효량은 투여방법, 제재형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 일반적으로 다슬기의 추출물은 0.5∼20g/㎏(체중), 다슬기 및 생약추출물은 0.5∼30g/㎏(체중)의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기한 범위를 벗어난 양일 수도 있다.

또한, 타그린으로 독성을 유발한 HepG2에서 간세포 손상에 대하여 다슬기의 추출액은 바람직하게 0.1∼5,000㎎/㎖의 농도로 사용할 수 있으며, 상기한 범위를벗어난 농도범위에서도 사용할 수 있다.

한편, 다슬기 및 생약 추출물을 상기한 범위내로 투여하기 위한 제재는 알약, 캅셀 형태, 드링크제, 의약품 등의 통상의 형태를 가질 수 있다. 또한, 이들은 경구 또는 각종의 비경구 통해 간 기능 개선제 및 치료제로 투여될 수 있으며, 투여 제형에 따라 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 약제 조성물은 다슬기 추출물을 함유하며, 보다 바람직하게는 다슬기 추출물과 생약추출물을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 그중에서도 다슬기 및 인진쑥, 지구자, 마늘, 백작약, 당귀, 황정, 감초, 대추, 계피, 치자 등의 생약추출물을 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사, 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 들어있다. 경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말, 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴, 아카시아 등의 결합제; 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 , 탈크 등의 윤활제와 같은 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 함께 섞여진 상태로 본 발명의 화합물을 갖고 있다. 또한, 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용한다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용해도 좋다. 경질캅셀은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질캅셀은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol), 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀, 올리브 오일등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다.

한편, 수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스검(gum tragacanth), 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 또한, 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유한다.

한편, 유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀, 세틸 알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유한다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유하는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.

분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제, 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 갖고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제는, 예를 들어, 감미료, 향신료, 착색제 등이 있다.

유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것이다. 또한, 시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 슈크로스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합한 것이다.

한편, 비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사한다. 사용 가능한 부형제나 용매중에는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노-, 디- 글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

이하, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1~3] 다슬기 및 생약추출물의 제조

전북 임실군 임실생약조합으로부터 다슬기, 인진쑥, 지구자, 마늘, 백작약, 당귀, 황정, 감초, 대추, 계피, 건강 및 치자 등 생약(총량 3,000g)을 준비하여 하기 표 1의 조성으로 혼합하였다. 하기 표 1의 조성으로 혼합한 혼합물을 전통적인 추출방법인 증류수를 이용하여 3시간동안 100~115℃로 가온하고 1~1.5기압으로 가압하여 추출하였다. 다음, 추출물을 0.45㎛ 여과막으로 여과한 후, 동결건조하여 추출분말을 얻었으며, 얻어진 추출 분말은 -20℃에 보관하면서 사용하였다.

원료명	함유율(중량%)
원료명	실시예 1	실시예 2	실시예 3
다슬기	100	50	70.0
인진쑥	-	50	5.0
지구자	-	-	5.0
마늘	-	-	3.5
백작약	-	-	3.4
당귀	-	-	3.4
황정	-	-	3.0
감초	-	-	2.7
대추	-	-	2.0
계피	-	-	1.2
건강	-	-	0.5
치자	-	-	0.3

[실시예 4] 액상추출물의 제조

상기 실시예 1~3에서 제조한 건조 추출물 1g을 10㎖의 인산완충액(Phosphate buffered saline, pH 7.2: 증류수 1ℓ에 Sodium chloride 8.0g/ℓ, Pottasium chloride 0.2g/ℓ, disodium hydrogen phosphate 1.15g/ℓ, Potassium dihydrogen phosphate 0.2g/ℓ)에 용해하여 0.45 ㎛의 여과막으로 여과하거나, 루이스 렛트 ㎏당 추출물 1g을 3㎖의 인산완충액에 용해, 또는 독성실험을 위하여 인간(체중 60㎏)의 투여량(추출물 15g)의 50배를 용해하여 각 실험별로 액상추출물을 제조하였다.

[실시예 5~6] 에탄올 및 부탄올 추출

추출용매를 증류수 대신 에탄올 및 부탄올을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하여 실시예 5(추출용매로 에탄올 사용) 및 실시예 6(추출용매로 부탄올 사용)을 얻었다.

[시험예 1] 급성 및 만성약물에 대한 독성평가

상기 실시예의 독성평가를 위해 실험군당 BALB/c계 마우스(임뮤노파이사, 원광대 원광창업보육센터) 20마리를 대상으로 인간(체중 60㎏)에 투여될 수 있는 투여량(실시예 3의 15g)을 마우스 ㎏당 1배, 10배, 50배 약물군을 1회 경구투여하는 급성독성과 1배, 10배의 약물을 1일당 1회씩 30일간 투여하는 만성독성을 평가하였다. 이때, 시료를 처리하지 않는 경우를 대조군으로 하였으며, 독성평가는 사망률, 혈청내로 유리되는 ALT(alanine aminotransferase), ALT), AST(aspartate aminotransferase)의 양을 시그마 진단키트를 이용하여 통상적으로 귄하고 있는 시그마사의 방법에 준하여 그 흡광도를 측정하였다. 즉, AST 및 ALT의 경우, 각각의 효소기질 용액 1㎖을 튜브에 주입하고 37℃로 유지된 항온조에 5분간 방치한 후, 혈청 시료를 0.2㎖ 첨가하고 잘 혼합한 다음, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다음, 칼라반응용액을 주입하고 20분동안 반응한 후, 5분 이내에 505㎚에서 흡광도를 측정하여 표준농도곡선을 정하여 AST 및 ALT 활성을 IU/ℓ로 표시하였다. 그 결과를 하기 표 2~표 3에 나타내었다.

평가항목농도배율	ALT(IU/ℓ)	AST(IU/ℓ)	사망률(%)
대조군	48±7	88±13	0
1	50±6	90±15	0
10	51±8	95±17	0
50	52±9	105±23	0

평가항목농도배율	ALT(IU/ℓ)	AST(IU/ℓ)	사망률(%)
대조군	50±8	90±15	0
1	53±9	100±17	0
10	58±7	109±20	0

상기 표 2~표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 급성독성 평가(표 2참조) 및 만성독성 평가(표 3 참조)의 경우 모두 사용된 모든 농도에서 사망률은 0%였으며, ALT 및 AST의 경우에 있어서도 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서, 본 발명의 다슬기, 인진쑥 등을 포함하는 생약추출물이 독성이 없음을 알 수 있었다.

[시험예 2] 세포 생존율 평가

추출용매에 따른 추출액의 HepG2 세포손상에 의한 세포 생존율을 알아보기 위해, 먼저 간암세포주인 HepG2 세포주를 미국 조직 배양 보관소(American Tissue Culture Collection; ATCC TIB TIB-71, Rockville, MD)로부터 얻었다. 56℃로 불활성화시킨 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 항생제/항균제(10,000U/㎖의 페니실림, 25 ㎍/㎖의 암포테신 D 또는 10㎎/㎖의 스트렙토마이신)가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃의 온도로 가습된 5% CO₂상태를 유지하면서 24시간동안 배양하였다.

다음, 1㎖ 당 1 ×10⁵HepG2 세포를 24 well 배양플레이트에 접종하고 12시간동안 배양한 후, 부착되지 않은 세포를 멸균 인산완충액으로 3회 세척하고 1mM의 타크린과 각각 다른 용매(에탄올, 부탄올 및 증류수)로 추출된 상기 실시예 4~6을 0.1∼200㎍/㎖의 농도로 동시에 처리한 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(이하, MTT라함)를 처리하고 2시간 후에 MTT(최종농도 0.5㎍/㎖)을 첨가하였다. 다음, 4시간 후 0.01M 염산에서 10%의 도데실 설페이트 나트륨으로 용해한 후, 570㎚에서의 흡수값을 모레귤라 디바이스사(US)의 멀티스펙트라로 결정하였다. 이때, 타크린 단독으로 처리된 세포의 생존율을 0%로 간주하고, 용매 및 농도에 따른 세포생존율은 약물처리에 의한 흡광도 수치를 타크린 단독 처리군에 나타난 흡광도 수치로 나누어 결정하여 결과를 평균과 표준오차로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

HepG2 세포생존율(%)농도(㎍/ml)	추출용매
HepG2 세포생존율(%)농도(㎍/ml)	에탄올	부탄올	증류수
0	0	0	0
0.1	36.72±4.40	26.33±1.44	14.56±6.05
1	31.67±2.82	28.98±1.63	12.73±3.91
10	32.64±2.13	27.89±4.73	12.08±3.49
50	58.92±2.90	24.49±6.12	14.02±3.55
100	62.10±1.87	29.39±1.87	23.62±1.29
200	67.50±1.92	27.62±3.40	19.31±5.04

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 부탄올 및 증류수 추출물의 경우는 사용된 농도와 관계없이 대략 10~30%의 세포생존율을 보인 반면, 에탄올 추출물의 경우는 세포생존율이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 일산화질소(NO) 합성효과

매우 불안정한 가스인 일산화질소는 생체에서 병원체를 사멸시키는 중요한 대식세포 매개체이지만, 과다하게 일산화질소가 생성되면 숙주세포는 물론 조직까지도 손상을 일으킨다고 알려져 있다. 즉, 일산화질소는 반응산소중간물질인 O₂ ^-와결합하면 퍼나이트레이트로 변형되면서 보다 독성이 강해진다. 따라서, 과다하게 생산된 일산화질소를 줄여주는 것은 세포나 조직손상을 보호해주는 효과가 있다. 특히, 간은 대장으로부터 유입되는 대장균, 각종 바이러스 및 외부 병원체 또는 인체가 섭취하는 화학 유해물질에 노출되어있다. 이때, 간세포의 방어를 담당하는 대식세포 유래 쿠퍼씨 세포가 활성화되면 내인성 독성 사이토카인들은 물론 과량의 일산화질소가 분비되는데, 이로 인해 간세포(hepatocytes)는 물론 간섬유화의 원인세포인 스텔레이트 세포를 활성화시키게 된다. 이에, 본 발명에서는 이러한 점을 감안하여 상기 실시예 2에서 제조한 다슬기를 주성분으로 한 생약혼합물의 농도를 1, 10, 50, 100 및 500㎍/㎖의 농도로 처리 또는 처리하지 않은 조건하에서 IFN-γ와 LPS로 자극하여 24시간 배양하였다. RAW 264.7 세포 배지에서 아질산염의 축적은 일산화질소 생성의 지표다.

상기 RAW 264.7 세포는 리포폴리사카레이드(이하, LPS라 함)에 의해 활성화되었을 때 많은 양의 일산화질소를 생산한다. 따라서, 본 발명의 추출물이 일산화질소에 미치는 영향을 평가하기에 적당한 세포모델이다. 설치류의 대식세포 RAW 264.7 세포는 아메리칸 타입컬쳐 콜렉션에서 구입하여, DMEM 배지로 1 × 10⁶세포/㎖의 농도를 유지했고 여기에 10%의 열에 비활성화된 우태아 혈청, 페니실린 G(100U/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖) 및 L-글루타민 2mM를 보충하여, 5% CO₂와 95%의 공기를 포함하는 가습 조건하에서 37℃ 온도를 유지하여 배양하였다.

다음, 충분히 성장한 세포들은 다슬기 및 생약혼합 추출물을 1㎖당 1~500㎍의 농도로 2시간 전처리하고, 100ng/㎖의 LPS로 자극하여 일산화질소의 생성능력을 측정하였다. 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

하기 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 다슬기를 유효성분으로 하는 생약 혼합추출액의 농도가 증가할수록 일산화질소의 생성을 억제함을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 간섬유화 및 간세포변형 억제효과

다슬기, 인진쑥 또는 다슬기를 함유한 11가지 생약혼합 추출물이 간섬유화 및 간세포변형 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 루이스 렛트에 6일간 음성대조군과 양성대조군으로 생리식염수를 투여하고, 실험군으로 상기 실시예 4의 추출물을 렛트 체중 1㎏ 당 300㎎이 되도록 마리당 1㎖씩 생리식염수를 이용하여 적정하여 경구투여하였다. 약물이 투여된 6일 후, 사염화탄소 용액과 콘오일이 1: 3 의 비율로 혼합된 혼합액을 렛트 체중 ㎏ 당 5㎖씩 1주일에 2회 레트의 복강에 주사하여 투여하고, 이를 4주간 지속하여 주사하여 간섬유화를 유도하여 상기의 각 추출물이 간섬유화 억제에 미치는 영향을 현미경(×100)으로 확인하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

하기 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군 및 약물 투여군의 간조직을 헤마톡실린/에오진 염색을 하여 100배 현미경 소견을 조사한 결과 음성대조군(도 2의 가)은 간조직세포의 정상소견을 보였으나, 사염화탄소가 투여된 양성대조군(도 2의 나)은 전체적으로 큰 지방세포(fat vacuoles)의 출현과 함께 문맥부위(portal area)로 섬유성 확장(fibrous expansion)이 관찰되었으며, 일부에서는 문맥부위와 문맥부위를 연결하는 섬유성 격벽(fibrous septae)이 뚜렷히 나타나 전형적으로 간섬유화가 유도된 현상을 관찰하였다. 그러나, 다슬기 추출액이 투여된 경우(도 2의 다)는 지방포가 남아있기는 하나 뚜렷하게 감소하였으며, 문맥부위 주변에 약간의 섬유성 조직이 관찰되나 섬유성 격벽은 거의 관찰되지 않았다. 또한, 다슬기와 인진쏙의 혼합추출물액이 투여된 레트의 간조직(도 2의 마)은 좌단에 소수의 지방공포가 남아있으나 문맥부위 이외의 부위에서 섬유성 조직은 관찰되지 않았다. 한편, 다슬기를 함유하는 11가지 생약혼합추출물이 투여된 실험군(도 2의 바)에서 간조직은 극소수의 지방공포가 관찰되나 섬유성조직도 없으며 거의 대부분 정상조직으로 이루어져 있음을 확인하였다.

[시험예 5] 간섬유화 억제 효과

다슬기, 인진쑥 또는 다슬기를 함유한 11가지 생약혼합 추출물의 간섬유화 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 4의 추출물을 레트 체중 1㎏ 당 500㎎의 농도로 투여된 렛트의 간조직을 Yutaka 등 (Yutaka et al., 2002, Hepatology 35:1022-1030)의 방법에 따라 파라핀이 제거된 간조직을 포화 피클릭산(picric acid)과 1% 페스트 그린(Fast green)이 함유된 0.1 % 실리루스 레드(Sirius red) F3B 용액에 30분간 방치한 후, 증류수로 2회 세척하고 70% 에탄올로 간단히 탈수시킨 다음 자일렌으로 세척하고 커버슬립을 덮어 봉입하여 현미경으로 겸경하고 촬영하여 콜라겐 합성정도를 판정하였다. 간섬유화 진행판단은 Ishak 등 (Ishak et al., 1995, J. Hepatol ., 22:696-699)의 방법에 따라 하기 표 5와 같이 실리루스 레드 염색상태에 따라 0~6까지 스코어를 주어 판단하였다. 그 결과를 하기 도 3~도 4에 나타내었다.

스코어	조직소견
0	간 섬유화 없는 정상세포
1	섬유 셉타 (fibrous septa)가 약간 있거나 없이 일부 문맥주위에 약간의 섬유소 팽창
2	섬유 셉타 (fibrous septa)가 약간 있거나 없이 대부분 문맥주위에 섬유소 팽창
3	문맥과 문맥사이에 섬유가교 (portal to portal(P-P) bridging)가 형성되고 전 문맥으로 섬유소 팽창
4	문맥과 문맥 (P-P)사이 뿐만 아니라 문맥에서 중심 (portal to central(P-C)]까지 뚜렷한 섬유가교가 형성되어 전 문맥주변으로 섬유소 팽창
5	노듈 (nodules) 형성 (간경화 초기 증상)과 함께 뚜렷한 P-P/PC 섬유가교가 형성
6	심한 노듈형성으로 간경화 상태

하기 도 3~도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 생리식염수만 투여된 음성대조군(도 3의 가)에서는 섬유소가 없고 정상세포로 이루어진 간조직의 소견을 보여주었으며, 생리식염수에 사염화탄소가 투여된 양성대조군(도 3의 나)은 스코어 4로 문맥과 문맥(P-P)사이 뿐만 아니라 문맥에서 중심 (portal to central(P-C)]까지 뚜렷한 섬유가교가 형성되어 전 문맥주변으로 섬유소 팽창된 소견을 나타내었다. 반면, 다슬기 추출액 투여군(도 3의 다)는 양성대조군(스코어 4)에 비해 문맥과 문맥사이에 섬유가교(portal to portal(P-P) bridging)가 형성되고 전 문맥으로 섬유소 팽창이 되었으나, 간섬유소 생성이 억제되었고, 인진쑥 추출물의 경우(도 3의 라)도 섬유 셉타(fibrous septa)가 약간 있거나 없이 대부분 문맥주위에 섬유소가 있을 뿐 양성대조군에 비해 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 또한, 다슬기와 인진쑥 혼합 추출물의 경우(도 3의 마)는 스코어 1로 섬유소 형성이 크게 억제되었으며, 다슬기 함유 11가지 생약혼합추출물 투여군(도 3의 바)은 정상조직과 비슷한 소견을 보여주어 사염화탄소의 간섬유화 진행과정을 차단하는 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 다슬기 또는 인진쑥을 함유하는 생약혼합 추출물로 이루어진 간섬유화 및 간손상 치료용 약제 조성물은 사염화탄소와 같은 화학유해물질에 의해 유도되는 지방세포분화에 있어서 뚜렷한 억제효과가 있었을 뿐만 아니라 스텔레이트 세포의 활성화를 억제함으로써 간섬유화 억제에 우수한 효과를 나타낼 수 있었다.

Claims

다슬기 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간질환 치료용 약제 조성물.
제 1항에 있어서, 다슬기 추출물에 생약추출물을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 간질환 치료용 약제조성물.
제 2항에서 있어서, 상기 생약추출물은 인진쑥, 지구자, 마늘, 백작약, 당귀, 황정, 감초, 대추, 계피, 건강 및 치자로 이루어진 군에서 선택된 1종이상을 추출하여 얻은 추출물임을 특징으로 하는 간질환 치료용 약제 조성물.
제 2항에서 있어서, 상기 약제 조성물을 일일 0.5~30g/㎏(체중)의 농도로 투여하는 것을 특징으로 하는 간질환 치료용 약제 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서 있어서, 상기 간질환은 간섬유화 또는 간경화인 것을 특징으로 하는 간질환 치료용 약제 조성물.