CN102482326A - 分离治疗用肽的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了分离利那洛肽的方法，所述利那洛肽为具有三个二硫键的环化的14-氨基酸肽。该序列由Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr(SEQ ID NO 1)组成，二硫键位于1位和6位、2位和10位以及5位和13位的半胱氨酸残基之间。该药物充当GCC超激动剂，提高细胞内cGMP成分，用于治疗各种病症，包括胃肠道病症、肥胖、充血性心力衰竭和良性前列腺增生。

Description

分离治疗用肽的方法
本发明涉及分离用于治疗各种病症的肽的方法，所述病症包括胃肠道病症、肥胖、充血性心力衰竭和良性前列腺增生。
肠道易激综合征(IBS)是常见的肠慢性病症，其单独在美国影响2千万至6千万人。IBS是胃肠病学家诊断的最常见的病症(检查的患者的28％)并占初级保健医生出诊的12％(Camilleri 2001，Gastroenterology120：652-668)。在美国，通过卫生保健用途的直接成本和旷工的间接成本，IBS的经济影响估计每年在$250亿(Talley 1995，Gastroenterology109：1736-1741)。IBS患者具有三次以上的旷工并有报道生活质量降低。患病者可能不能或不愿意参加社会活动、维持工作或旅行甚至短距离(Drossman 1993，Dig Dis Sci 38：1569-1580)。由于很少有处方方案来治疗IBS，因此在该人群中存在巨大的未满足的医疗需求。
利那洛肽(Linaclotide)是一种新型的14mer肽和鸟苷酸环化酶C型受体(GCC)激动剂，其刺激环鸟苷酸(cGMP)的产生。体外研究显示，利那洛肽以不同的浓度增加人肠细胞中的cGMP，以及在小鼠和大鼠的体内研究显示，口服利那洛肽对增加小肠运动性、液体分泌和减少内脏痛具有希望的效果。
利那洛肽是具有三个二硫键的14-氨基酸环肽，序列由环化的(SEQID NO.1)Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr组成，在1位和6位、2位和10位以及5位和13位的半胱氨酸残基之间具有二硫键，如下所示：
Figure BPA00001480296700021
它在胃肠道中与内源性激素GN和UGN具有共同的药理学活性(GASTROENTEROLOGY 2005 128 4 Suppl 2 A464)。该药物充当GCC超激动剂(superagonist)，从而提高细胞内cGMP。
在形成二硫键之前，环肽通常利用自动化的固相肽合成仪线性地合成(US7,371,727；WO-2004069165；Current Opinion in MolecularTherapeutics 2007 Vol.9 No.4)。然而，与作为分离方法的冷冻干燥结合的典型的线性构造导致10-20％的产率(US7,371,727)。冷冻干燥不提供具有最适制造性质的疏松材料(builk material)。冻干材料的松密度通常低，该材料具有差的处理特性(细颗粒易带静电)和由于高表面积导致的潜在稳定性降低。另外，目前药物化合物的效能(potency)造成与冻干材料的开放处理相关的工业卫生关注。因此，分离利那洛肽——环化的(SEQ ID NO 1)——的改进方法是必需的。
在第一个目的中，本发明提供沉淀肽的方法，包括以下步骤：
a)提供环化肽的异丙醇或乙醇水溶液，该环化肽包括(SEQ IDNO.1)的氨基酸序列
Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr
在优选实施方式中，醇溶液是异丙醇溶液，并且该方法进一步包括以下步骤：
b)b)为了减少溶液中水的百分比，用异丙醇进液反萃取(feed-stripping)由步骤a)产生的溶液。
在另外的优选实施方式中，醇溶液是乙醇溶液，并且该方法进一步包括以下步骤：
b)为了减少溶液中水的百分比，用乙醇进液反萃取由步骤a)产生的溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约45％至大约70％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约65％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约60％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约50％至大约60％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约55％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，乙醇水溶液是大约55％至大约75％乙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，乙醇水溶液是大约60％至大约75％乙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，乙醇水溶液是大约65％至大约75％乙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，在步骤b)中用异丙醇或乙醇进液反萃取降低溶液中水的百分比直到异丙醇或乙醇的百分比大于96％，优选97％，更优选98％。
在另外的优选实施方式中，本发明的方法进一步包括以下步骤：
c)用庚烷进液反萃取由步骤b)产生的溶液。
在另外的优选实施方式中，在步骤c)中用庚烷进液反萃取降低溶液中异丙醇或乙醇的百分比直到庚烷的百分比大于98％，优选98.5％，更优选99％，甚至更优选99.5％，最优选99.9％。
在可选的实施方式中，本发明的方法进一步包括以下步骤：
b)用水稀释由步骤a)产生的溶液。
在另外的优选实施方式中，将溶液稀释到约3/1 v/v 水/异丙醇或稀释到约3/1 v/v 水/乙醇以沉淀SEQ ID No.1。
在第二个目的中，本发明提供分离肽的方法，包括以下步骤：
a)提供环化肽的异丙醇或乙醇水溶液，该环化肽包括(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列
Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr
b)喷雾干燥由步骤a)产生的溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约45％至大约70％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约65％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约60％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约50％至大约60％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，异丙醇水溶液是大约55％异丙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，乙醇水溶液是大约55％至大约75％乙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，乙醇水溶液是大约60％至大约75％乙醇水溶液。
在另外的优选实施方式中，乙醇水溶液是大约65％至大约75％乙醇水溶液。
定义
如本文所用，词语“一个(a)”或“一个(an)”实体指那个实体的一个或多个；例如，一个化合物指一个或多个化合物或至少一个化合物。因此，术语“一个(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。
如本说明书所用，不论在权利要求的过渡词语中还是在权利要求的主体中，术语“包括(包含，comprise(s))”和“包括(包含，comprising)”将被解释为具有开放式含义。即，所述术语将被解释为与词语“至少具有”或“至少包括”同义。当在方法的语境下使用时，术语“包括”指该方法至少包括列举的步骤，但可以包括另外的步骤。当在化合物或组合物的语境下使用时，术语“包括”指化合物或组合物至少包括列举的特征或组分，但也可以包括另外的特征或组分。如本文所用，除非另外明确说明，词“或”用于“和/或”的“包括的”意思，而不是“或者/或(either/or)”的“排除的”意思。
术语“约(about)”用于本文指大约(approximately)、在附近(inthe region of)、大致(roughly)或在周围(around)。当术语“约”与数值范围联用时，其通过延伸所述数值以上和以下的界限来修饰该范围。
如本文所用，术语“SEQ ID No 1的环化肽”、“包括(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列的环化肽”、“利那洛肽”和“具有三个二硫键的14-氨基酸环肽，该序列由环化的(SEQ ID NO.1)组成”指(SEQ ID NO.1)的肽序列
Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr
其中，由于在1位和6位、2位和10位以及5位和13位的半胱氨酸残基之间的二硫键，(SEQ ID NO.1)的肽以多环三-二硫化物(poly-cyclic tri-disulfide)形式折叠。
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员共同理解的意思。本文引用了本领域技术人员已知的各种方法学和材料。阐明药理学一般原则的标准参考作品包括Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，10th Ed.，McGrawHill Companies Inc.，New York(2001)。技术人员已知的任何合适的材料和/或方法均可用于实施本发明。然而，优选的材料和方法被描述。除非另外指出，下列描述和实例中引用的材料、试剂等等可从商业来源获得。
如本文所用，术语“包括氨基酸序列”优选指“具有氨基酸序列”。
如本文所用，词语“大约45％至大约70％异丙醇水溶液”指包括大约45％v/v异丙醇和大约55％v/v水至大约70％v/v异丙醇和大约30％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约45％至大约60％异丙醇水溶液”指包括大约45％v/v异丙醇和大约55％v/v水至大约60％v/v异丙醇和大约40％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约50％至大约60％异丙醇水溶液”指包括大约50％v/v异丙醇和大约50％v/v水至大约60％v/v异丙醇和大约40％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约55％异丙醇水溶液”指包括大约55％v/v异丙醇和大约45％v/v水的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约55％至大约75％乙醇水溶液”指包括大约55％v/v乙醇和大约45％v/v水至大约75％v/v乙醇和大约25％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约60％至大约75％乙醇水溶液”指包括大约60％v/v乙醇和大约40％v/v水至大约75％v/v乙醇和大约25％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约65％至大约75％乙醇水溶液”指包括大约65％v/v乙醇和大约35％v/v水至大约75％v/v乙醇和大约25％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约65％至大约70％乙醇水溶液”指包括大约65％v/v乙醇和大约35％v/v水至大约70％v/v乙醇和大约30％v/v水之间的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“大约67％乙醇水溶液”指包括大约67％v/v乙醇和大约33％v/v水的溶液。如本文所用，在该语境中，术语“大约”指加或减5％v/v。
如本文所用，词语“进液反萃取溶液”指在真空下逐渐地向第一溶液中加入第二溶剂，并且第二溶剂逐渐地用第二溶剂替换第一溶液，同时保持大约恒定的体积。例如，用异丙醇进液反萃取50％v/v异丙醇水溶液将逐渐地产生异丙醇溶液，其中剩余的水小于大约2％。例如，用庚烷进液反萃取异丙醇溶液将逐渐地产生庚烷溶液，其中剩余的异丙醇小于大约0.1％。例如，用乙醇进液反萃取50％v/v乙醇水溶液将逐渐地产生乙醇溶液，其中剩余的水小于大约2％。例如，用庚烷进液反萃取乙醇溶液将逐渐地产生庚烷溶液，其中剩余的乙醇小于大约0.1％。
如本文所用，术语“用水稀释”指将水加入到溶液中以增加水的体积百分比，以便得到的溶液为约3/1v/v水比醇。例如，用水稀释50％v/v异丙醇水溶液将得到大约3/1v/v水/异丙醇的溶液。例如，用水稀释50％v/v乙醇水溶液将得到大约3/1v/v水/乙醇的溶液。
如本文所用，肽合成中涉及的“大规模”一般包括每批次至少500g，更优选至少2kg范围的肽合成。大规模合成通常在大反应容器，如钢反应容器中进行，它能容纳大量试剂如树脂、溶剂、氨基酸、用于偶合的化学品和脱保护反应，其大小允许以千克至公吨范围生产肽。
通常使用的缩写包括：乙酰基(Ac)、偶氮二异丁腈(AIBN)、大气压(Atm)、9-硼双环[3.3.1]壬烷(9-BBN或BBN)、叔丁氧羰基(Boc)、二碳酸二叔丁酯或boc酸酐(BOC2O)、苄基(Bn)、丁基(Bu)、化学文摘服务社登记号(CASRN)、苄氧羰基(CBZ或Z)、羰基二咪唑(CDI)、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、二乙氨基三氟化硫(DAST)、二亚苄基丙酮(dba)、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，2-二氯乙烷(DCE)、二氯甲烷(DCM)、偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)、偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD)、二异丁基氢化铝(DIBAL或DIBAL-H)、二异丙基乙胺(DIPEA)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、1，1′-双-(二苯膦基)乙烷(dppe)、1，1′-双-(二苯膦基)二茂铁(dppf)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、乙基(Et)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙醇(EtOH)、2-乙氧基-2H-喹啉-1-羧酸乙酯(EEDQ)、二乙醚(Et2O)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N、N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、乙酸(HOAc)、1-N-羟基苯并三唑(HOBt)、高压液相色谱法(HPLC)、异丙醇(IPA)、六甲基二硅氮烷锂盐(LiHMDS)、甲醇(MeOH)、熔点(mp)、MeSO2-(甲磺酰基或Ms)、甲基(Me)、乙腈(MeCN)、间氯过氧苯甲酸(MCPBA)、质谱(ms)、甲基叔丁醚(MTBE)、N-溴丁二酰亚胺(NBS)、N-羧基酸酐(NCA)、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、N-甲基吗啉(NMM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、氯铬酸吡啶盐(PCC)、重铬酸吡啶盐(PDC)、苯基(Ph)、丙基(Pr)、异丙基(i-Pr)、磅/平方英寸(psi)、吡啶(pyr)、室温(rt或RT)、叔丁基二甲基甲硅烷基或t-BuMe2Si(TBDMS)、三乙胺(TEA或Et3N)、氧化2，2，6，6-四甲基哌啶(2，2，6，6-tetramethylpiperidine 1-oxyl)(TEMPO)、三氟甲磺酸盐(triflate)或CF3SO2-(Tf)、三氟乙酸(TFA)、1，1′-双-2，2，6，6-四甲基庚烷-2，6-二酮(TMHD)、O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(O-benzotriazol-1-yl-N，N，N′，N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate)(TBTU)、薄层色谱法(TLC)、四氢呋喃(THF)、三甲基硅烷基或Me3Si(TMS)、对甲苯磺酸一水合物(TsOH或pTsOH)、4-Me-C6H4SO2-或甲苯磺酰基(Ts)、N-尿烷-N-羧酸酐(N-urethane-N-carboxyanhydride)(UNCA)。当与烷基部分使用时，包括前缀正(n)、异(i-)、仲(sec-)、叔(tert-)和新的传统命名法具有它们通常的含义。(J.Rigaudy和D.P.Klesney，Nomenclature in Organic Chemistry，IUPAC 1979 PergamonPress，Oxford.)。
可以利用标准自动固相合成设备线性地合成利那洛肽(US7,371,727、WO2004069165、Current Opinion in MolecularTherapeutics 20079(4)：403-410)。
在SEQ ID No.1的肽形成之后，可根据需要将产物进行纯化、冷冻干燥、进一步处理(例如与另一肽反应以形成融合蛋白)；这些的组合，和/或类似处理。
例如，在本方法中，纯化之前将肽氧化以形成三-二硫化物形式。
具体地，线性肽在树脂上形成，然后将粗制的肽以线性硫醇形式与树脂分离。然后将该线性形式折叠(和氧化)以形成多环三-二硫化物形式。然后将该三-二硫化物形式通过HPLC纯化，并将纯化的合并液(pool)在水/异丙醇中浓缩(再次通过色谱法)至较小体积的合并液。然后将该溶液进行沉淀用于分离。
纯化之后，可以将SEQ ID NO.1的肽冻干或从溶液沉淀出。由于冷冻干燥不适合按照商业生产的需要大规模制备肽，本申请公开了沉淀纯化的利那洛肽的有用和新的方法，这与纯化的肽的冷冻干燥不同。
在一个优选的实施方式中，将环化的SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中。该溶液可以含有来自HPLC色谱法的残余量的乙酸和三氟乙酸。下面所有百分比和比率都是按体积计，除非另外明确说明。
在一个优选的实施方式中，将SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中，其中溶液的异丙醇组分百分比在大约45％和大约70％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的实施方式中，将SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中，其中溶液的异丙醇组分百分比在大约45％和大约60％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的实施方式中，将SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中，其中溶液的异丙醇组分百分比在大约50％和大约60％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的实施方式中，将SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中，其中溶液的异丙醇组分百分比在大约50％和大约55％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的实施方式中，将SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中，其中溶液的异丙醇组分百分比在大约50％和大约52.5％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的实施方式中，将SEQ ID NO.1溶解在异丙醇水溶液中，其中溶液的异丙醇组分百分比在大约52.5％和大约55％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的实施方式中，溶液的异丙醇组分百分比为大约55％v/v，并且溶液的剩余部分是水。
在优选的实施方式中，然后将含有SEQ ID No.1的异丙醇溶液稀释到约3/1v/v水/异丙醇以沉淀SEQ ID No.1。
在可选的实施方式中，含有SEQ ID NO.1的异丙醇水溶液不是用水稀释，而是用异丙醇进液反萃取以减少溶液中水的百分比，直到异丙醇的百分比大于95％。
在另一个可选的实施方式中，然后用异丙醇进液反萃取含有SEQID NO.1的异丙醇水溶液，以减少溶液中水的百分比，直到异丙醇的百分比大于96％。
在另一个可选的实施方式中，然后用异丙醇进液反萃取含有SEQID NO.1的异丙醇水溶液，以减少溶液中水的百分比，直到异丙醇的百分比大于97％。
在另一个可选的实施方式中，然后用异丙醇进液反萃取含有SEQID NO.1的异丙醇水溶液，以减少溶液中水的百分比，直到异丙醇的百分比大于98％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的异丙醇溶液，以减少溶液中异丙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于98％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的异丙醇溶液，以减少溶液中异丙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于98.5％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的异丙醇溶液，以减少溶液中异丙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于99％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的异丙醇溶液，以减少溶液中异丙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于99.5％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的异丙醇溶液，以减少溶液中异丙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于99.9％。
在另一个优选的可选实施方式中，含有SEQ ID NO.1的异丙醇水溶液不是用水稀释或用水异丙醇然后是庚烷进液反萃取，然后喷雾干燥。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中。该溶液可以含有来自HPLC色谱法的残余量的乙酸和三氟乙酸。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中，其中溶液的乙醇组分百分比在大约55％和大约75％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中，其中溶液的乙醇组分百分比在大约60％和大约75％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中，其中溶液的乙醇组分百分比在大约65％和大约75％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中，其中溶液的乙醇组分百分比在大约65％和大约70％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中，其中溶液的乙醇组分百分比在大约65％和大约67％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在一个优选的方法中，将SEQ ID NO.1溶解在乙醇水溶液中，其中溶液的乙醇组分百分比在大约67％和大约70％v/v之间，并且溶液的剩余部分是水。
在优选的实施方式中，溶液的乙醇组分百分比为大约67％v/v，并且溶液的剩余部分是水。
在优选的实施方式中，然后将含有SEQ ID No.1的乙醇溶液稀释到约3/1 v/v 水/乙醇以沉淀SEQ ID No.1。
在可选的实施方式中，含有SEQ ID NO.1的乙醇水溶液不是用水稀释，而是然后用乙醇进液反萃取以减少溶液中水的百分比，直到乙醇的百分比大于95％。
在另一个可选的实施方式中，然后用乙醇进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇水溶液，以减少溶液中水的百分比，直到乙醇的百分比大于96％。
在另一个可选的实施方式中，然后用乙醇进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇水溶液，以减少溶液中水的百分比，直到乙醇的百分比大于97％。
在另一个可选的实施方式中，然后用乙醇进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇水溶液，以减少溶液中水的百分比，直到乙醇的百分比大于98％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇溶液，以减少溶液中乙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于98％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇溶液，以减少溶液中乙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于98.5％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇溶液，以减少溶液中乙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于99％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇溶液，以减少溶液中乙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于99.5％。
在另一个可选的实施方式中，随后用庚烷进液反萃取含有SEQ IDNO.1的乙醇溶液，以减少溶液中乙醇的百分比，直到庚烷的百分比大于99.9％。
在另一个可选的实施方式中，含有SEQ ID NO.1的乙醇水溶液不是用水稀释或用乙醇然后是庚烷进液反萃取，而是然后喷雾干燥。
就以下实施例而言，本发明的原理现在将被进一步阐明。下面所有百分比和比率都是按体积计，除非另外明确说明。
实施例
实施例1
向1-颈、3-L圆底烧瓶中装入1500mL大约50.2g SEQ ID NO.1的50％异丙醇水溶液，其含有来自HPLC色谱法的残余量的乙酸和三氟乙酸。初始产物的分析(HPLC，面积归一法)显示97.4％的纯度。
将烧瓶于减压下(34Torr)放到旋转蒸发器上并部分浸到30℃浴中。粒状的白色悬浮液通过以保持3-L烧瓶中大约1500mL液体的速度在396分钟内进液反萃取大约6500mL异丙醇而形成。悬浮液的分析(GC，面积归一法)显示水(1.8％)和异丙醇(98.2％)。
将烧瓶于减压下(46Torr)放到旋转蒸发器上并部分浸到30℃浴中。更多粒状的白色悬浮液通过以保持3-L烧瓶中大约1500mL液体的速度在210分钟内进液反萃取大约6000mL庚烷而形成。分析(glc，面积归一法)显示水(0.0％)、异丙醇(0.0％)和庚烷(100.0％)。
在两分钟内，将粒状的悬浮液真空过滤通过600-mL中等玻璃料过滤器(medium-glass frit)(10-20微米，直径95mm)并用100mL庚烷洗涤饼状物以产生澄清的滤液。只有0.44g固体保持粘附到3-L烧瓶。
于大约22℃在减压(51mTorr)下干燥产生粒状的含有异丙醇(0.8wt.％)和庚烷(2.5wt.％)的固体。
将该固体放到玻璃烧结的树脂反应器中，并通过使水湿润的氮气穿过该固体而使其增湿。得到的粒状固体的分析(GC)显示异丙醇(0.0wt.％)和庚烷(0.01wt.％)。卡尔-费歇尔分析显示水(17.2wt.％)。
于大约22℃伴随着氮气输出在减压(29Torr)下干燥树脂反应器中的固体产生39.2g白色粒状的含有水(2.7wt.％)的SEQ ID NO.1。
最终干燥产物的分析(HPLC，面积归一法)显示97.0％的纯度。
下面的表1显示SEQ ID NO.1的量，其能溶解于异丙醇水溶液中，这取决于v/v％ 异丙醇∶水。40-60％异丙醇之间溶解度非常急剧的增加非常出乎意料，该出乎意料的结果的发现允许通过沉淀成功分离SEQID NO.1，这对商业生产所要求的切实可行的大规模生产是必需的。
表1
  IPA(v/v％)   SEQ ID No.1(mg/mL)
  0   1.3
  5   1.8
  10   2.3
  15   3.3
  20   4.3
  25   4.8
  30   6.0
  35   7.0
  40   13.8
  45   47.8
  50   120.3
  55   162.5
  60   138.5
  65   106.5
  70   65.7
  75   26.5
  80   19.0
  85   12.5
  90   9.0
  95   4.5
  100   0.3
实施例2
用乙醇替换异丙醇(IPA)，进行上述一般程序。
下面的表1显示了SEQ ID NO.1的量，其能溶解于乙醇水溶液中，这取决于v/v％ 乙醇∶水。50-70％乙醇之间溶解度非常急剧的增加非常出乎意料，该出乎意料的结果的发现允许通过沉淀成功分离SEQ IDNO.1，这对商业生产所要求的切实可行的大规模生产是必需的。
表2
  EtOH(v/v％)   SEQ ID No.1(mg/mL)
  0   0.50
  5   0.25
  10   0.75
  15   1.00
  20   0.75
  25   3.00
  30   3.00
  35   2.75
  40   2.25
  45   3.50
  50   9.25
  55   179.25
  60   347.50
  65   430.00
  70   441.50
  75   304.00
  80   45.25
  85   10.25
  90   10.00
  95   3.75
  100   0.50
实施例3
SEQ ID No.1的沉淀和分离
上述用于分离SEQ ID No.1的程序包括在旋转蒸发器中通过用异丙醇或乙醇，然后用庚烷真空进液反萃取去除水。通过旋转蒸发的溶剂去除用于最小化潜在的产物降解和由于产物附着到烧瓶上表面而导致的产率损耗。该程序提供非常容易处理和过滤的产物。然而，残余溶剂，特别是庚烷的去除需要用水湿润的氮气流“增湿”以及随后用干燥的氮气处理。该整个分离程序过程中的纯度从97.4％下降到97.0％。
目前的生产液流(process stream)由大约50％含水异丙醇中的SEQID No.1组成。该水和异丙醇的比率用于确保最大产物溶解度。为了最小化产物降解，该生产液流通常储存在大约2℃，这引起一些产物沉淀。向该生产液流中加入水，引起另外的产物沉淀，并将产物通过过滤和干燥进行分离。为了实现最大回收水平，加入足够的水以达到3/1的最终水/异丙醇比率。在一小时内用水稀释的优选温度范围是3℃至5℃。在该温度范围内搅拌大约30分钟，之后在大约30分钟内冷却至大约-5℃，在通过冷却的过滤器过滤之前在该较低的温度搅拌5h至6h。沉淀容器的少量冲洗液随着含水异丙醇(3/1，v/v)进入过滤器之后，只有大约1％的产物因为沉淀容器中的薄膜而损失。聚集足以使简单的过滤产生澄清的滤液。大约4％的产物溶解在滤液中。分析数据显示，在该沉淀程序期间发生非常少的降解。
实施例4
利那洛肽的喷雾干燥：
将从制备HPLC步骤或从浓缩步骤获得的纯化肽溶液投入到喷雾干燥器装置中，并在干燥室中使其雾化。将由雾化器产生的细雾与热氮气流(干燥气体)混合，开始溶剂从微滴的蒸发。调整溶液的投入速度以实现期望的气体出口温度。干燥气体携带细粉通过干燥室出来到达旋风分离器。因为在干燥室中的停留时间非常短，热降解被最小化。旋风分离器将粉末与干燥气体分离，通过重力将该粉末收集到转筒中。
随后无粉末的气体流进过滤袋罩中，其中任何非常细微的颗粒被保留在袋式过滤器中。无粉末的气体可以在冷凝器中被冷却，其中溶剂冷凝然后发生。干燥气体可以在再加热后被再循环回干燥室，或其可以一次通过模式被利用。
投入溶液(水与有机溶剂)的组成决定了必须提供给每个微滴以基本上蒸发所有溶剂的能量。喷雾干燥器中微滴大小与投入溶液中肽的浓度一起控制得到的颗粒的大小并影响喷雾干燥工艺的回收。
示例性的喷雾干燥工艺参数：
Figure BPA00001480296700161
上述的描述或以下权利要求中公开的、以它们特定的形式或根据执行公开功能的手段或用于达到公开结果的方法或工艺表示的特征，如果合适，可单独地或以这些特征的任何组合，用于以其各种不同的形式实现本发明。
为了清楚和理解的目的，上述发明已通过说明和实施例被详细地描述。在所附权利要求的范围内可以实施的变化和修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的。因此，应当理解，以上描述意欲是示例性的而不是限制性的。因此，本发明的范围不应参考以上描述确定，而应参考所附权利要求以及这些权利要求赋予的等同物的全部范围而确定。
Figure IPA00001480296300011

Claims (26)

1.沉淀肽的方法，包括以下步骤：
a)提供环化肽的异丙醇或乙醇水溶液，所述环化肽包括氨基酸序列(SEQ ID NO.1)
Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr。
2.权利要求1所述的方法，其中所述醇溶液是异丙醇溶液，并且所述方法进一步包括以下步骤：
b)用异丙醇进液反萃取步骤a)得到的水溶液以减小所述溶液中水的百分比。
3.权利要求1所述的方法，其中所述醇溶液是乙醇溶液，并且所述方法进一步包括以下步骤：
b)用乙醇进液反萃取步骤a)得到的所述溶液以减小所述溶液中水的百分比。
4.权利要求1或2所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约45％至大约70％异丙醇水溶液。
5.权利要求4所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约65％异丙醇水溶液。
6.权利要求5所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约60％异丙醇水溶液。
7.权利要求6所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约50％至大约60％异丙醇水溶液。
8.权利要求7所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约55％异丙醇水溶液。
9.权利要求1或3所述的方法，其中所述乙醇水溶液是大约55％至大约75％乙醇水溶液。
10.权利要求9所述的方法，其中所述乙醇水溶液是大约60％至大约75％乙醇水溶液。
11.权利要求10所述的方法，其中所述乙醇水溶液是大约65％至大约75％乙醇水溶液。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤b)中用异丙醇或乙醇进液反萃取降低所述溶液中水的百分比直到异丙醇或乙醇的百分比大于95％，优选96％，更优选97％，最优选98％。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
c)用庚烷进液反萃取步骤b)得到的溶液以减小所述溶液中异丙醇或乙醇的百分比。
14.权利要求13所述的方法，其中步骤c)中用庚烷进液反萃取降低异丙醇或乙醇的百分比直到庚烷的百分比大于98％，优选98.5％，更优选99％，甚至更优选99.5％，最优选99.9％。
15.权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
b)用水稀释步骤a)得到的所述溶液。
16.权利要求15所述的方法，其中所述溶液被稀释到约3/1 v/v 水/异丙醇或约3/1 v/v 水/乙醇以沉淀SEQ ID No.1。
17.分离肽的方法，包括以下步骤：
a)提供环化肽的异丙醇或乙醇水溶液，所述环化肽包括氨基酸序列(SEQ ID NO.1)
Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr
b)喷雾干燥步骤a)得到的所述溶液。
18.权利要求17所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约45％至大约70％异丙醇水溶液。
19.权利要求18所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约65％异丙醇水溶液。
20.权利要求19所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约45％异丙醇至大约60％异丙醇水溶液。
21.权利要求20所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约50％至大约60％异丙醇水溶液。
22.权利要求21所述的方法，其中所述异丙醇水溶液是大约55％异丙醇水溶液。
23.权利要求22所述的方法，其中所述乙醇水溶液是大约55％至大约75％乙醇水溶液。
24.权利要求23所述的方法，其中所述乙醇水溶液是大约60％至大约75％乙醇水溶液。
25.权利要求24所述的方法，其中所述乙醇水溶液是大约65％至大约75％乙醇水溶液。
26.本文所描述的方法，具体参考上述实施例。
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