CN1625561A - 肽的纯化 - Google Patents
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Abstract
九肽或十肽从残留的有机溶剂中纯化,办法是通过将其溶解在含有水和至少一种C1-C3醇的溶剂中,接着加入剧烈搅拌的由羧酸烷基酯(包含3-6个碳原子)和一种或多种非极性化合物(选自己烷、庚烷、辛烷、环己烷、甲基环己烷)和任选地高达5%的乙酸或丙酸构成的溶剂中进行沉淀,分离沉淀的九肽或十肽,接着用C3-C5酯的混合物洗涤并干燥,条件是含有水和至少一种醇的溶剂的水含量低于8%(v/v),溶解溶剂混合物和沉淀溶剂混合物的体积比为1∶10或更高。还叙述了Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2的单乙酸酯。
Description
发明领域
本发明涉及肽的纯化,具体涉及中等大小的肽的纯化,更具体涉及九肽和十肽,如LHRH-拮抗剂的纯化。
发明背景
大多数中等大小的天然的和合成的肽是无定形物质。它们中的许多具有药理学上有兴趣的性质,诸如许多九肽和十肽,是LHRH(促黄体激素释放激素)拮抗剂。这类已知的仅以无定形形态存在的一个具体的物质就是式(I)的合成的十肽
Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-
D-Ala-NH2(I)它是强力的LHRH拮抗剂,具有所需要的药理性质。
为了在药物制剂中应用,LHRH拮抗剂(I)和类似结构的九肽和十肽必须基本上是纯的。在多步合成的最后一步得到的粗产物通过色谱或其它方法纯化。为了除去从色谱带来的残留溶剂,经这样纯化的产物通常要被溶解在水性介质中并冷冻干燥。这是一个高成本的过程,产生不容易操作的体积庞大的产物。
因此希望有冷冻干燥以外的手段,从否则是纯的肽中除去溶剂的纯化方法。
发明目的
本发明目的是提供从上述种类的否则是纯的肽中除去残留的有机溶剂的纯化方法,该方法避免了冷冻干燥。
本发明的另一个目的是提供这样的一种基本上不含残留的有机溶剂的否则是纯的肽,它不是呈冷沉淀物的形态。
本发明的其它目的通过以下的本发明概要、其优选的实施方案的叙述、以及所附的权利要求书将变得明显。
发明概述
本发明提供否则是纯的肽(具体是九肽或十肽,更具体是作为LHRH-拮抗剂的九肽或十肽)中除去残留的有机溶剂的纯化方法,该方法包含以下步骤:
将所述的否则是纯的肽溶解在含有水和至少一种选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇的醇的溶解溶剂混合物中;
-将该否则是纯的肽在所述的溶剂混合物中的溶液加到剧烈搅拌的沉淀溶剂混合物中,该溶剂混合物由一种或多种极性化合物和一种或多种非极性化合物,和任选的高达5%的乙酸或丙酸构成,所述极性化合物选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、异丙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸异丙酯,所述非极性化合物选自己烷、庚烷、辛烷、环己烷、甲基环己烷;
-分离沉淀的肽;
-用一种所述的极性化合物或该极性化合物的混合物,或相似极性的溶剂或溶剂混合物洗涤该分离的肽;
-干燥该洗涤过的肽,
条件是,所述的含有水和至少一种醇的溶剂混合物的水含量低于8%(v/v),溶解溶剂混合物和沉淀溶剂混合物的体积比为1∶10或更高。
术语“否则是纯的肽”指对于药物应用是非常纯的肽,只是其挥发性的杂质需要除去或其含量需要显著地降低。该否则是纯的肽一般是已经经过色谱纯化的物质。
优选地,该否则是纯的肽是
Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-
D-Ala-NH2(I).
按照本发明的第一优选方面,溶解溶剂混合物的水含量低于5%(v/v)。
按照本发明的第二优选方面,溶解溶剂混合物和沉淀溶剂混合物的体积比为至少15,特别是至少20。
按照本发明的第三优选方面,溶解溶剂混合物的醇是乙醇。
按照本发明的第四优选方面,沉淀溶剂混合物的极性组分是乙酸乙酯。
按照本发明的第五优选方面,沉淀溶剂混合物的非极性组分是庚烷。
以下本发明将通过参照其优选的实施方案更详细地叙述,但这不应该被理解为对本发明的限制。
优选实施方案的叙述
实施例1
用制备型HPLC将合成产物纯化所得到的含纯化合物(1)(共100克)在乙醇-水-乙酸(40∶59∶1,v/v/v)中的级份收集起来并真空浓缩,所产生的油状产物用乙醇共蒸发两次。产生的固体溶解在440毫升乙醇中,所得到的澄清溶液在20分钟时间内加入8.8升乙酸乙酯/庚烷1∶1(v/v)中。继续搅拌1小时,过滤。无定形产物用3升乙酸乙酯洗涤;发现这一步除去了几乎全部的庚烷。洗涤过的产物在真空烘箱中40℃在0.3巴干燥48小时。干燥产物的元素分析表明得到了(I)的单乙酸酯。相反,冷沉淀产生相应的二乙酸酯。在下表中,按照本发明产生的单乙酸酯的分析参数与相应的冷冻干燥产物(二乙酸酯)的分析参数做比较。
表.所有的百分数都是重量百分数
冷冻干燥产物 | 沉淀产物 | |
水 | 3.4% | 3.0% |
乙醇 | <0.024% | <0.024% |
乙酸乙酯 | <0.024% | <0.024% |
庚烷 | <0.024% | <0.024% |
乙酸(作为乙酸酯) | 7.5% | 3.9% |
HPLC纯度 | 99.8% | 99.8% |
肽含量 | 88.8% | 94.9% |
滤液中的损失 | - | 0.3% |
实施例2
改变沉淀溶剂或溶剂混合物的组成;其它方面和实施例1的程序相同。在纯乙酸乙酯中沉淀造成约3-5重量%的肽损失。在纯庚烷中沉淀造成粘性产物,难以过滤。乙酸乙酯-己烷(1∶1,v/v)混合物给出的产物容易过滤和干燥;在重复实验中肽的损失总低于0.5重量%。
实施例3
改变在溶解溶剂(绝对乙醇)中油性产物的溶液的水含量;其它按照实施例1的程序。10%(v/v)的水含量在沉淀时产生粘性产物,难以过滤。15%(v/v)的水含量在沉淀时产生油性产物。为了得到满意的结果,水含量必须不超过8%(v/v),最好应该保持在5%(v/v)以下。低于5%的水含量可以通过将从色谱得到的油性产物—乙醇共蒸发两次达到。
实施例4
改变沉淀的温度;其它方面按照实施例1。沉淀温度证明不是关键性的。可从0℃改变到20℃而在产物的产率和形态上没有可察觉的不同。
实施例5
改变(I)在溶解溶剂中的浓度;其它方面按照实施例1。发现,从色谱得到又经过用乙醇共蒸发两次的油性产物在溶解溶剂中的浓度应该尽可能高。甚至可以使用330克(重量)的浓度。
实施例6
改变溶解溶剂和沉淀溶剂之间的比;其它方面按照实施例1。发现最佳的比为约1∶20。从1∶15到1∶30的比都可给出满意的结果。1∶10的比产生粘性的产物。沉淀过程是非常快的。可以在溶解的物质最后加入的30分钟以后过滤虚浮液。用乙酸乙酯洗涤不会造成产物的损失,但能有效除去庚烷。
Claims (11)
1.一种从否则是纯的九肽或十肽中除去残留的有机溶剂的纯化方法,所述方法包含以下步骤:
-将所述的九肽或十肽溶解在溶解溶剂混合物中,该混合物含有水和至少一种选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇的醇;
-将九肽或十肽在所述溶剂混合物中的溶液加到剧烈搅拌的沉淀溶剂混合物中,该溶剂混合物基本上由一种或多种极性化合物和一种或多种非极性化合物和任选地高达5%的乙酸或丙酸构成,所述极性化合物选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、异丙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸异丙酯,所述非极性化合物选自己烷、庚烷、辛烷、环己烷、甲基环己烷;
-分离沉淀的九肽或十肽;
-用一种所述的极性化合物或所述的极性化合物的混合物,或者类似极性的溶剂或溶剂混合物洗涤该分离的九肽或十肽;
-干燥该洗涤过的九肽或十肽,
条件是,所述含有水和至少一种醇的溶剂混合物的水含量低于8%(v/v),所述溶解溶剂混合物和所述沉淀溶剂混合物的体积比是1∶10或更高。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含有水和至少一种醇的溶剂混合物的水含量低于5%(v/v)。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述九肽或十肽是LHRH拮抗剂。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述九肽或十肽是Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(I)。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(I)是以单乙酸酯的形式得到的。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述溶解溶剂混合物的水含量低于5%(v/v)。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述溶解溶剂和沉淀溶剂的体积比为至少15。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述溶解溶剂混合物中的醇是乙醇。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述沉淀溶剂混合物中的极性组分是乙酸乙酯。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述沉淀溶剂混合物中的非极性组分是庚烷。
11.Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2的单乙酸酯。
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