ES2350880T3 - Purificación de péptidos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificación de un nona- o deca-péptido por lo demás puro de disolvente orgánico residual, que comprende las siguientes etapas: - disolver el nona- o deca-péptido en una mezcla de disolventes de disolución que comprende agua y al menos un alcohol seleccionado de metanol, etanol, propanol, isopropanol; - añadir la solución del nona- o deca-péptido en dicha mezcla de disolventes a una mezcla de disolventes de precipitación vigorosamente agitada que con- siste esencialmente en uno o varios compuestos polares seleccionados de ace- tato de metilo, acetato de etilo, propionato de metilo, propionato de etilo, acetato de butilo, acetato de isobutilo, acetato de t-butilo, formiato de etilo, formiato de propilo, formiato de isopropilo, y uno o varios compuestos no polares seleccionados de hexano, heptano, octano, ciclohexano, metilciclohexano y, opcionalmente, en hasta 5% de ácido acético o propiónico; - aislar el nona- o deca-péptido precipitado; - lavar el nona- o deca-péptido aislado con uno o una mezcla de dichos compuestos polares o un disolvente o una mezcla de disolventes de polaridad si- milar, - secar el nona- o deca-péptido lavado, con la condición de que el contenido de agua de dicha mezcla de disolventes que comprende agua y al menos un alcohol esté por debajo de 8% (v/v), y que la relación en volumen de la mezcla de disolventes de disolución y la mezcla de disolventes de precipitación sea 1:10 o más.
Description
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la purificación de péptidos, en particular péptidos de tamaño intermedio, más particularmente nona-y deca-péptidos, tales como antagonistas de LHRH. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La mayoría de los péptidos naturales y sintéticos de tamaño intermedio son sustancias amorfas. Muchos de ellos tienen propiedades farmacológicamente interesantes, tales como muchos nona-y deca-péptidos que son antagonistas de LHRH (hormona liberadora de hormona luteinizante). Una sustancia particular de este tipo conocida solo en su forma amorfa es el decapéptido sintético de la fórmula (I) Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 (I) que, siendo un potente antagonista de LHRH, tiene propiedades farmacológicas deseables.
Para el uso en preparaciones farmacéuticas, es necesario que el antagonista de LHRH (I) y los nona-y deca-péptidos de estructura similar sean esencialmente puros. El producto crudo obtenido en la última etapa de una síntesis de múltiples etapas se purifica mediante métodos cromatográficos y otros. Para eliminar el disolvente residual de la cromatografía, un producto así purificado habitualmente tiene que disolverse en un medio acuoso y secarse por congelación. Este es un procedimiento costoso que produce un producto voluminoso que no es fácil de manejar.
Es deseable así un procedimiento de purificación de un péptido por lo demás puro mediante otros medios distintos al secado por congelación.
WO 0018423 A divulga el uso de la combinación de ciclodextrina y un análogo peptídico de LHRH, incluyendo sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación de una composición farmacéutica para administración oral. Abarelix es un análogo de LHRH preferido. Se divulga que las sales de acetato de los antagonistas peptídicos de D1 son en general farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de WO 0018423 son útiles en la fabricación de medicamentos.
WO 0055190 A divulga antagonistas de LHRH decapeptídicos para la fabricación de medicamentos contra tumores dependientes de hormonas y enfermedades influidas por hormonas, que puede purificarse mediante HPLC preparativa y secarse por congelación.
EP 0955308 A divulga un procedimiento para la transformación de sales de hidrocloruro de antagonistas de LHRH decapeptídicos en sus sales de diacetato en una purificación simultánea en una sola etapa mediante cromatografía de líquidos. OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de purificación de un péptido por lo demás puro del tipo mencionado anteriormente de disolvente orgánico residual, que evite el secado por congelación.
El procedimiento de la presente invención da como resultado un péptido por lo demás puro, que está esencialmente libre de disolvente orgánico residual y no está en la forma de un crioprecipitado. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento de purificación de un péptido, en particular un nona-o deca-péptido, lo más particularmente un nona-o deca-péptido que es un antagonista de LHRH, por lo demás puro de disolvente orgánico residual, que comprende las siguientes etapas:
- -
- disolver dicho péptido por lo demás puro en una mezcla de disolventes de
- disolución que comprende agua y al menos un alcohol seleccionado de meta
- nol, etanol, propanol, isopropanol;
- -
- añadir la solución del péptido por lo demás puro en dicha mezcla de disol
- ventes a una mezcla de disolventes de precipitación vigorosamente agitada
- que consiste esencialmente en uno o varios compuestos polares seleccionados
- de acetato de metilo, acetato de etilo, propionato de metilo, propionato de eti
- lo, acetato de butilo, acetato de isobutilo, acetato de t-butilo, formiato de eti
- lo, formiato de propilo, formiato de isopropilo, y uno o varios compuestos no
- polares seleccionados de hexano, heptano, octano, ciclohexano, metilciclo
- hexano y, opcionalmente, en hasta 5% de ácido acético o propiónico;
-aislar el péptido precipitado;
- -
- lavar el péptido aislado con uno o una mezcla de dichos compuestos polares
- o un disolvente o una mezcla de disolventes de polaridad similar,
- -
- secar el péptido lavado,
con la condición de que el contenido de agua de dicha mezcla de disolventes que comprende agua y al menos un alcohol esté por debajo de 8% (v/v), y que la relación en volumen de la mezcla de disolventes de disolución y la mezcla de disolventes de precipitación sea 1:10 o más.
“Un péptido por lo demás puro” es un péptido que es suficientemente puro para el uso en una medicina, excepto por las impurezas volátiles que necesitan retirarse o cuyo contenido necesita reducirse sustancialmente. El péptido por lo demás puro normalmente será una sustancia que se ha sometido a purificación mediante cromatografía.
Preferiblemente, el péptido por lo demás puro es Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 (I).
De acuerdo con un primer aspecto preferido de la invención, el contenido de agua de la mezcla de disolventes de disolución está por debajo de 5% (v/v).
De acuerdo con un segundo aspecto preferido de la invención, la relación en volumen de la mezcla de disolventes de disolución y la mezcla de disolventes de precipitación es al menos 15, en particular al menos 20.
De acuerdo con un tercer aspecto preferido de la invención, el alcohol de la mezcla de disolventes de disolución es etanol.
De acuerdo con un cuarto aspecto preferido de la invención, el componente polar de la mezcla de disolventes de precipitación es acetato de etilo.
De acuerdo con un quinto aspecto preferido de la invención, el componente no polar de la mezcla de disolventes de precipitación es heptano.
En lo siguiente, la invención se describirá con más detalle mediante referencia a una realización preferida de la misma que debe entenderse que no limita la invención. DESCRIPCIÓN DE UNA REALIZACIÓN PREFERIDA Ejemplo 1. Las fracciones que contienen compuesto (1) puro (100 g en total) en etanol-agua-ácido acético 40:59:1 (v/v/v) obtenidas de HPLC preparativa mediante la que se ha purificado el producto obtenido sintéticamente se reunieron y se concentra
ron a vacío hasta un aceite que se coevaporó dos veces de etanol. El sólido resultante se disolvió en 440 ml de etanol y la solución transparente resultante se añadió durante un período de 20 min a 8,8 l de acetato de etilo/heptano 1:1 (v/v). La agitación se continuó durante 1 hora y se filtró. El producto amorfo se lavó con 3 l de acetato de 5 etilo; se encontró que esto retiraba casi todo el heptano. El producto lavado se secó a vacío en un horno de vacío a 40°C a 0,3 bar durante 48 h. El análisis elemental del producto secado indicaba que se había obtenido el monoacetato de (I). La crioprecipitación, en contraste, produce el diacetato correspondiente. En la siguiente Tabla, parámetros analíticos del monoacetato de (I) producido de acuerdo con la invención
10 se comparan con los de un producto liofilizado correspondiente (diacetato).
Tabla. Todos los porcentajes son en peso
producto liofilizado producto precipitado Agua 3,4 % 3,0% Etanol <0,024% <0,024% Acetato de etilo <0,024% <0,024% Heptano <0,024% <0,024% Ácido acético (como acetato) 7,5% 3,9% Pureza por HPLC 99,8% 99,8% Contenido de péptido 88,8% 94,9% Pérdida en el filtrado -0,3%
Ejemplo 2. Variación de la composición del disolvente o la mezcla de disolventes de precipitación; por lo demás, procedimiento como en el Ejemplo 1. La pre
15 cipitación en acetato de etilo puro da como resultado de aproximadamente 3% a aproximadamente 5% en peso de péptido. La precipitación en heptano puro da como resultado un producto pegajoso que es difícil de filtrar. Una mezcla 1:1 (v/v) de acetato de etilo-hexano da un producto que es fácil de filtrar y secar; en experimentos repetidos la pérdida de péptido era siempre menor de 0,5% en peso.
20 Ejemplo 3. Variación del contenido de agua de la solución de producto oleoso en el disolvente de disolución (etanol absoluto); por lo demás, procedimiento como en el Ejemplo 1. Un contenido de agua de 10% (v/v) da como resultado un producto pegajoso durante la precipitación que es difícil de filtrar. Un contenido de agua de 15% (v/v) da como resultado un producto oleoso durante la precipitación. Para obtener resultados satisfactorios, el contenido de agua no debe superar 8% (v/v), pero preferiblemente debe mantenerse por debajo de 5% (v/v). Un contenido de agua por debajo de 5% se consigue coevaporando el producto oleoso procedente de la croma
5 tografía al menos dos veces con etanol.
Ejemplo 4. Variación en la temperatura de precipitación; por lo demás, procedimiento como en el Ejemplo 1. La temperatura de precipitación resultó no ser crítica. Podía variarse de 0°C a 20°C sin diferencias notables en el rendimiento de producto.
10 Ejemplo 5. Variación en la concentración de (I) en el disolvente de disolución; por lo demás, procedimiento como en el Ejemplo 1. Se encontró que la concentración del producto oleoso procedente de la cromatografía que se había coevaporado con etanol en el disolvente de disolución debía ser tan alta como fuera posible. Incluso podía usarse una concentración de 330 g en peso.
15 Ejemplo 6. Variación de la relación entre los volúmenes de disolvente de disolución y disolvente de precipitación y otras variaciones; por lo demás, procedimiento como en el Ejemplo 1. Se encontró que la relación óptima era aproximadamente 1:20. Podía mostrarse que relaciones de 1:15 a 1:30 daban resultados satisfactorios. Una relación de 1:10 daba como resultado un producto pegajoso. La precipi
20 tación es muy rápida. La suspensión puede filtrarse 30 min después de la última adición de sustancia disuelta. El lavado con acetato de etilo no daba como resultado pérdida de producto sino que retiraba eficazmente el heptano.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento de purificación de un nona-o deca-péptido por lo demás puro de disolvente orgánico residual, que comprende las siguientes etapas:
- -
- disolver el nona-o deca-péptido en una mezcla de disolventes de disolución
- que comprende agua y al menos un alcohol seleccionado de metanol, etanol,
- propanol, isopropanol;
- -
- añadir la solución del nona-o deca-péptido en dicha mezcla de disolventes a
- una mezcla de disolventes de precipitación vigorosamente agitada que con
- siste esencialmente en uno o varios compuestos polares seleccionados de ace
- tato de metilo, acetato de etilo, propionato de metilo, propionato de etilo, ace
- tato de butilo, acetato de isobutilo, acetato de t-butilo, formiato de etilo, for
- miato de propilo, formiato de isopropilo, y uno o varios compuestos no pola
- res seleccionados de hexano, heptano, octano, ciclohexano, metilciclohexano
- y, opcionalmente, en hasta 5% de ácido acético o propiónico;
- -
- aislar el nona-o deca-péptido precipitado;
- -
- lavar el nona-o deca-péptido aislado con uno o una mezcla de dichos com
- puestos polares o un disolvente o una mezcla de disolventes de polaridad si
- milar,
- -
- secar el nona-o deca-péptido lavado,
con la condición de que el contenido de agua de dicha mezcla de disolventes que comprende agua y al menos un alcohol esté por debajo de 8% (v/v), y que la relación en volumen de la mezcla de disolventes de disolución y la mezcla de disolventes de precipitación sea 1:10 o más. - 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el contenido de agua de dicha mezcla de disolventes que comprende agua y al menos un alcohol está por debajo de 5% (v/v).
- 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho nona-
- o deca-péptido es un antagonista de LHRH.
- 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho nona-
- o deca-péptido es Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)ProD-Ala-NH2 (I).
- 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que Ac-D-2NalD-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 (I) se obtiene en forma del monoacetato.
- 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la relación5 en volumen de la mezcla de disolventes de disolución y la mezcla de disolventes de precipitación es al menos 15.
- 7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el alcohol de la mezcla de disolventes de disolución es etanol.
- 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compo10 nente polar de la mezcla de disolventes de precipitación es acetato de etilo.
- 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el componente no polar de la mezcla de disolventes de precipitación es heptano.
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