CN108697770A - 用于溶液相gap肽合成的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于Fmoc/tBu溶液相肽合成的系统和方法，包括开发新的苄基型GAP保护基团及其相关用途。使用这种新的GAP保护基团代替聚合物载体，促进C至N Fmoc肽合成，而无需色谱法、重结晶或聚合物载体。可以高收率添加和去除GAP基团。
Description
本申请包含受版权保护的材料。版权所有人不反对任何人对专利公开内容进行传真复制，因为它出现在专利和商标局的文件或记录中，但在其它方面保留所有版权。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月21日提交的名称为“用于溶液相GAP肽合成的系统和方法(System And Method For Solution Phase GAP Peptide Synthesis)”、序列号为62/270,432的美国专利申请的优先权。在此出于所有目的将上述专利申请的全部内容引用本文作为参考。
技术领域
本公开内容一般涉及肽合成领域。特别地，该系统提供无需色谱法、重结晶或聚合物载体的溶液相肽合成，并且允许获得高总收率和高纯度。所公开的系统和方法支持多种场景并且包括各种产品和服务。
联邦资助研究声明
无。
发明背景
最近的研究工作在纯化化学领域取得了重大进展，特别集中在避免柱色谱法和重结晶。这项研究被定义为基团辅助纯化(GAP)化学/技术，其作为用于有机合成的化学，通过有目的地在起始材料或新生成的产物中引入良好官能化的基团，避免了传统的纯化方法，如色谱法和/或重结晶。这种研究有可能涵盖整个合成有机化学领域。
广泛使用保护基团的一个领域是在肽合成中，用于固相和溶液相方法二者。由Merrifield在20世纪60年代开发的固相肽合成(SPPS)已经成为多个科学学科为了研究和制造所使用的标准方案(参见图1A)。聚合物载体的优点在于其能够在每次偶联/脱保护步骤后容易地纯化生长中的肽，这避免了使用柱色谱法。SPPS的主要缺点在于放大的难度：许多聚合物载体是昂贵的，并且占据了要处理的大部分材料。几乎在每个存在多个官能团的复杂合成中都可以见到保护基团。有效的保护基团需要对各种条件都适用，并且必须以高收率添加和去除。GAP化学的理想实例是其中半永久性保护基团引入GAP所需的必需溶解度特性的实例。然而，大多数传统的保护基团是非极性的，因此对于大多数底物不会产生所需的GAP溶解度。如果可以开发出能够产生适当溶解度控制的保护基团，那么GAP化学可以潜在地扩展到所有需要使用该保护基团的合成。
已经使用了几种方法。公开的专利申请WO 2014093723 A2教导了用配备GAP的手性助剂保护亚胺，然后在不对称硼加成反应中使用这些手性N-膦酰亚胺作为亲电子试剂。纯化通过GAP过程进行。这项工作是有价值的，因为它提供了获得手性α-硼酸胺的便利途径，该手性α-硼酸胺可以潜在地用于合成新的氨基酸衍生物，该新的氨基酸衍生物可以潜在地被引入到新的肽靶标中。
第8,383,770 B2号美国专利教导了在SPPS中使用Fmoc和Boc N末端保护基团。这项技术是众所周知的，并在工业中广泛应用。Boc和Fmoc基团已经在肽化学的所有领域使用了数十年，并且优选的Fmoc基团几乎完全限于固相。溶液中经济可行的Fmoc保护方案的实例是不存在的，在文献中几乎没有实例。
第5,516,891A号美国专利提供了基于Fmoc的SolPPS的少数实例之一。此外，由于在脱保护期间形成N-芴基甲基哌啶(NFMP)作为副产物，Fmoc肽合成几乎完全限于SPPS，所述副产物在没有聚合物载体的情况下难以去除。Fmoc脱保护的标准方案是在含有过量哌啶的DMF或DCM溶液中搅拌Fmoc-肽，在该过程中将Fmoc基团脱保护并形成NFMP。该‘891专利教导通过用4-氨基甲基哌啶(4AMP)替代哌啶脱保护去除该杂质。这形成NFMP-CH2NH2而不是NFMP，由于NFMP-CH2NH2存在额外的氨基，可以将其萃取到水中。这种方法的问题在于使用4AMP的高成本。按照Sigma Aldrich，4AMP的价格为每克3.80美元，而哌啶的价格仅为每克0.12美元。这就是为什么这种方法成本过高，以及为什么它没有被业界所接受的原因。
因此，本领域需要开发能够克服这些限制的经济可行的GAP肽合成系统，同时保持固相肽合成的纯化益处。
发明内容
本公开内容通过提供利用在溶液相中发生的反应的用于肽合成的系统和方法解决了本领域的缺陷，而没有聚合物载体的大量浪费，但作为传统溶液相肽合成(SolPPS)以及SPPS的替代方案保留了SPPS的所有纯化益处，提供了两种方法的优点。通过利用GAP化学的优点，提出了经济上可行并且对于肽的商业生产有用的Fmoc-SolPPS策略。
因此，本公开内容的目的是通过开发用于C末端保护的新GAP苄基型保护基团来实现GAP肽合成(GAP-PS)(参见图1B)。关于C末端保护，可以使用Fmoc/tBu策略来实现GAP-PS，由于其温和的脱保护方案，其是SPPS中使用最多的方法。由于在脱保护期间形成N-芴基甲基哌啶(NFMP)作为副产物，该策略目前几乎完全限于SPPS，所述副产物在没有聚合物载体的情况下难以去除。因此，本公开内容的目的是通过利用溶液相Fmoc/tBu策略作为肽合成的一般方法的实例，以高收率和高纯度提供超过1克的目标肽，例如胸腺五肽。用这种新的保护基团保护各种氨基酸也已经以一致的定量收率实现。
在一个方面，提供了用于肽合成的方法。该方法允许在溶液相肽合成(SolPPS)的情况下使用Fmoc/tBut策略实现高收率(超过50％)和高纯度(99％)。本发明利用基团辅助纯化(GAP)与SolPPS结合，使肽能够通过沉淀而不是重结晶或色谱法纯化。所公开的方法还避免了固相肽合成(SPPS)，从而增加了实际形成的产物的量。
本发明的另一个目的是提供化学连接于C末端的新型C末端保护基团(本文称为“BnDppOH”、“BnDppYH”、“BzDppOH”)。该GAP基团的用途也不同：尽管以前的GAP基团用作氨基保护基团，但本发明公开了羧酸的保护基团。通过保护羧酸，允许以行业优选的C至N方向而不是N至C方向进行肽合成，这是与以前的GAP-PS方法的关键区别，进一步使得能够将Fmoc用作临时保护基团，借助其生长肽链。在Fmoc脱保护期间，形成NFMP，其在没有固体载体的情况下难以去除。本发明提供了一种选择性地沉淀GAP-肽的去除方法，从而使NFMP留在溶液中。
附图简述
根据附图中所示的实施方案的以下描述，本公开内容的前述和其它目的、特征和优点将变得显而易见，其中附图标记在各个视图中指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本公开内容的原理上：
图1A描绘了固相肽合成(SPPS)的现有技术方法。
图1B描绘了本公开内容的方法，包括使用苄基型保护基团进行C末端保护。
图2描绘了在图1B中使用的保护基团的开发过程。
图3描绘了测试图2的保护基团的正交性和GAP能力的示意图。
图4A-4B各自描绘了将图2的保护基团连接到各种氨基酸的过程的示意图。
图5描绘了出于本发明的肽合成的示例性非限制性实例的目的，使用图2的保护基团合成胸腺五肽的示意图。
图6描绘了可用于本发明的实施方案中的其它保护基团。
图7描绘了用于生产、合成和制备如在本发明的实施方案中所使用的图6的保护基团的替代方法。
图8描绘了用于生产、合成和制备如在本发明的实施方案中所使用的图6的保护基团的另一替代方法。
图9A描绘了将保护基团“BnDppYH”连接到各种氨基酸的过程的示意图。
图9B描绘了在图9A所示过程的示意图中使用的保护基团“BnDppYH”。
图10A描绘了将保护基团“BnDppZH”连接到各种氨基酸的过程的示意图。
图10B描绘了在图10A中所示过程的示意图中使用的保护基团“BzDppOH”。
发明详述
虽然以下详细讨论了本公开内容的各种实施方案的制备和使用，但应该理解的是，本公开内容提供了许多可在各种特定环境、商品或服务中实施的可应用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅仅是说明制备和使用本公开内容的具体方式，并不限定本公开内容的范围。
说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本公开内容所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入。
现在将在下文中参照附图更全面地描述本公开内容，所述附图形成其部分，并以说明的方式示出了具体的示例实施方案。然而，主题可以以各种不同的形式来体现，因此，所涵盖或要求保护的主题意在被解释为不限于在此阐述的任何示例实施方案；提供示例实施方案仅仅是说明性的。同样地，要求保护或涵盖的主题意在合理的宽范围。其中，例如，主题可以体现为方法、组合物或系统。因此，实施方案可以例如采取方法、组合物、化合物、材料或其任何组合的形式。因此，下面的详细描述并非意在限制。
在整个说明书和权利要求书中，术语可能具有超出明确表述的含义的在上下文中暗示的或隐含的有细微差别的含义。同样地，如本文所使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，并且在本文使用的短语“在另一个实施方案中”不一定指代不同的实施方案。例如，意图是，所要求保护的主题全部或部分地包括示例实施方案的组合。
通常，术语可以至少部分地从上下文中的用法来理解。例如，如本文所使用的诸如“和”、“或”或“和/或”的术语可以包括可以至少部分取决于使用这些术语的上下文的各种含义。通常，如果用于关联列表，如A、B或C，“或”在这里以包含意义使用时意在表示A、B和C，以及在这里以排他意义使用时意在表示A、B或C。另外，如本文所用的术语“一个或多个”至少部分依据上下文可用于以单数意义描述任何特征、结构或特性，或可用于以复数意义描述特征、结构或特性的组合。类似地，术语诸如“一(a)”、“一个(an)”或“该(the)”也至少部分依据上下文可以被理解为表达单数用法或表达复数用法。另外，再次至少部分依据上下文，术语“基于”可以被理解为不一定意在表达排他性因素集合，而是可以允许存在不必明确描述的附加因素。
因此，本公开内容的实施方案提供用于新的C末端保护基团的系统和方法。在设计新的保护基团时，显然，保护基团的GAP官能化片段需要在各种条件下稳定。考虑的是它必须提供GAP化学所需的溶解度特性。而且，它必须有效地和与当前保护策略的反应性正交地起作用。因此使用修饰的苄基保护基团以在引入GAP基团的同时保持期望的反应性。由于已知以前使用GAP化学的氧化膦基团的成功，选择的GAP基团是二苯基氧化膦。此外，将该基团连接到苄基的对位产生三苯基氧化膦部分，其在文献中众所周知对广泛的各种条件稳定。这种稳定性对避免干扰底物可能暴露在其中的多种脱保护条件是必要的，由此建立真正的正交性。
最初的努力集中在用于合成手性胺的手性N-膦酰基和N-氧膦基亚胺化学的开发上，并取得了很大的成功。通过控制溶解度，可以从粗混合物中选择性地沉淀出手性胺产物，从而避免了色谱法和重结晶。进一步的努力已经将这种技术扩展到其它底物和官能团。为此，GAP性质取自手性助剂，并且在修饰的情况下为本公开内容的GAP保护基团提供基础。
在本公开内容的一个示例性实施方案中，该新的保护基团的合成从商业上可获得的二苯基(对甲苯基)膦1开始(图2)。用高锰酸钾氧化1提供苯甲酸2，以及通过膦氧化提供GAP基团。该GAP基团是二苯基氧化膦(Dpp)。酯化接着硼氢化物还原以高收率提供配备GAP的苯甲醇4或“BndppOH”(或者“HOBndpp”)。接下来，测试这个新保护基团的正交性和GAP能力。使用EDCI作为碳化二亚胺偶联试剂，保护Boc-Phe-OH既容易又定量(图3)。产物5a可以从乙酸乙酯/石油醚溶剂混合物中选择性地沉淀为白色固体，从而满足GAP化学的要求。Boc基团的脱保护也是定量的，并且不会导致Bndpp基团的任何损失。使用催化氢化可以容易地去除Bndpp基团，并且也可以在洗去脱保护的氨基酸之后作为“HBndpp”7a回收并再循环以再利用。如上所述，对7a进行高锰酸盐氧化得到2，其可以转化为HOBndpp 4(图2)。
图4A-4B描绘了将图2的保护基团连接到各种氨基酸的过程的示意图。氨基酸保护的全部底物范围显示于下表1中，对于保护具有不同侧链保护基团的各种Boc和Fmoc氨基酸具有一致的定量收率。值得注意的是色氨酸、精氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的定量保护。
表1
在一个实施方案中，提供了通过GAP化学/技术进行Fmoc/tBu液相肽合成的方法，以及用于羧酸的新的苄基型GAP保护基团的开发。这种新的GAP保护基团被用来代替聚合物载体，并且有助于C到N Fmoc肽的合成，而无需色谱法或重结晶。GAP保护基团可以高收率添加和去除，同时保持与存在的其它保护基团的正交关系。作为这种用于GAP肽合成的新保护基团的第一次测试，以高总收率(83％)和高纯度(99％)合成了超过1克的五肽药物胸腺五肽(一种免疫刺激剂)。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于基团辅助纯化(GAP)肽合成的保护基团，包括以下化合物：
其中，R是：H、Me或OMe；Y是：O、S和NH；X是：O、S或NH。
在另一个实施方案中，本发明提供了形成用于C末端保护的保护基团的方法，其包括基于Fmoc-tBu的溶液相肽合成(SolPPS)。该方法包括保护基团：
所述保护基团是通过以下制备的：
其中，所述保护基团通过以下形成：回流(对甲苯基)二苯基膦与高锰酸钾(KMnO4)，分离羧酸产物，将羧酸产物在酸性乙醇(EtOH，H+)中回流并加入硼氢化钠(NaBH4)。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备以下保护基团的方法：
其是通过以下制备的：
其中所述保护基团通过以下制备：在单一反应中使二溴化物与丁基锂(nBuLi)、二苯基氯化膦(Ph2PCl)、二氧化碳(CO2)和过氧化氢(H+，H2O2)反应以生成羧酸产物，分离羧酸产物，在酸性乙醇(EtOH，H+)中回流羧酸产物，加入硼氢化钠(NaBH4)形成醇产物，并用甲烷磺酸酐Ms2O或YH2处理醇产物；并且其中R是：H、Me或OMe；Y是：S或NH。
在另一个实施方案中，保护基团：
是通过以下制备的：
其中乙酯衍生物与二苯基氯化膦(Ph2PCl)反应，接着用过氧化氢(H2O2)氧化。所得到的氧化膦用硼氢化钠(NaBH4)处理，生成醇，用甲烷磺酸酐(Ms2O)和YH2处理醇形成(1C)；并且其中R是：H、Me或OMe；X是：O、S或NH；Y是：O、S或NH。
在另一个实施方案中，保护基团：
是通过以下制备的：
其中二溴化物与丁基锂(nBuLi)、二苯基氯化膦(Ph2PCl)、二氧化碳(CO2)和过氧化氢(H+，H2O2)通过一锅法反应，生成羧酸产物(1D)；并且其中R是：H、Me或OMe。
在本发明的另一个实施方案中，保护基团：
是通过以下制备的：
其中乙酯衍生物与二苯基氯化膦(Ph2PCl)反应，接着用过氧化氢(H2O2)氧化。所得到的氧化膦用氢氧化锂(LiOH)和水(H2O)处理，形成羧酸产物(1E)；并且其中R是：H、Me或OMe；X是：O、S或NH。
在本发明的另一个实施方案中，提供了将保护基团1A、1B、1C、1D或1E与氨基酸连接的方法，其中所述方法包括使权利要求1的保护基团与以下氨基酸化合物反应：
该方法可以包括以下步骤：
其中BnDppOH是保护基团(1A、1B、1C、1D或1E)；并且其中Pg可以包括但不限于：Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm或tBu；并且其中Z是一般变量。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括保护基团：
该方法可以进一步包括以下步骤：
其中BnDppYH是保护基团(1A、1B、1C、1D或1E)；并且其中Pg可以包括但不限于：Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm或tBu；并且其中Z是一般变量。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括保护基团：
和
其中R是：H、Me或OMe；并且其中X是：O、S或NH。
在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
其中BnDppYH是保护基团1A、1B、1C、1D或1E；Pg可以包括但不限于：Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm或tBu；并且其中Z是一般变量。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
其中BzDppOH是保护基团1A、1B、1C、1D或1E；Pg可以包括但不限于：Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm或tBu；Z是一般变量。
在另一个实施方案中，该方法包括保护基团：
或
其中R选自：H、Me或OMe；并且其中X选自O、S或NH。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种进行基团辅助纯化(GAP)肽合成的方法，其中所述方法包括以下步骤：使用本文所述的任何方法将保护基团1A、1B、1C、1D或1E连接至氨基酸，然后根据本文所述的方法对所得产物进行基于Fmoc-tBu的溶液相肽合成(SolPPS)偶联反应。这样的GAP-PS方法可进一步包括在乙酸乙酯中或供选择地在二氯甲烷中发生的反应。
本文讨论的原理可以以许多不同的形式体现。现在将描述本公开内容的优选实施方案，其中为了完整起见，至少应参考附图。
实施例1
对于新的保护基团的首次应用，测试了处理Fmoc/tBu SolPPS策略的能力。用于该非限制性实例的感兴趣的目标肽是胸腺五肽，其为具有药理学意义的免疫调节多肽胸腺生成素的生物活性五肽亚基。对于短肽来说，胸腺五肽含有具有多种官能团(一个芳族、两个碱性(一个具有胍)、两个酸性和一个β支链官能团)的氨基酸。这使得胸腺五肽成为GAP保护基团的示例性应用的理想候选者以及其耐受去除几个侧链保护基团的能力。胸腺五肽的合成示于图5中。首先用30％哌啶的DCM溶液处理化合物5k 10分钟以去除Fmoc基团，接着用氯化铵洗涤以去除过量的哌啶。DCM层(干燥后)直接负载下一个Fmoc氨基酸(如上所述的侧链保护)以及TBTU偶联试剂和DIPEA。偶联20分钟后，反应混合物用氯化铵和0.5M氢氧化钠(分别)洗涤，干燥并抽空。偶联后的粗产物含有一些杂质，最显著的是NFMP和四甲基脲(来自偶联)。GAP纯化程序可以简单地通过将混合物溶解在最小量的乙酸乙酯中，然后用石油醚选择性沉淀GAP-肽来容易地去除这些杂质。对于四肽和五肽片段，在沉淀之前将少量DCM加入到乙酸乙酯中以帮助溶解。在最后的偶联步骤和9k的合成后，如前所述去除最后一个Fmoc基团，但在后处理后，浓缩DCM层，并将肽溶解于TFA/DCM/H2O(6/3/1)溶液用于侧链脱保护。五肽10k(现在具有Bndpp作为唯一的保护基团)用乙醚沉淀。然后将该肽进行氢化并去除GAP基团。通过用10％乙酸(水溶液)从氯仿萃取分离产物。通过用10％乙酸(水溶液)从氯仿萃取分离产物。出乎意料的是，产物肽的HPLC分析显示该化合物几乎99％纯，不需任何柱色谱法、重结晶或聚合物载体。萃取后可简单地通过抽空氯仿层来回收GAP基团。使该原料经受图2中的合成方法可以再生BndppOH。
通用方法：所有溶剂均为ACS级，无需额外纯化即可使用。使用Orbitrap质量分析仪进行HRMS分析。使用配备有UV检测器的Perkin Elmer Flexar等度泵进行HPLC分析。Fmoc和Boc保护的氨基酸购自BachemBio并直接用于偶联。
苯甲酸2的合成：将10.0g 1置于500mL圆底烧瓶中，接着加入130mL 0.43M NaOH(水)溶液，然后加入22.2g KMnO4。将反应在回流下搅拌12小时，然后将反应混合物在热的时候通过硅藻土过滤。将所得溶液用乙醚洗涤两次，接着加入50％H2SO4以沉淀产物。过滤后，收集苯甲酸2，为白色固体；收率，10.8g，93％；将该产物直接进行下一步反应。
酯3的合成：将10.8g 2与300mL乙醇和3mL亚硫酰氯一起置于500mL圆底烧瓶中。使反应回流并搅拌12小时。完成后，将反应冷却至室温，将挥发物抽空，得到酯3，为白色固体；收率，11.8g，99％；将该产物直接进行下一步反应。
BndppOH 4的合成：将11.8g酯3与300mL乙醇一起置于500mL圆底烧瓶中。将反应冷却至0℃，然后分批加入3.82g NaBH4。将反应升至室温并搅拌12小时。将溶剂抽空，接着在DCM中溶剂化粗品并用2M HCl(水溶液)洗涤三次。然后将有机层用MgSO4干燥，过滤并抽空，得到BndppOH 4，为白色固体；收率，9.96g，96％；该化合物先前已通过不同方法合成，并且NMR数据与文献30中发现的相匹配：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.62–7.57(m,4H),7.54–7.47(m,4H),7.45–7.40(m,4H),7.38–7.36(m,2H),4.70(s,2H)。
Bndpp保护的通用过程：将100mg BndppOH、2.0当量PG-AA-OH和10mL DCM在0℃下在20mL螺旋盖小瓶中搅拌。加入124mg(2.0当量)EDCI(HCl)，搅拌反应10分钟，此时加入4mg(10mol％)DMAP，将反应升至室温并搅拌2小时。将反应混合物用饱和NH4Cl(水溶液)洗涤两次，接着用饱和Na2CO3(水溶液)洗涤两次。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并抽空，得到保护的氨基酸粗品。通过将粗品混合物溶解在最少量的乙酸乙酯中，接着用石油醚沉淀并过滤所得白色沉淀来进行GAP纯化。除了5k之外，对于每个底物使用相同的过程，其中使用600mg BndppOH和与之前相同当量的其它试剂以更大的规模进行反应。
化合物说明
化合物5a.白色固体；收率180mg，99％；熔点62-63℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.69–7.63(m,6H),7.58–7.52(m,2H),7.49–7.45(m,4H),7.35–7.32(m,2H),7.24–7.18(m,3H),7.07–7.05(d,J＝6.4Hz,2H),5.20–5.12(m,2H),4.96–4.95(d,J＝7.8Hz,1H),4.68–4.58(m,1H),3.09–3.07(d,J＝5.9Hz,2H),1.40(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝171.9,155.2,139.3,135.9,133.0,132.6,132.5,132.2,132.1,132.0,129.4,128.8,128.6,128.2,128.1,127.2,80.2,66.3,54.6,38.5,28.4；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.28；HRMS(ESI):[C33H34NO5P+H]+的m/z计算值:556.2253,测定值:556.2235。
化合物5b.白色固体；收率189mg，99％；熔点76-77℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.69–7.64(m,6H),7.58–7.54(m,2H),7.49–7.44(m,6H),6.65(bs,1H),5.52–5.50(d,J＝5.9Hz,1H),5.27–5.19(m,2H),4.54(bs,1H),4.38–4.32(m,2H),3.09–2.91(m,2H),2.06–2.00(m,1H),1.98(s,3H),1.43(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝170.9,170.4,139.3,133.5,132.8,132.6,132.5,132.4,132.2,132.1,131.8,128.7,128.2,80.7,66.7,54.2,42.2,34.5,28.4,23.3,22.5,14.2；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.46；HRMS(ESI):[C30H35N2O6PS+H]+的m/z计算值:583.2032,测定值:583.2012。
化合物5c.白色固体；收率246mg，99％；熔点86-87℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.76-7.74(d,J＝7.5Hz,2H),7.69-7.63(m,6H),7.60-7.52(m,4H),7.47–7.42(m,6H),7.40–7.36(t,J＝7.4Hz,2H),7.31–7.27(t,J＝7.4Hz,2H),5.48–5.46(d,J＝7.3Hz,1H),5.22(s,2H),4.65–4.57(bs,1H),4.43–4.34(m,3H),4.22–4.19(t,J＝6.9Hz,1H),3.10–3.02(m,2H),1.88–1.84(m,1H),1.72–1.68(m,1H),1.42(s,9H),1.38–1.24(m,4H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.4,156.2,143.9,141.4,139.5,132.9,132.6,132.2,131.8,128.7,128.0,127.8,127.2,125.2,120.1,79.3,67.2,66.4,54.0,47.3,40.0,32.1,29.8,28.5,22.5；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.37；HRMS(ESI):[C45H47N2O7P+H]+的m/z计算值:759.3199,测定值:759.3183。
化合物5d.白色固体；收率227mg，99％；熔点85-86℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.76–7.74(d,J＝7.5Hz,2H),7.66–7.52(m,10H),7.46–7.36(m,8H),7.29–7.26(t,J＝7.2Hz,2H),5.86–5.84(d,J＝8.6Hz,1H),5.29–5.20(dd,J＝12.8Hz,12.4Hz,2H),4.69–4.66(m,1H),4.44–4.31(m,2H),4.24–4.21(t,J＝7.0Hz,1H),3.01–2.95(dd,J＝4.3Hz,17.0Hz,1H),2.81–2.76(dd,J＝4.2Hz,17.0Hz,1H),1.39(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝170.9,170.2,156.1,143.9,143.8,141.4,139.5,132.7,132.6,132.5,132.2,132.1,131.7,128.7,128.6,128.0,127.9,127.2,125.2,120.1,82.1,67.4,66.7,50.7,47.2,37.8,28.1；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.75；HRMS(ESI):[C42H40NO7P+H]+的m/z计算值:702.2621,测定值:702.2602。
化合物5e.白色固体；收率257mg，97％；熔点98-99℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.10–8.08(d,J＝7.7Hz,1H),7.76–7.74(d,J＝7.5Hz,2H),7.68–7.61(m,6H),7.56–7.36(m,14H),7.31–7.25(m,3H),7.21–7.18(t,J＝7.5Hz,1H),5.48–5.46(d,J＝8.2Hz,1H),5.21–5.06(dd,J＝12.9,47.8Hz,2H),4.84–4.79(m,1H),4.41–4.34(m,2H),4.22–4.18(t,J＝7.0Hz,1H),3.28–3.27(d,J＝5.7Hz,2H),1.63(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝171.6,155.8,149.6,143.9,143.8,141.4,139.1,135.5,132.9,132.6,132.5,132.2,132.1,131.8,130.4,128.7,128.6,127.8,127.2,125.2,124.8,124.3,122.8,120.1,118.9,115.5,114.8,84.0,67.4,66.6,54.3,47.2,28.2；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.32；HRMS(ESI):[C50H45N2O7P+H]+的m/z计算值:817.3043,测定值:817.3031。
化合物5f.白色固体；收率304mg，99％；熔点117-118℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.75–7.73(d,J＝7.5Hz,2H),7.69–7.63(m,4H),7.60–7.55(m,4H),7.53–7.46(m,8H),7.39–7.35(t,J＝7.4Hz,2H),7.29–7.27(d,J＝7.4Hz,2H),6.61(bs,2H),5.88(bs,1H),5.50–5.35(dd,J1＝9.7Hz,J2＝52.8Hz,2H),5.03–5.00(d,J＝11.8Hz,1H),4.36–4.34(m,3H),4.20–4.16(t,J＝7.0Hz,1H),3.25–3.15(m,2H),2.90(s,2H),2.78–2.67(m,2H),2.58(s,3H),2.51(s,3H),2.06(s,3H),1.68–1.57(m,2H),1.42(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.0,158.6,156.6,156.2,143.8,141.3,140.0,138.3,133.3,132.5,132.4,132.2,132.0,131.9,131.8,130.8,128.9,128.8,127.8,127.2,125.2,124.6,121.1,120.0,119.8,117.4,86.4,68.0,67.2,66.2,53.5,47.1,43.3,40.5,29.6,28.6,25.2,19.4,18.1,12.6；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝31.03；HRMS(ESI):[C53H55N4O8PS+H]+的m/z计算值:939.3556,测定值:939.3538。
化合物5g.白色固体；收率204mg，99％；熔点81-82℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.77–7.75(d,J＝7.2Hz,2H),7.70–7.53(m,10H),7.48–7.44(m,6H),7.41–7.37(t,J＝7.2Hz,2H),7.32–7.28(t,J＝7.2Hz,2H),5.36–5.34(d,J＝8.8Hz,1H),5.22(s,2H),4.44–4.32(m,3H),4.24–4.21(t,J＝6.8Hz,1H),2.26–2.17(m,1H),0.97–0.95(d,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.0,156.3,143.9,143.8,141.4,139.4,132.6,132.5,132.2,132.1,128.7,128.6,128.1,128.0,127.8,127.1,125.1,120.1,67.1,66.2,59.1,47.2,31.3,19.1,17.6；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.45；HRMS(ESI):[C39H36NO5P+H]+的m/z计算值:630.2409,测定值:630.2392。
化合物5h.白色固体；收率287mg，99％；熔点121-122℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.76–7.71(t,J＝6.4Hz,2H),7.65–7.51(m,12H),7.46–7.40(m,4H),7.38–7.31(m,4H),7.24–7.20(m,9H),7.15–7.13(m,6H),6.75(s,1H),6.13–6.11(d,J＝8.8Hz,1H),5.21–5.11(q,J＝12.8Hz,2H),4.69–4.65(m,1H),4.43–4.38(m,1H),4.30–4.26(t,J＝8.9Hz,1H),4.20–4.16(t,J＝7.1Hz,1H),3.18–3.13(dd,J1＝4.2Hz,J2＝15.8Hz,1H),2.87–2.82(dd,J1＝4.2Hz,J2＝15.8Hz,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝171.0,169.4,156.4,144.3,144.0,143.8,141.4,139.6,132.6,132.5,132.2,132.0,128.7,128.6,128.2,127.9,127.6,127.5,127.4,127.2,125.3,120.1,71.1,67.4,66.6,51.2,47.2,38.8；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.38；HRMS(ESI):[C57H47N2O6P+H]+的m/z计算值:887.3250,测定值:887.3230。
化合物5i.白色固体；收率195mg，99％；熔点78-79℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.76–7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.70–7.63(m,6H),7.59–7.53(m,4H),7.48–7.37(m,8H),7.31–7.28(t,J＝7.6Hz,2H),5.37–5.35(d,J＝7.6Hz,1H),5.23(s,2H),4.49–4.38(m,3H),4.23–4.19(t,J＝7.2Hz,1H),1.46–1.44(d,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.9,155.8,144.0,143.8,141.4,139.5,132.9,132.6,132.5,132.2,132.1,131.9,128.7,128.6,127.9 127.8,127.2,125.2,120.1,67.2,66.4,53.6,49.8,47.3,31.7,22.8,18.7,14.3；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.28；HRMS(ESI):[C37H32NO5P+H]+的m/z计算值:602.2096,测定值:602.2080。
化合物5j.白色固体；收率189mg，99％；熔点79-80℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.76–7.75(d,J＝7.5Hz,2H),7.70–7.63(m,6H),7.60–7.53(m,4H),7.48–7.42(m,6H),7.41–7.37(t,J＝7.5Hz,2H),7.31–7.27(t,J＝7.4Hz,2H),5.42–5.37(m,1H),5.23(s,2H),4.41–4.39(d,J＝7.1Hz,2H),4.24–4.21(t,J＝7.0Hz,1H),4.06–4.05(d,J＝5.6Hz,2H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝169.9,156.4,143.9,141.4,139.3,132.9,132.6,132.2,132.1,131.8,128.7,128.6,128.1,128.0,127.9,127.2,125.2,120.1,67.4,66.4,47.2,42.9；31PNMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.33；HRMS(ESI):[C36H30NO5P+H]+的m/z计算值:588.1940,测定值:588.1925。
化合物5k.白色固体；收率，99％；熔点99-100℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.77–7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.69–7.64(m,6H),7.56–7.53(t,J＝7.4Hz,4H),7.48–7.44(m,4H),7.41–7.36(m,4H),7.31–7.27(t,J＝7.4Hz,2H),6.95–6.93(d,J＝8.4Hz,2H),6.87–6.85(d,J＝8.4Hz,2H),5.28–5.26(d,J＝7.9Hz,1H),5.22–5.13(q,J＝8.5Hz,2H),4.70–4.68(m,1H),4.44–4.32(m,2H),4.21–4.18(t,J＝6.9Hz,1H),3.09–3.06(m,2H),1.30(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝171.5,155.7,154.7,143.9,143.8,141.4,139.2,132.9,132.6,132.5,132.2,132.1,129.9,128.8,128.6,128.2,128.0,127.9,127.2,125.2,124.3,120.1,78.6,67.1,66.5,55.0,47.3,37.8,28.9；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.29；HRMS(ESI):[C47H44NO6P+H]+的m/z计算值:750.2984,测定值:750.2966。
化合物6a的合成：将Boc-Phe-OBndpp 5a(80mg)溶于5mL 60％TFA/DCM中并在室温下搅拌。1小时后，将溶剂混合物抽空，并将粗品溶解在DCM中。用1M HCl(水溶液)洗涤两次后，将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到粗品6a的盐酸盐。通过将粗品溶解在最小量的乙酸乙酯中，接着用石油醚沉淀来进行GAP纯化。通过过滤分离纯化的产物，为白色固体；收率71mg，99％；熔点68-71℃(分解)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.57–7.40(m,12H),7.10–7.04(m,7H),4.99–4.96(d,J＝10.4Hz,2H),4.41(bs,1H),3.43(bs,1H),3.25(bs,1H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝169.1,138.6,134.3,132.5,132.3,132.2,132.1,132.0,131.5,129.6,128.8,128.7,128.6,128.3,128.2,127.5,67.0,54.6,36.6；31P NMR(162MHz,CDCl3)δ＝29.79；HRMS(ESI):[C28H26NO3P+H]+的m/z计算值:456.1729,测定值:456.1725。
HBndpp 7a的合成：将Boc-Phe-OBndpp 5a(100mg)溶于5mL甲醇和10％Pd/C(20mg)的混合物中。将反应混合物置于H2气氛(气球)下并在室温下搅拌12小时。然后将反应混合物通过硅藻土过滤并抽空甲醇。将粗品固体溶解在DCM中并用饱和Na2CO3(水)溶液洗涤两次。将有机层用MgSO4干燥，过滤并抽空，得到HBndpp 7a，为白色固体；收率，51mg，97％；该化合物先前已通过不同方法合成，并且NMR数据与文献30中发现的相匹配：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.68–7.63(m,4H),7.57–7.52(m,4H),7.48–7.44(m,4H),7.29–7.26(m,2H),2.41(s,3H)。
Fmoc脱保护和偶联的通用过程：将Fmoc-(AA)n-OBnDpp溶于30％哌啶/DCM(100mL/g)中，并在室温下搅拌10分钟。反应混合物用饱和NH4Cl(水溶液)洗涤三次，用MgSO4干燥并过滤。向得到的DCM溶液中加入1.2当量的TBTU、1.2当量的Fmoc-AA-OH和2.4当量的DIPEA；将偶联反应搅拌20分钟。然后将反应混合物用饱和NH4Cl(水溶液)洗涤两次，接着用0.5MNaOH洗涤两次。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并抽空，得到粗品肽。通过将粗品混合物(含有Fmoc-(AA)n+1-OBndpp、NFMP和四甲基脲)溶解在最少量的乙酸乙酯(对于更长的肽加一些DCM)中，接着用石油醚沉淀产物来进行GAP纯化。通过真空过滤以定量收率去除产物肽，为白色固体。
化合物9k，Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(tBu)-Val-Tyr(tBu)-OBndpp。白色固体；收率3.08g，97％(从6k开始经过3步)；熔点124-125℃；用0.1％乙醇胺的IPA溶液作为洗脱剂的分析型NP-HPLC的保留时间：8.85分钟，纯度92.0％；HRMS(ESI):[C90H114N9O17PS+H]+的m/z计算值:1657.7903,测定值:1657.7871。
侧链保护基的脱保护：将Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(tBu)-Val-Tyr(tBu)-OBnDpp 9k溶解在100mL 30％哌啶/DCM中并在室温下搅拌10分钟。然后将反应混合物用饱和NH4Cl(水溶液)洗涤两次，用MgSO4干燥，过滤并抽空。然后将粗品溶于TFA/DCM/H2O(6/3/1)中并在室温下搅拌1小时。将反应混合物抽空至饱和，然后用乙醚沉淀产物肽。过滤后得到肽10k，为白色固体，直接用于下一步。
BnDpp的脱保护：在氢化瓶中向100mg干燥的Pd/C中加入H-RKDVY-OBnDpp 10k在150mL甲醇中的溶液。将瓶子置于70PSI H2气氛下并在室温下振荡24小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，并抽空至干。将粗品溶于10％乙酸(水溶液)和氯仿的混合物中，然后用氯仿洗涤水层两次。抽空水层，得到胸腺五肽，为白色固体；收率，1.09g，87％；用50％MeCN在0.06％TFA/H2O中的溶液作为洗脱剂的分析型RP-HPLC的保留时间：1.24分钟，纯度98.9％；HRMS(ESI)：[C30H49N9O9+H]+的m/z计算值：680.3731，测定值：680.3730。令我们高兴的是，产物肽的HPLC分析显示该化合物纯度接近99％，无需任何柱色谱、重结晶或聚合物载体。通过在萃取后抽空氯仿层，可以简单地回收GAP基团。使该原料经受图2中的合成方法可以再生BndppOH。
另外的GAP基团和连接方法
图6描绘了可以在本发明的实施方案中使用的代表性保护基团。图7-8描绘了可用于开发BndppOH的替代方法(图2中所示方法的替代方案)和开发例如图6中所示的其它代表性保护基团的替代方法。
图4A-4B各自描绘了将图2的保护基团连接到各种氨基酸的过程的示意图。用于连接保护基团的其它过程示于图9A-9B和10A-10B中。图9A描绘了将保护基团“BnDppYH”连接到各种氨基酸上的过程的示意图。图9B描绘了在图9A所示过程的示意图中使用的保护基团“BnDppYH”。图10A描绘了将保护基团“BzDppOH”连接到各种氨基酸的过程的示意图。图10B描绘了在图10A所示过程的示意图中使用的保护基团“BzDppOH”。
这些另外的保护基团可以以与“BnDppOH”相同的方式用于肽合成，与本发明的实施方案一致。这些另外的保护基团的肽偶联反应可以在乙酸乙酯和二氯甲烷中进行。
本领域技术人员将认识到，本公开内容的方法和系统可以以许多方式实施，并且因此不受前述示例性实施方案和实例的限制。换句话说，在硬件和软件或固件的各种组合中的单个或多个组件执行的功能元件以及各个功能可以在客户端级别或服务器级别或两者分布在各种软件应用之间。在这方面，本文描述的不同实施方案的任何数量的特征可以组合成单个或多个实施方案，并且具有少于或多于本文描述的所有特征的替代实施方案是可能的。
功能也可以全部或部分地以现在已知或变得已知的方式分布在多个组件之间。因此，在实现本文描述的功能、特征和优选方面，无数种组合是可能的。此外，本公开内容的范围涵盖用于实现所述特征的常规已知方式以及可对本文所述的方法、组合物或化合物进行的如本领域技术人员现在以及以后将理解的那些变化和修改。
此外，通过示例的方式提供了在本公开内容中以图表、示意图或流程图(诸如附图)形式呈现和描述的方法的实施方案，以便提供对该技术的更完整的理解。所公开的方法不限于本文给出的操作和逻辑流程。考虑了替代实施方案，其中改变了各种操作的顺序，并且其中被描述为作为较大操作的一部分的子操作是独立执行的。
虽然已经出于本公开内容的目的描述了各种实施方案，但是不应认为这些实施方案将本公开内容的教导限制于那些实施方案。可以对上述元件和操作进行各种改变和修饰，以获得保持在本公开内容中描述的系统和过程的范围内的结果。
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Claims (18)
1.一种用于基团辅助纯化(GAP)肽合成的保护基团，其选自：
(1A)
(1B)
(1C)
(1D)和
(1E)
其中：
R选自H、Me和OMe；
Y选自O、S和NH；并且
X选自O、S和NH。
2.一种形成用于C末端保护的保护基团的方法，其包括基于Fmoc-tBu的溶液相肽合成(SolPPS)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中保护基团：
(1A)
是通过以下制备的：
4.根据权利要求2所述的方法，其中保护基团：
(1B)
是通过以下制备的：
其中R选自H、Me和OMe；并且
其中Y选自S和NH。
5.根据权利要求2所述的方法，其中保护基团：
(1C)
是通过以下制备的：
其中R选自H、Me和OMe；并且
其中X选自O、S和NH；并且
其中Y选自O、S和NH。
6.根据权利要求2所述的方法，其中保护基团：
(1D)
是通过以下制备的：
其中R选自H、Me和OMe。
7.根据权利要求2所述的方法，其中保护基团：
(1E)
是通过以下制备的：
其中R选自H、Me和OMe；并且
其中X选自O、S和NH。
8.一种将权利要求1的保护基团连接到氨基酸的方法，其中所述方法包括：
使权利要求1的保护基团与以下氨基酸化合物反应：
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
其中BnDppOH为权利要求1的保护基团；并且
其中Pg选自Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm和tBu；并且
其中Z是一般变量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述保护基团是以下化合物：
(1A)
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
其中BnDppYH为权利要求1的保护基团；并且
其中Pg选自Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm和tBu；并且
其中Z是一般变量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述保护基团选自：
(1B)和(1C)
其中R选自H、Me和OMe；并且
其中X选自O、S和NH。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
其中BnDppYH是权利要求1的保护基团；并且
其中Pg选自Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm和tBu；并且
其中Z是一般变量。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
其中BzDppOH是权利要求1的保护基团；并且
其中Pg选自Cbz、Fmoc、Boc、Bn、Fm和tBu；并且
其中Z是一般变量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述保护基团选自包括以下的群组：
(1D)和(1E)
其中R选自H、Me和OMe；并且
其中X选自O、S和NH。
16.一种进行基团辅助纯化(GAP)肽合成的方法，其中所述方法包括以下步骤：将权利要求1的保护基团连接到氨基酸，接着对得到的具有连接的保护基团的氨基酸进行基于Fmoc-tBu的溶液相肽合成(SolPPS)偶联反应。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应在乙酸乙酯中发生。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应在二氯甲烷中发生。
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