JP6842471B2 - 液相ｇａｐペプチド合成のための系及び方法 - Google Patents

液相ｇａｐペプチド合成のための系及び方法 Download PDF

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Description

本出願は、著作権保護の対象となる資料を含む。本著作権者は、何人かによる特許開示のファクシミリ複製に対しては、それが特許商標庁のファイル又は記録に表れる場合は意義を唱えるものではないが、それ以外の場合には、全ての著作権を留保する。
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年１２月２１日出願の「System And Method For Solution Phase GAP Peptide Synthesis」と題する米国特許出願第６２／２７０，４３２号の優先権を主張する。前述の特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は一般に、ペプチド合成の分野に関する。特に、この系は、クロマトグラフィー、再結晶化、又はポリマー支持体のない液相ペプチド合成を提供し、高い全体収率及び純度を可能とする。開示される系及び方法は、多種多様なシナリオをサポートし、様々な生成物及びサービスを含む。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
なし。
最近の研究努力は、カラムクロマトグラフィー及び再結晶化を回避することに特に重点を置いて、精製化学の分野において著しい進歩をもたらした。この研究は、十分に官能基化した基を出発材料又は新たに生成された生成物に意図的に導入することにより、クロマトグラフィー及び／又は再結晶化などの従来の精製方法を回避する有機合成のための化学としての基支援精製（ＧＡＰ、Group-Assisted Purification）化学／技術として定義されてきた。こうした研究は、合成有機化学の全分野を網羅する可能性を秘めている。
保護基が広範囲に使用される一分野が、固相法及び液相法の両方に係るペプチド合成である。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ、Solid-Phase Peptide Synthesis）は、１９６０年代にMerrifieldによって開発され、研究及び製造のために多数の科学的専門分野で使用される標準的なプロトコルとなっている（図１Ａ参照）。ポリマー支持体の長所は、各カップリング／脱保護ステップ後に成長するペプチドの精製を容易にするその能力にあり、それがカラムクロマトグラフィーの使用を回避させる。ＳＰＰＳの主な欠点は、規模拡大が難しいことである。多くのポリマー支持体は高価であり、使用する材料の質量の大部分を占める。保護基は、多数の官能基が存在するほぼ全ての複雑な合成において見いだされる。効果的な保護基は、多種多様な条件に対して堅牢であることが必要であり、高収率で付加及び除去されなければならない。ＧＡＰ化学にとって理想的な例は、半永久的保護基がＧＡＰに求められる必要な溶解度特性を導入したものである。しかし、ほとんどの従来の保護基は無極性であり、従って、ほとんどの基質の場合に求められるＧＡＰ溶解度を生じさせない。適切な溶解度制御を生じさせる保護基を開発できれば、ＧＡＰ化学は潜在的に、保護基の使用が求められる全ての合成に拡張される可能性がある。
幾つかのアプローチが既に利用されている。公開された特許出願国際公開第２０１４０９３７２３Ａ２号パンフレットは、ＧＡＰを備えるキラル補助剤でイミンを保護し、次いで、それらのキラルＮ−ホスホニルイミンを求電子試薬として不斉ホウ素付加反応に使用することを教示する。精製は、ＧＡＰ法により行われている。この研究は、新規なペプチド標的に潜在的に組み込まれる可能性がある新規なアミノ酸誘導体を合成するために潜在的に使用される可能性のある、キラルα−ボロン酸アミンへの容易なアクセスを提供するという点で価値がある。
米国特許第８，３８３，７７０Ｂ２号明細書は、ＳＰＰＳにおけるＦｍｏｃ及びＢｏｃＮ−末端保護基の使用を教示する。この技術は業界で周知であり、広く適用されている。Ｂｏｃ基及びＦｍｏｃ基は、ペプチド化学のあらゆる分野で数十年間使用されており、好適なＦｍｏｃ基は、ほとんど全てが固相に限定されている。溶液中で経済的に実現可能なＦｍｏｃ保護スキームの例は存在せず、文献にもほとんど例がない。
米国特許第５，５１６，８９１Ａ号明細書は、ＦｍｏｃベースのＳｏｌＰＰＳの数少ない例の１つを提供する。ここでも、脱保護中に副生物として、ポリマー支持体なしに除去することが困難であるＮ−フルオレニルメチルピペリジン（ＮＦＭＰ、N-fluorenylmethylpiperidine）が形成されるため、Ｆｍｏｃペプチド合成は、ほとんど全てがＳＰＰＳに限定されている。Ｆｍｏｃ脱保護のための標準的なプロトコルは、ＤＭＦ又はＤＣＭ溶液中のＦｍｏｃペプチドを過剰量のピペリジンと共に撹拌し、プロセス中にＦｍｏｃ基を脱保護してＮＦＭＰを形成することである。’８９１号特許明細書は、ピペリジンの代わりに４−アミノメチルピペリジン（４ＡＭＰ、4-aminomethylpiperidine）で脱保護することによるこの不純物の除去を教示する。これは、ＮＦＭＰの代わりに、余分なアミノ基が存在するために水中に抽出することができるＮＦＭＰ−ＣＨ２ＮＨ２を形成する。この方法の問題点は、４ＡＭＰを使用するコストが高いことである。Sigma Aldrich社によると、４ＡＭＰは１グラム当たり＄３．８０かかるが、ピペリジンは１グラム当たり＄０．１２しかかからない。これが、この方法が非常に費用がかかる理由であり、業界で受け入れられなかった理由である。
従って、本技術分野において、固相ペプチド合成の精製の利点を維持しながらこれらの限界を克服することができる、経済的に実現可能なＧＡＰペプチド合成系を開発する必要性が存在する。
国際公開第２０１４０９３７２３Ａ２号パンフレット 米国特許第８，３８３，７７０Ｂ２号明細書 米国特許第５，５１６，８９１Ａ号明細書
本開示は、ポリマー支持体の大量廃棄を伴わずに液相において起こるが、ＳＰＰＳの精製の利点の全てを維持して両方法の長所を与える反応を従来の液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ、solution-phase peptide synthesis）及びＳＰＰＳの両方の代替法として利用した、ペプチド合成のための系及び方法を提供することにより、本技術分野における欠点に取り組む。ＧＡＰ化学の長所を利用することにより、経済的に実現可能であり、ペプチドの商業生産にとって有用なＦｍｏｃ−ＳｏｌＰＰＳ戦略が提示される。
従って、本開示の目的は、Ｃ末端保護のための新規なＧＡＰベンジル型保護基の開発により、ＧＡＰペプチド合成（ＧＡＰ−ＰＳ、GAP peptide synthesis）を可能にすることである（図１Ｂ参照）。Ｃ末端保護に関連して、ＧＡＰ−ＰＳは、その温和な脱保護プロトコルのためにＳＰＰＳにおいて最も使用される方法であるＦｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を用いて達成し得る。この戦略は、ポリマー支持体なしに除去することが困難である脱保護中の副生物としてのＮ−フルオレニルメチルピペリジン（ＮＦＭＰ）の形成のために、現在ほとんど全てがＳＰＰＳに限定されている。従って、本開示の目的は、ペプチド合成の一般的方法の一例としての液相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を利用することにより、１グラムを超える標的ペプチド、例えばチモペンチンを高収率かつ高純度で提供することである。この新規な保護基を用いた様々なアミノ酸の保護も、一定の定量的収率で達成されている。
一態様において、ペプチド合成のための方法が提供される。方法は、液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ）を用いたＦｍｏｃ／ｔＢｕｔ戦略を使用して、高純度（９９％）での高収率（５０％超）を可能とする。本発明は、ＳｏｌＰＰＳと共に基支援精製（ＧＡＰ）を利用し、再結晶化又はクロマトグラフィーの代わりに沈殿によってペプチドを精製できるようにする。開示される方法はさらに、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を回避することで、実際に形成される生成物の量を増加させる。
本発明の別の目的は、Ｃ末端に化学的に結合する新規なＣ末端保護基（本明細書においては「ＢｎＤｐｐＯＨ」、「ＢｎＤｐｐＹＨ」、「ＢｚＤｐｐＯＨ」と呼ぶ）を提供することである。このＧＡＰ基の使用も、特異である。以前のＧＡＰ基がアミノ保護基として作用するのに対し、本発明は、カルボン酸のための保護基を開示する。カルボン酸を保護することにより、以前のＧＡＰ−ＰＳ法との決定的な違いである、ペプチド合成をＮからＣへの方向ではなく業界的に好適なＣからＮへの方向とすることが可能であり、さらに、ペプチド鎖を成長させるための一時的な保護基としてＦｍｏｃを使用することが可能となる。Ｆｍｏｃ脱保護中、固体支持体なしで除去することが困難なＮＦＭＰが形成される。本発明は、ＧＡＰペプチドを選択的に沈殿させることで溶液中にＮＦＭＰを残す除去方法を提供する。
本開示の前述の目的及び他の目的、特徴、並びに長所は、添付図面に図示される下記の実施形態の説明から明らかとなる。参照符号は、様々な図面を通じて同じ部分を指している。図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、本開示の原理を例示することに重点を置いている。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の先行技術の方法を図示する。 Ｃ末端保護のためのベンジル型保護基の使用を含む、本開示の方法を図示する。 図１Ｂで利用される保護基の開発のための方法を図示する。 図２の保護基の直交性及びＧＡＰ能力を試験するための概略を図示する。 図２の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略をそれぞれ図示する。 本発明のペプチド合成の典型的非限定的例の例示を目的とする、図２の保護基を使用したチモペンチンの合成の概略を図示する。 本発明の実施形態において使用可能な他の保護基を図示する。 本発明の実施形態において利用される、図６の保護基の生成、合成及び製造のための代替的な方法を図示する。 本発明の実施形態において利用される、図６の保護基の生成、合成及び製造のための別の代替的な方法を図示する。 「ＢｎＤｐｐＹＨ」の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略を図示する。 図９Ａに示す方法の概略において利用される保護基「ＢｎＤｐｐＹＨ」を図示する。 「ＢｎＤｐｐＺＨ」の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略を図示する。 図１０Ａに示す方法の概略において利用される保護基「ＢｚＤｐｐＯＨ」を図示する。
本開示の様々な実施形態の実施及び使用を以下に詳細に論ずるが、当然ながら、本開示は、多種多様な特定の状況、商品、又はサービスにおいて具体化できる多くの適用可能な本発明の概念を提供する。本明細書において論ずる特定の実施形態は、本開示を実施し使用する特定の方法の例示に過ぎず、本開示の範囲を定めるものではない。
本明細書において言及する出版物及び特許出願は全て、本開示が関連する当業者の技術水準を示すものである。出版物及び特許出願は全て、個々の出版物又は特許出願のそれぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
以下に本開示を、その一部を形成し、特定の例示的実施形態を実例として示す添付図面を参照してより詳細に説明する。しかし、主題は様々な異なる形態で具体化されてもよく、従って、包含され請求される主題は、本明細書に記載されるいかなる例示的実施形態にも限定されないと解釈されることを意図している。例示的実施形態は、単に説明のためだけに提供される。同様に、請求又は包含された主題に対する合理的に広い範囲が意図されている。とりわけ、例えば、主題は、方法、組成物、又は系として具体化してもよい。従って、実施形態は、例えば、方法、組成物、化合物、材料、又はそれらの任意の組合せの形態を取ることができる。従って、下記の詳細な説明は、限定的な意味で捉えられることを意図するものではない。
明細書及び請求の範囲を通じて、用語は、明示的に述べられた意味を超えて、文脈において示唆又は暗示された微妙な意味を有することがある。同様に、「一実施形態において」という語句は、本明細書において使用された場合、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らず、「別の実施形態において」という語句は、本明細書において使用された場合、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らない。例えば、請求される主題が、全体又は一部において例示的実施形態の組合せを含むことが意図される。
一般に、用語は、少なくとも部分的には文脈における用法から理解され得る。例えば、「及び」、「又は」、又は「及び／又は」などの用語は、本明細書において使用された場合、そうした用語が使用される文脈に少なくとも部分的に依存し得る様々な意味を含み得る。典型的には、例えばＡ、Ｂ又はＣのように、リストを関連づけるために使用した場合、「又は」は、排他的な意味で使用されるＡ、Ｂ、又はＣ、に加えて、包含的な意味で使用されるＡ、Ｂ、及びＣ、を意味することも意図している。加えて、「１又は２以上」という用語は、本明細書において使用した場合、文脈に少なくとも部分的に依存して、任意の特徴、構造、又は特性を単数形の意味で説明するために使用されてもよく、特徴、構造、又は特性の組合せを複数形の意味で説明するために使用されてもよい。同様に、「１つの（a）」、「１つの（an）」、又は「その（the）」などの用語は、ここでも、文脈に少なくとも部分的に依存して、単数形の用法を伝えるもの、又は複数形の用法を伝えるものと理解することができる。加えて、「に基づく」という用語は、要因の排他的な集合を伝えることを必ずしも意図するものではなく、ここでも、文脈に少なくとも部分的に依存して、必ずしも明示的に記載されていない追加の要因の存在を許容するものであってもよいと理解され得る。
従って、本開示の実施形態は、新規なＣ末端保護基のための系及び方法を提供することである。新規な保護基の設計において、保護基のＧＡＰ官能基化セグメントが多種多様な条件に対して安定であることが必要なのは明らかであった。ＧＡＰ化学に対して必要な溶解度特性を提供しなければならないことに配慮がなされた。また、保護基は、現在の保護戦略の反応性に対して効率的かつ直交的に作用しなければならない。そのため、ＧＡＰ基を導入しつつ望ましい反応性を維持するために、修飾されたベンジル保護基を利用した。選択したＧＡＰ基は、ＧＡＰ化学を使用したホスフィンオキシド基で以前に成功していることが公知であることから、ジフェニルホスフィンオキシドである。また、この基のベンジル基のパラ位への結合は、広範な種々の条件に対して安定していることが文献で広く知られているトリフェニルホスフィンオキシド部分を創出する。この安定性は、基質が曝露され得る複数の脱保護条件との干渉を回避するために必要であり、それによって真の直交性が確立される。
初期の努力は、キラルアミンの合成のためのキラルなＮ−ホスホニル及びＮ−ホスフィニルイミン化学の開発に焦点を当て、多くの成功を収めた。溶解度を制御することにより、キラルアミン生成物を粗混合物から選択的に沈殿させることができ、それによりクロマトグラフィー及び再結晶化を回避することができる。さらなる努力は、この技術を他の基質及び官能基へと拡張した。これを行うため、ＧＡＰ特性がキラル補助剤から得られ、修正を伴って本開示のＧＡＰ保護基のための基礎を提示する。
本開示の例示的実施形態において、この新規な保護基の合成は、市販のジフェニル（ｐ−トリル）ホスフィン１（図２）から開始される。過マンガン酸カリウムで１を酸化すると、ホスフィン酸化によって安息香酸２及びＧＡＰ基が得られる。このＧＡＰ基がジフェニルホスフィンオキシド（Ｄｐｐ、diphenylphosphine oxide）である。エステル化とそれに続くホウ化水素還元が、ＧＡＰを備えるベンジルアルコール４、又は「ＢｎｄｐｐＯＨ」（或いは「ＨＯＢｎｄｐｐ」）を高収率で与える。次に、この新規な保護基の直交性とＧＡＰ能力を試験する。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨの保護は、カルボジイミドカップリング試薬としてＥＤＣＩを使用して容易かつ定量的であった（図３）。生成物５ａを酢酸エチル／石油エーテル溶媒混合物から白色固体として選択的に沈殿させ、それによってＧＡＰ化学の要件を満たすことができる。Ｂｏｃ基の脱保護も定量的であり、Ｂｎｄｐｐ基の喪失をもたらさなかった。Ｂｎｄｐｐ基は、接触水素化を使用して容易に除去することができ、脱保護アミノ酸を洗い流した後、再利用のために「ＨＢｎｄｐｐ」７ａとして回収し再循環することもできる。７ａを過マンガン酸塩酸化に付することが２を与え、これは、前述したようにＨＯＢｎｄｐｐ４に変換することができる（図２）。
図４Ａ〜４Ｂは、図２の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略を図示する。種々の側鎖保護基を有する様々なＢｏｃ及びＦｍｏｃアミノ酸の保護の定量的収率が一定であるアミノ酸の保護のための完全な基質の範囲を、以下の表１に示す。注目すべきは、トリプトファン、アルギニン、バリン、及びシステインの定量的保護である。
一実施形態において、ＧＡＰ化学／技術によるＦｍｏｃ／ｔＢｕ液相ペプチド合成のための方法が、カルボン酸のための新規なベンジル型ＧＡＰ保護基の開発と共に提示される。この新規なＧＡＰ保護基は、ポリマー支持体の代わりに利用され、クロマトグラフィー又は再結晶化なしでＣからＮへのＦｍｏｃペプチド合成を促進する。ＧＡＰ保護基は、存在する他の保護基との直交関係を維持しながら高収率で付加及び除去することができる。ＧＡＰペプチド合成のためのこの新規な保護基の第１の試験として、１グラムを超えるペンタペプチド薬物チモペンチン（免疫賦活剤）が高全体収率（８３％）及び高純度（９９％）で合成された。
本発明の一実施形態において、下記の化合物を含む、基支援精製（ＧＡＰ）ペプチド合成のための以下の保護基が提示される：
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅであり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨである）。
別の実施形態において、本発明は、Ｆｍｏｃ−ｔＢｕベースの液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ）を含む、Ｃ末端保護のための保護基を形成する方法を提供する。方法は、保護基：
であって、下記：
（式中、前記保護基は、（ｐ−トリル）ジフェニルホスフィンを過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）と共に還流し、カルボン酸生成物を単離し、カルボン酸生成物を酸性エタノール（ＥｔＯＨ、Ｈ＋）中で還流し、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加することによって形成される）
によって生成される保護基を含む。
別の実施形態において、本発明は、保護基：
であって、下記：
（式中、保護基は、ジブロミドをブチルリチウム（ｎＢｕＬｉ）、ジフェニルクロロホスフィン（Ｐｈ２ＰＣｌ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び過酸化水素（Ｈ＋、Ｈ２Ｏ２）と単一反応で反応させてカルボン酸生成物を生成し、カルボン酸生成物を単離し、カルボン酸生成物を酸性エタノール（ＥｔＯＨ、Ｈ＋）中で還流し、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加してアルコール生成物を形成し、アルコール生成物をメシン酸無水物Ｍｓ２Ｏ又はＹＨ２で処理することによって生成する；式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅであり、Ｙは、Ｓ、又はＮＨである）
によって生成される保護基を生成する方法を提示する。
別の実施形態において、保護基：
が、下記：
（式中、エチルエステル誘導体をジフェニルクロロホスフィン（Ｐｈ２ＰＣｌ）と反応させ、続いて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と反応させて酸化する。結果として得られたホスフィンオキシドを水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）で処理してアルコールを生成し、それをメシン酸無水物（Ｍｓ２Ｏ）及びＹＨ２で処理して（１Ｃ）を形成する；式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨであり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨである）
によって生成される。
別の実施形態において、保護基：
が、下記：
（式中、ジブロミドをブチルリチウム（ｎＢｕＬｉ）、ジフェニルクロロホスフィン（Ｐｈ２ＰＣｌ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び過酸化水素（Ｈ＋、Ｈ２Ｏ２）とワンポット式に反応させてカルボン酸生成物（１Ｄ）を生成する；式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅである）
によって生成される。
本発明の別の実施形態において、保護基：
が、下記：
（式中、エチルエステル誘導体をジフェニルクロロホスフィン（Ｐｈ２ＰＣｌ）と反応させ、続いて酸化のために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と反応させる。結果として得られたホスフィンオキシドを水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）と水（Ｈ２Ｏ）で処理し、カルボン酸生成物（１Ｅ）を形成する；式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨである）
によって生成される。
別の実施形態において、本発明は、保護基１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、又は１Ｅをアミノ酸に結合させる方法であって、請求項１に記載の保護基を以下のアミノ酸化合物と反応させることを含む方法を提供する。
こうした方法は、以下のステップ：
（式中、ＢｎＤｐｐＯＨは保護基（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、又は１Ｅ）であり；式中、Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、又はｔＢｕを含んでもよいがこれらに限定されず；式中、Ｚは、一般変数である）
を含んでもよい。
別の実施形態において、本発明の方法は、以下の保護基を含む。
方法は、以下のステップ：
（式中、ＢｎＤｐｐＹＨは保護基（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、又は１Ｅ）であり；式中、Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、又はｔＢｕを含んでもよいがこれらに限定されず；式中、Ｚは、一般変数である）
をさらに含んでもよい。
本発明の別の実施形態において、方法は、以下の保護基：
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅであり；式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨである）
を含む。
別の実施形態において、方法は、以下のステップ：
（式中、ＢｎＤｐｐＹＨは、保護基１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、又は１Ｅであり；Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、又はｔＢｕを含んでもよいがこれらに限定されず；式中、Ｚは、一般変数である）
を含む。
別の実施形態において、本発明の方法は、以下のステップ：
（式中、ＢｚＤｐｐＯＨは、保護基１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、又は１Ｅであり；Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、又はｔＢｕを含んでもよいがこれらに限定されず；Ｚは、一般変数である）
を含む。
別の実施形態において、方法は、以下の保護基を含む：
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、又はＯＭｅからなる群から選択され；式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＨからなる群から選択される）。
本発明の別の実施形態において、基支援精製（ＧＡＰ）ペプチド合成を実施する方法が提供され、方法は、本明細書に記載のいずれかの方法を使用して保護基１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、又は１Ｅをアミノ酸に結合するステップ、及び、次いで、結果として得られる生成物に本明細書に記載の方法でＦｍｏｃ−ｔＢｕベースの液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ）カップリング反応を行うステップを含む。こうしたＧＡＰ−ＰＳの方法は、酢酸エチル、或いは、ジクロロメタンの中で反応が起こることをさらに含んでもよい。
本明細書において論じた原理は、多くの異なる形態で具体化してもよい。本開示の好適な実施形態を記載するが、完全性のためには少なくとも図面を参照すべきである。
新規な保護基の最初の適用のため、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ ＳｏｌＰＰＳ戦略を扱う際の能力が試験される。この非限定的例のための所望の標的ペプチドは、免疫調節ポリペプチド、チモポイエチンの薬理学的に興味深い、生物学的に活性のあるペンタペプチドサブユニットであるチモペンチンである。短ペプチドの場合、チモペンチンは、様々な官能基（１つの芳香族、２つの塩基性（グアニジンを持つものが１つ）、２つの酸性、及び１つのβ分岐）を持つアミノ酸を含有する。これが、チモペンチンを、ＧＡＰ保護基の例示的な使用及び幾つかの側鎖保護基の除去に耐えるその能力のための理想的な候補とする。チモペンチンの合成を図５に示す。化合物５ｋをまず、ＤＣＭ中の３０％ピペリジンで１０分間処理してＦｍｏｃ基を除去し、続いて塩化アンモニウムで洗浄して過剰なピペリジンを除去する。ＤＣＭ層（乾燥後）には、次のＦｍｏｃアミノ酸（記載した側鎖保護）が、ＴＢＴＵカップリング試薬及びＤＩＰＥＡと共に、直接充填される。２０分間カップリングした後、反応混合物を塩化アンモニウムと０．５Ｍ水酸化物ナトリウムで（それぞれ）洗浄し、乾燥させ、真空排気した。カップリング後の粗生成物は、数種の不純物を含有し、中でも注目すべきは、ＮＦＭＰ及びテトラメチル尿素（カップリングに由来）である。ＧＡＰ精製手順は、混合物を最小量の酢酸エチルに溶解させ、続いて石油エーテルでＧＡＰペプチドを選択的に沈殿させるだけでこれらの不純物を容易に除去することができる。テトラペプチド及びペンタペプチド断片については、沈殿前に少量のＤＣＭを酢酸エチルに添加して溶解性を補助する。最後のカップリングステップ及び９ｋの合成に続き、最後のＦｍｏｃ基を前述同様除去するが、操作後、ＤＣＭ層を濃縮し、側鎖脱保護のためにペプチドをＴＦＡ／ＤＣＭ／Ｈ２Ｏ（６／３／１）溶液に溶解させる。ペンタペプチド１０ｋ（この時点でＢｎｄｐｐを唯一の保護基として持つ）を、ジエチルエーテルを使用して沈殿させる。次いで、このペプチドを水素化に付し、ＧＡＰ基を除去する。生成物を、クロロホルムから１０％酢酸（水溶液）で抽出することにより単離する。生成物を、クロロホルムから１０％酢酸（水溶液）で抽出することにより単離する。予期外であるが、生成物ペプチドのＨＰＬＣ分析は、カラムクロマトグラフィー、再結晶化、又はポリマー支持体なしで化合物がほぼ９９％純粋であることを明らかにする。ＧＡＰ基は、抽出後にクロロホルム層を真空排気するだけで回収することができる。この原料に図２の合成方法を施すと、ＢｎｄｐｐＯＨを再生することができる。
一般的方法：溶媒は全てＡＣＳグレードであり、さらなる精製を加えずに使用した。ＨＲＭＳ分析は、Orbitrap質量分析器を使用して実施した。ＨＰＬＣ分析は、ＵＶ検出器を備えたPerkin Elmer社製Flexarアイソクラティックポンプを使用して行った。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃ保護アミノ酸は、BachemBio社から購入し、カップリングに直接使用した。
安息香酸２の合成：１０．０ｇの１を５００ｍＬ丸底フラスコに入れ、続いて１３０ｍＬの０．４３ＭのＮａＯＨ（水）溶液、次いで２２．２ｇのＫＭｎＯ４を入れた。反応物を還流下で１２時間撹拌し、その後反応混合物を高温のうちにセライトを通してろ過した。結果として得られた溶液をジエチルエーテルで２回洗浄し、続いて５０％Ｈ２ＳＯ４を添加して生成物を沈殿させた。ろ過後、安息香酸２を白色固体として回収した；収量１０．８ｇ、９３％；この生成物を直接次の反応に付した。
エステル３の合成：１０．８ｇの２を、３００ｍＬのエタノールと３ｍＬ塩化チオニルと共に５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。反応物を１２時間還流し撹拌した。完了後、反応物を室温に冷却し、揮発性物質を真空排気し、エステル３を白色固体として得た；収量１１．８ｇ、９９％；この生成物を直接次の反応に付した。
ＢｎｄｐｐＯＨ４の合成：１１．８ｇのエステル３を、３００ｍＬのエタノールと共に５００ｍＬ丸底フラスコに入れた。反応物を０℃に冷却し、その後、３．８２ｇのＮａＢＨ４を少しずつ添加した。反応物を室温にし、１２時間撹拌した。溶媒を真空排気し、続いて、ＤＣＭに粗生成物を溶解し、２ＭのＨＣｌ（水溶液）で３回洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空排気してＢｎｄｐｐＯＨ４を白色固体として得た；収量９．９６ｇ、９６％；この化合物は以前に異なる方法で合成されており、ＮＭＲデータは、文献に見られるものと一致する３０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．６２〜７．５７（ｍ，４Ｈ）、７．５４〜７．４７（ｍ，４Ｈ）、７．４５〜７．４０（ｍ，４Ｈ）、７．３８〜７．３６（ｍ，２Ｈ）、４．７０（ｓ，２Ｈ）。
Ｂｎｄｐｐ保護のための一般手順：１００ｍｇのＢｎｄｐｐＯＨ、２．０当量のＰＧ−ＡＡ−ＯＨ、及び１０ｍＬのＤＣＭを、２０ｍＬスクリューキャップバイアル中０℃で撹拌した。１２４ｍｇ（２．０当量）のＥＤＣＩ（ＨＣｌ）を添加し、反応物を１０分間撹拌し、その時点で４ｍｇ（１０モル％）のＤＭＡＰを添加し、反応物を室温にして２時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で２回、続いて飽和Ｎａ２ＣＯ３（水溶液）で２回洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空排気して粗保護アミノ酸を得た。粗混合物を最小量の酢酸エチルに溶解させ、続いて石油エーテルで沈殿させ、結果として得られた白色沈殿物をろ過することにより、ＧＡＰ精製を実施した。この同じ手順を、６００ｍｇのＢｎｄｐｐＯＨと上記と同じ当量の他の試薬を使用してより大規模に反応を行った５ｋを除く全ての基質に使用した。
化合物凡例
化合物５ａ。白色固体；収量１８０ｍｇ、９９％；融点６２〜６３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．６９〜７．６３（ｍ，６Ｈ）、７．５８〜７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．４９〜７．４５（ｍ，４Ｈ）、７．３５〜７．３２（ｍ，２Ｈ）、７．２４〜７．１８（ｍ，３Ｈ）、７．０７〜７．０５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、５．２０〜５．１２（ｍ，２Ｈ）、４．９６〜４．９５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６８〜４．５８（ｍ，１Ｈ）、３．０９〜３．０７（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）、１．４０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．９、１５５．２、１３９．３、１３５．９、１３３．０、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．１、１３２．０、１２９．４、１２８．８、１２８．６、１２８．２、１２８．１、１２７．２、８０．２、６６．３、５４．６、３８．５、２８．４；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．２８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ３３Ｈ３４ＮＯ５Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：５５６．２２５３、実測値：５５６．２２３５。
化合物５ｂ。白色固体；収量１８９ｍｇ、９９％；融点７６〜７７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．６９〜７．６４（ｍ，６Ｈ）、７．５８〜７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．４９〜７．４４（ｍ，６Ｈ）、６．６５（ｂｓ，１Ｈ）、５．５２〜５．５０（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）、５．２７〜５．１９（ｍ，２Ｈ）、４．５４（ｂｓ，１Ｈ）、４．３８〜４．３２（ｍ，２Ｈ）、３．０９〜２．９１（ｍ，２Ｈ）、２．０６〜２．００（ｍ，１Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７０．９、１７０．４、１３９．３、１３３．５、１３２．８、１３２．６、１３２．５、１３２．４、１３２．２、１３２．１、１３１．８、１２８．７、１２８．２、８０．７、６６．７、５４．２、４２．２、３４．５、２８．４、２３．３、２２．５、１４．２；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．４６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ３０Ｈ３５Ｎ２Ｏ６ＰＳ＋Ｈ］＋の計算値：５８３．２０３２、実測値：５８３．２０１２。
化合物５ｃ。白色固体；収量２４６ｍｇ、９９％；融点８６〜８７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７６〜７．７４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．６９〜７．６３（ｍ，６Ｈ）、７．６０〜７．５２（ｍ，４Ｈ）、７．４７〜７．４２（ｍ，６Ｈ）、７．４０〜７．３６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３１〜７．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、５．４８〜５．４６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．２２（ｓ，２Ｈ）、４．６５〜４．５７（ｂｓ，１Ｈ）、４．４３〜４．３４（ｍ，３Ｈ）、４．２２〜４．１９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．１０〜３．０２（ｍ，２Ｈ）、１．８８〜１．８４（ｍ，１Ｈ）、１．７２〜１．６８（ｍ，１Ｈ）、１．４２（ｓ，９Ｈ）、１．３８〜１．２４（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７２．４、１５６．２、１４３．９、１４１．４、１３９．５、１３２．９、１３２．６、１３２．２、１３１．８、１２８．７、１２８．０、１２７．８、１２７．２、１２５．２、１２０．１、７９．３、６７．２、６６．４、５４．０、４７．３、４０．０、３２．１、２９．８、２８．５、２２．５；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．３７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ４５Ｈ４７Ｎ２Ｏ７Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：７５９．３１９９、実測値：７５９．３１８３。
化合物５ｄ。白色固体；収量２２７ｍｇ、９９％；融点８５〜８６℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７６〜７．７４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．６６〜７．５２（ｍ，１０Ｈ）、７．４６〜７．３６（ｍ，８Ｈ）、７．２９〜７．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、５．８６〜５．８４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．２９〜５．２０（ｄｄ，Ｊ＝ １２．８Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．６９〜４．６６（ｍ，１Ｈ）、４．４４〜４．３１（ｍ，２Ｈ）、４．２４〜４．２１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．０１〜２．９５（ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．８１〜２．７６（ｄｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，１Ｈ）、１．３９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７０．９、１７０．２、１５６．１、１４３．９、１４３．８、１４１．４、１３９．５、１３２．７、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．１、１３１．７、１２８．７、１２８．６、１２８．０、１２７．９、１２７．２、１２５．２、１２０．１、８２．１、６７．４、６６．７、５０．７、４７．２、３７．８、２８．１；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．７５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ４２Ｈ４０ＮＯ７Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：７０２．２６２１、実測値：７０２．２６０２。
化合物５ｅ。白色固体；収量２５７ｍｇ、９７％；融点９８〜９９℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．１０〜８．０８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．７６〜７．７４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．６８〜７．６１（ｍ，６Ｈ）、７．５６〜７．３６（ｍ，１４Ｈ）、７．３１〜７．２５（ｍ，３Ｈ）、７．２１〜７．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、５．４８〜５．４６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．２１〜５．０６（ｄｄ，Ｊ＝１２．９，４７．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．８４〜４．７９（ｍ，１Ｈ）、４．４１〜４．３４（ｍ，２Ｈ）、４．２２〜４．１８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．２８〜３．２７（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）、１．６３（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．６、１５５．８、１４９．６、１４３．９、１４３．８、１４１．４、１３９．１、１３５．５、１３２．９、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．１、１３１．８、１３０．４、１２８．７、１２８．６、１２７．８、１２７．２、１２５．２、１２４．８、１２４．３、１２２．８、１２０．１、１１８．９、１１５．５、１１４．８、８４．０、６７．４、６６．６、５４．３、４７．２、２８．２；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．３２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ５０Ｈ４５Ｎ２Ｏ７Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：８１７．３０４３、実測値：８１７．３０３１。
化合物５ｆ。白色固体；収量３０４ｍｇ、９９％；融点１１７〜１１８℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７５〜７．７３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．６９〜７．６３（ｍ，４Ｈ）、７．６０〜７．５５（ｍ，４Ｈ）、７．５３〜７．４６（ｍ，８Ｈ）、７．３９〜７．３５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．２９〜７．２７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．６１（ｂｓ，２Ｈ）、５．８８（ｂｓ，１Ｈ）、５．５０〜５．３５（ｄｄ，Ｊ１＝９．７Ｈｚ，Ｊ２＝５２．８Ｈｚ，２Ｈ）、５．０３〜５．００（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．３６〜４．３４（ｍ，３Ｈ）、４．２０〜４．１６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．２５〜３．１５（ｍ，２Ｈ）、２．９０（ｓ，２Ｈ）、２．７８〜２．６７（ｍ，２Ｈ）、２．５８（ｓ，３Ｈ）、２．５１（ｓ，３Ｈ）、２．０６（ｓ，３Ｈ）、１．６８〜１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．４２（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７２．０、１５８．６、１５６．６、１５６．２、１４３．８、１４１．３、１４０．０、１３８．３、１３３．３、１３２．５、１３２．４、１３２．２、１３２．０、１３１．９、１３１．８、１３０．８、１２８．９、１２８．８、１２７．８、１２７．２、１２５．２、１２４．６、１２１．１、１２０．０、１１９．８、１１７．４、８６．４、６８．０、６７．２、６６．２、５３．５、４７．１、４３．３、４０．５、２９．６、２８．６、２５．２、１９．４、１８．１、１２．６；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝３１．０３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ５３Ｈ５５Ｎ４Ｏ８ＰＳ＋Ｈ］＋の計算値：９３９．３５５６、実測値：９３９．３５３８。
化合物５ｇ。白色固体；収量２０４ｍｇ、９９％；融点８１〜８２℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７７〜７．７５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．７０〜７．５３（ｍ，１０Ｈ）、７．４８〜７．４４（ｍ，６Ｈ）、７．４１〜７．３７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．３２〜７．２８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、５．３６〜５．３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．２２（ｓ，２Ｈ）、４．４４〜４．３２（ｍ，３Ｈ）、４．２４〜４．２１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．２６〜２．１７（ｍ，１Ｈ）、０．９７〜０．９５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７２．０、１５６．３、１４３．９、１４３．８、１４１．４、１３９．４、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．１、１２８．７、１２８．６、１２８．１、１２８．０、１２７．８、１２７．１、１２５．１、１２０．１、６７．１、６６．２、５９．１、４７．２、３１．３、１９．１、１７．６；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．４５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ３９Ｈ３６ＮＯ５Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：６３０．２４０９、実測値：６３０．２３９２。
化合物５ｈ。白色固体；収量２８７ｍｇ、９９％；融点１２１〜１２２℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７６〜７．７１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．６５〜７．５１（ｍ，１２Ｈ）、７．４６〜７．４０（ｍ，４Ｈ）、７．３８〜７．３１（ｍ，４Ｈ）、７．２４〜７．２０（ｍ，９Ｈ）、７．１５〜７．１３（ｍ，６Ｈ）、６．７５（ｓ，１Ｈ）、６．１３〜６．１１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．２１〜５．１１（ｑ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．６９〜４．６５（ｍ，１Ｈ）、４．４３〜４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．３０〜４．２６（ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．２０〜４．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．１８〜３．１３（ｄｄ，Ｊ１＝４．２Ｈｚ，Ｊ２＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．８７〜２．８２（ｄｄ，Ｊ１＝４．２Ｈｚ，Ｊ２＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．０、１６９．４、１５６．４、１４４．３、１４４．０、１４３．８、１４１．４、１３９．６、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．０、１２８．７、１２８．６、１２８．２、１２７．９、１２７．６、１２７．５、１２７．４、１２７．２、１２５．３、１２０．１、７１．１、６７．４、６６．６、５１．２、４７．２、３８．８；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．３８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ５７Ｈ４７Ｎ２Ｏ６Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：８８７．３２５０、実測値：８８７．３２３０。
化合物５ｉ。白色固体；収量１９５ｍｇ、９９％；融点７８〜７９℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７６〜７．７５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．７０〜７．６３（ｍ，６Ｈ）、７．５９〜７．５３（ｍ，４Ｈ）、７．４８〜７．３７（ｍ，８Ｈ）、７．３１〜７．２８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、５．３７〜５．３５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．２３（ｓ，２Ｈ）、４．４９〜４．３８（ｍ，３Ｈ）、４．２３〜４．１９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、１．４６〜１．４４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７２．９、１５５．８、１４４．０、１４３．８、１４１．４、１３９．５、１３２．９、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．１、１３１．９、１２８．７、１２８．６、１２７．９ １２７．８、１２７．２、１２５．２、１２０．１、６７．２、６６．４、５３．６、４９．８、４７．３、３１．７、２２．８、１８．７、１４．３；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．２８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ３７Ｈ３２ＮＯ５Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：６０２．２０９６、実測値：６０２．２０８０。
化合物５ｊ。白色固体；収量１８９ｍｇ、９９％；融点７９〜８０℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７６〜７．７５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．７０〜７．６３（ｍ，６Ｈ）、７．６０〜７．５３（ｍ，４Ｈ）、７．４８〜７．４２（ｍ，６Ｈ）、７．４１〜７．３７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．３１〜７．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、５．４２〜５．３７（ｍ，１Ｈ）、５．２３（ｓ，２Ｈ）、４．４１〜４．３９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．２４〜４．２１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．０６〜４．０５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１６９．９、１５６．４、１４３．９、１４１．４、１３９．３、１３２．９、１３２．６、１３２．２、１３２．１、１３１．８、１２８．７、１２８．６、１２８．１、１２８．０、１２７．９、１２７．２、１２５．２、１２０．１、６７．４、６６．４、４７．２、４２．９；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．３３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ３６Ｈ３０ＮＯ５Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：５８８．１９４０、実測値：５８８．１９２５。
化合物５ｋ。白色固体；ｙｉｅｌｄ、９９％；融点９９〜１００℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７７〜７．７５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．６９〜７．６４（ｍ，６Ｈ）、７．５６〜７．５３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ）、７．４８〜７．４４（ｍ，４Ｈ）、７．４１〜７．３６（ｍ，４Ｈ）、７．３１〜７．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．９５〜６．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．８７〜６．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、５．２８〜５．２６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、５．２２〜５．１３（ｑ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．７０〜４．６８（ｍ，１Ｈ）、４．４４〜４．３２（ｍ，２Ｈ）、４．２１〜４．１８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．０９〜３．０６（ｍ，２Ｈ）、１．３０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．５、１５５．７、１５４．７、１４３．９、１４３．８、１４１．４、１３９．２、１３２．９、１３２．６、１３２．５、１３２．２、１３２．１、１２９．９、１２８．８、１２８．６、１２８．２、１２８．０、１２７．９、１２７．２、１２５．２、１２４．３、１２０．１、７８．６、６７．１、６６．５、５５．０、４７．３、３７．８、２８．９；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．２９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ４７Ｈ４４ＮＯ６Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：７５０．２９８４、実測値：７５０．２９６６。
化合物６ａの合成：Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＢｎｄｐｐ５ａ（８０ｍｇ）を５ｍＬ（６０％）のＴＦＡ／ＤＣＭに溶解させ、室温で撹拌した。１時間後、溶媒混合物を真空排気し、粗生成物をＤＣＭに溶解させた。１ＭのＨＣｌ（水溶液）で２回洗浄した後、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して粗６ａＨＣｌ塩を得た。粗生成物を最小量の酢酸エチルに溶解させ、続いて石油エーテルで沈殿させることによりＧＡＰ精製を行った。精製した生成物をろ過により白色固体として単離した；収量７１ｍｇ、９９％；融点６８〜７１℃（分解）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．５７〜７．４０（ｍ，１２Ｈ）、７．１０〜７．０４（ｍ，７Ｈ）、４．９９〜４．９６（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．４１（ｂｓ，１Ｈ）、３．４３（ｂｓ，１Ｈ）、３．２５（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１６９．１、１３８．６、１３４．３、１３２．５、１３２．３、１３２．２、１３２．１、１３２．０、１３１．５、１２９．６、１２８．８、１２８．７、１２８．６、１２８．３、１２８．２、１２７．５、６７．０、５４．６、３６．６；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝２９．７９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｃ２８Ｈ２６ＮＯ３Ｐ＋Ｈ］＋の計算値：４５６．１７２９、実測値：４５６．１７２５。
ＨＢｎｄｐｐ７ａの合成：Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＢｎｄｐｐ５ａ（１００ｍｇ）をメタノールと１０％Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）の５ｍＬ混合物に溶解させた。反応混合物をＨ２雰囲気（バルーン）下に置き、室温で１２時間撹拌した。次いで、反応混合物をセライトを通してろ過し、メタノールを真空排気した。粗固形物をＤＣＭに溶解させ、飽和Ｎａ２ＣＯ３（水）溶液で２回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空排気してＨＢｎｄｐｐ７ａを白色固体として得た；収量５１ｍｇ、９７％；この化合物は以前に異なる方法で合成されており、ＮＭＲデータは、文献に見られるものと一致する３０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．６８〜７．６３（ｍ，４Ｈ）、７．５７〜７．５２（ｍ，４Ｈ）、７．４８〜７．４４（ｍ，４Ｈ）、７．２９〜７．２６（ｍ，２Ｈ）、２．４１（ｓ，３Ｈ）。
Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリングのための一般手順：Ｆｍｏｃ−（ＡＡ）ｎ−ＯＢｎＤｐｐを３０％ピペリジン／ＤＣＭ（１グラム当たり１００ｍＬ）に溶解させ、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過した。結果として得られたＤＣＭ溶液に、１．２当量のＴＢＴＵ、１．２当量のＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ、及び２．４当量のＤＩＰＥＡを添加し；カップリング反応物を２０分間撹拌した。次いで、反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で２回、続いて０．５ＭのＮａＯＨで２回洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空排気して粗ペプチドを得た。粗混合物（Ｆｍｏｃ−（ＡＡ）ｎ＋１−ＯＢｎｄｐｐ、ＮＦＭＰ、及びテトラメチル尿素を含有）を最小量の酢酸エチル（より長いペプチドについては幾らかのＤＣＭを用いて）に溶解させ、続いて生成物を石油エーテルで沈殿させることにより、ＧＡＰ精製を実施した。生成物ペプチドを真空ろ過により白色固体として定量的収率で取り出した。
化合物９ｋ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＢｎｄｐｐ。白色固体；収量３．０８ｇ、９７％（６ｋから３ステップにわたり）；融点１２４〜１２５℃；溶離剤としてのＩＰＡ中０．１％エタノールアミンを用いた分析的ＮＰ−ＨＰＬＣでの保持時間：８．８５分、純度９２．０％；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｃ９０Ｈ１１４Ｎ９Ｏ１７ＰＳ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値：１６５７．７９０３、実測値：１６５７．７８７１。
側鎖保護基の脱保護：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＢｎＤｐｐ９ｋを１００ｍＬの３０％ピペリジン／ＤＣＭに溶解させ、室温で１０分間撹拌した。次いで、反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空排気した。次いで、粗生成物をＴＦＡ／ＤＣＭ／Ｈ２Ｏ（６／３／１）に溶解させ、室温で１時間撹拌した。反応混合物を真空排気して飽和させ、次いで、生成物ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させた。ろ過後、ペプチド１０ｋを白色固体として得、次のステップに直接使用した。
ＢｎＤｐｐの脱保護：水素化ボトル中の１００ｍｇの乾燥Ｐｄ／Ｃに、１５０ｍＬのメタノール中のＨ−ＲＫＤＶＹ−ＯＢｎＤｐｐ１０ｋを添加した。ボトルを７０ＰＳＩのＨ２雰囲気に置き、室温で２４時間振とうした。反応混合物をセライトを通してろ過し、真空排気して乾燥させた。粗生成物を１０％酢酸（水溶液）とクロロホルムの混合物に溶解させ、その後水層をクロロホルムで２回洗浄した。水層を真空排気してチモペンチンを白色固体として得た；収量１．０９ｇ、８７％；溶離剤としての０．０６％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中５０％ＭｅＣＮを用いた分析的ＲＰ−ＨＰＬＣでの保持時間：１．２４分、純度９８．９％；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｃ３０Ｈ４９Ｎ９Ｏ９＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値：６８０．３７３１、実測値：６８０．３７３０。喜ばしいことに、生成物ペプチドのＨＰＬＣ分析は、カラムクロマトグラフィー、再結晶化、又はポリマー支持体なしで化合物がほぼ９９％純粋であることを明らかにする。ＧＡＰ基は、抽出後にクロロホルム層を真空排気するだけで回収することができる。この原料に図２の合成方法を施すと、ＢｎｄｐｐＯＨを再生することができる。
さらなるＧＡＰ基及び結合方法
図６は、本発明の実施形態において使用可能な代表的な保護基を図示する。図７〜８は、ＢｎｄｐｐＯＨの開発に使用可能な代替的な方法（図２に示す方法の代替法）、及び図６に示すような他の代表的保護基の開発に使用可能な代替的な方法を図示する。
図４Ａ〜４Ｂはそれぞれ、図２の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略を図示する。保護基を結合させる他の方法を図９Ａ〜９Ｂ及び１０Ａ〜１０Ｂに示す。図９Ａは、「ＢｎＤｐｐＹＨ」の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略を図示する。図９Ｂは、図９Ａに示す方法の概略において利用される保護基「ＢｎＤｐｐＹＨ」を図示する。図１０Ａは、「ＢｚＤｐｐＯＨ」の保護基を様々なアミノ酸に結合させる方法の概略を図示する。図１０Ｂは、図１０Ａに示す方法の概略において利用される保護基「ＢｚＤｐｐＯＨ」を図示する。
これらの追加の保護基は、本発明の実施形態に整合する「ＢｎＤｐｐＯＨ」と同じ方式でペプチド合成に使用することができる。これらの追加の保護基の場合のペプチドカップリング反応は、酢酸エチル及びジクロロメタン中で行うことができる。
当業者は認識することであるが、本開示の方法及び系は、多くの方法で実施してもよく、そのようなものは、前述の例示的な実施形態及び実施例によって限定されるものではない。換言すれば、ハードウェア及びソフトウェア又はファームウェアと個々の機能との様々な組合せにおいて単一又は複数のコンポーネントによって実施される機能要素は、クライアントレベル若しくはサーバレベルのいずれか、又はその両方において様々なソフトウェアアプリケーションに分散されてもよい。この点に関し、本明細書に記載された異なる実施形態の任意の数の特徴は、単一又は複数の実施形態に統合されてもよく、本明細書に記載された全ての特徴より少ない特徴又は多くの特徴を有する代替の実施形態が可能である。
機能性はさらに、全体又は一部において、現在知られているか、今後知られるようになる様式で多数のコンポーネントに分散されてもよい。従って、本明細書に記載の機能、特徴、及び選択を達成する際に無数の組合せが可能である。さらに、本開示の範囲は、現在及び今後当業者が理解するように、記載された特徴及び本明細書に記載の方法、組成物、又は化合物になされ得る変形及び修正を行うための従来公知の様式を包含する。
さらには、本開示においてダイアグラム、概略図又はフローチャート（例えば図など）として提示及び説明される方法の実施形態は、その技術のより完全な理解を与えるために例として提供される。開示された方法は、本明細書に提示される操作及び論理の流れに限定されない。様々操作の順序が変更され、より大きな操作の一部として記載された下位操作が独立して実施される代替の実施形態が企図される。
本開示の目的のために様々な実施形態を記載したが、そのような実施形態は、本開示の教示をそれらの実施形態に限定するものとみなすべきではない。本開示に記載された系及び方法の範囲内にとどまる結果を得るために、上記の要素及び操作に対して様々な変更及び修正を行うことができる。
（関連する参考文献）
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Claims (11)

  1. 以下からなる群から選択される、基支援精製（ＧＡＰ）ペプチド合成のための保護基：
    （式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅからなる群から選択され；
    Ｙは、Ｏ、Ｓ、及びＮＨからなる群から選択され；
    Ｙ＝Ｏ又はＮＨのとき、式（１Ｂ）のすべてのＲ基がＨであることはなく；
    式（１Ｄ）のすべてのＲ基がＨであることはない）。
  2. Ｆｍｏｃ−ｔＢｕベースの液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ）のためのＣ末端保護基を形成する方法であって、前記保護基：
    が、下記：

    （式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅからなる群から選択され；
    Ｙは、Ｏ、Ｓ、及びＮＨからなる群から選択され；
    Ｙ＝Ｏ又はＮＨのとき、すべてのＲ基がＨであることはない）
    によって生成される、前記方法。
  3. Ｆｍｏｃ−ｔＢｕベースの液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ）のためのＣ末端保護基を形成する方法であって、前記保護基：

    が、下記：
    （式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ及びＯＭｅからなる群から選択され、すべてのＲ基がＨであることはない）
    によって生成される、前記方法。
  4. 請求項１に記載の保護基を以下のアミノ酸化合物：

    と反応させることを含む、前記保護基をアミノ酸に結合させる方法であって、
    式中、保護基（Ｐｇ）が、ベンゾイルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、フルオレニルメチル（Ｆｍ）、及びｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）からなる群から選択され；
    Ｚは、一般的な可変基である、前記方法。
  5. 以下のステップ：
    （式中、ＧＡＰを備えるベンジルアルコール４（ＢｎＤｐｐＯＨ）は、請求項１に記載の保護基である）
    を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 以下のステップ：
    （式中、ＧＡＰを備える保護基（ＢｎＤｐｐＹＨ）（式中、ＹはＯ、Ｓ、及びＮＨ基からなる群から選択される可変基である）は、前記保護基であり；
    Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、及びｔＢｕからなる群から選択され；
    Ｚは、一般的な可変基である）
    を含む、請求項４に記載の方法。
  7. 保護基が、
    （式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅからなる群から選択され、すべてのＲ基がＨであることはない）
    である、請求項６に記載の方法。
  8. 以下のステップ：
    （式中、ＢｎＤｐｐＹＨは、請求項１に記載の保護基であり；
    Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、及びｔＢｕからなる群から選択され；
    Ｚは、一般的な可変基である）
    を含む、請求項４に記載の方法。
  9. 以下のステップ：
    （式中、ＢｚＤｐｐＯＨは、請求項１に記載の保護基であり；
    Ｐｇは、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｎ、Ｆｍ、及びｔＢｕからなる群から選択され；
    Ｚは、一般的な可変基である）
    を含む、請求項４に記載の方法。
  10. 保護基が、
    （式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅからなる群から選択され；すべてのＲ基がＨであることはない）
    である、請求項９に記載の方法。
  11. 基支援精製（ＧＡＰ）ペプチド合成を実施する方法であって、請求項１に記載の保護基をアミノ酸に結合させ、続いて結果として得られる前記保護基が結合した前記アミノ酸にＦｍｏｃ−ｔＢｕベースの液相ペプチド合成（ＳｏｌＰＰＳ）カップリング反応を行うステップを含み、前記反応が、酢酸エチル、ジクロロメタン、又はその両方の中で起こってもよい、前記方法。

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