CN102471332A

CN102471332A - 取代的2-甲酰胺环氨基脲类

Info

Publication number: CN102471332A
Application number: CN2010800300379A
Authority: CN
Inventors: R·A·费尔赫斯特; P·菲雷; M·格施帕赫; R·马
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2012-05-23
Also published as: EP2448935B1; MX2012000177A; KR20120092552A; TW201105666A; AR077367A1; EP2448935A1; US8293753B2; US20110003818A1; EA201200086A1; JP2012531456A; AU2010268019A1; UY32747A; CA2766855A1; BRPI1015909A2; WO2011000905A1

Abstract

本发明涉及式(I)的化合物及其盐，其中取代基如本说明书中所定义；本发明还涉及该化合物的组合物及其在治疗可通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶而改善的疾病中的用途。

Description

取代的2-甲酰胺环氨基脲类

本发明涉及作为新的磷脂酰肌醇(PI)3-激酶抑制剂化合物的取代的2-甲酰胺环氨基脲类、它们的可药用盐、其前药以及它们的生产方法。本发明还涉及单独或者与至少一种另外的治疗剂组合的这些化合物以及任选还有可药用载体的组合物。本发明还涉及使用单独或者与至少一种另外的治疗剂组合的这些化合物来预防或治疗多种疾病、特别是通过一种或多种生长因子、受体酪氨酸激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸(heroine)激酶、G蛋白偶联受体以及磷脂激酶和磷酸酶的异常活性所介导的那些疾病的方法。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)包含脂激酶(lipid kinases)家族，这些脂激酶可催化磷酸基团转移到肌醇脂类的D-3′位置上，产生磷酸肌醇-3-磷酸(PIP)、磷酸肌醇-3，4-二磷酸(PIP₂)和磷酸肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP₃)，它们接着作为第二信使在信号级联放大中通过使含有普列克底物蛋白-同源性、FYVE、Phox和其他磷脂结合区域的蛋白质停靠在通常位于质膜的多种信号传导复合物中而发挥作用((Vanhaesebroeck等人，Ann u.Rev.Biochem70：535(2001)；Katso等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17：615(2001))。在两种1类PI3K中，1A类PI3K是由与调节亚基(它可以是p85α、p55α、p50α、p85β或p55γ组成性结合的催化p110亚基(α、β、δ同工型)所组成的异二聚体。1B类亚类具有一个家族成员：由与两个调节亚基p101或p84其中之一结合的催化p110γ亚基所组成的异二聚体(Fruman等人，Annu Rev.Biochem.67：481(1998)；Suire等人，Curr.Biol.15：566(2005))。p85/55/50亚基的模块结构域包括Src同源性(SH2)结构域，它们可使特定的序列背景中的磷酸酪氨酸残基结合在激活的受体和胞质酪氨酸激酶上，引起1A类PI3K的激活和定位。1B类PI3K直接被结合各种肽和非肽类配体的G蛋白偶联受体所激活(Stephens等人，Cell 89：105(1997))；Katso等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17：615-675(2001))。因此，I类PI3K产生的磷脂产物使上游受体与下游的细胞活动联系起来，所述的细胞活动包括增殖、存活、趋化性、细胞运输、运动性、代谢、炎症和过敏反应、转录和翻译(Cantley等人，Cell64：281(1991)；Escobedo和Williams，Nature 335：85(1988)；Fantl等人，Cell69：413(1992))。

在许多情况中，PIP2和PIP3将Akt(病毒癌基因v-Akt的人类同源物的产物)募集到质膜，在那里它充当许多对生长和存活很重要的细胞内信号传导途径的节点(Fantl等人，Cell69：413-423(1992)；Bader等人，Nature Rev.Cancer 5：921(2005)；Vivanco和Sawyer，Nature Rev.Cancer 2：489(2002))。PI3K的异常调节通常通过Akt的激活来增加存活，这是人类癌症中最普遍的事件之一，并且已经显示出可在多种水平上发生。肿瘤抑制基因PTEN使磷酸肌醇在肌醇环的3′位上脱磷酸，从而拮抗PI3K活性，而在多种肿瘤中该基因PTEN在功能上被删除。在其他肿瘤中，p110α同工型PIK3CA和Akt的基因被扩增，并且其基因产物的蛋白表达增加已经在一些人类癌症中得到证实。而且，用于向上调节p85-p110复合物的p85α的突变和易位也已经在人类癌症中有描述。最后，激活下游信号传导途径的PIK3CA中的体细胞错义突变已经以相当大的频率在各种人类癌症中有描述(Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 102：802(2005)；Samuels等人，Science304：554(2004)；Samuels等人，Cancer Cell 7：561-573(2005))。这些观察表明，磷酸肌醇-3激酶以及该信号传导途径的上游和下游组分的失控是与人类癌症和增殖性疾病有关的最常见的失控之一(Parsons等人，Nature436：792(2005)；Hennessey等人，Nature Rev.Drug Disc.4：988-1004(2005))。

由上文可知，PI3K的抑制剂在治疗增殖性疾病和其他障碍中将是特别有价值的。对PI3K α同种型的选择性是期望的且另外期望的特性包括改善的药代动力学特性和/或化学稳定性。

WO2004/096797公开了作为PI3激酶抑制剂的某些噻唑衍生物及其作为药物的用途。

WO 2005/021519也公开了作为PI3激酶抑制剂的某些噻唑衍生物及其作为药物的用途。

现在已经发现，以下所给的式I的取代的2-甲酰胺环氨基脲类具有有利的药理性质，它们例如可抑制PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)。特别是优选这些化合物在生物化学和/或细胞试验中对PI3Kα(相对于β和/或δ和/或γ亚型)显示出高度的选择性。对式I的化合物优选期望的另一种特性包括改善的稳定性，例如改善的化学稳定性，例如固体形式和/或缓冲溶液形式。因此，式I化合物适宜例如用于治疗依赖于PI3激酶(特别是PI3Kα，例如显示PIK3CA体细胞突变或种系突变或PTEN体细胞突变的那些)的疾病，尤其是增殖性疾病，例如肿瘤疾病和白血病。

在第一方面，本发明提供了式I化合物或其盐、溶剂化物、水合物或前药，

其中

m是0或1；

n是0或1；

R¹代表H、卤素、未取代的C₁-C₄-烷基或取代的C₁-C₄-烷基；

R²独立地选自未取代或取代的C₁-C₈-烷基、未取代或取代的C₁-C₈-烷氧基、未取代或取代的氨基、卤素或羟基；

R³独立地选自未取代或取代的C₁-C₈-烷基、未取代或取代的C₁-C₈-烷氧基、未取代或取代的氨基、卤素或羟基；

R⁴独立地选自未取代或取代的C₁-C₈-烷基、未取代或取代的C₁-C₈-烷氧基、卤素或羟基；或

R³和R⁴与所连接的相同或不同碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基或杂环基；

R⁵是未取代或取代的杂芳基；

且

不包括化合物(1R，2S，5S)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸2-酰胺3-{[5-(2-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}。

本发明可以通过参考以下描述、包括以下术语汇编和总结性实例而被更完全地理解。如本文所用的术语“包括”、“含有”和“包含”以其公开的非限制的意义而在本文中使用。

本文所给的任意式意欲代表具有结构式所描述的结构的化合物以及某些变体或形式。特别是本文所给的任意式的化合物可以具有不对称中心并因此以不同的立体异构体形式例如不同的对映异构形式存在。如果式I化合物中存在至少一个不对称碳原子，则这类化合物可以以旋光活性形式或以旋光异构体混合物的形式、例如以外消旋混合物的形式存在。因此，不对称碳原子可以以(R)-、(S)-或(R，S)-构型、优选(R)-或(S)-构型形式存在。所有旋光异构体及其混合物、包括外消旋混合物是本发明的一部分。因此，本文所给的任意所给式意欲代表外消旋物、一种或多种对映异构形式、一种或多种非对映异构形式、一种或多种阻转异构体形式及其混合物。而且，某些结构还可以作为几何异构体(即顺式和反式异构体)、互变异构体或阻转异构体而存在。例如，在双键或环上的取代基可以以顺式-(＝Z-)或反式(＝E-)形式存在。本发明的化合物由此可以作为异构体混合物或优选作为纯异构体存在，优选作为对映体-纯的非对映异构体或纯对映体存在。

本文所给的任意式意欲代表这类化合物的水合物、溶剂合物和多晶型物及其混合物。

本文所给的任意式还意欲代表化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。除了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子所代替外，同位素标记的化合物具有本文所给的式所描述的结构。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如分别有²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、³¹P、³²P、¹⁸F、³⁵S、³⁶Cl、¹²⁵I。不同的同位素标记的本发明的化合物例如有放射性同位素如³H、¹³C和¹⁴C被掺入其中的那些。这类同位素标记的化合物可用于代谢研究(优选用¹⁴C)、反应动力学研究(例如用²H或³H)、检测或显像技术、例如正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算体层摄影术(SPECT)、包括药物或底物组织分布试验，或者可用于放射性治疗患者。特别是¹⁸F或标记的化合物可以特别优选用于PET或SPECT研究。此外，被更重的同位素如氘(即²H)所取代还可以获得由更高的代谢稳定性所带来的某些治疗益处，例如延长体内半衰期或降低剂量要求。通常可以通过进行在下文描述的流程图或者实施例和制备中公开的方法、通过用容易得到的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备同位素标记的本发明的化合物及其前药。

此外，被更重同位素、特别是氘(即²H或D)所取代还可以获得由更高的代谢稳定性引起的某些治疗益处，例如延长体内半衰期或降低剂量要求或改善治疗指数。可以理解，本上下文中的氘可被看作式(I)化合物中的取代基。这类更重同位素、特别是氘的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语“同位素富集因子”表示特定同位素的同位素丰度和天然丰度之间的比值。如果本发明的化合物中的取代基标有氘，则这类化合物具有的对每个指定氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定氘原子处具有52.5％氘掺入率)、至少4000(60％氘掺入率)、至少4500(67.5％氘掺入率)、至少5000(75％氘掺入率)、至少5500(82.5％氘掺入率)、至少6000(90％氘掺入率)、至少6333.3(95％氘掺入率)、至少6466.7(97％氘掺入率)、至少6600(99％氘掺入率)或至少6633.3(99.5％氘掺入率)。在本发明的化合物中，没有具体指定为特定同位素的任意原子意欲代表该原子的任意稳定同位素。除非另有说明，当位置被具体指定为“H”或“氢”时，该位置可以理解为在其天然丰度同位素组成上具有氢。因此，在本发明的化合物中，被具体指定为氘(D)的任意原子意欲代表例如在以上所给范围内的氘。

当参考本文所给的任意式时，从可能种类的名单中为规定变量选择特定部分并非意欲用来定义在别处出现的变量部分。换言之，当变量出现一次以上时，从规定名单中选择种类不依赖于为式中别处的相同变量选择种类(当在如上文或下文所优选的那样被表征的实施方案中一个或多个直至所有更一般的表述可以被更具体的定义代替时，由此分别产生本发明的更优选的实施方案)。

当使用复数形式(例如多种化合物、盐、药物制剂、疾病等)时，其包括单数(例如一种化合物、一种盐、一种药物制剂、一种疾病等)。“化合物”不排除(例如在药物制剂中)存在一种以上式I化合物(或其盐)。

式(I)化合物的盐优选是可药用盐，条件是它们携带成盐基团；形成这类盐所需的酸/碱一般是本领域中已知的。

以下一般定义将适用于本说明书，另有说明除外：

卤素(或卤代)表示氟、溴、氯或碘，特别是氟、氯。卤素取代的基团和部分，例如被卤素取代的烷基(卤代烷基)可以是单、多或全卤代的。

杂原子是除碳和氢外的原子，优选氮(N)、氧(O)或硫(S)，特别是氮。

“烷基”指直链或支链烷基且包括其中所述的C_1-4烷基和C_1-8烷基。这类烷基包括例如甲基、乙基、正或异丙基，正、异、仲或叔丁基，正戊基、正己基、正庚基、正辛基，特别优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基。烷基可以是未取代的或取代的。示例的取代基包括但不限于羟基、烷氧基、卤素(尤其是氟)、氨基、一或二烷基取代的氨基、乙酰基氨基和吗啉基。取代的烷基的实例有三氟甲基。环烷基也可以是烷基的取代基。这类情况的实例有部分(烷基)-环烷基，例如(烷基)-环丙基或(烷基)-环丁基，如甲基-环丙基或甲基-环丁基。(烷基)-环烷基部分的更具体的实例包括成对类型的取代型式，例如1-烷基环烷基，如1-甲基环丙基。作为烷基的取代基的环烷基的另一个实例是亚烷基-环烷基，例如亚烷基-环丙基，如-CH₂-环丙基。C₁-C₈-烷基是具有从1且包括1至8且包括8、优选从1且包括1至4且包括4个碳原子(C₁-C₄-烷基)的烷基，并且是直链或支链；优选低级烷基是丁基如正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、丙基如正丙基或异丙基、乙基或者优选甲基。

其他基团如“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“烷氧基羰基”、“烷氧基-羰基烷基”、“烷基磺酰基”、“烷基磺酰基”、“烷基氨基”、“卤代烷基”中的每个烷基部分应具有以上提到的“烷基”定义中描述的相同含义。

“C_3-8环烷基”指饱和或部分饱和的单环、稠合多环或螺多环碳环，碳环具有3至8个环原子/碳环。环烷基的说明性实例包括以下部分：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可以是未取代的或取代的；示例的取代基在对烷基的定义中提供。

“杂环基”指如下定义的杂环基团：其为饱和或部分饱和的并且优选是单环或者在本发明的更广泛方面是二环、三环或螺环；并且具有3至24个、更优选4至16个、最优选5至10个且最优选5或6个环原子；其中一个或多个、优选1至4个、尤其是1或2个碳环原子被杂原子替换，键合环优选具有4至12个、尤其是5至7个环原子。杂环基团(杂环基)可以是未取代的或者被一个或多个、尤其是1至3个取代基所取代，所述的取代基独立地选自以上对取代的烷基所定义的取代基和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基。此外，杂环基尤其选自如下的杂环基：环氧乙烷基、吖丙啶基、1，2-氧杂硫杂环戊烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、(S-氧代或S，S-二氧代)-硫代吗啉基、氮杂环庚基、二氮杂环庚基、尤其是1，4-二氮杂环庚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基和2，3-二氢-苯并[1，4]二英-6-基，这些基团各自是未取代的或者被一个或多个、优选最多三个取代基所取代，所述的取代基选自以上提到的那些和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)，亚氨基-低级烷基。

“杂芳基”指如下定义的杂环基团：其为不饱和的(特别是最大不饱和的，例如在环上携带最高可能数量的共轭双键)并且优选是单环或者在本发明的更广泛方面是二环或三环；并且具有3至24个、更优选4至16个、最优选5至10个且最优选5或6个环原子；其中一个或多个、优选1至4个、尤其是1或2个碳环原子是杂原子，键合环(即键合分子其余部分的环)优选具有4至12个、尤其是5至7个环原子。杂芳基可以是未取代的或者被一个或多个、尤其是1至3个取代基所取代，所述的取代基独立地选自烷基或以上对取代的烷基所定义的取代基和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基且对含氮杂芳基而言包括其N-氧化物。此外，杂芳基尤其选自如下的杂环基：吖丙啶基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、噻喃基、噻蒽基、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、异噻唑基、二噻唑基、

唑基、异

唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基(cumaryl)、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、啶基、菲咯啉基、呋咱基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩

嗪基、色烯基和苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基，这些基团各自是未取代的或者被一个或多个、优选最多三个取代基所取代，所述的取代基选自以上对取代的芳基提到的那些和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基且对含氮杂芳基而言包括其N-氧化物。

“治疗”包括预防性(防护性)和治疗性治疗以及延缓疾病或障碍的进展。

“PI3激酶介导的疾病”(尤其是PI3Kα介导的疾病)尤其是以有益的方式(例如改善一种或多种症状、延缓疾病发作、直至暂时或完全治愈疾病)对抑制PI3激酶、尤其是抑制PI3Kα有响应的这类障碍(其中所治疗的疾病包括显示PIK3CA体细胞突变或种系突变或PTEN体细胞突变的那些)。所治疗的疾病包括尤其是增殖性疾病例如肿瘤疾病，包括可以举出的实体瘤、白血病、胶质母细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌)。

“盐”(其以“或其盐”表示)可以单独或与游离式I化合物混合存在，并且优选是可药用盐。式(I)化合物上的成盐基团是具有碱性或酸性的基团或基。具有至少一个碱性基团或至少一个碱性基例如氨基、不形成肽键的仲氨基或吡啶基可以例如与无机酸或与适宜的有机酸或磺酸形成酸加成的盐，所述的无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸，所述的有机羧酸，例如脂族一元或二元羧酸，例如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸，或氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；芳香羧酸，例如苯甲酸；2-苯氧基-苯甲酸；2-乙酰氧基-苯甲酸；水杨酸；4-氨基水杨酸；芳香-脂族羧酸，例如扁桃酸或肉桂酸；杂芳香羧酸，例如烟酸或异烟酸；脂族磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸或2-羟基乙磺酸；或芳香磺酸，例如苯磺酸、对甲苯磺酸或萘-2-磺酸。当存在几个碱性基团时，可以形成单-或多-酸加成的盐。具有酸性基团羧基或酚羟基的式(I)的化合物可以形成金属或铵盐，例如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾、镁或钙盐；或与氨或适合的有机胺类形成的铵盐，所述的有机胺类例如叔单胺类，例如三乙胺或三(2-羟基乙基)-胺或杂环碱，例如N-乙基-哌啶或N，N′-二甲基哌嗪。盐的混合物是可能的。

具有酸性和碱性基团的式(I)的化合物可以形成内盐。

为了分离或纯化的目的，也能够使用不可药用盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。为了治疗应用，仅使用可药用盐或游离化合物(如果适合，为药物制剂形式)，且由此优选它们。鉴于游离形式的新化合物与其盐形式的那些化合物包括可以用作中间体的那些盐之间的紧密相关性，所以，例如在纯化或鉴定新化合物过程中，还应将上下文中任意涉及的游离化合物理解为相应的作为适合和有利的盐。

本发明的化合物还可以形成溶剂合物和水合物，照此，还应将任意涉及的式(I)的化合物理解为作为适合和有利的式(I)的化合物的相应溶剂合物和/或水合物。

本发明还涉及式(I)的化合物的前药，照此其在体内转化成式(I)的化合物。由此还应将任意涉及的式(I)的化合物理解为作为适合和有利的式(I)的化合物的前药。

组合是指一种剂量单位形式的固定组合，或者用于组合施用的成套药盒，其中式I化合物和组合伙伴(例如如下解释的其他药物，还称为“治疗剂”或“共用物质”)可以同时独立施用或在时间间隔内分别施用，尤其是当这些时间间隔使组合伙伴显示出协作作用、例如协同作用时。如本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等意欲囊括将所选的组合伙伴施用于需要其的单个个体(例如患者)，并且意欲包括其中物质不必通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合产品”表示将一种以上活性成分混合或组合所得到的产品，并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术语“固定组合”表示活性成分如式I化合物和组合伙伴均以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”表示活性成分如式I化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、共同或无特定时间限制地先后施用于患者，其中该施用在患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或更多种活性成分。

在优选的实施方案(其独立地、共同地或以任意组合或亚组合进行优选)中，本发明涉及游离碱形式或酸加成盐形式的式I化合物，其中取代基如本文所定义。

如式I所示，α-酰胺取代基位于吡咯烷环的2-位上且立体化学如所画出的，R4取代基位于吡咯烷环的3位上，且每个取代基具有彼此相对为顺式的确定的立体化学。

R¹优选代表C₁-C₄-烷基，最优选甲基。

R²优选代表C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基、二-C₁-C₄-烷基-氨基、卤素或羟基。

R²更优选代表甲基、甲氧基、二甲基氨基、氟或羟基。

R²甚至更优选代表甲氧基、二甲基氨基、氟或羟基。

R³优选代表C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基、二-C₁-C₄-烷基-氨基、卤素或羟基。

R³更优选代表甲基、甲氧基、二甲基氨基、氟或羟基。

R³甚至更优选代表甲基、甲氧基、二甲基氨基、氟或羟基。

如果存在(即m＝1和/或n＝1)，则R²或R³基团可以连接在式I的吡咯烷环的2-和/或3-和/或4-和/或5-位上。最优选R²或R³基团可以连接在吡咯烷环的3-位上，即同时被R⁴基团取代的同一碳上。

R⁴优选代表羟基、C₁-C₄-烷基或被C₁-C₄-烷氧基、未取代或取代的氨基、杂环基或杂芳基取代的C₁-C₄-烷基。

R⁴更优选代表羟基、C₁-C₄-烷基或被C₁-C₄-烷氧基、二-C₁-C₄-烷基-氨基、乙酰基氨基、吗啉基或吡啶基取代的C₁-C₄-烷基。

R⁴更优选代表羟基、甲基或被C₁-C₄-烷氧基、二-C₁-C₄-烷基-氨基、乙酰基氨基、吗啉基或吡啶基取代的甲基。

R⁴最优选代表羟基、甲基、甲氧基甲基、二甲基氨基-甲基、乙酰基氨基

-甲基、吗啉-4-基甲基或吡啶基-甲基。

如上所述，提供了式I的化合物，其中R³和R⁴可以与所连接的相同或不同碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基或杂环基，且其中不包括化合物(1R，2S，5S)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸2-酰胺3-{[5-(2-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}。

式I的化合物包括这样的化合物，其中取代基如对式(I)的化合物所定义，且

R³和R⁴与所连接的相同碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基；或

R³和R⁴与所连接的相同或不同碳原子一起形成杂环基。

在另一种可替代选择中，式I的化合物包括这样的化合物，其中取代基如对式(I)的化合物所定义，且

R³和R⁴与所连接的同一碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基或杂环基(优选环烷基)。

因此，当R³和R⁴形成C₃-C₈-环烷基(优选)或杂环基时，优选R³基团连接在吡咯烷环的3-位上，即同时被R⁴基团取代的同一碳上。

R⁵如上所述，其代表未取代或优选取代的杂芳基，其被一个或多个优选一个部分取代，所述的部分独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C₁-C₇-烷基、全氘代C₁-C₇-烷基、C₃-C₁₂-环烷基、(C₁-C₇-烷基)-C₃-C₁₂-环烷基、(卤代-C₁-C₇-烷基)-C₃-C₁₂-环烷基、氨基-C₁-C₇-烷基、卤代-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-烷酰基氨基-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-烷磺酰基-氨基-C₁-C₇-烷基、吡咯烷代-C₁-C₇-烷基、氧代-吡咯烷代-C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷亚磺酰基、C₁-C₇-烷磺酰基、C₁-C₇-烷氧基、氨基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨基、N-一-或N，N-二-(全氘代C₁-C₇-烷基)-氨基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-环烷基)-氨基C₁-C₇-烷酰基氨基、吡咯烷代、氧代-吡咯烷代、哌啶子基、哌嗪-1-基、4-(C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基-C₁-C₇-烷基、卤代-C₁-C₇-烷基或C₃-C₁₀-环烷基)-哌嗪-1-基、4-(氨基-C₁-C₇-烷基)-哌嗪-1-基、4-[N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基氨基)-C₁-C₇-烷基]-哌嗪-1-基、吗啉代、硫吗啉代、S-氧代-或S，S-二氧代硫吗啉代、C₁-C₇-烷磺酰基氨基、氨基甲酰基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基-C₁-C₇-烷基、氨基-C₁-C₇-烷基和/或(N’-一-或N’，N’-二-(C₁-C₇-烷基)-氨基-C₁-C₇-烷基)-氨基甲酰基、吡咯烷-1-羰基、哌啶-1-羰基、哌嗪-1-羰基、4-(C₁-C₇-烷基)哌嗪-1-羰基、吗啉-1-羰基、硫吗啉-1-羰基、S-氧代-或S，S-二氧代硫吗啉-1-羰基、磺基、C₁-C₇-烷磺酰基、C₁-C₇-烷亚磺酰基、氨磺酰基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨磺酰基、吗啉代磺酰基、硫吗啉代磺酰基、噻唑基。

R⁵更优选代表未取代杂芳基或被一个取代基取代的杂芳基，所述的取代基选自C₁-C₄-烷基(特别是叔丁基)、全氘代C₁-C₄-烷基(特别是d₉-叔丁基)、卤代-C₁-C₄-烷基(特别是1-氟-1-甲基-乙基、2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)、1-(C₁-C₄-烷基)-C₃-C₆-环烷基(特别是1-甲基-环丙基)、(卤代-C₁-C₄-烷基)-C₃-C₆-环烷基(特别是1-三氟甲基-环丙基)、二-C₁-C₄-烷基氨基(特别是二乙基氨基)、二-(全氘代C₁-C₄-烷基)氨基(特别是d₁₀-二乙基氨基)。

R⁵更优选代表杂芳基，其选自吡啶基(尤其是4-吡啶基)、嘧啶基(尤其是4-嘧啶基)、吡嗪基(尤其是2-吡嗪基)和噻唑基(尤其是噻唑-4-基)，其中所述取代基选自C₁-C₄-烷基(特别是叔丁基)、全氘代C₁-C₄-烷基(特别是d₉-叔丁基)、卤代-C₁-C₄-烷基(特别是1-氟-1-甲基-乙基、2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)、1-(C₁-C₄-烷基)-C₃-C₆-环烷基(特别是1-甲基-环丙基)、(卤代-C₁-C₄-烷基)-C₃-C₆-环烷基(特别是1-三氟甲基-环丙基)、二-C₁-C₄-烷基氨基(特别是二乙基氨基)、二-(全氘代C₁-C₄-烷基)氨基(特别是d₁₀-二乙基氨基)。

R⁵极为优选地代表杂芳基，其选自2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基、2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基、2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基、2-(1-(三氟甲基)环丙基)噻唑-4-基、2-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基、6-叔丁基-吡嗪-2-基。

R⁵在另一个实施方案中极为优选地代表杂芳基，其选自2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基、2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基、2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基、2-(1-(三氟甲基)环丙基)噻唑-4-基、2-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基、6-叔丁基-吡嗪-2-基、2-叔丁基-吡啶-4-基。

优选当R⁵是取代的吡啶基例如4-吡啶基时，例如被至少一个取代基取代(如上文所定义)，则所述取代基至少位于吡啶基环的2-位上。

优选当R⁵是取代的嘧啶基例如4-嘧啶基时，例如被至少一个取代基取代(如上文所定义)，则所述取代基至少位于嘧啶基环的2-位上。

优选当R⁵是取代的吡嗪基例如4-吡嗪基时，例如被至少一个取代基取代(如上文所定义)，则所述取代基至少位于吡嗪基环的6-位上。

优选当R⁵是取代的噻唑基例如4-噻唑基时，例如被至少一个取代基取代(如上文所定义)，则所述取代基至少位于噻唑基的2-位上。

本发明的一个实施方案包括式I的化合物，其中m和/或n是0。

本发明的另一个实施方案包括式I的化合物，其中m和n都为0，即其中吡咯烷环仅在2位上被酰胺取代和在3位上被R⁴基团取代，即式IA的化合物：

其中取代基如对式(I)的化合物所定义。

本发明的另一个实施方案包括式I的化合物，其中m是0或1且n是1。在该实施方案中，优选R³键合在吡咯烷环的3位上，即得到式IB的化合物：

其中取代基如对式(I)的化合物所定义。

在式IB的化合物中，当m是1(即存在R²)时，R²基团优选连接在吡咯烷环的4-或5-位(优选4-位)上，由此得到式IB’的化合物：

在式IB或IB’中，优选R³是C₁-C₄-烷基，最优选甲基。

本发明的另一个实施方案包括式I的化合物，其中m是0或1且n是1，其中R³键合在吡咯烷环的3位上，并且与R⁴一起形成C₃-C₈-环烷基或杂环基，优选C₃-C₈-环烷基，特别是环丙基，得到式IC的化合物：

其中取代基如对式(I)的化合物所定义。

在式IC的化合物中，当m是1(即存在R²)时，R²基团优选连接在吡咯烷环的4-或5-位(优选4-位)上。

本发明还涉及式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)的化合物的可药用前药。

本发明还涉及式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)的化合物的可药用代谢物。

本发明尤其涉及指定实施例中的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)的化合物以及本文所述的制备方法。

本发明还涉及式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)的化合物的生产方法。一般而言，将两种不同胺类转化成相应脲衍生物的所有已知方法是适合的且可以通过使用相应的原料进行应用。

因此，本发明特别涉及一种方法，包括使式II的化合物

其中取代基如上述所定义，在活化剂的存在下与式IIIA的化合物反应(“方法A”)，

其中取代基如上述所定义，或与式IIIB的化合物反应

其中R¹如上述所定义；RG代表反应基团(例如咪唑基羰基)(“方法B”)，在每种情况中任选存在稀释剂和任选存在反应助剂；和

回收得到的游离形式或盐形式的式I化合物，和任选将根据方法A或方法B可得到的式I化合物转化为不同的式I化合物，和/或将可得到的式I化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将可得到的游离式I化合物转化为其盐，和/或从一种或多种不同的可得到的式I的异构体中分离可得到的式I化合物的异构体。

反应条件

可以根据本领域已知的方法或者按照以下实施例中公开的方法进行该方法。例如，可以使式II化合物与式IIIA或IIIB化合物在溶剂如二甲基甲酰胺中、在碱例如有机胺如三乙胺的存在下反应。

当温度在上文或下文中被给出时，必须加入“约”，因为所给数值的小偏差、例如±10％的变化是可允许的。

所有反应可以在一种或多种稀释剂和/或溶剂的存在下进行。原料可以以等摩尔量使用；或者，化合物可以过量使用，例如以作为溶剂而发挥作用或使平衡移动或通常加快反应速率。

可以如本领域已知的、反应所需要的那样并且按照通常已知的方法加入适宜量的反应助剂，例如酸、碱或催化剂。

保护基团

如果一个或多个其他官能团，例如羧基、羟基、氨基、巯基等在如本文描述的原料或任意其他前体中被保护或需要被保护，因为它们不应参与反应或干扰反应，则这些基团是如通常在肽化合物、还有头孢菌素类和青霉素类以及核酸衍生物和糖类的合成中使用的这类基团。保护基团是一旦它们被除去就不再在最终化合物中存在的这类基团，而在此处所用的意义上作为取代基保留的基团不是保护基团，保护基团是在原料或中间体阶段被加入并且被除去以得到最终化合物的基团。此外，对于式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物转化为不同的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物而言，如果有用或需要的话，可以加入和除去保护基团。保护基团可以已经在前体中存在，并且应该保护有关的官能团以防止不需要的二次反应如酰化、醚化、酯化、氧化、溶剂解以及类似的反应。保护基团的特征是它们易于(即没有不需要的二次反应)除去，通常通过乙酰水解、质子解、溶剂解、还原、光解或通过酶活性、例如在类似于生理条件的条件下除去，并且它们在终产物中不存在。专业人员知道或可以容易确定哪些保护基团适于上下文提到的反应。

这类官能团被这类保护基团所保护，保护基团本身及其除去反应例如在如下标准参考著作中有描述：例如J.F.W.McOmie，《有机化学中的保护基团》(“Protective Groups in Organic Chemistry”)、普莱姆出版社(Plenum Press)、伦敦和纽约1973，T.W.Greene，《有机合成中的保护基团》(“Protective Groups in Organic Synthesis”)，第三版，威利(Wiley)公司，纽约1999，《肽》(“The Peptides”)；第3卷(编者：E.Gross和J.Meienhofer)，学术出版社(Academic Press)、伦敦和纽约1981，“Methoden derorganischen Chemie”(有机化学方法)，Houben Weyl，第4版，第15卷/I，Georg Thieme Verlag，斯图加特1974，H.-D.Jakubke和H.Jescheit，“

Peptide，Proteine”(氨基酸、肽、蛋白质)，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield Beach和Basel 1982，和Jochen Lehmann，“Chemieder Kohlenhydrate：Monosaccharide und Derivate”(碳水化合物化学：单糖和衍生物)，Georg Thieme Verlag，斯图加特1974。

任选的反应和转化

式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物可以被转化为不同的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物。

在式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)的化合物中，其中取代基携带氨基或氨基-C₁-C₇-烷基取代基，氨基可以通过与相应的C₁-C₇-烷酰基卤例如相应的氯化物反应被转化成酰基氨基，例如C₁-C₇-烷酰基氨基，在该反应中，存在叔氮碱，例如三乙胺或吡啶，在没有或有适合溶剂的存在下，例如二氯甲烷，例如在-20-50℃温度下，例如在约室温下。

具有成盐基团的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物的盐可以按照本身已知的方式来制备。因此，式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物的酸加成盐可以通过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而得到。具有两个酸分子的盐(例如式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物的二卤化物)还可以被转化为每个化合物具有一个酸分子的盐(例如单卤化物)；这可以通过如下方法做到：加热至熔化物，或者例如作为固体在高真空下、在高温如从130至170℃下加热，此时每分子的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物排出一分子酸。通常可以例如通过用适宜的碱性化合物、例如用碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、通常为碳酸钾或氢氧化钠处理而将盐转化为游离化合物。

可以按照本身已知的方式、通过适宜的分离方法将立体异构混合物、例如非对映异构体的混合物分离为其相应的异构体。例如可以通过分步结晶、色谱法、溶剂分配和类似方法将非对映异构混合物分离为其单独的非对映异构体。该分离可以在起始化合物的水平或者在式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物本身中进行。可以通过形成非对映异构盐、例如通过与对映异构体纯的手性酸形成盐或者通过色谱法、例如通过HPLC、使用具有手性配体的色谱底物来分离对映异构体。

应该强调，与本章中所提到的转化类似的反应也可以在适当中间体的水平进行(并且因此可用于制备相应的原料)。

原料：

式II和III的原料以及本文如下文提到的其他原料可以按照或类似于本领域已知的方法来制备，它们是本领域已知的和/或可市售获得。对于原料的制备没有特别描述的情况，化合物是已知的或者可以按照类似于本领域已知的方法、例如WO 05/021519或WO04/096797中的方法或者按照下文公开的方法来制备。新原料及其制备方法同样是本发明的实施方案。在优选的实施方案中，使用这类原料并选择所选反应以便能够得到优选的化合物。

在还可以适当和有利地作为盐形式使用和/或得到的原料(包括中间体)中，取代基优选如对式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物所定义。

药物组合物、用途和治疗方法

本发明还涉及如本文所公开的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)作为药物的用途。本发明在一个实施方案中包括组合物，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)的化合物，例如用于人或兽应用，例如其中显示抑制PI3K。

在一项实施方案中，本发明涉及通过PI3K介导的细胞增殖性疾病、例如肿瘤(良性或恶性)和/或癌性细胞生长的治疗。疾病包括显示PIK3CA体细胞突变或种系突变或PTEN体细胞突变的那些。特别是化合物可用于治疗人或动物(例如鼠类)癌症，包括例如肉瘤；肺癌；支气管癌；前列腺癌；乳腺癌(包括散在的乳腺癌和考登病患者)；胰腺癌；胃肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠癌；结肠直肠癌；甲状腺癌；肝癌；肝内胆管癌；肝细胞癌；肾上腺癌；胃癌；胃癌；神经胶质瘤；成胶质细胞瘤；子宫内膜癌；黑素瘤；肾癌；肾盂癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；卵巢癌；多发性骨髓瘤；食管癌；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓性白血病；脑癌；口腔和咽癌；喉癌；小肠癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；绒毛状结肠腺瘤；瘤形成；上皮性质的瘤形成；淋巴瘤；乳腺癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；光化性角化病；肿瘤病包括实体瘤；颈或头肿瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；和具有髓样化生的骨髓纤维化伴骨髓化生。

在其他实施方案中，病症或障碍(例如PI3K-介导的)选自：表皮增殖过度、前列腺肥大、瘤形成、上皮性质的瘤形成、考登综合征、Lhermitte-Dudos病或Bannayan-Zonana综合征、哮喘、COPD、ARDS、勒夫勒综合征、嗜酸细胞性肺炎、寄生虫(特别是后生动物)侵染(包括热带肺嗜酸细胞增多)、支气管肺曲霉病、结节性多动脉炎(包括丘-斯综合征)、嗜酸细胞肉芽肿、由药物反应引起的影响气道的与嗜酸性细胞有关的障碍、银屑病、接触性皮炎、特应性皮炎、局限性脱发、多形性红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白癜风、变应性血管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、天疱疮(pemphisus)、后天性大疱性表皮松解、自身免疫性血液病(例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、系统性红斑狼疮、多发性软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、斯-琼氏综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、肺泡炎、慢性过敏性肺炎、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬化、(前和后)眼色素层炎、肺间质纤维化、银屑病关节炎、肾小球肾炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、深部静脉血栓形成、中风、心肌梗塞、不稳定心绞痛、血栓栓塞、肺栓塞、血栓溶解性疾病、急性动脉缺血、外周血栓性阻塞和冠状动脉疾病、再灌注损伤、视网膜病、例如糖尿病性视网膜病或高压氧引起的视网膜病以及以眼内压升高或眼房水分泌为特征的病症、例如青光眼。

对于以上应用，所需的剂量当然将根据施用方式、所治疗的具体病症和所期望的作用而改变。通常，以约0.03至10.0mg/kg体重的日剂量全身施用表明可获得满意的结果。较大哺乳动物、例如人中的指示日剂量的范围为约0.5mg至约1g，其方便地例如以一天最多四次的分份剂量或以缓释形式施用。适合于口服施用的单位剂量形式包含约0.1至500mg活性成分。

式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物可以通过任意常规途径施用，特别是经肠施用、例如口服施用，如以片剂或胶囊剂的形式施用，或经胃肠道外施用、例如以可注射的溶液或混悬液的形式施用，局部施用、例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂的形式施用，通过吸入施用，鼻内施用，或以栓剂形式施用。

式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物可以以游离形式或以可药用盐的形式、例如如上所示的那样施用。这类盐可以以常规方式来制备并且显示出与游离化合物相同级别的活性。

因此，本发明还提供了：

■在需要这类治疗的个体中预防或治疗通过激活PI3激酶α酶所介导的病症、障碍或疾病、例如以上所示的那些的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物或其可药用盐。

■游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物的用途，其例如在如本文所示的任意方法中作为药物。

■游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物，其例如在如本文所示的任意方法中用作药物，特别是用于一种或多种磷脂酰肌醇3-激酶介导的疾病。

■游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物在如本文所示的任意方法中的用途，特别是用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇3-激酶介导的疾病。

■游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物在如本文所示的任意方法中的用途，特别是在制备用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇3-激酶介导的疾病的药物中的用途。

PI3K用作整合平行的信号传导途径的第二信使节点，有证据正在表明，PI3K抑制剂和其他途径的抑制剂的组合将可用于治疗人类癌症和增殖性疾病。约20-30％的人乳腺癌过表达Her-2/neu-ErbB2(药物曲妥珠单抗的靶标)。虽然曲妥珠单抗在表达Her2/neu-ErbB2的一些患者中已经证明了持久的响应，但是只有部分这些患者有响应。近来的工作已经表明，该有限的响应速率可以通过曲妥珠单抗和PI3K或PI3K/AKT途径的抑制剂的组合来显著提高(Chan等人，Breast Can.Res.Treat.91：187(2005)，Woods Ignatoski等人，Brit.J.Cancer 82：666(2000)，Nagata等人，CancerCell 6：117(2004))。

多种人恶性瘤表达激活突变或增加Her1/EGFR水平，已经开发了许多抗体和小分子抑制剂来对抗该受体酪氨酸激酶，包括特罗凯、吉非替尼和爱必妥。但是，虽然EGFR抑制剂证明在某些人肿瘤(例如NSCLC)中具有抗肿瘤活性，可是它们不能在患有表达EGFR的肿瘤的所有患者中增加总的患者存活。这可以由如下事实来合理解释：Herl/EGFR的许多下游靶点在多种恶性瘤中以高频率发生突变或失调，包括PI3K/Akt途径。例如，吉非替尼在体外试验中可抑制腺癌细胞系的生长。但是，可以挑选出对吉非替尼有抗性的这些细胞系的亚克隆，这证明PI3/Akt途径的激活增加了。向下调节或抑制该途径使有抗性的亚克隆对吉非替尼敏感(Kokubo等人，Brit.J.Cancer 92：1711(2005))。而且，在具有含PTEN突变并且过表达EGFR的细胞系的乳腺癌的体外模型中，既抑制PI3K/Akt途径又抑制EGFR产生了协同作用(She等人，Cancer Cell 8：287-297(2005))。这些结果表明，吉非替尼和PI3K/Akt途径抑制剂的组合将是癌症中有吸引力的治疗策略。

AEE778(Her-2/neu/ErbB2、VEGFR和EGFR的抑制剂)和RAD001(mTOR(Akt的下游靶标)的抑制剂)的组合在成胶质细胞瘤异种移植物模型中产生了比单独的任一物质更大的组合效能(Goudar等人，Mol.Cancer.Ther.4：101-112(2005))。

抗雌激素剂如他莫昔芬可通过诱导细胞周期停滞(其需要细胞周期抑制物p27Kip的作用)而抑制乳腺癌生长。近来，已经表明Ras-Raf-MAP激酶途径的激活可改变p27Kip的磷酸化状态，结果其在使细胞周期停滞中的抑制活性被减弱，由此引起抗雌激素抗性(Donovan等人，J.Biol.Chem.276：40888，(2001))。如Donovan等人所报道的那样，通过用MEK抑制剂处理来抑制MAPK信号传导在激素抵抗的乳腺癌细胞系中逆转了p27的异常磷酸化状态，并且由此恢复了激素敏感性。类似地，通过Akt使p27Kip磷酸化也可取消其对使细胞周期停滞的作用(Viglietto等人，Nat Med.8：1145(2002))。

因此，在另一方面，式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物可用于治疗激素依赖性癌症、例如乳腺和前列腺癌。该应用的目标是用常规的抗癌剂来逆转这些癌症中常见的激素抗性。

在血液癌症如慢性髓性白血病(CML)中，染色体易位负责组成性激活的BCR-Abl酪氨酸激酶。受折磨的患者由于Abl激酶活性的抑制而对伊马替尼(小分子酪氨酸激酶抑制剂)作出响应。但是，患有晚期疾病的许多患者起初对伊马替尼有响应，可是后来由于在Abl激酶结构域中发生了给予抗性的突变而复发。体外研究已经表明，BCR-Ab1利用Ras-Raf激酶途径来引起其作用。此外，抑制相同途径中一种以上的激酶可提供另外的保护以防止给予抗性的突变。

因此，在另一方面，本发明提供了可与至少一种选自激酶抑制剂如

的另外的物质组合使用来治疗血液癌症如慢性髓性白血病(CML)的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物。通过该应用可知，目标是逆转或阻止对所述的至少一种另外的物质的抗性。

因为激活PI3K/Akt途径可驱动细胞存活，所以与驱动癌细胞中细胞凋亡的疗法(包括放射治疗和化学治疗)组合来抑制该途径将使响应提高(Ghobrial等人，CA Cancer J.Clin 55：178-194(2005))。作为实例，PI3激酶抑制剂和卡铂的组合表明在体外增殖和细胞凋亡试验中以及在卵巢癌的异种移植物模型的体内肿瘤效能中具有协同作用(Westfall和Skinner，Mol.Cancer Ther.4：1764-1771(2005))。

除了癌症和增殖性疾病外，有越来越多的证据表明1A和1B类PI3激酶的抑制剂将在治疗上可用于其他疾病领域。抑制p110β(PIK3CB基因的PI3K同工型产物)已经表明可参与剪切引起的血小板激活(Jackson等人，Nature Medicine 11：507-514(2005))。因此，抑制p110β的PI3K抑制剂将在抗血栓治疗中可用作单独的药物或可组合使用。同工型p110

(PIK3CD基因的产物)在B细胞功能和分化(Clayton等人，J.Exp.Med.196：753-763(2002))、T细胞依赖性和非依赖性抗原响应(Jou等人，Mol.Cell.Biol.22：8580-8590(2002))及肥大细胞分化(Ali等人，Nature 431：1007-1011(2004))中是重要的。因此，期望p110δ抑制剂将可用于治疗B细胞驱动的自身免疫性疾病和哮喘。最后，抑制p110γ(PI3KCG基因的同工型产物)使T细胞而非B细胞响应减少(Reif等人，J.Immunol.173：2236-2240(2004))，这种抑制证明在自身免疫性疾病的动物模型中具有效能(Camps等人，Nature Medicine 11：936-943(2005)，Barber等人，Nature Medicine11：933-935(2005))。

本发明还提供了药物组合物，其包含单独的或者与另一种治疗剂例如另一种抗癌剂一起的至少一种式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及适于施用于人或动物个体的可药用赋形剂。

本发明还提供了治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物个体的方法。因此，本发明提供了治疗需要这类治疗的人或动物个体的方法，包括给该个体单独施用或者与一种或多种其他抗癌剂组合施用治疗有效量的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物。特别是组分将被配制在一起作为组合治疗剂或者分别施用。适于与式I化合物使用的抗癌剂包括但不限于一种或多种选自以下所述的激酶抑制剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂、其他抑制剂、癌症化疗药物、烷化剂、螯合剂、生物效应调节剂、癌症疫苗、用于反义治疗的物质：

A.激酶抑制剂：_作为抗癌剂与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的激酶抑制剂包括：表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂，例如小分子喹唑啉类如吉非替尼(US 5457105、US 5616582和US 5770599)、ZD-6474(WO 01/32651)、厄洛替尼(

US 5,747,498和WO96/30347)和lapatinib(US 6,727,256和WO 02/02552)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制剂，包括SU-11248(WO 01/60814)、SU 5416(US5,883,113和WO 99/61422)、SU 6668(US 5,883,113和WO 99/61422)、CHIR-258(US 6,605,617和US 6,774,237)、伐他拉尼或PTK-787(US6,258,812)、VEGF-Trap(WO 02/57423)、B43-染料木黄酮(WO-09606116)、芬维A胺(维甲酸对-羟基苯胺)(US 4,323,581)、IM-862(WO 02/62826)、贝伐单抗或

(WO 94/10202)、KRN-951、3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、AG-13736和AG-13925、吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪、ZK-304709、VMDA-3601、EG-004、CEP-701(US 5,621,100)、Cand5(WO 04/09769)；Erb2酪氨酸激酶抑制剂，例如pertuzumab(WO01/00245)、曲妥珠单抗和利妥昔单抗；Akt蛋白激酶抑制剂，例如RX-0201；蛋白激酶C(PKC)抑制剂，例如LY-317615(WO 95/17182)和哌立福辛(US2003171303)；Raf/Map/MEK/Ras激酶抑制剂，包括索拉非尼(BAY43-9006)、ARQ-350RP、LErafAON、BMS-354825AMG-548，和在WO03/82272中公开的其他化合物；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶抑制剂；细胞依赖性激酶(CDK)抑制剂，包括CYC-202或roscovitine(WO97/20842和WO 99/02162)；血小板衍生生长因子受体(PDGFR)激酶抑制剂，例如CHIR-258、3G3mAb、AG-13736、SU-11248和SU6668；以及Bcr-Abl激酶抑制剂和融合蛋白如STI-571或(伊马替尼)。

B.抗雌激素剂：_在抗癌治疗中与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的雌激素靶向的物质包括：选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬；芳香酶抑制剂，包括

或阿那曲唑；雌激素受体负调节物(ERD)，包括

或氟维司群。

C.抗雄激素剂：_在抗癌治疗中与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的雄激素靶向的物质包括氟他胺、比卡鲁胺、非那雄胺、氨鲁米特、酮康唑和皮质类固醇。

D.其他抑制剂：_作为抗癌剂与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的其他抑制剂包括：蛋白法尼基转移酶抑制剂，包括替匹法尼或R-115777(US 2003134846和WO 97/21701)、BMS-214662、AZD-3409和FTI-277；拓扑异构酶抑制剂，包括merbarone和二氟替康(BN-80915)；有丝分裂纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂，包括SB-743921和MKI-833；蛋白酶体调节剂，例如硼替佐米或

(US 5,780,454)、XL-784；和环加氧酶2(COX-2)抑制剂，包括非甾体抗炎药I(NSAID)。

E.癌症化疗药物：作为抗癌剂与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的具体的癌症化学治疗剂包括阿那曲唑

比卡鲁胺

硫酸博来霉素

白消安

白消安注射液

卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂

卡莫司汀

苯丁酸氮芥

顺铂

克拉屈滨

环磷酰胺(

或

)、阿糖胞苷、阿糖胞苷(Cytosar-

)、阿糖胞苷脂质体注射液

达卡巴嗪(DTIC-

)、放线菌素D(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素

枸橼酸柔红霉素脂质体注射液(Dauno

)、地塞米松、多西他赛(

US 2004073044)、盐酸多柔比星(

)、依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶

氟他胺

tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺

伊立替康

L-门冬酰胺酶

亚叶酸钙、美法仑

6-巯基嘌呤

甲氨蝶呤

米托蒽醌

麦罗塔、紫杉醇

phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物

枸橼酸他莫昔芬替尼泊苷

6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明

注射用盐酸托泊替康长春碱

长春新碱

和长春瑞滨

F.烷化剂：_与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的烷化剂包括VNP-40101M或cloretizine、奥沙利铂(US 4,169,846、WO 03/24978和WO 03/04505)、葡磷酰胺、马磷酰胺、凡毕复(US 5,041,424)、泼尼莫司汀；曲奥舒凡；白消安；irofluven(酰基富烯)；penclomedine；吡唑并吖啶(PD-115934)；O6-苄基鸟嘌呤；地西他滨(5-氮杂-2-脱氧胞苷)；brostallicin；丝裂霉素C(MitoExtra)；TLK-286

；替莫唑胺；曲贝替定(US 5,478,932)；AP-5280(顺铂的铂酸盐制剂)；泊非霉素；和clearazide(meclorethamine)。

G.螯合剂：_与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的螯合剂包括四硫钼酸盐(WO 01/60814)；RP-697；嵌合T84.66(cT84.66)；钆膦维司(gadofosveset)

去铁胺；以及任选与电穿孔法(EPT)组合的博来霉素。

H.生物效应调节剂：_与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的生物效应调节剂、例如免疫调节剂包括：星型包菌素(staurosprine)及其大环类似物，包括UCN-01、CEP-701和米哚妥林(参见WO 02/30941、WO 97/07081、WO 89/07105、US 5,621,100、WO 93/07153、WO 01/04125、WO 02/30941、WO 93/08809、WO 94/06799、WO 00/27422、WO 96/13506和WO 88/07045)；角鲨胺(WO 01/79255)；DA-9601(WO 98/04541和US6,025,387)；阿仑单抗；干扰素(例如IFN-a、IFN-b等)；白细胞介素，特别是IL-2或阿地白介素以及IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12，及具有大于70％天然人序列的氨基酸序列的其活性生物变体；六甲蜜胺

SU 101或来氟米特(WO 04/06834和US 6,331,555)；咪唑并喹啉，例如瑞喹莫德和咪喹莫特(US 4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612)；以及SMIP，包括苯并唑类、蒽醌类、缩氨基硫脲类和色胺酮类(WO 04/87153、WO 04/64759和WO04/60308)。

I.癌症疫苗：_与式(I)、(IA)、(IB)和/或(IC)化合物联合使用的抗癌疫苗包括

(Tetrahedron Lett.26：2269-70(1974))；oregovomab

(STn-KLH)；黑素瘤疫苗；针对Ras蛋白中5个突变的GI-4000系列(GI-4014、GI-4015和GI-4016)；GlioVax-1；MelaVax；

或INGN-201(WO 95/12660)；Sig/E7/LAMP-1，编码HPV-16E7；MAGE-3疫苗或M3TK (WO 94/05304)；HER-2VAX；刺激对肿瘤特异的T细胞的ACTIVE；GM-CSF癌症疫苗；和基于李斯特菌属(Listeria)单细胞质基因的疫苗。

J.反义治疗：_与式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物联合使用的抗癌剂还包括反义组分，例如AEG-35156(GEM-640)；AP-12009和AP-11014(TGF-β2特异性反义寡核苷酸)；AVI-4126；AVI-4557；AVI-4472；oblimersenJFS2；aprinocarsen (WO 97/29780)；GTI-2040(R2核糖核苷酸还原酶mRNA反义寡核苷酸)(WO 98/05769)；GTI-2501(WO 98/05769)；脂质体包囊的c-Raf反义寡脱氧核苷酸(LErafAON)(WO98/43095)；和Sirna-027(基于RNAi的靶向于VEGFR-1mRNA的治疗剂)。

式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物还可以在药物组合物中与支气管扩张或抗组胺药物组合。这类支气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱剂，特别是格隆溴铵、异丙托溴铵、氧托溴铵和噻托溴铵、OrM3、aclidinium、CHF5407、GSK233705，以及β-2-肾上腺素受体激动剂，例如沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗、卡莫特罗(carmoterol)、milveterol以及尤其是茚达特罗(indacaterol)和福莫特罗。共同治疗的抗组胺药物包括盐酸西替利嗪、富马酸氯马斯汀、异丙嗪、氯雷他定、地氯雷他定、苯海拉明和盐酸非索非那定。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及一种或多种可用于治疗血栓性疾病、心脏病、中风等的化合物。这类化合物包括阿司匹林、链激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、尿激酶、抗凝血剂、抗血小板药(例如PLAVIX；氯吡格雷硫酸氢盐)、他汀类化合物(例如LIPITOR或阿托伐他汀钙、ZOCOR(辛伐他汀)、CRESTOR(罗苏伐他汀)等)、β阻滞剂(例如阿替洛尔)、NORVASC(苯磺酸氨氯地平)和ACE抑制剂(例如赖诺普利)。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)合物以及一种或多种可用于治疗高血压的化合物。这类化合物包括ACE抑制剂、降脂药物如他汀类、LIPITOR(阿托伐他汀钙)、钙通道阻滞剂如NORVASC(苯磺酸氨氯地平)。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及一种或多种选自贝特类(fibrates)、β-阻滞剂、NEPI抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂和血小板聚集抑制剂的化合物。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及适于治疗炎性疾病、包括类风湿性关节炎的化合物。这类化合物可以选自TNF-α抑制剂如抗-TNF-α单克隆抗体(例如REMICADE、CDP-870)和D2E7(HUMIRA)及TNF受体免疫球蛋白融合分子(例如ENBREL)、IL-1抑制剂、受体拮抗剂或可溶性IL-1Rα(例如KINERET或ICE抑制剂)、非甾体抗炎剂(NSAIDS)、吡罗昔康、双氯芬酸、萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬布洛芬、灭酸酯类(fenamates)、甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮类、保泰松、阿司匹林、COX-2抑制剂(例如CELEBREX(塞来考昔)、PREXIGE(芦米考昔))、金属蛋白酶抑制剂(优选MMP-13选择性抑制剂)、p2x7抑制剂、α2α抑制剂、NEUROTIN、普瑞巴林、低剂量甲氨蝶呤、来氟米特、羟氯喹、d-青霉胺、金诺芬或者胃肠道外或口服金。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及适于治疗骨关节炎的化合物。这类化合物可以选自标准的非甾体抗炎剂(下文为NSAID)如吡罗昔康、双氯芬酸、丙酸类如萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬和布洛芬、灭酸酯类如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮类如保泰松、水杨酸类如阿司匹林、COX-2抑制剂如塞来考昔、伐地考昔、芦米考昔和艾托考昔、镇痛药以及关节内治疗剂如皮质类固醇及透明质酸如海尔根和欣维可。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及抗病毒剂和/或抗菌化合物。所述抗病毒剂可以选自奈非那韦(Viracept)、AZT、阿昔洛韦和泛昔洛韦。所述抗菌化合物可以选自Valant。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及一种或多种选自如下的物质：CNS药物，例如抗抑郁药(舍曲林)、抗帕金森症药(例如地普雷尼尔、L-多巴、Requip、Mirapex；MAOB抑制剂(例如司来吉兰(selegine)和雷沙吉兰)；comP抑制剂(例如Tasmar)；A-2抑制剂；多巴胺重吸收抑制剂；NMDA拮抗剂；烟碱激动剂；多巴胺激动剂；和神经元的一氧化氮合酶抑制剂)。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及一种或多种抗阿尔茨海默病药物。这类抗阿尔茨海默病药物可以选自多奈哌齐、他克林、α2δ抑制剂、NEUROTIN、普瑞巴林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或metryfonate。

在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及骨质疏松症药物和/或免疫抑制剂。这类骨质疏松症药物可以选自EVISTA(盐酸雷洛昔芬)、屈洛昔芬、拉索昔芬或fosomax。这类免疫抑制剂可以选自FK-506和雷帕霉素。

在优选实施方案的另一方面，提供了药盒，其包括一种或多种式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物和如本文公开的组合伙伴。代表性药盒包括PI3K抑制剂化合物(例如式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物)以及包装插页或其他标签、包括通过施用PI3K抑制量的化合物来治疗细胞增殖性疾病的说明书。

通常，式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物将以治疗有效量、通过对任何发挥类似功效的物质而言可接受的施用方式来施用。式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物、即活性成分的实际量将取决于多种因素，例如所治疗疾病的严重性、个体的年龄和相对健康、所用化合物的效能、施用的途径和形式以及其他因素。药物可以一天施用一次以上，优选一天施用一次或两次。所有这些因素都在主治医师的技能之内。式I化合物的治疗有效量的范围可以在约0.05至约50mg/公斤受者体重/天；优选约0.1-25mg/kg/天，更优选约0.5至10mg/kg/天。因此，对于施用于70kg的人而言，剂量范围将最优选为约35-70mg/天。

通常，式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物将作为药物组合物、通过任意一种以下途径施用：口服、全身(例如透皮、鼻内或通过栓剂)或胃肠道外(例如肌内、静脉内或皮下)施用。优选的施用方式是使用方便的日剂量方案进行口服，所述的日剂量方案可以根据病痛的程度进行调整。组合物可以采取片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉末、缓释制剂、溶液、混悬液、酏剂、气雾剂的形式或任意其他适当的组合物。另一种优选的施用式I化合物的方式是吸入。这是将治疗剂直接传递到呼吸道的有效方法。

制剂的选择取决于多种因素，例如药物施用的方式和药物物质的生物利用度。对于通过吸入传递而言，化合物可以被配制成液体溶液、混悬液、气雾喷射剂或干粉，并且可以被装入适于施用的分配器中。有数种类型的药物吸入装置-喷雾器吸入器、定量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。喷雾器装置可产生高速空气流，使治疗剂(以液体形式配制)喷成薄雾，其被带入患者的呼吸道。MDI通常是用压缩气体包装的制剂。启动后，该装置通过压缩气体释放出定量的治疗剂，由此提供施用指定量的物质的可靠方法。DPI可分配自由流动的粉末形式的治疗剂，这些治疗剂可以在通过该装置进行呼吸的过程中被分散到患者的吸入气流中。为了获得自由流动的粉末，治疗剂可与赋形剂如乳糖进行配制。定量的治疗剂以胶囊形式贮存，并且用每次启动进行分配。

本发明还涉及其中式I化合物的粒度在10-1000nm、优选10-400nm之间的制剂。尤其对于显示出生物利用度差的药物，根据可以通过增加表面积、即减小粒度来提高生物利用度的原理，已经开发了这类药物制剂。例如，U.S.4,107,288描述了具有大小范围为10至1,000nm的颗粒的药物制剂，其中活性物质被支持在交联的大分子基质上。U.S.5,145,684描述了药物制剂的制备，其中在表面修饰剂的存在下药物物质被粉碎成纳米粒(平均粒度为400nm)，然后被分散在液体介质中，得到显示出非常高的生物利用度的药物制剂。这两篇文献均被包括在内作为参考。

在另外的方面，本发明提供了药物组合物，其包含(治疗有效量)的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及至少一种可药用赋形剂。可接受的赋形剂是无毒的、可帮助施用并且不会不利地影响式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物的治疗益处。这类赋形剂可以是任意固体、液体、半固体，或者对于气雾剂组合物而言可以是通常是本领域技术人员可得到的气体赋形剂。

固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。

液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和多种油类、包括石油、动物、植物或合成来源的那些、例如花生油、大豆油、矿油、芝麻油等。特别用于可注射溶液的优选的液体载体包括水、盐水、葡萄糖水溶液和二醇类。

压缩气体可以用于分散气雾剂形式的式I化合物。适于该目的的惰性气体有氮气、二氧化碳等。其他适宜的药物赋形剂及其制剂在E.W.Martin编写的《雷氏药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(马克(Mack)出版公司，第18版，1990)中有描述。

制剂中化合物的量可以在本领域技术人员所采用的全部范围内改变。通常，基于重量百分数(重量％)计算，制剂将含有约0.01-99.99重量％的式I化合物(基于总制剂计算)，而剩余物质为一种或多种适宜的药物赋形剂。优选化合物以约1-80重量％的水平存在。

本发明还涉及药物组合物，其包含(即含有或由...组成)至少一种式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及至少一种可药用赋形剂。

包含游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及至少一种可药用赋形剂(例如载体和/或稀释剂)的药物组合物可以按照常规方式、通过将组分混合来制备。

包含游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物并且还包含组合伙伴(为一种剂量单位形式或作为成套药盒)以及至少一种可药用的载体和/或稀释剂的组合的药物组合物可以按照常规方式、通过将可药用的载体和/或稀释剂与所述的活性成分混合来制备。

因此，在另外的方面，本发明提供了：

■例如用于本文描述的任意方法的组合的药物组合物，其包含游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及可药用的稀释剂和/或载体。

■组合的药物组合物，其包含作为活性成分的游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物；一种或多种可药用的载体物质和/或稀释剂以及任选的一种或多种另外的药物物质。这类组合的药物组合物可以是一种剂量单位形式或作为成套药盒。

■组合的药物组合物，其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物以及第二种药物物质，它们可同时或依次施用。

■如上定义的方法，该方法包括共同施用、例如同时或依次施用治疗有效的无毒量的式(I)、(IA)、(IB)和/或(IC)化合物或其可药用盐以及至少第二种药物物质、例如如上所示的第二种药物物质。

■药物组合产品，例如药盒，其包含a)第一种物质，它是游离形式或可药用盐形式的如本文公开的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物，和b)至少一种共用药物、例如如上所示的共用药物；其中这类药盒可以包含其施用说明书。

以下的式(I)、(IA)、(IB)、(IB’)和/或(IC)化合物的实施例说明了本发明而非限制其范围。描述了制备这类化合物的方法。

温度以摄氏度测定。除非另有说明，反应在rt和氩气气氛中进行。使用ESI得到MS。在中间体和实施例的制备中使用了以下HPLC和LC-MS方法：

HPLC(方法A)：

系统：Agilent 1100Series

柱：HP Hypersil BDS C18，4x 125mm，5微米

温度：25℃

洗脱剂A：H₂O，包含0.1％v/v TFA

洗脱剂B：乙腈，包含0.1％v/v TFA

梯度：在5min从10％→100％B，2.5min100％B，然后在1min→10％B

流速：1.5mL/min

检测：UV 215nm

HPLC (方法B)：

系统：Agilent 1100 Series

柱：Macherey-Nagel Nucleosil 100-3C18HD，4x 125mm，3微米

温度：30℃

洗脱剂A：H₂O，包含0.1％v/v TFA

洗脱剂B：乙腈，包含0.1％v/v TFA

梯度：在7min从2％→100％B，2min100％B，然后在1min→2％B，

流速：1.0mL/min

检测：UV 215nm

LC-MS(方法A)：

系统：Waters Acquity UPLC与Waters Micromass ZQ 2000ESI+/-

柱：Acquity HSS T3C18，2.1x 50mm，1.8微米

温度：50℃

洗脱剂A：H₂O，包含0.05％v/v HCOOH和3.75mM乙酸铵

洗脱剂B：乙腈，包含0.04％HCOOH

梯度：在4.3min从2％→98％B，0.7min98％B，然后在0.1min→2％

B，并在0.9min用2％B洗脱

流速：1.0mL/min

LC-MS (方法B)：

系统：Agilent 1100 Series；MS：G1946D

柱：Symmetry C8，2.1x 50mm，3.5微米

洗脱剂A：H2O，包含0.1％v/v HCOOH

洗脱剂B：乙腈，包含0.1％v/v HCOOH

梯度：0-3.3min：5％-95％的B

流速：1.0mL/min

LC-MS(方法C)：

系统：Waters Acquity UPLC

柱：Acquity HSS T3C18，2.1x 50mm，1.8微米

洗脱剂A：H₂O，包含0.05％v/v HCOOH和0.05％乙酸铵

洗脱剂B：乙腈，包含0.04％HCOOH

梯度：1.7min从2％→98％B，0.45min98％B，然后在0.04min→2％B，

流速：1.2ml/min

LC-MS(方法D)：

系统：Waters Aquity UPLC；MS：Waters AQ Detector

柱：Aquity HSS，1.8μm 2.1x 50mm，3/pk

洗脱剂A：H₂O，包含0.1％v/v HCOOH

洗脱剂B：乙腈，包含0.1％v/v HCOOH

梯度：0-1.5min：10％-95％d B，然后1min：95％B

流速：1.2mL/min

ESI-MS：

仪器：Micromass Platform II

洗脱剂：包含0.2％v/v 25％氢氧化铵溶液的15％v/v甲醇水溶液

流速：0.05mL/min

在如下实施例中，使用下列给出的缩写：

atm. 大气压

CDI 1，1′-羰基二咪唑

CH₂Cl₂ 二氯甲烷

DCE 1，2-二氯乙烷

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

Et₂O 乙醚

EtOAc 乙酸乙酯

EtOH 乙醇

Et₃N 三乙胺

eq 当量

h 小时

Hex 己烷

HPLC 高效液相色谱法

HV 高度真空

LC-MS 偶联质谱法的液相色谱法

LiHMDS 双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂

MeOH 甲醇

mL 毫升

min 分钟

MS-ESI 电喷雾电离质谱

MTBE 甲基叔丁基醚

MW 微波

R_f TLC中的前沿比

rt 室温

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱法

t_R 保留时间

UV 紫外线

实施例1：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

在rt将Et₃N(0.53mmol)加入到咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺(步骤1.1)(0.177mmol)和(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤1.8)(0.194mmol)在DMF(1mL)中的混合物中。搅拌20h后，浓缩该反应混合物，使用

硅胶柱纯化残余物，然后与EtOAc一起研磨，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝4.27min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.34min，[M+H]⁺400(方法A)；TLC：R_f＝0.12(95∶5CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.92(br s，1H)，8.41(d，1H)，7.38(br s，1H)，7.28(s，1H)，7.16(d，1H)，6.98(br s，1H)，4.15(m，1H)，3.69(m，1H)，3.37(m，1H)，2.40(s，3H)，2.36(m，1H)，1.95(m，1H)，1.69(m，1H)，1.48(s，3H)，1.18(m，2H)，0.98(d，3H)，0.80(m，2H)。

步骤1.1：咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺

将4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基胺(步骤1.2)(28.5mmol)和CDI(42.8mmol)在CH₂Cl₂(330mL)中的混合物回流11h。冷却至rt后，过滤该反应混合物，得到标题化合物，为淡绿色固体。

步骤1.2：4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基胺

将N-{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-乙酰胺(步骤1.3)(34.8mmol)、6N HCl水溶液(53mL)和EtOH(265mL)的混合物在85℃搅拌5h，冷却至rt，然后浓缩。缓慢用NaHCO₃饱和溶液稀释残余物，然后用EtOAc(3X)萃取。依次用NaHCO₃饱和溶液和盐水洗涤合并的有机相，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。将残余物与CH₂Cl₂一起研磨，然后过滤，得到标题化合物，为黄-绿色固体。HPLC：t_R＝3.55min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.03min，[M+H]⁺ 246；TLC：R_f＝0.26(1∶2己烷/EtOAc)。

步骤1.3：N-{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-乙酰胺

将2-乙酰氨基-4-甲基噻唑[7336-51-8](60.4mmol)、碳酸铯(110mmol)、三-叔钉基膦

四氟硼酸盐(10.99mmol)、乙酸钯(II)(5.49mmol)和4-溴-2-(1-甲基-环丙基)-吡啶(步骤1.4)(54.9mmol)在DMF(230mL)中的混合物在100℃搅拌3.5h。冷却至rt后，过滤该反应混合物，然后浓缩。用NaHCO₃饱和溶液稀释残余物，用EtOAc(3X)萃取。依次用NaHCO₃饱和溶液和盐水洗涤合并的有机相，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。使用硅胶柱纯化残余物，得到标题化合物，为淡黄色固体。HPLC：t_R＝4.37min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.47 min，[M+H]⁺ 288；TLC：R_f＝0.26(1∶2己烷/EtOAc)。

步骤1.4：4-溴-2-(1-甲基-环丙基)-吡啶

将2-(1-甲基-环丙基)-1H-吡啶-4-酮(步骤1.5)(13.4mmol)和POBr₃(14.74mmol)的混合物在85℃搅拌，然后在120℃搅拌15min。轻微冷却后，将该反应混合物倾入NaHCO₃饱和溶液，用CH₂Cl₂(2X)萃取。用NaHCO₃饱和溶液洗涤合并的有机相，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到标题化合物，为棕色油状物。HPLC：t_R＝4.11min(方法B)；LC-MS：t_R＝2.39min，[M+H]⁺ 212/214；TLC：R_f＝0.31(CH₂Cl₂)。

步骤1.5：2-(1-甲基-环丙基)-1H-吡啶-4-酮

将2-(1-甲基-环丙基)-吡喃-4-酮(步骤1.6)(66.6mmol)和28-30％氢氧化铵水溶液(182mL)的混合物在65℃搅拌1h。冷却至rt后，滗析该反应混合物，以除去深棕色固体，然后浓缩。用MeOH稀释残余物，再浓缩(3X)，得到标题化合物，为棕-橙色固体。HPLC：t_R＝3.56min(方法B)；LC-MS：t_R＝0.87min，[M+H]⁺ 151；TLC：R_f＝0.18(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)。

步骤1.6：2-(1-甲基-环丙基)-吡喃-4-酮

将(1Z，4E)-1-羟基-5-甲氧基-1-(1-甲基-环丙基)-戊-1，4-二烯-3-酮(步骤1.7)(111mmol)和TFA(221mmol)在甲苯(175mL)中的混合物在rt搅拌15.5h，然后浓缩。使用

硅胶柱纯化残余物，得到标题化合物，为白色固体。LC-MS：t_R＝1.48min，[M+H]⁺ 151；TLC：R_f＝0.26(EtOAc)。

步骤1.7：(1Z，4E)-1-羟基-5-甲氧基-1-(1-甲基-环丙基)-戊-1，4-二烯-3-酮

在-78℃将LiHMDS(1M在THF中，845mmol)滴加到反式-4-甲氧基-3-丁烯-2-酮[51731-17-0](845mmol)在THF(2L)中的溶液中。搅拌15min后，加入1-甲基-环丙烷羰基氯[16480-05-0](407mmol)在THF(100mL)中的溶液。将得到的混合物在2.5h内温热至rt，然后通过添加NH₄Cl饱和溶液停止反应。用Et₂O(2X)萃取该混合物。依次用NaHCO₃饱和溶液和盐水洗涤合并的有机相，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到标题化合物，为黄色固体。ESI-MS：[M+H]⁺ 183；TLC：R_f＝0.29(9∶1己烷/EtOAc)。

步骤1.8：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺

将(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤1.9)(4.76mmol)和10％Pd/活性炭(0.947mmol)在MeOH(20mL)中的混合物在rt氢化46h。然后使将该反应混合物通过Fluoropore薄膜滤器(0.2μm FG)过滤，蒸发。将残余物溶于CH₂Cl₂，蒸发至干，得到标题化合物，为白色固体。ESI-MS：[M+H]⁺ 129；TLC：R_f＝0.10(1∶3己烷/EtOAc)。

步骤1.9：(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

在0℃将三甲基铝的甲苯溶液(2M，6.46mmol)滴加到NH₄Cl(6.47mmol)在甲苯(3.2mL)中的混合物中，形成甲烷气体。将该反应混合物温至rt，再搅拌15min，然后缓慢用(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯(如Tet.Lett.1997，38，85-88中所述制备)(6.47mmol)处理。搅拌56h后，将该混合物冷却至0℃，用1M HCl停止反应，然后用CH₂Cl₂(3X)洗涤。用NaHCO₃饱和溶液碱化水相，用CH₂Cl₂(3X)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤，浓缩。使用

硅胶柱纯化残余物，得到标题化合物，为无色油状物。ESI-MS：[M+H]⁺ 233；HPLC：t_R 2.35min(方法A)。

实施例2：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但在步骤1.7中，3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤2.1)用于替代1-甲基-环丙烷羰基氯。

得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝5.16min(方法B)；LC-MS：t_R＝2.29min，[M+H]⁺456(方法A)；TLC：R_f＝0.17(95∶5CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.98(br s，1H)，8.59(d，1H)，7.54(s，1H)，7.40(d，1H)，7.39(br s，1H)，6.98(br s，1H)，4.15(m，1H)，3.69(m，1H)，3.37(m，1H)，2.40(s，3H)，2.36(m，1H)，1.95(m，1H)，1.69(m，1H)，1.61(s，6H)，0.97(d，3H)。

步骤2.1：3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯

在rt将DMF(3滴)加入到3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酸[889940-13-0](179mmol)在CH₂Cl₂(160mL)中的溶液中。缓慢加入草酰氯(197mmol)的CH₂Cl₂(20mL)溶液。搅拌14h后，谨慎蒸发该反应混合物(500mbar，33℃)，得到标题化合物(挥发性物质！)，为黄色溶液。

实施例3：(外消旋)-3，3-二甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但(外消旋)-3，3-二甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(如J.Org.Chem.，2008，73，3946-3949中所述制备)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为黄色固体。HPLC：t_R＝2.90min(方法A)；LC-MS：t_R＝1.32min，[M+H]⁺ 414(方法A)；TLC：R_f＝0.17(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.97(br s，1H)，8.43(d，1H)，7.39(m，2H)，7.31(br s，1H)，6.97(m，1H)，3.82(m，1H)，3.65(m，1H)，3.46(m，1H)，2.43(s，3H)，1.86(m，1H)，1.62(m，1H)，1.48(s，3H)，1.19(m，2H)，1.04(s，3H)，0.99(s，3H)，0.85(m，2H)。

实施例4：(外消旋)-3，3-二甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例2中所述类似的方法制备标题化合物，但(外消旋)-3，3-二甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(如J.Org. Chem.，2008，73，3946-3949中所述制备)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为黄色固体。HPLC：t_R＝5.38min(方法B)；LC-MS：t_R＝2.12min，[M+H]⁺470(方法A)；TLC：R_f＝0.12(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.93(br s，1H)，8.58(d，1H)，7.54(s，1H)，7.39(d，1H)，7.39(br s，1H)，6.97(br s，1H)，3.82(m，1H)，3.65(m，1H)，3.46(m，1H)，2.39(s，3H)，1.86(m，1H)，1.61(m，1H)，1.59(s，6H)，1.04(s，3H)，1.00(s，3H)。

实施例5：(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤5.1)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝4.00min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.04min，[M+H]⁺ 457(方法A)；TLC：R_f＝0.17(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.96(br s，1H)，8.42(d，1H)，7.80(br s，1H)，7.49(br s，1H)，7.29(s，1H)，7.17(d，1H)，7.10(br s，1H)，4.25(m，1H)，3.72(m，1H)，3.37(m，1H)，3.23(m，1H)，2.92(m，1H)，2.41(s，3H)，2.39(m，1H)，2.00(m，1H)，1.82(s，3H)，1.73(m，1H)，1.49(s，3H)，1.19(m，2H)，0.81(m，2H)。

步骤5.1：(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.8中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤5.2)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺。此外，用50％H2O(Aldrich 330108)湿润的10％Pd/活性炭用于替代干燥催化剂。

得到标题化合物，为黄白色固体。ESI-MS：[M+H]⁺186；TLC：R_f＝0.08(200∶20∶1CH₂Cl₂/MeOH/浓NH₄OH)。

步骤5.2：(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

在rt将硫代乙酸(2.312mmol)加入到(2S，3S)-3-叠氮基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤5.3)(0.578mmol)中，形成氮气。搅拌16h后，用Et₂O稀释该反应混合物，通过过滤除去固体，浓缩滤液。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到标题化合物，为淡黄色油状物(硫醇气味)。HPLC：t_R＝3.71min(方法B)；LC-MS：t_R＝0.64min，[M+H]⁺ 290；TLC：R_f＝0.38(200∶20∶1CH₂Cl₂/MeOH/浓NH₄OH)。

步骤5.3：(2S，3S)-3-叠氮基甲基-1-(((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.9中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-叠氮基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯(步骤5.4)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯。此外，1∶1NaHCO₃饱和溶液/罗谢尔盐饱和溶液用于碱化，用THF彻底地萃取碱化的水层。

得到标题化合物，为黄色油状物。HPLC：t_R＝2.50min(方法A)；ESI-MS：[M+H]⁺ 274；TLC：R_f＝0.26(3∶1己烷/EtOAc)。

步骤5.4：(2S，3S)-3-叠氮基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯

在rt将叠氮化钠(5.34mmol)加入到(2S，3R)-3-碘甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯(步骤5.5)(3.56mmol)在DMF(30mL)中的溶液中。18h后，将该反应混合物倾倒在水上，用MTBE(2X)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。使用

硅胶柱纯化残余物，得到标题化合物，为棕色油状物。HPLC：t_R＝3.26min(方法A)；ESI-MS：[M+H]⁺ 289。

步骤5.5：(2S，3R)-3-碘甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯

在-78℃将[丁-3-烯基-((S)-1-苯基-乙基)-氨基]-乙酸甲酯[432555-77-6](20.22mmol)在THF(10mL)中的溶液缓慢加入到二异丙基氨基锂(24.26mmol)在1：2己烷/THF(30mL)中的溶液中。将该反应混合物温至0℃，搅拌1h，然后再冷却至-78℃。加入溴化锌(50.5mmol)的Et₂O(40mL)溶液，然后将该反应混合物温至rt。搅拌1h后，将该混合物冷却至0℃，分部分加入碘(22.24mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌2h，在rt再搅拌2h，用Et₂O稀释，然后依次用Na₂S₂O₃饱和溶液和NH₄Cl饱和溶液洗涤。用Et₂O各自反萃取水层。干燥(Na₂SO₄)合并的有机相，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到标题化合物，为红色油状物。HPLC：t_R＝3.46min(方法A)；ESI-MS：[M+H]⁺374。

实施例6：(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例2中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤5.1)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝4.73/4.78min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.81min，[M+H]⁺ 513(方法A)；TLC：R_f＝0.17(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：11.05(br s，1H)，8.59(d，1H)，7.80(br s，1H)，7.55(s，1H)，7.49(br s，1H)，7.40(m，1H)，7.10(br s，1H)，4.25(m，1H)，3.72(m，1H)，3.39(m，1H)，3.23(m，1H)，2.92(m，1H)，2.41(s，3H)，2.39(m，1H)，2.00(m，1H)，1.82(s，3H)，1.72(m，1H)，1.61(s，6H)。

实施例7：(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤7.1)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为淡黄色固体。HPLC：t_R＝2.39min(方法A)；LC-MS：t_R＝0.90min，[M+H]⁺485(方法A)；TLC：R_f＝0.09(19∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.90(br s，1H)，8.41(d，1H)，7.35(br s，1H)，7.29(s，1H)，7.17(d，1H)，7.02(br s，1H)，4.26(br s，1H)，3.69(m，1H)，3.58(m，4H)，3.40(m，1H)，2.58(m，1H)，2.41(s，3H)，2.38(m，4H)，2.35(m，1H)，2.17(m，1H)，2.00(m，1H)，1.75(m，1H)，1.49(s，3H)，1.19(m，2H)，0.81(m，2H)。

步骤7.1：(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.8中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤7.2)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺。此外，用50％H2O(Aldrich 330108)湿润的10％Pd/活性炭用于替代干燥催化剂。

得到标题化合物，为无色油状物。ESI-MS：[M+H]⁺214；TLC：R_f＝0.14(200∶20∶1CH₂Cl₂/MeOH/浓NH₄OH)。

步骤7.2：(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.9中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯(步骤7.3)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯。此外，用THF而不是CH₂Cl₂彻底萃取碱化的水层。

得到标题化合物，为黄色油状物。HPLC：t_R＝2.18min(方法A)；ESI-MS：[M+H]⁺318。

步骤7.3：(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯

将(2S，3R)-3-碘甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯(步骤5.5)(7.07mmol)、K₂CO₃(21.22mmol)和吗啉(10.61mmol)在乙腈(24mL)中的混合物在50℃搅拌62h。将该反应混合物倾倒在冰水上，用EtOAc(3X)萃取。依次用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。使用

硅胶柱纯化残余物，得到标题化合物，为黄色油状物。HPLC：t_R＝2.56min(方法A)；ESI-MS：[M+H]⁺ 333。

实施例8：(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例2中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤7.1)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为黄色泡沫。HPLC：t_R＝4.81min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.53min，[M+H]⁺541(方法A)；TLC：R_f＝0.22(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：11.02(br s，1H)，8.60(d，1H)，7.55(s，1H)，7.41(d，1H)，7.36(br s，1H)，7.03(br s，1H)，4.26(m，1H)，3.69(m，1H)，3.58(m，4H)，3.41(m，1H)，2.58(m，1H)，2.41(s，3H)，2.38(m，4H)，2.35(m，1H)，2.17(m，1H)，2.01(m，1H)，1.75(m，1H)，1.61(s，6H)。

实施例9：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但咪唑-1-甲酸{5-[2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺(步骤9.1)用于替代咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺。LC-MS：t_R＝1.53min，M+H＝407.0(方法B)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600.13MHz)11(s，br，1H)8.7(s，1H)，7.5(s，1H)，7.35(s，1H)，6.95(s，1H)，4.15(s，1H)，3.65(m，1H)，3.4(m，1H)；2.6(s，3H)，2.3(m，1H)，1.95(m，1H)，1.75(s，3H)，1.7(s，3H)，1.7(s，3H)，1.7(m，1H)，0.95(d，3H)。

步骤9.1：咪唑-1-甲酸{5-[2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺

在rt将CDI(0.10g)加入到5-[2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤9.2)(0.15g)在CH₂Cl₂(4mL)中的搅拌溶液中。然后在25℃将该反应混合物静置56h，通过过滤分离标题化合物。

步骤9.2：5-[2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基胺

将N′-[5-((E)-3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒[507487-90-3](2.1g)、2-氟-2-甲基丙酰脒(1.7g，通过与EP 0227415中实施例1所述类似的方法制备)和2-甲氧基乙醇(3.8mL)的混合物在rt搅拌30min。加入NaOH(0.3g)，将该混合物在125℃搅拌2h。冷却至rt后，加入水，蒸发该混合物至干，通过正相硅胶色谱法纯化，使用CH₂Cl₂：MeOH：浓NH₄OH 97.5∶2∶0.5洗脱，得到标题化合物。

实施例10：(2S，3R)-3-羟基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺}

按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但咪唑-1-甲酸[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺(步骤10.1)用于替代咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺，和(2S，3R)-3-羟基-吡咯烷-2-甲酰胺(描述在H.Fukushima等人，Biorg.MedChem.2004，12，6053；H.Ji等人，J.Med Chem.2006，49，6254中)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。LC-MS：t_R＝1.78min，M+H＝462.0，M-H＝460.0(方法B)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600.13MHz)10.8(s，br，1H)7.6(s，1H)，7.1(s，br，1H)，6.9(s，br，1H)，5.15(s，1H)，4.4(s，1H)，4.2(s，br，1H)，3.6(m，1H)；3.40(m，1H)，2.4(s，3H)，1.9(m，1H)，1.7(m，1H)，1.6(s，1H)，1.52(s，2H)。

步骤10.1：咪唑-1-甲酸[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺

在rt将CDI(0.13g)加入到4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基胺(步骤10.2)(0.16g)在CH₂Cl₂(5mL)中的搅拌溶液中。然后将该反应混合物在25℃静置3h，通过过滤分离标题化合物。

步骤10.2：4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基胺

将HCl(1.17g 32％水溶液)加入到N-[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-乙酰胺(步骤10.3)(0.18g)在EtOH(10mL)中的溶液中，将该反应混合物回流加热7h。使冷却的反应混合物分配在EtOAc与NaHCO₃水溶液之间，用Na₂SO₄干燥有机层，蒸发，得到标题化合物。MS(ESI)：正306.1(M+H)，负304.1(M-H)。

步骤10.3：N-[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-乙酰胺

在rt向N-[5-(2-溴-乙酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(0.29g，如WO2005/068444中所述制备)在MeOH(15mL)中的溶液中加入1-三氟甲基-环丙烷硫代甲酰胺[871913-36-9](0.20g)和钼磷酸铵(0.15g)。在rt搅拌18h后，使该反应混合物分配在EtOAc与水之间，用Na₂SO₄干燥有机层，蒸发，得到粗产物。通过快速色谱法纯化，使用1％MeOH的CH₂Cl₂溶液作为洗脱剂，得到标题化合物。MS(ESI)：正348.1(M+H)，负346.1(M-H)。

实施例11：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺}

在rt将咪唑-1-甲酸[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺(步骤10.1)(20mg)加入到(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤1.8)(9mg)和Et₃N(21μl)在DMF(0.5mL)中的搅拌溶液中。将该反应混合物在rt搅拌56h，蒸发，从MeOH水溶液中结晶，得到标题化合物。LC-MS：t_R＝1.90min，M+H＝460.0，M-H＝458.0(方法B)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600.13MHz)10.75(s，br，1H)7.62(s，1H)，7.35(s，br，1H)，6.95(s，br，1H)，4.15(s，br，1H)，3.65(m，1H)；3.35(m，1H)，2.4(s，3H)，2.35(m，1H)，1.9(m，1H)，1.7(m，1H)，1.52(s，1H)，1.50(s，2H)，0.95(d，3H)。

实施例12：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}

在rt将咪唑-1-甲酸[5-(2-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(步骤12.1)(222mg)加入到(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤1.8)(95mg)和Et₃N(264μl)在DMF(3mL)中的搅拌溶液中。将该反应混合物在rt搅拌56h，蒸发，从MeOH水溶液中结晶，得到标题化合物。MS(ESI)：正412.1(M+H)，负410.2(M-H)。

步骤12.1：咪唑-1-甲酸[5-(2-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺

在rt将CDI(0.77g)加入到5-(2-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤12.2)(1.11g)在DMF(4.3mL)中的搅拌溶液中。然后将该反应混合物在25℃静置18h，通过过滤分离标题化合物。

步骤12.2：5-(2-d₉-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺

将NaOH粉末(3.71g)加入到N′-[5-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒[507487-90-3](5.51g)和d₉-2，2-二甲基-丙酰脒盐酸盐(步骤12.3)(4.50g)在2-甲氧基乙醇(41mL)的搅拌溶液中，将该混合物在125℃在搅拌下加热1h。冷却该反应混合物，加入水，通过过滤分离粗产物。通过制备型HPLC纯化粗产物，使包含标题化合物的级分分配在CH₂Cl₂与NaHCO₃水溶液之间，蒸发干燥的CH₂Cl₂层后得到标题化合物，为黄色固体。LC-MS：t_R＝1.12min，M+H 258.4。

步骤12.3：d₉-2，2-二甲基-丙酰脒盐酸盐

在冰浴冷却下将2M三甲基铝的甲苯(61mL)溶液滴加到氯化铵(6.53g)在甲苯(46mL)中的混悬液中。将该反应混合物在rt搅拌4h，加入d₉-2，2-二甲基-丙酸丁酯(步骤12.4)(6.3g)。在80℃加热4天后，将该反应混合物冷却至0℃，谨慎滴加MeOH(200mL)。在rt下搅拌和超声处理1h后，通过Hyflo过滤该反应混合物，用MeOH洗涤，蒸发滤液，得到标题化合物，为黄白色固体。

步骤12.4：d₉-2，2-二甲基-丙酸丁酯

将d₉-叔丁基氯(5.0g)逐步加入到镁(1.50g)的THF(20mL)混悬液中，用催化量的碘活化，根据需要在1h内通过加热以维持稳定的回流。然后将该反应混合物再加热1h，以确保完全Grignard形成。然后将上述Grignard溶液滴加到用冰浴冷却的咪唑-1-甲酸丁酯(7.5g，如T.Werner和A.G.M.Barrett，J.Org.Chem.2006，71，4302-4304所述制备)在THF(40mL)中的溶液中。将该反应混合物在rt搅拌18h，加入(200mL)，通过Hyflo过滤该混合物，用Et₂O萃取滤液，用Na₂SO₄干燥Et₂O层，蒸发，得到标题化合物。

实施例13：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}

在rt将咪唑-1-甲酸[5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(步骤13.1)(19mg)加入到(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤1.8)(9mg)和Et3N(21μl)在DMF(0.5mL)中的搅拌溶液中。将该反应混合物在rt搅拌56h，加入水(1mL)，通过过滤收集标题化合物。MS(ESI)：正428.1(M+H)，负426.2(M-H)。

步骤13.1：咪唑-1-甲酸[5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺

在rt将CDI(78mg)加入到5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤13.2)(121mg)在DMF(2mL)中的溶液中，在rt静置3.5h。过滤反应混合物，用CH₂Cl₂洗涤，得到标题化合物。

步骤13.2：5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺

在rt将浓HCl(0.4mL)加入到N-[5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(步骤13.3)(140mg)的EtOH(9ml)溶液中，将该混合物回流加热40h。蒸发冷却的反应混合物，用NaHCO₃水溶液中和，用10％MeOH的CH₂Cl₂溶液萃取。用Na₂SO₄干燥合并的有机萃取物，蒸发，得到标题化合物。LC-MS：t_R＝1.17min，M+H 274.4(方法A)。

步骤13.3：N-[5-(6-d₁₀-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺

在rt使氩气通过2-d₁₀-二乙基氨基-6-氯吡嗪(步骤13.4)(293mg)、2-乙酰氨基-4-甲基噻唑(300mg)、乙酸巴(24mg)、四氟硼酸三-叔丁基

(61mg)和碳酸铯(1.02g)在DMF(3mL)中的混合物发泡5min。将该反应混合物在密封小瓶中、在氩气气氛中、在150℃、在Biotage Initiator微波仪中加热45min，过滤，通过制备型HPLC纯化。合并包含标题化合物的级分，蒸发除去乙腈，通过过滤得到标题化合物，为浅褐色固体。LC-MS：t_R＝1.68min，M+H 316.3(方法A)。

步骤13.4：2-d₁₀-二乙基氨基-6-氯吡嗪

在rt将d₁₀-二乙胺(0.5g)加入到搅拌的2，6-二氯吡嗪[4774-14-5](0.93g)和碳酸钾(1.41g)在乙腈(4mL)中的混合物中。然后将该反应混合物在55℃加热60h，冷却，加入水，用CH₂Cl₂萃取。用Na₂SO₄干燥合并的有机萃取物，蒸发，通过正相色谱法纯化，CH₂Cl₂洗脱，得到标题化合物。LC-MS：t_R＝2.10min，M+H 196.4和198.4(方法A)。

实施例14：(2S，3R)-3-甲氧基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例2中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3R)-3-甲氧基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤14.1)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝3.18min(方法A)；LC-MS：t_R＝1.88min，[M+H]⁺486(方法A)；TLC：R_f＝0.14(19∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.97(br s，1H)，8.60(d，1H)，7.55(br s，1H)，7.41(d，1H)，7.39(br s，1H)，7.04(br s，1H)，4.26(br s，1H)，3.73(m，1H)，3.45(m，1H)，3.40(m，1H)，3.24(s，3H)，3.16(m，1H)，2.50(m，1H)，2.42(s，3H)，2.02(m，1H)，1.77(m，1H)，1.61(s，6H)。

步骤14.1：(2S，3R)-3-甲氧基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.8中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3R)-3-甲氧基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤14.2)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺。此外，用50％H2O(Aldrich330108)湿润的10％Pd/活性炭用于替代干燥催化剂。

得到标题化合物，为白色固体。ESI-MS：[M+H]⁺ 159。

步骤14.2：(2S，3R)-3-甲氧基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.9中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3R)-3-甲氧基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯(步骤14.3)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯。此外，用THF而不是CH₂Cl₂彻底萃取碱化的水层。

得到标题化合物，为黄色油状物。HPLC：t_R＝2.35min(方法A)；LC-MS：t_R＝0.47min，[M+H]⁺ 263(方法C)；TLC：R_f＝0.05(1∶1庚烷/EtOAc)。

步骤14.3：(2S，3R)-3-甲氧基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯

将(3aR，6aS)-1-((S)-1-苯基-乙基)-六氢-呋喃并[3，4-b]吡咯-6-酮[805246-48-4](17.05mmol)、KOH(71.60mmol)和碘甲烷(68.20mmol)在甲苯(79mL)中的混合物在80℃搅拌1.5h。将该反应混合物冷却至rt，使其分配在水与MTBE之间。用MTBE(3X)萃取水层。干燥合并的有机层(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到标题化合物，为黄色油状物。HPLC：t_R＝2.98min(方法A)；LC-MS：t_R＝0.69min，[M+H]⁺ 278(方法C)；TLC：R_f＝0.25(1∶3庚烷/EtOAc)。

实施例15：(2S，3S)-3-二甲基氨基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)

按照与实施例2中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-二甲基氨基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤15.1)用于替代(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-2-甲酰胺。

得到标题化合物，为黄色固体。HPLC：t_R＝4.71min(方法B)；LC-MS：t_R＝1.58min，[M+H]⁺ 499(方法A)；TLC：R_f＝0.08(4∶1CH₂Cl₂/MeOH)；¹H-NMR(d₆-DMSO，600MHz)：10.99(br s，1H)，8.60(d，1H)，7.55(br s，1H)，7.41(d，1H)，7.40(br s，1H)，7.04(br s，1H)，4.25(br s，1H)，3.69(m，1H)，3.41(m，1H)，2.51(m，1H)，2.41(s，3H)，2.32(m，1H)，2.17(m，1H)，2.17(s，6H)，2.01(m，1H)，1.72(m，1H)，1.61(s，6H)。

步骤15.1：(2S，3S)-3-二甲基氨基甲基-吡咯烷-2-甲酰胺

按照与步骤1.8中所述类似的方法制备标题化合物，但(2S，3S)-3-二甲基氨基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤15.2)用于替代(2S，3R)-3-甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺。此外，在4巴压力下进行氢化。

得到标题化合物，为黄色油状物。ESI-MS：[M+H]⁺172。

步骤15.2：(2S，3S)-3-二甲基氨基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

将(2S，3S)-3-氨基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤15.3)(0.418mmol)、氰基硼氢化钠(2.86mmol)和37％甲醛水溶液(2.14mmol)在MeOH(3.3mL)中的混合物在55℃搅拌16h。将该反应混合物冷却至rt，浓缩。使用

硅胶柱纯化残余物，得到标题化合物，为白色泡沫。HPLC：t_R 3.59min(方法B)；LC-MS：t_R＝0.86min，[M+H]⁺276(方法A)；TLC：R_f＝0.13(9∶1CH₂Cl₂/MeOH)。

步骤15.3：(2S，3S)-3-氨基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺

将(2S，3S)-3-叠氮基甲基-1-((S)-1-苯基-乙基)-吡咯烷-2-甲酰胺(步骤5.3)(0.723mmol)和三苯膦(0.867mmol)在THF(3mL)中的混合物在rt搅拌25h。浓缩该反应混合物，得到粗标题化合物，为淡棕色固体。HPLC：t_R 3.53min(方法B)；ESI-MS：[M+H]⁺ 248。

实施例16：(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}

由商购(Combi-Phos)4-溴-2-叔丁基-吡啶(替代4-溴-2-(1-甲基-环丙基)-吡啶)、使用对实施例1制备所述的合成方法制备标题化合物。

LC-MS：t_R＝0.45min，M+H＝402.3，M-H＝400.2(方法D)。¹H-NMR(d₆-DMSO，400MHz)：8.495(d，1H)，7.34(s，2H)，7.205(d，1H)，6.95(bs，1H)，4.15(m，1H)，3.68(dd，1H)，3.37(m，1H)，2.39(s，3H)，2.37(m，1H)，1.95(m，1H)，1.68(m，1H)，1.32(s，9H)，0.965(d，3H)。

作为PI3激酶抑制剂的效能

PI3K激酶Glo试验：将50nL化合物稀释液分配在黑色384孔小体积非结合苯乙烯(NBS)板(卡西达(Costar)公司，目录号NBS#3676)上。将作为10mg/ml溶液(在甲醇中)提供的L-a-磷脂酰肌醇(PI)转移到玻璃管中，在氮气流下干燥。然后通过涡旋将其重新混悬在3％辛基葡糖苷(OG)中，于4℃贮存。激酶Glo发光激酶试验(普洛麦格(Promega)公司，麦迪逊/WI，美国)是通过对在激酶反应后溶液中剩余的ATP的量进行定量来测定激酶活性的均一的HTS方法。

加入5μL PI/OG与PI3K亚型的混合物(表1)。加入5μl ATP混合物(在10μL终体积中含有10mM TRIS-HCl pH7.5、3mM MgCl₂、50mM NaCl、0.05％CHAPS、1mM DTT和1μM ATP)使激酶反应开始，这些反应于室温进行。用10μl激酶Glo使反应终止，10分钟后在Synergy2读数器中使用0.1秒/孔的积分时间对板进行读数。将2.5μM全种类1PI3激酶抑制剂(标准品)加入到试验板中，产生对激酶反应的100％抑制，溶剂载体(90％DMSO，在水中)给出了0％抑制。使用标准品作为参考化合物，并且在所有试验板中以16个稀释点的形式包括标准品，一式两份。

表1通过激酶Glo的PI3K：试验条件和试剂方案

PI3K的克隆

PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ构建体是p85αiSH2结构域与各自的p110同工型的融合体。通过PCR、由第一链cDNA(通过RT-PCR由市售的来自胎盘、睾丸和脑的RNA产生)按照下述方法产生了p85α片段和p110同工型基因。PI3Kγ构建体获自罗杰·威廉斯(Roger Williams)实验室(分子生物学MRC实验室，剑桥，英国)(2003年11月)，并且有描述(Pacold，MichaelE.；Suire，Sabine；Perisic，Olga；Lara-Gonzalez，Samuel；Davis，ColinT.；Walker，Edward H.；Hawkins，Phillip T.；Stephens，Len；Eccleston，John F.；Williams，Roger L. Crystal structure and functional analysis ofRas binding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)，103(6)，931-943)。

PI3Kα构建体和蛋白质

BV1075：用于杆状病毒BV-1075的构建体由三部分连接物产生，所述的三部分连接物包含克隆到载体pBlueBac4.5中的p85片段和p110α片段。p85片段获自用Nhe/Spe消化的质粒p1661-2。p110α片段衍生自克隆，其通过测序被证实并且作为SpeI/HindIII片段用在LR410中。为了产生杆状病毒表达载体LR410，使用Gateway LR反应将插入物转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(英杰(Invitrogen)公司)载体中。将克隆载体pBlueBac4.5(英杰公司)用Nhe/HindIII消化。这产生了构建体PED 153.8。通过PCR、使用作为模板的ORF 318(上文所述)以及一个正向引物KAC1028(5’-GCTAGCATGCGAGAATATGATAGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID No.1)和两个反向引物KAC1029(5’-GCCTCCACCAC-CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ ID No.2)和KAC1039(5’-TACTAGTC-CGCCTCCAC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID No.3)产生了p85组分(iSH2)。两个反向引物重叠，将12×Gly连接子和p110α基因的N-末端序列引入SpeI位点。12×Gly连接子取代了BV1052构建体中的一个Gly连接子。PCR片段被克隆到pCR2.1 TOPO(英杰公司)中。在所得克隆中，通过测序确定了p1661-2是正确的。将该质粒用Nhe和SpeI消化，将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。

通过将克隆LR410(见上)用Spe I和HindIII进行酶消化而产生了p110α克隆片段。SpeI位点在p110α基因的编码区内。将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。通过用Nhe和HindIII进行酶消化而制得克隆载体pBlueBac4.5(英杰公司)。将切割的载体用凯杰公司(Qiagen)柱进行纯化，然后用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)(生物实验室公司(BioLabs))脱磷酸。CIP反应完成后，将切割的载体再次进行柱纯化，产生最终载体。使用罗氏公司(Roche)快速连接酶和销售商说明书进行了三部分连接。通过测序证实了最终质粒。

激酶结构域

BV 1075的蛋白质序列：

1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK

61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG

121 GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER

181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF

241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS

301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE

361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN

421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS

481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG

541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS

601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV

661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL

721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT

781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM

841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI

901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ

961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS

102 1NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER

1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPEIQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF

1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH(SEQ ID No.4)

PI3Kβ构建体和蛋白质

PI3Kβ

BV949

p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-His

BV949：通过重叠PCR产生和融合了用于p85PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ亚基的inter SH2结构域(iSH2)以及用于全长p110β亚单位的PCR产物。由第一链cDNA(通过RT-PCR由市售的来自胎盘、睾丸和脑的人RNA(克隆技术公司(Clontech)产生)，起初使用引物gwG130-p01(5’-CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID No.5)和gwG130-p02(5’-TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’)(SEQ ID No.6)获得了iSH2PCR产物。随后，在第二次PCR反应中，分别在p85iSH2片段的5’端和3’端、使用引物gwG130-p03(5’-GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID No.7)和gwG130-p05(5’-ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’)(SEQ ID No.8)加入GateWay重组AttB1位点和连接子序列。通过PCR、使用作为模板的p110β克隆(来自未知来源，其序列已被证实)，使用含有连接子序列和p110β的5’端的引物gwG130-p04(5’-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATAATGCCTCCTGCT-3’)(SEQ ID No.9)和含有与组氨酸标记融合的p110-β的3’端序列的gwG130-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’)(SEQ ID No.10)得到了p110β片段。通过重叠PCR、在iSH2片段的3’端和p110β片段的5’端进行的连接子反应，使用以上提到的gwG130-p03引物以及含有重叠的组氨酸标记和AttB2重组序列的引物(5’-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’)(SEQ ID No.11)组建了p85-iSH2/p110β融合蛋白。该终产物在GateWay(英杰公司)OR反应中被重组到供体载体pDONR201(英杰公司)中，产生ORF253输入克隆。通过测序证实了该克隆，其用于GateWay LR反应(英杰公司)，使插入物转移到GateWay接头的pBlueBac4.5(英杰公司)载体中，以产生杆状病毒表达载体LR280。该LR280具有p85序列中的氨基酸突变。

激酶结构域

BV949的蛋白质序列：

1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK

61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI

121 MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY

181 PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI

241 GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE

301 NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY

361 VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR

421 NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE ETVKVHVRAG LFHGTELLCK

481 TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE FDINICDLPR MARLCFAVYA VLDKVKTKKS TKTINPSKYQ

541 TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF DFKGQLRTGD IILHSWSSFP DELEEMLNPM GTVQTNPYTE

601 NATALHVKFP ENKKQPYYYP PFDKIIEKAA EIASSDSANV SSRGGKKFLP VLKEILDRDP

661 LSQLCENEMD LIWTLRQDCR EIFPQSLPKL LLSIKWNKLE DVAQLQALLQ IWPKLPPREA

721 LEILDFNYPD QYVREYAVGC LRQMSDEELS QYLLQLVQVL KYEPFLDCAL SRFLLERALG

781 NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA VSVQFGVILE AYCRGSVGHM KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI

841 KLNAVKLNEA KGKEAMHTCL KQSAYREALS DLQSPLNPCV ILSELYVEKC KYMDSKMKPL

901 WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN GDDLRQDMLT LQMLRLMDLL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD

961 RSGLIEVVST SETIADIQLN SSNVAAAAAF NKDALLNWLK EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA

1021 GYCVASYVLG IGDRHSDNIM VKKTGQLFHI DFGHILGNFK SKFGIKRERV PFILTYDFIH

1081 VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC EDAYLILRRH GNLFITLFAL MLTAGLPELT SVKDIQYLKD

1141 SLALGKSEEE ALKQFKQKFD EALRESWTTK VNWMAHTVRK DYRSGAHHHH HHGA(SEQ ID No.12)激酶结构域

PI3Kγ构建体和蛋白质

PI3Kγ

BV950

p110γ(Δ143-[Met144-1102])-His

构建体获自罗杰·威廉斯实验室(分子生物学MRC实验室，剑桥，英国)(2003年11月)。构建体在(Pacold，Michael E.；Suire，Sabine；Perisic，Olga；Lara-Gonzalez，Samuel；Davis，Colin T.；Walker，Edward H.；Hawkins，Phillip T.；Stephens，Len；Eccleston，John F.；Williams，RogerL.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effectorphosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)，103(6)，931-943)中有描述。构建体缺少N-末端144aa。

BV950的蛋白质序列：

1 MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV

61 TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP

121 ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHVVLDTPPD PALDEVRKEE

181 WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF

241 VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS

301 SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL

361 TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD

421 PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL

481 DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL

541 KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML

601 QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK

661 VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL

721 CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ

781 AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER

841 VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMIMTGMPQL

901 TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA

961 HHHHHH(SEQ ID No.13)

PI3Kδ构建体和蛋白质

PI3Kδ

BV1060

p85iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-His

BV1060：通过重叠PCR产生和融合了用于p85亚基的inter SH2结构域(iSH2)以及用于全长p110δ亚基的PCR产物。通过使用作为模板的ORF318(见上)以及引物gwG130-p03(5’-GGGACAAG-TTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC-GAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID No.7)和gwG154-p04(5’-TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’)(SEQ ID No.14)产生了iSH2PCR产物。由第一链cDNA(通过RT-PCR由市售的来自胎盘、睾丸和脑的人RNA(克隆技术公司)产生)、起初使用引物gwG154-p01(5’-ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’)(SEQ ID No.15)和gwG 154-p02(5’-CTACTGCCTGT-TGTCTTTGGACACGT-3’)(SEQ IDNo.16)获得了p110δ片段。在随后的PCR反应中，分别在p110δ片段的5’端和3’端、使用引物gw154-p03(5’-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’)(SEQ ID No.17)和gwG154-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’)(SEQ ID No.18)加入连接子序列和组氨酸标记。在第三次PCR反应中，通过iSH2片段的3’端和p110δ片段的5’端的重叠连接子、使用以上提到的gwG130-p03引物以及含有重叠的组氨酸标记和Gateway(英杰公司)AttB2重组序列的引物(5’-GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGTGAGTGCTCC-3’)(SEQ ID No.19)组装了p85-iSH2/p110δ融合蛋白。该终产物在Gateway OR反应中被重组到供体载体pDONR201(英杰公司)中，产生ORF319输入克隆。通过测序证实了该克隆，其用于Gateway LR反应(英杰公司)中，使插入物转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(英杰公司)载体中，以产生杆状病毒表达载体LR415。

BV1060的蛋白质序列：

1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK

61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD

121 CPMEFWTKEE NQSVVVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE

181 AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH

241 EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP

301 NRALLVNVKFEGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR

361 HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI

421 PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE LIQGSKVNAD ERMKLVVQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC

481 SEPVWKQRLE FDINICDLPR MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF

541 DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP

601 ALEKILELGR HSECVHVTEE EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL

661 ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD

721 ELFQYLLQLV QVLKYESYLD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL

781 ILEAYCRGST HHMKVLMKQG EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE

841 ALSHLQSPLD PSTLLAEVCV EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ

901 DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE VVLRSDTIAN IQLNKSNMAA

961 TAAFNKDALL NWLKSKNPGE ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ

1021 LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI

1081 LRRHGLLFLH LFALMRAAGL PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES

1141 WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL GGAHHHHHH(SEQ ID No.20)

PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ构建体的纯化

以两个色谱步骤纯化了PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ：在Ni琼脂糖树脂(通用电气公司医疗保健部(GE Healthcare))上进行固定化金属亲和层析(IMAC)以及采用Superdex 20026/60柱(通用电气公司医疗保健部)进行凝胶过滤。将所有缓冲液冷却至4℃，在冰上冷却下进行裂解。于室温进行柱分级分离。除了以下描述的那些外，用于纯化PI3Kβ的所有缓冲液还含有0.05％Triton X100。

通常，将来自10L的Tn5细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在“裂解缓冲液”(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，5mM咪唑，1mM NaF，0.1ug/mL冈田酸(OAA)，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA(20片/1L缓冲液，罗氏应用科学公司(Roche Applied Sciences))，benzonase(25U/mL缓冲液，EMD生物科学公司(EMD Biosciences))(片状物(pellet)与裂解缓冲液的比例为1∶6v/v))中，通过使用紧密契合的研棒冲击20次而进行机械裂解。于45,000g将裂解物离心30分钟，将上清液装到预平衡的IMAC柱上(3mL树脂/100mL裂解物)。将柱用3-5个柱体积的裂解缓冲液冲洗，然后用3-5个柱体积的20mM Tris-Cl，pH7.5，500mMNaCl，5％甘油，45mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行第二次冲洗。将蛋白质用20mMTris-Cl，pH7.5，0.5M NaCl，5％甘油，250mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mLOAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行洗脱。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。通过在Superdex20026/60柱(用20mM Tris-Cl，pH7.5，0.5M NaCl，5％甘油，1mM NaF，5mM DTT，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行平衡)上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。将等体积的透析缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，50％甘油，5mM NaF，5mM DTT)加入到合并物中，然后通过透析缓冲液进行透析，其间更换两次(一次更换过夜)。将蛋白质于-20℃贮存。

PI3Kδ的纯化

以三个色谱步骤纯化了PI3Kδ：在Ni琼脂糖树脂(通用电气公司医疗保健部)上进行固定化金属亲和层析，采用Superdex 20026/60柱(通用电气公司医疗保健部)进行凝胶过滤，最后在Q-HP柱(通用电气公司医疗保健部)上进行离子交换步骤。将所有缓冲液冷却至4℃，在冰上冷却进行裂解。于室温进行柱分级分离。

通常，将来自10L的Tn5细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在“裂解缓冲液”(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，5mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mL冈田酸(OAA)，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA(20片/1L缓冲液，罗氏应用科学公司)，benzonase(25U/mL裂解缓冲液，EMD生物科学公司)(片状物与裂解缓冲液的比例为1∶10v/v))中，通过使用紧密契合的研棒冲击20次进行机械裂解。于45,000g将裂解物离心30分钟，将上清液装到预平衡的IMAC柱上(5mL树脂/100mL裂解物)。将柱用3-5个柱体积的裂解缓冲液冲洗，然后用3-5个柱体积的20mMTris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，40mM咪唑，1mM NaF，0.1ug/mLOAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行第二次冲洗。将蛋白质用20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，250mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行洗脱。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。通过在Superdex 200(用20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，1mM NaF，0.1ug/mL OAA，5mM DTT，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行平衡)上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。将这些流分用“缓冲液A”(20mM Tris-Cl，pH8.2，5％甘油，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM DTT)稀释(合并物体积与缓冲液的比例为1∶10v/v)，并装载到制备的Q-HP柱上。样品装载完成后，我们用3-5个柱体积的缓冲液A和5％“缓冲液B”(20mMTris-Cl，pH8.2，1M NaCl，5％甘油，1mM NaF，0.1ug/mL OAA，5mM DTT)进行了冲洗。我们使用缓冲液B的5％-30％梯度洗脱了蛋白质。通常，以～200mM NaCl洗脱出蛋白质。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。将等体积的透析缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，50％甘油，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM DTT)加入到合并物中，然后通过透析缓冲液进行透析，其间更换两次(一次更换过夜)。将蛋白质于-20C贮存。

使用上述试验得到如下结果。通过相应的IC₅₀值除以PI3KαIC₅₀值计算PI3Kβ、γ和δ同种型的选择性因子。

n.d.＝未进行。

Claims

1.式I的化合物或其盐

其中

m是0或1；

n是0或1；

R³和R⁴与所连接的相同的或不同的碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基或杂环基；

R⁵是未取代或取代的杂芳基；

且

2.根据权利要求1的化合物或其盐，其中

R²代表C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基、二-C₁-C₄-烷基-氨基、卤素或羟基。

3.根据上述权利要求任意项的化合物或其盐，其中

R³代表C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基、二-C₁-C₄-烷基-氨基、卤素或羟基。

4.根据上述权利要求任意项的化合物，其中

R³和R⁴与所连接的同一碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基；或

R³和R⁴与所连接的相同或不同碳原子一起形成杂环基。

5.根据上述权利要求任意项的化合物，其中

R³和R⁴与所连接的相同碳原子一起形成C₃-C₈-环烷基或杂环基。

6.根据上述权利要求任意项的化合物，其中

R⁵代表未取代或取代的杂芳基，

其被一个或多个部分取代，所述部分独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C₁-C₇-烷基、全氘代C₁-C₇-烷基、C₃-C₁₂-环烷基、(C₁-C₇-烷基)-C₃-C₁₂-环烷基、(卤代-C₁-C₇-烷基)-C₃-C₁₂-环烷基、氨基-C₁-C₇-烷基、卤代-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-烷酰基氨基-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-烷磺酰基-氨基-C₁-C₇-烷基、吡咯烷代-C₁-C₇-烷基、氧代-吡咯烷代-C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷亚磺酰基、C₁-C₇-烷磺酰基、C₁-C₇-烷氧基、氨基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨基、N-一-或N，N-二-(全氘代C₁-C₇-烷基)-氨基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-环烷基)-氨基C₁-C₇-烷酰基氨基、吡咯烷代、氧代-吡咯烷代、哌啶子基、哌嗪-1-基、4-(C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基-C₁-C₇-烷基、卤代-C₁-C₇-烷基或C₃-C₁₀-环烷基)-哌嗪-1-基、4-(氨基-C₁-C₇-烷基)-哌嗪-1-基、4-[N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基氨基)-C₁-C₇-烷基]-哌嗪-1-基、吗啉代、硫吗啉代、S-氧代-或S，S-二氧代硫吗啉代、C₁-C₇-烷磺酰基氨基、氨基甲酰基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基-C₁-C₇-烷基、氨基-C₁-C₇-烷基和/或(N’-一-或N’，N’-二-(C₁-C₇-烷基)-氨基-C₁-C₇-烷基)-氨基甲酰基、吡咯烷-1-羰基、哌啶-1-羰基、哌嗪-1-羰基、4-(C₁-C₇-烷基)哌嗪-1-羰基、吗啉-1-羰基、硫吗啉-1-羰基、S-氧代-或S，S-二氧代硫吗啉-1-羰基、磺基、C₁-C₇-烷磺酰基、C₁-C₇-烷亚磺酰基、氨磺酰基、N-一-或N，N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨磺酰基、吗啉代磺酰基、硫吗啉代磺酰基、噻唑基。

7.根据上述权利要求任意项的化合物，其中

R⁵代表杂芳基，其选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和噻唑基，它们各自独立地被一个取代基取代，所述取代基选自C₁-C₄-烷基、全氘代C₁-C₄-烷基、卤代-C₁-C₄-烷基、1-(C₁-C₄-烷基)-C₃-C₆-环烷基、(卤代-C₁-C₄-烷基)-C₃-C₆-环烷基、二-C₁-C₄-烷基氨基、二-(全氘代C₁-C₄-烷基)氨基。

8.根据上述权利要求任意项的化合物，其中

m是0或1且n是1。

9.根据权利要求1的化合物，其选自：

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(rac)-3，3-二甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(rac)-3，3-二甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3S)-3-(乙酰基氨基-甲基)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3S)-3-吗啉-4-基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-氟-1-甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3R)-3-羟基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺}；

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4′-甲基-2-(1-三氟甲基-环丙基)-[4，5′]联噻唑-2′-基]-酰胺}；

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-d9-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}；

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(6-d10-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}；

(2S，3R)-3-甲氧基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3S)-3-二甲基氨基甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)；

(2S，3R)-3-甲基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}。

10.药物组合物，其包含根据权利要求1-9任意项的式(I)的化合物或其可药用盐和任选的另一种治疗剂与可药用载体。

11.根据权利要求1-9任意项的式(I)的化合物或其可药用盐，其用于治疗脂质和/或蛋白激酶依赖性疾病。

12.根据权利要求1-9的任意一项的式(I)的化合物或其可药用盐用于制备治疗脂质和/或蛋白激酶依赖性疾病的药物组合物中的用途。

13.治疗对抑制脂质和/或蛋白激酶有响应的疾病的方法，该方法包括对有这种治疗需要的温血动物施用预防或治疗有效量的根据权利要求1-9任意一项的式(I)的化合物或其可药用盐。

14.用于根据权利要求11的用途的化合物或根据权利要求12的化合物的用途或根据权利要求13的治疗方法，其中所述疾病是依赖于I类PI3K的脂质激酶依赖性疾病。

15.用于根据权利要求11的用途的化合物，或根据权利要求12的化合物的用途，或根据权利要求13的治疗方法，其中所述疾病是依赖于I类PI3K的脂质激酶依赖性疾病，所述PI3K选自PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ。

16.用于根据权利要求11的用途的化合物，或根据权利要求12的化合物的用途，或根据权利要求13的治疗方法，其中所述疾病是增殖性疾病；良性或恶性肿瘤；选自如下的癌症：肉瘤；肺癌；支气管癌；前列腺癌；乳腺癌(包括散在的乳腺癌和考登病患者)；胰腺癌；胃肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠癌；结肠直肠癌；甲状腺癌；肝癌；肝内胆管癌；肝细胞癌；肾上腺癌；胃癌；胃癌；神经胶质瘤；成胶质细胞瘤；子宫内膜癌；黑素瘤；肾癌；肾盂癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；阴道癌、卵巢癌；多发性骨髓瘤；食管癌；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓性白血病；脑癌；脑癌；口腔和咽癌；喉癌；小肠癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；绒毛状结肠腺瘤；瘤形成；上皮性质的瘤形成；淋巴瘤；乳腺癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；光化性角化病；包括实体瘤的肿瘤病；颈或头肿瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；和具有髓样化生的骨髓纤维化。