CN102388806A - 一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其采用薄壳山核桃种子繁育的优良实生幼苗的带芽茎段为外植体，经消毒后接种在含有启动培养基的玻璃培养瓶中，以普通日光灯为光源，每日照光14小时，温度25～28℃、湿度为50％～65％，培养25天，分化长成试管芽苗，然后经剪切，转接于含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，进行增殖培养，增殖系数为3.25～3.98，将增殖后的茎段剪切后接种于含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，进行壮苗培养，25天后去掉基部组织和部分叶片，留3～4片叶片，接种于含有生根处理产生根原基培养基的玻璃培养瓶中，进行生根培养8～15天，生根率在90％～95％，待根长至3cm左右时经清洗后移栽到含有泥炭和黄心土的体积比为1∶1的基质中，移栽成活率在80～85％。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养繁殖方法，具体地说，是涉及一种薄壳山核桃的组织培养繁殖方法。
背景技术
薄壳山核桃[Carya illinoinensis(Wangehn.)K.Koch]原产于北美东部，为胡桃科山核桃属落叶乔木，对土壤酸碱度的适应范围比较大，在土层深厚、疏松、富含腐殖质的冲积平原或河谷地带生长迅速、长势良好。20世纪初引入我国，至今已有百年的历史，引种范围广泛，北至北京，南至海南岛，东至福建，西至成都；早年引种到江苏省的山核桃现在长势良好，已经进入稳产期。薄壳山核桃树体高大雄伟，树姿优美，是庭院美化和城市绿化的优良树种；其木材结构细密，且坚固强韧，是雕刻和制作高档家具和工艺品的上等用材，也是优良的军工用材；其果实为世界著名的高档干果、油料原料，壳薄易剥，味香甜，是理想的保健品和食品添加剂。
薄壳山核桃传统繁殖方法是采用种子播种繁殖，但薄壳山核桃种子价格昂贵，平均每公斤只有100多粒，导致种子繁殖成本高；扦插繁殖需要良种提供数量巨大的插条，繁殖材料受到很大的局限；嫁接繁殖需要大量砧木且技术要求高、人工成本高。上述几种传统的繁殖方式，都需要大量的繁殖材料且很难在短期内获得大量优质种苗。利用组织方法培养繁育薄壳山核桃苗，只需要少量的带芽茎段为外植体，且扩繁速度快，成本低，在短时间内能提供大量优质的山核桃幼苗。现有技术中，傅玉兰等仅在外植体消毒、获得无菌材料方面取得一些进展，没有进一步开展增殖、壮苗、生根等关键技术的研究。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种繁殖速度快、种苗质量好的薄壳山核桃组织培养繁殖方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)选材及消毒处理：采用由薄壳山核桃种子繁育的优良实生幼苗为接种材料，取离根部10厘米以上的茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成3-4cm左右长的小段，经70％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒6～8分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％，培养25天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，增殖系数为3.25～3.98，使其不断增殖，直至达到所需要的繁殖生产规模；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养8～15天；生根率在90％～95％；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有直根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先闭光培养10天，后逐渐见光，在培养40～45天后，进行全光照；移栽成活率在80％～85％。
所述的启动培养基为：每升基本培养基+3.0～4.0mg 6-苄基嘌呤+0.01～0.05mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的增殖培养基为：每升基本培养基+2.0～3.0mg 6-苄基嘌呤+0.05～0.1mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基+3.5～4.5mg 6-苄基嘌呤+0.08～0.2mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的生根处理产生根原基培养基为：每升基本培养基+0.2～0.5mgα-萘乙酸+0.3～0.6mg吲哚丁酸+2000～3000mg活性炭。
2、根据权利要求1所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的基本培养基包括常量元素、微量元素、铁盐和有机成分。
3、根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的常量元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾 950～1900mg/L；
硝酸铵 825～1650mg/L；
磷酸二氢钾 85～170mg/L；
硫酸镁 185～370mg/L；
氯化钙 165～330mg/L。
4、根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的微量元素的组分和其对应的浓度如下：
碘化钾 0.83mg/L；
硼酸 6.2mg/L；
硫酸锰 22.3mg/L；
硫酸锌 8.6mg/L；
钼酸钠 0.25mg/L；
硫酸铜 0.025mg/L；
氯化钴 0.025mg/L。
5、根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的铁盐的组分和其对应的浓度如下：
乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L；
硫酸亚铁 27.8mg/L。
6、根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的有机成分的组分和其对应的浓度如下：
肌醇 100mg/L；
甘氨酸 2mg/L；
盐酸硫胺素 0.1mg/L；
盐酸吡哆醇 0.5mg/L；
烟酸 0.5mg/L；
蔗糖 30g/L；
琼脂 5.5g/L。
本发明的有益效果是：本发明通过组织培养的方法来进行薄壳山核桃种苗的培养，能够保持原植株的优良性状，且繁殖速度非常快，能在短期内生产出大量的优质种苗，满足各种需求，同时，利用本发明所述的生产方法，种苗的成活率高，且种苗质量好。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，详细说明本发明的具体实施方式：
实施例1
基本培养基的配置：
其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：
硝酸钾(KNO3)950mg/L、硝酸铵(NH4NO3)825mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)85mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)185mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)165mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L、蔗糖(sucrose)30g/L、琼脂(agar)5.5g/L。
利用上述的基本培养基配置启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根处理产生根原基培养基。
其中，启动培养基：每升基本培养基+3.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.01mg吲哚丁酸(IBA)；
增殖培养基：每升基本培养基+2.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.05mg吲哚丁酸(IBA)+1000mg活性炭(Charcoal)；
壮苗培养基：每升基本培养基+3.5mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.08mg吲哚丁酸(IBA)+1000mg活性炭(Charcoal)；
生根处理产生根原基培养基：每升基本培养基+0.2mgα-萘乙酸(NAA)+0.6mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)。
将上述的配置好的启动培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM2。
薄壳山核桃组织培养繁殖步骤如下：
(1)选材及消毒处理：采用由薄壳山核桃种子繁育的优良实生幼苗为接种材料，取离根部10厘米以上的茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成3-4cm左右长的小段，经70％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒6～8分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％，培养25天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，一个周期25天的繁殖系数为3.25，生长高度达3.8cm，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达3000～4000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养8～15天；生根率为92.4％；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有直根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先闭光培养10天，后逐渐见光，在培养40～45天后，进行全光照；移栽成活率为80.3％。
实施例2：
基本培养基的配置：
其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：
硝酸钾(KNO3)1900mg/L、硝酸铵(NH4NO3)1650mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)330mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L、蔗糖(sucrose)30g/L、琼脂(agar)5.5g/L。
利用上述的基本培养基配置启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根处理产生根原基培养基。
其中，启动培养基：每升基本培养基+4.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.05mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)；
增殖培养基：每升基本培养基+3.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.1mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)；
壮苗培养基：每升基本培养基+4.5mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.2mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)；
生根处理产生根原基培养基：每升基本培养基+0.5mgα萘乙酸(NAA)+0.3mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)。
将上述的配置好的启动培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM2。
薄壳山核桃组织培养繁殖步骤如下：
(1)选材及消毒处理：采用由薄壳山核桃种子繁育的优良实生幼苗为接种材料，取离根部10厘米以上的茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成3-4cm左右长的小段，经70％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒6～8分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％，培养25天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，一个周期25天的繁殖倍数为3.98，生长高度达3.1cm，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达3000～4000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养8～15天；生根率为95.1％
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有直根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先闭光培养10天，后逐渐见光，在培养40～45天后，进行全光照；移栽成活率为85.3％。
实施例3：
基本培养基的配置：
其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：
硝酸钾(KNO3)1500mg/L、硝酸铵(NH4NO3)1200mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)130mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)300mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)240mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L、蔗糖(sucrose)30g/L、琼脂(agar)5.5g/L。
利用上述的基本培养基配置启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根处理产生根原基培养基。
其中，启动培养基：每升基本培养基+3.5mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.05mg吲哚丁酸(IBA)+1500mg活性炭(Charcoal)；
增殖培养基：每升基本培养基+4.5mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.05mg吲哚丁酸(IBA)+1500mg活性炭(Charcoal)；
壮苗培养基：每升基本培养基+4.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.08mg吲哚丁酸(IBA)+1500mg活性炭(Charcoal)；
生根处理产生根原基培养基：每升基本培养基+0.5mgα-萘乙酸(NAA)+0.6mg吲哚丁酸(IBA)+2500mg活性炭(Charcoal)。
将上述的配置好的启动培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM2。
薄壳山核桃组织培养繁殖步骤如下：
(1)选材及消毒处理：采用由薄壳山核桃种子繁育的优良实生幼苗为接种材料，取离根部10厘米以上的茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成3-4cm左右长的小段，经70％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒6～8分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％，培养25天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，一个周期25天的繁殖倍数为3.54，生长高度达3.66cm，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达3000～4000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养8～15天，生根率为90.4％；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有直根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先闭光培养10天，后逐渐见光，在培养40～45天后，进行全光照；移栽成活率为83.4％。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)选材及消毒处理：采用由薄壳山核桃种子繁育的优良实生幼苗为接种材料，取离根部10厘米以上的茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成3-4cm左右长的小段，经70％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒6～8分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％，培养25天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，增殖系数为3.25～3.98，使其不断增殖，直至达到所需要的繁殖生产规模；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1-2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的玻璃培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养8～15天，生根率在90％～95％；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有直根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先闭光培养10天，后逐渐见光，在培养40～45天后，进行全光照，移栽成活率在70～80％；
所述的启动培养基为：每升基本培养基+3.0～4.0mg 6-苄基嘌呤+0.01～0.05mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的增殖培养基为：每升基本培养基+2.0～3.0mg 6-苄基嘌呤+0.05～0.1mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基+3.5～4.5mg 6-苄基嘌呤+0.08～0.2mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的生根处理产生根原基培养基为：每升基本培养基+0.2～0.5mgα-萘乙酸+0.3～0.6mg吲哚丁酸+2000～3000mg活性炭。
2.根据权利要求1所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的基本培养基包括常量元素、微量元素、铁盐和有机成分。
3.根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的常量元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾 950～1900mg/L；
硝酸铵 825～1650mg/L；
磷酸二氢钾 85～170mg/L；
硫酸镁 185～370mg/L；
氯化钙 165～330mg/L。
4.根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的微量元素的组分和其对应的浓度如下：
碘化钾 0.83mg/L；
硼酸 6.2mg/L；
硫酸锰 22.3mg/L；
硫酸锌 8.6mg/L；
钼酸钠 0.25mg/L；
硫酸铜 0.025mg/L；
氯化钴 0.025mg/L。
5.根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的铁盐的组分和其对应的浓度如下：
乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L；
硫酸亚铁 27.8mg/L。
6.根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃组织培养繁殖方法，其特征在于，所述的有机成分的组分和其对应的浓度如下：
肌醇 100mg/L；
甘氨酸 2mg/L；
盐酸硫胺素 0.1mg/L；
盐酸吡哆醇 0.5mg/L；
烟酸 0.5mg/L；
蔗糖 30g/L；
琼脂 5.5g/L。
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