CN104957040A - 一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法 - Google Patents

一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，包括选材、消毒处理、试管芽苗诱导培养、体胚诱导、增殖培养、成熟培养、体胚的萌发一系列操作；在体胚诱导、增殖、成熟、萌发培养的培养基中进行培养。本发明具有繁殖系数高，繁殖时间不受季节限制，取材对母体伤害小，无病虫害困扰，能够保持原植株优良性状，在薄壳山核桃苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。

Description

一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法
技术领域
本发明涉及薄壳山核桃的组织培养方法，具体的说是薄壳山核桃的体细胞胚胎组织培养方法。
背景技术
薄壳山核桃，又名美国山核桃，系胡桃科、山核桃属中的一个种。原产美国和墨西哥，是世界上重要的油料干果树种之一，其壳薄易剥、仁肉肥厚、味香可口，具有较高的营养价值。树干通直、树形优美、根深叶茂，是四旁绿化及园林观赏的优良树种。同时木材坚韧致密、心材暗红、边材黄白、富弹性、不易变形和开裂，是建筑、高级家具等优良用材树种。因此，薄壳山核桃是一个用途广、受益期长、经济效益高、社会效益和生态效益明显的优良经济树种。
我国自20世纪初即开始进行薄壳山核桃的引种栽培，但是由于其结果迟、适合各地的优良品种缺乏等因素，目前薄壳山核桃在我国尚呈零星分布，真正形成产量的、稳产高产的果用园尚不多见。且虽然薄壳山核桃种子春、秋均可播种。无论是春播还是秋播，种子易被鼠、鸟啃食。有时天气干旱，种子失水，出苗率低。春播一般在3月下旬或四月上旬进行。但是不管是春播或者是秋播，一年生的实生苗很难可以达到可嫁接的程度，生长缓慢。为了使得薄壳山核桃尽快踏上良种化、基地化建设的进程，在良种催芽培养的同时，着手进行砧木嫁接技术攻关，但是由于嫁接成活率不高，导致嫁接苗供不应求，因此，只好栽培实生苗，然而实生苗存在投产迟、坚果小，适应性差等缺陷，市场上不受欢迎，因此，制约生产发展的关键因素有两个，一个是缺乏充足的优良品种苗木，另一个是缺乏科学系统的栽培技术。
本领域技术人员也从事种植大量薄壳山核桃育苗工作，重点进行了薄壳山核桃扦插和嫁接等无性繁殖实验，但繁殖系数较低，苗木质量参差不齐，现有技术中薄壳山核桃的无性繁殖技术仍停留在尝试性试验阶段，还没有形成一种可以大量推广和重复验证的成熟方法。因此，提供一个系统的薄壳山核桃育苗方法是本领域急待解决的技术问题。为满足生产方面的需求，我们对常规播种的方法进行了改良，并对嫁接方法进行创新，以达到缩短育苗周期、增加育苗数量的目的。
发明内容
发明目的：建立薄壳山核桃胚发生技术体系，实现薄壳山核桃优选单株规模化高效生产。
技术方案：本发明提供了一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5～6cm的带芽小段；
(2)对带芽小段外植体进行消毒处理；
(3)芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤(2)中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11～20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.05～0.08mg.L-16-BA、0.05～0.06mg.L-1NAA、25～40g.L-1蔗糖、18～21g.L-1蜂胶乳油、11～13g.L-1柠檬酸、6.5～7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.2～5.4；
(4)体胚诱导：将步骤(3)中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养15～30d；MS基本培养基，附加0.16～0.20mg.L-16-BA、0.2～0.3mg.L-1NAA、0.08～0.12mg.L-12,4-D、0.05～0.06mg.L-1玉米素，25～40g.L-1蔗糖、9.5～11.0g.L-1酵母膏、6.5～7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7～5.8；
(5)体胚增殖培养：将步骤(4)中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20～25d后，体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8～2.0mg.L-16-BA、0.01～0.03mg.L-1NAA、25～40g.L-1蔗糖、6.5～7.0g.L-1卡拉胶、0.05～0.08mg.L芸苔素内酯、0.03～0.06mg.L长春碱，调pH值为5.7～5.8；
(6)成熟培养：将步骤(5)中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中培养32～51d；体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40～60g.L-1蔗糖、6.5～7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7～5.8；
(7)体胚的萌发：将步骤(6)中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42～58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8～12g.L-1山梨醇、20～30g.L-1蔗糖、6.5～7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7～5.8。
进一步地，所述步骤(2)中的消毒处理过程包括：将采集的枝条去除2/3叶片后修剪成约4～6cm长的带腋芽茎段，洗涤剂浸泡20min，流水冲洗30次，蒸馏水清洗外植体后，用无菌水冲洗3～4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用70％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗2～3次，再用0.1％升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗6次；
进一步地，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)和步骤(7)中的培养条件为：光照强度为1800～2500lx，每日光照时间为16h，温度为(25±3)℃。进一步地，所述的WPM基本培养基即木本植物培养基的具体配方如下：
进一步地，所述的MS基本培养基的具体配方如下：
有益效果：本发明的相对于现有技术而言具有以下优点：以无菌瓶苗叶片作为外植体进行体胚诱导，克服了离体培养外植体取材受季节限制的缺点，另外通过建立本再生体系，大大提高了薄壳山核桃的再生效率和繁殖系数，并且其成苗率和后期抗病能力都得到了较大提升，克服了无性繁殖实验的繁殖系数较低，质量参差不齐的缺点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
以下实例例所用的基本培养基的配方如下：
所述的WPM基本培养基即木本植物培养基的具体配方如下：
所述的MS基本培养基的具体配方如下：
实施例1：
一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，包括以下步骤：
(1)选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5～6cm的带芽小段；
(2)对带芽小段外植体进行消毒处理；消毒处理过程包括：将采集的枝条去除2/3叶片后修剪成约4～6cm长的带腋芽茎段，洗涤剂浸泡20min，流水冲洗30次，蒸馏水清洗外植体后，用无菌水冲洗3～4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用70％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗2～3次，再用0.1％升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗6次；
(3)芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤(2)中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11～20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.08mg.L-16-BA、0.05mg.L-1NAA、25g.L-1蔗糖、18g.L-1蜂胶乳油、11g.L-1柠檬酸、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.2；
(4)体胚诱导：将步骤(3)中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养15～30d；体胚诱导培养基配方为，MS基本培养基，附加0.20mg.L-16-BA、0.2mg.L-1NAA、0.08mg.L-12,4-D、0.05mg.L-1玉米素，25g.L-1蔗糖、9.5g.L-1酵母膏、7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7；
(5)体胚增殖培养：将步骤(4)中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20～25d后，体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加2.0mg.L-16-BA、0.01mg.L-1NAA、40g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶、0.08mg.L芸苔素内酯、0.03mg.L长春碱，调pH值为5.7；
(6)成熟培养：将步骤(5)中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中培养32～51d；体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加60g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7；
(7)体胚的萌发：将步骤(6)中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42～58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8g.L-1山梨醇、20g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7。
实施例2：
本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：
(1)芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.06mg.L-16-BA、0.06mg.L-1NAA、40g.L-1蔗糖、21g.L-1蜂胶乳油、13g.L-1柠檬酸、7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.3。
(2)体胚诱导培养基配方为，MS基本培养基，附加0.16mg.L-16-BA、0.3mg.L-1NAA、0.08mg.L-12,4-D、0.06mg.L-1玉米素，25g.L-1蔗糖、11.0g.L-1酵母膏、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.8。
(3)体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加2.0mg.L-16-BA、0.01mg.L-1NAA、25g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶、0.08mg.L芸苔素内酯、0.06mg.L长春碱，调pH值为5.7。
(4)体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加60g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7。
(5)体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加12g.L-1山梨醇、20g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7。
实施例3：
本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：
(1)芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.08mg.L-16-BA、0.05mg.L-1NAA、25g.L-1蔗糖、6.5g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7；
(2)体胚诱导培养基配方为，MS基本培养基，附加0.18mg.L-16-BA、0.25mg.L-1NAA、0.1mg.L-12,4-D、0.05mg.L-1玉米素，30g.L-1蔗糖、9.5g.L-1酵母膏、7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.8。
(3)体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8mg.L-16-BA、0.03mg.L-1NAA、40g.L-1蔗糖、7.0g.L-1卡拉胶、0.06mg.L芸苔素内酯、0.05mg.L长春碱，调pH值为5.7。
(4)体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40g.L-1蔗糖、7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7。
(5)体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加8g.L-1山梨醇、30g.L-1蔗糖、7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7。
实施例4：
本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：
(1)述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.07mg.L-16-BA、0.05mg.L-1NAA、40g.L-1蔗糖、21g.L-1蜂胶乳油、13g.L-1柠檬酸、7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.2；
(2)体胚诱导培养基配方为，MS基本培养基，附加0.20mg.L-16-BA、0.2mg.L-1NAA、0.12mg.L-12,4-D、0.06mg.L-1玉米素，30g.L-1蔗糖、10g.L-1酵母膏、6.5～7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7～5.8。
(3)体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.9mg.L-16-BA、0.02mg.L-1NAA、32g.L-1蔗糖、6.8g.L-1卡拉胶、0.06mg.L芸苔素内酯、0.04mg.L长春碱，调pH值为5.8。
(4)体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加45g.L-1蔗糖、6.8g.L-1卡拉胶，调pH值为5.8。
(5)体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加10g.L-1山梨醇、28g.L-1蔗糖、6.8g.L-1卡拉胶，调pH值为5.8。
以下是本发明与传
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种薄壳山核桃细胞胚胎的组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5~6cm的带芽小段；
（2）对带芽小段外植体进行消毒处理；
（3）芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤（2）中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11~20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.05~0.08mg.L-16-BA、  0.05~0.06mg.L-1NAA、25~40g.L-1蔗糖、18~21 g.L-1蜂胶乳油、11~13 g.L-1柠檬酸、6.5~7.0 g.L-1卡拉胶，调pH值为5.2~5.4；
（4）体胚诱导：将步骤（3）中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养15~30d；体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.16~0.20 mg. L-16-BA、0.2~0.3mg. L-1NAA、0.08~0.12 mg. L-12,4-D、0.05~0.06mg.L-1  玉米素，25~40g.L-1蔗糖、9.5~11.0g.L-1酵母膏、6.5~7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8；
（5）体胚增殖培养：将步骤（4）中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20~25d后，体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8~2.0 mg. L-16-BA、0.01~0.03 mg. L-1NAA、25~40g.L-1蔗糖、6.5~7.0 g.L-1卡拉胶、0.05~0.08mg. L芸苔素内酯、0.03~0.06mg.L长春碱，调pH值为5.7~5.8；
（6）成熟培养：将步骤（5）中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中培养32~51d；体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40~60g.L-1蔗糖、6.5~7.0 g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8；
（7）体胚的萌发：将步骤（6）中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42~58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8~12 g. L-1山梨醇、20~30g.L-1蔗糖、6.5~7.0 g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8 ；
所述的MS基本培养基的具体配方如下：
硝酸钾KNO3    　　　1900 mg/L
硝酸铵NH4NO3      　1650 mg/L
磷酸二氢钾KH2PO4      　170 mg/L
硫酸镁MgSO4.7H2O     370 mg/L
氯化钙CaCl2.2H2O 　　440 mg/L
碘化钾KI   　　　　　0.83 mg/L
硼酸H3BO3     　　　　6.2 mg/L
硫酸锰 MnSO4.4H2O   22.3 mg/L
硫酸锌　ZnSO4.7 H2O        8.6 mg/L
钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O     0.25 mg/L
硫酸铜　CuSO4.5 　     0.025 mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O    　　　0.025 mg/L
乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA   37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO24.7H2O       27.8 mg/L
肌醇     　　　　　　　　　100 mg/L
甘氨酸        　　　　　　　2 mg/L
盐酸硫胺素VB1     　　　　0.1 mg/L
盐酸吡哆醇　VB6 　　　   0.5 mg/L
烟酸VPP     　　　　　　　0.5 mg/L
羧甲基纤维素钠           0.9 mg/L。
2.根据权利要求1所述的薄壳山核桃细胞胚胎的组织培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中的消毒处理过程包括：将采集的枝条去除2/3叶片后修剪成约4~6cm 长的带腋芽茎段，洗涤剂浸泡20 min，流水冲洗30次，蒸馏水清洗外植体后，用无菌水冲洗 3~4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用 70%的酒精浸泡20s，无菌水冲洗 2~3 次，再用0.1%升汞溶液消毒3 min，最后用无菌水冲洗6次。
3.根据权利要求1所述的薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，其特征在于：所述步骤（3）、步骤（4）、步骤（5）、步骤（6）和步骤（7）中的培养条件为：光照强度为1800~2500lx，每日光照时间为16h，温度为(25±3)℃。
4.根据权利要求4所述的薄壳山核桃细胞胚胎的组织培养方法，其特征在于：所述的WPM基本培养基即木本植物培养基的具体配方如下：
硝酸铵NH4NO3             400 mg/L
               硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O       556 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O           96 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O          370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4              170 mg/L
硫酸钾K2SO4                990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA   37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O         27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O           22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O           8.6 mg/L
硼酸H3BO3                          6.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O        0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O          0.025 mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O                    0.025 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O           100 mg/L
甘氨酸  NH2·CH2·COOH      2 mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl   1 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P         0.5 mg/L
烟酸NC5H4COOH            0.5 mg/L
硬脂酸钠C17H35COONa            13mg/L
硫酸亚铁                        0.025 mg/L。
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A morphological and histological comparison of the initiation and development of pecan (Carya illinoinensis) somatic embryogenic cultures induced with naphthaleneacetic acid or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid;Adriana P. M. Rodriguez et.al.,;《Protoplasma》;19981231;第204卷;第72页右栏第2段 *
ADRIANA P. M. RODRIGUEZ ET.AL.,: "A morphological and histological comparison of the initiation and development of pecan (Carya illinoinensis) somatic embryogenic cultures induced with naphthaleneacetic acid or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid", 《PROTOPLASMA》 *
山核桃间接体细胞胚发生和植株再生;张启香等;《园艺学报》;20111231;第38卷(第6期);第1063-1070页 *
张启香等: "山核桃间接体细胞胚发生和植株再生", 《园艺学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110278872A (zh) * 2019-07-12 2019-09-27 山东农业大学 一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法

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