CN110278872A

CN110278872A - 一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法

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Publication number: CN110278872A
Application number: CN201910628721.XA
Authority: CN
Inventors: 杨克强; 段琪程; 常董董
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110278872B

Abstract

本发明公开了一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，包括以下步骤：(1)体细胞胚的生长培养，(2)体细胞胚萌发，(3)体细胞胚生根，(4)体细胞胚苗移栽。本发明所提供的核桃体细胞胚生根和练苗移栽方法解决了核桃体细胞胚生根难，移栽成活率低的问题，经实验统计：体细胞胚的萌发率可达到45.22％，较之前有了很大提升，萌发的体细胞胚生根率可达到43.43％，使用生长发育良好的体细胞胚苗进行移栽成活率可达57.69％。应用本发明方法短时间内能提供大量的种苗，完全能够满足大规模生产的需要。

Description

一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法。

背景技术

核桃属(Juglans)是胡桃科(Juglandaceae)落叶乔木，在全世界的范围内有20余种，地域分布广泛，在亚洲、美洲和欧洲均有分布(Forde and McGranahan，1992)。核桃(Juglans regia L.)是核桃属中经济价值最高的的一个种，在世界各地均有栽培(Fordeand McGranahan，1992)。核桃的原产地在中国，同时也是世界核桃的主产国，其栽培面积为世界第一，产量居世界第二(郗荣庭，1996)。

核桃在我国具有悠久的栽培历史，不仅经济效益高营养丰富，也是医疗保健的重要材料(奚声珂，1996)。据《本草纲目》记载，核桃对润肺、补血、健胃、消痰有独特效果。被国内外医学家极度推崇，是养生保健延年益寿之精品(陈勤和李磊珂，2005)。核桃仁对大脑发育有特殊功效，亚油酸和亚麻酸在核桃仁中有较高含量，能够净化血液分解血液中的杂质，提高大脑的生理功能(孔凡真，2000)，也是人体理想的美容剂，核桃仁丙酮提物也具有抗衰老作用(毕敏和尹政，2006)。在最近的研究中核桃的青龙衣对肿瘤的预防和治疗有一定的功效，同时在传统中医学中青龙衣也是用来镇痛抑菌的中药材(仲军梅和刘玉梅，2014)。经济高速发展的今天，水污染和空气污染格外严重，用核桃壳制备活性炭能有效的对其进行防治(朱米家，2015)。核桃坚果内隔膜还是一味传统的中药材，具有固肾涩精的功效(张旭，2015)。核桃木木质重而坚硬，耐冲撞耐磨擦耐腐朽，容易乾燥，少变形；易施工，易於胶合。木质坚硬，适用于雕刻部份，能耐多变的气候，可施以任何涂装方法，最适於制造家具及室内装修。

关于核桃体细胞胚的萌发与成苗，在核桃中，体细胞胚的发芽效率相对较低(Lee，1988；Deng and Cornu 1992；Vahdati et al.，2006)。通常是因为体细胞胚想要萌发需要打破芽尖休眠作用，尽管有些体细胞胚没有经过冷藏处理也能萌发，但难以形成正常植株。Deng等(1998)采用脱水处理的方式可以提高体细胞胚萌发率3～5倍。增加ABA的浓度也能够提高体细胞胚发芽率，将ABA的浓度提高到5.0mg·L^-1时体细胞胚发芽率可以提高6％(Kourosh et al.，2008)。Kourosh等(2008)通过对正常体细胞胚和异常的体细胞胚进行解刨发现蔗糖对体细胞胚萌发几乎没有影响。体细胞胚的健康程度也对体细胞胚发芽有重大影响，健康程度较差的体细胞胚，即使经过冷藏处理和脱水处理也难以萌发(Kourosh etal.，2008)。由于体细胞胚具有两极性，上下胚轴同时萌发，所以不需要单独对根进行诱导，只需选择合适的培养基进行生根培养，使其发育成完整的体胚苗(汤浩茹等，2000)。国内外研究表明虽然体胚能够萌发但增殖系数较低，远远满足不了大规模工厂化育苗和市场的大量需求，体胚苗生根难的问题未解决，在生产上根本无法应用。因此，建立高效稳定的核桃体细胞胚萌发、生根体系，解决核桃萌发生根困难的问题，已成为目前国内外核桃组培中的难点。

关于核桃体细胞胚诱导和快繁国内外已经有了一定的报道(Tulecke et al.，1985；Kornova et al.，1989；袁巧平等，1990；汤浩茹等，2000；张启香等，2011)，但是关于核桃体细胞胚苗的炼苗、移栽驯化的研究较少，这对体细胞胚苗投入生产十分不利。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，以解决核桃体细胞胚成苗困难的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，包括以下步骤：

(1)体细胞胚的生长培养：将核桃次生体细胞胚接种到基础培养基中，在20～24℃黑暗条件下进行培养，待体细胞胚发育至3～4mm时进行萌发处理；

(2)体细胞胚萌发：将步骤(1)培养后的体细胞胚接种到萌发培养基上，培养2～3周后，再低温预处理2～3周，然后将低温预处理后的体细胞胚转接到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，6～9d后体细胞胚萌发；

(3)体细胞胚生根：将萌发后具有上、下胚轴分化的体细胞胚接种到生根培养基中，在光照强度3000～3500lx、光照时间16h·d^-1、24～26℃条件下培养12～15d，诱导生根；

(4)体细胞培苗移栽：将步骤(3)中培养出的具有3～4片真叶、根系发育良好的体细胞胚苗进行炼苗处理，炼苗后再移栽到混合基质中进行培养。

优选的，步骤(1)中，所述核桃次生体细胞胚是由核桃初生体细胞胚经增殖培养得到；增殖培养所采用的培养基为添加有1.0mg·L^-1 6-BA、2.0mg·L^-1KT、0.01mg·L^-1IBA、30g·L^-1蔗糖和7g·L^-1琼脂的DKW培养基。

所述核桃次生体细胞胚的长度为2mm。

优选的，步骤(1)中，所述基础培养基为添加有20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

优选的，步骤(1)中，培养过程中每隔1周转接1次新鲜的基础培养基。

优选的，步骤(2)中，所述萌发培养基为添加有1.0～3.0mg·L^-1GA3、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

优选的，步骤(2)中，所述昼夜光照周期培养的条件为：光照处理16h·d^-1，光照强度为3000～3500lx，温度24～26℃。

优选的，步骤(3)中，所述生根培养基为添加有1.0～3.0mg·L^-1 6-BA、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

优选的，步骤(3)中，每个含有生根培养基的培养瓶中接种2～3个体细胞胚。

优选的，步骤(4)中，所述炼苗处理具体为：将体细胞胚苗的培养瓶连同体细胞胚苗移出培养架，适应1d后逐渐打开培养瓶的封口膜；2～3d后取出体细胞胚苗，将体细胞胚苗上的培养基冲洗干净，移栽至由珍珠岩、草木灰和蛭石按体积比1：2：1组成的移栽基质中，移栽后用清水浇透，将体细胞胚苗放入遮阳网中遮阳，保持相对湿度在75％以上，炼苗1周。

优选的，步骤(4)中，所述混合基质的成分以体积比计为：珍珠岩：草木灰：蛭石＝1：2：1。

本发明的有益效果：

本发明所提供的核桃体细胞胚生根和练苗移栽方法解决了核桃体细胞胚生根难，移栽成活率低的问题，经实验统计：体细胞胚的萌发率可达到45.22％，较之前有了很大提升，萌发的体细胞胚生根率可达到43.43％，使用生长发育良好的体细胞胚苗进行移栽成活率可达57.69％。应用本发明方法短时间内能提供大量的种苗，完全能够满足大规模生产的需要。

附图说明

图1：体细胞胚生长培养。

图2：体细胞胚萌发。

图3：体细胞胚生根培养。

图4：在常温下炼苗。

图5：温室炼苗。

图6：温室炼苗(局部图)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，核桃体细胞胚存在生根难、移栽成活率低的问题，严重制约了核桃的大规模生产和种植。

基于此，本发明的目的是提供于一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，以解决核桃体细胞胚成苗困难的问题。

在本发明的一种实施方案中，给出的核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法包括以下步骤：

(1)体细胞胚的生长培养，(2)体细胞胚萌发，(3)体细胞胚生根，(4)体细胞胚苗移栽；其中：

步骤(1)所述体细胞胚生长培养的方法是：选取发育良好的长度为2mm的次生体细胞胚，在超净工作台上接种到基础培养基中，在20～24℃黑暗条件下进行培养，每隔1周转接1次新鲜培养基，待体细胞胚发育至3～4mm时进行萌发处理；

所述基础培养基为添加有20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

步骤(2)所述体细胞胚萌发的方法是：将步骤(1)培养的体细胞胚接种到萌发培养基上，培养2～3周之后，置于4℃条件下低温预处理2～3周。然后将体细胞胚转接到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，光照处理16h·d^-1，光照强度为3000～3500lx，温度25±1℃，6～9d后体细胞胚萌发；

所述萌发培养基为添加有1.0～3.0mg·L^-1GA3、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

步骤(3)所述体细胞胚生根的方法是：将步骤(2)具有上、下胚轴分化的体细胞胚接种到生根培养基中，每培养瓶接种2～3个体细胞胚，在光照强度3000～3500lx、光照时间16h·d^-1、24～26℃条件下培养12～15d，诱导生根；

所述生根培养基为添加有1.0～3.0mg·L^-1 6-BA、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

步骤(4)体细胞胚苗移栽的方法是：步骤(3)中培养出具有3～4片真叶、根系发育良好(根系发育良好是指根系长度大于5cm，并且根系分支数大于2)体细胞胚苗的培养瓶，连同体细胞苗移出培养架。适应1d后，逐渐打开培养瓶封口膜。2～3d后，用镊子夹出体胚苗，用清水将体胚苗上的培养基冲洗干净，以基质配比为珍珠岩、草木灰、蛭石体积比为1：2：1的移栽基质进行移栽，栽好后用清水浇透，将体胚苗放入遮阳网中遮阳，保持良好的的湿度条件(保持相对湿度在75％以上)，经炼苗1周后，将其移栽到混合基质中进行培养，3个周后统计移栽成活率。

所述的混合基质的成分以体积比计为：珍珠岩：草木灰：蛭石＝1：2：1。

体细胞胚的一个重要特征是能够反复进行次生胚发生。利用体细胞胚的这一特性不仅可以进行快速繁殖，而且还能进行遗传转化。次生体细胞胚的发生是受多种因素制约的，其中，植物生长调节剂、氮源、碳源等不仅关系到体细胞胚的增殖率，同时也关系到次生胚的质量。

体细胞胚的萌发是指其上下胚轴的延长与根和(或)枝的生长发育。一般而言，体细胞胚与合子胚的个体发育相似，都是经过典型的球形、鱼雷形和子叶形期而发育成熟。由于体细胞胚产生的不同步，其发育成熟往往也不同步；而且，即使相对同步发育的体细胞胚，其胚性器官也会以不同的速度发育成熟。因此，体细胞胚萌发往往只形成苗或根而不形成植株。尽管许多植物都可以进行体细胞胚发生，但真正作为繁殖苗木的理想的体细胞胚发生体系的植物却很有限。

体细胞胚的成苗是指萌发的体细胞胚转化成正常生长的植株。能够获得萌发的体细胞胚也并不意味着能够获得体细胞胚苗。核桃体细胞胚萌发只有根、只有枝或既有根又有枝，它们成苗的能力相差很大。

核桃体细胞胚的萌发和成苗率极低，以致用核桃的体细胞胚胎发生系统繁育苗木成功的报道甚少。

本发明是以次生体细胞胚为培养对象，相对于初生体细胞胚，其优势在于经过增殖培养次生胚的数量更多，并且次生胚相对于初生胚来说畸形胚的比例较少。本发明的次生体细胞胚是由初生体细胞胚经增殖培养得到，培养基的组成对核桃次生体细胞胚形成的影响很大。若培养基的组成不合适，会导致次生胚的产生频率低，而且所产生的次生胚多数被阻遏在球形胚期。本发明对培养基的组成进行了优化，采用本发明的培养基对初生体细胞胚进行增殖培养，其次生体细胞胚的增殖率高，所产生的次生体细胞胚发育整齐、生长势强。

为提高核桃体细胞胚的萌发率、生根率和移栽成活率，本发明对萌发培养基、生根培养基和炼苗移栽方法进行了优化。对于萌发培养基和生根培养基而言，培养基中所添加的激素的种类和浓度非常关键，采用本发明优化后的萌发培养基和生根培养基能够显著提高核桃体细胞胚的萌发率和生根率，特别是本申请在生根培养基中添加了特定浓度的6-BA，使核桃次生体细胞胚成功生根。

将组培的体胚幼苗进行移栽时,失水率高,容易死亡,因此，需要精确控制炼苗时间，并且需要精确掌握基质配比，本发明研究发现，适当增加移栽基质中的草木灰含量移栽成活率增加，当基质配比为基质配比为珍珠岩：草炭土：蛭石＝1:2:1时，移栽成活率最高；当基质中草木灰的比例较高时容易使基质透气性降低，使移栽成活率降低。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中，本发明实施例中所用到的培养基如下：

DKW其具体组分为：KNO₃ 1367.00mg·L^-1，NH₄NO₃ 1416.00mg·L^-1，MgSO₄361.49mg·L^-1，KH₂PO₄ 265.00mg·L^-1，CaCl₂·2H₂0 112.50mg·L^-1，MnSO₄·H₂O 33.50mg·L^-1，ZnSO₄·6H₂O 17.00mg·L^-1，H₃BO₃ 6.20mg·L^-1，NaMoO₄ 0.39mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O0.25mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.05mg·L^-1，Na₂-EDTA 45.40mg·L^-1，FeSO₄·7H₂0 33.80mg·L^-1。

基础培养基是指：不加任何生长调节物质的DKW培养基+20～30g·L^-1蔗糖+7～8g·L^-1琼脂，pH值5.6。

萌发培养基是指：DKW+1.0～3.0mg·L^-1GA3+20～30g·L^-1蔗糖+7～8g·L^-1琼脂，pH值5.6。

生根培养基是指：DKW+1.0～3.0mg·L^-1 6-BA+20～30g·L^-1蔗糖+7～8g·L^-1琼脂，pH值5.6。

本发明实施例中所采用的体细胞胚为核桃品种‘瑞嘉’的次生体细胞胚；所述核桃次生体细胞胚是由核桃初生体细胞胚经增殖培养得到；增殖培养所采用的培养基为添加有1.0mg·L^-1 6-BA、2.0mg·L^-1KT、0.01mg·L^-1IBA、30g·L^-1蔗糖和7g·L^-1琼脂的DKW培养基。

其中，核桃初生体细胞胚是由核桃品种‘瑞嘉’的试管苗的茎段作为外植体诱导形成。

实施例1：

(1)选取发育良好的长度为2mm的核桃次生体细胞胚，在超净工作台上接种到基础培养基中，在22℃黑暗条件下进行培养，每隔1周转接1次新鲜培养基，待体细胞胚发育至3～4mm时进行萌发处理。

(2)将步骤(1)培养的体细胞胚接种到DKW+2.0mg·L^-1GA3+30g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH值5.6的萌发培养基上，培养2周之后，置于4℃条件下低温预处理3周。然后将体细胞胚转接到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，光照处理16h·d^-1，光照强度为3200lx，温度25±1℃，8d后体细胞胚萌发；统计萌发率可达45.22％。

(3)将正常萌发的体细胞胚接种到DKW+2.0mg·L^-1 6-BA+20g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH值5.6的生根培养基中，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于玻璃培养瓶中，每个培养瓶中接种3个体细胞胚，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，两周后获得生根的体细胞胚苗。生根率为43.43％。

(4)步骤(3)中培养出具有3～4片真叶、根系发育良好(根系发育良好是指根系长度大于5cm，并且根系分支数大于2)体细胞胚苗的培养瓶，连同体细胞苗移出培养架。适应1d后，逐渐打开培养瓶封口膜。2d后，用镊子夹出体胚苗，用清水将体胚苗上的培养基冲洗干净，以基质配比为珍珠岩、草木灰、蛭石体积比为1：2：1的移栽基质进行移栽，栽好后用清水浇透，将体胚苗放入遮阳网中遮阳，保持良好的的湿度条件(保持相对湿度在75％以上)，经炼苗一周后，将其移栽到混合基质中进行培养，所述的混合基质的成分以体积比计为：珍珠岩：草木灰：蛭石＝1：2：1；3个周后统计移栽成活率为57.69％。

对比例1：

挑选出发育到4mm的具有成熟结构的发育良好的体细胞胚，将其接种于DKW+2.0mg·L^-1GA3+30g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH值5.6的萌发培养基，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min分装于无菌培养皿中。接种后培养皿用封口膜密封，萌发处理结束后将体细胞胚接种到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，9d后体细胞胚萌发，萌发率可达35.69％。

将正常萌发的体细胞胚接种到DKW+2.0mg·L^-1 6-BA+20g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH值5.6的生根培养基中，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于玻璃培养瓶中，每个培养瓶中接种3个体细胞胚，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，两周后获得生根的体细胞胚苗。生根率为40.10％。

具有3～4片真叶，将发育良好的体细胞胚苗以基质配比为珍珠岩、草木灰、蛭石体积比为1：3：1的移栽基质进行移栽，每种处理30株幼苗分为3组，栽好后用清水浇透，将体胚苗放入遮阳网中遮阳，保持良好的的湿度条件，经炼苗1周后，将其移栽到混合基质中进行培养，3个周后统计移栽成活率可达42.43％。

对比例2：

选取2mm的体细胞胚接种到不加任何生长调节物质的DKW培养基+30g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH值5.6的基础培养基中，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于无菌培养皿中。接种后培养皿用封口膜密封，置于22℃的黑暗条件下进行培养，每隔1周转移1次培养基。待体细胞胚发育至5mm时进行低温萌发预处理，打破体细胞胚的休眠状态，萌发率为23.75％。

挑选出发育到5mm的具有成熟结构的发育良好的体细胞胚，将其接种于DKW+1.0mg·L^-1GA3+30g·L^-1蔗糖+8g·L^-1琼脂，pH值5.6的萌发培养基，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于无菌培养皿中。接种后培养皿用封口膜密封，萌发处理结束后将体细胞胚接种到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，9d后体细胞胚萌发，萌发率为21.04％。

将正常萌发的体细胞胚接种到DKW+3.0mg·L^-1 6-BA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH值5.6的生根培养基中，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于玻璃培养瓶中，每个培养瓶中接种3个体细胞胚，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，两周后获得生根的体细胞胚苗。生根率可达34.59％。

具有3～4片真叶，将发育良好的体细胞胚苗以基质配比为珍珠岩、草木灰、蛭石体积比为1：2：1的移栽基质进行移栽，每种处理30株幼苗分为3组，栽好后用清水浇透，将体胚苗放入遮阳网中遮阳，保持良好的的湿度条件，经炼苗1周后，将其移栽到混合基质中进行培养，3个周后统计移栽成活率可达57.69％。

对比例3：

选取1mm的体细胞胚接种到不加任何生长调节物质的DKW培养基+25g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH值5.6的基础培养基中，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于无菌培养皿中。接种后培养皿用封口膜密封，置于22℃的黑暗条件下进行培养，每隔1周转移1次培养基。待体细胞胚发育至4mm时在常温下萌发预处理，经统计未经冷藏萌发预处理的体细胞胚萌发率为20.22％。

挑选出发育到4mm的具有成熟结构的发育良好的体细胞胚，将其接种于DKW+3.0mg·L^-1GA3+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH值5.6的萌发培养基，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于无菌培养皿中接种后培养皿用封口膜密封，萌发处理结束后将体细胞胚接种到新鲜的萌发培养基中，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，9d后体细胞胚萌发，萌发率为36.14％。

将正常萌发的体细胞胚接种到DKW+1.0mg·L^-1 6-BA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH值5.6的生根培养基中，培养基用121℃高压灭菌锅灭菌20min后分装于玻璃培养瓶中，每个培养瓶中接种2个体细胞胚，进行昼夜光照周期培养，光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1，温度25℃，17d后获得生根的体细胞胚苗。生根率可达25.63％。

具有3～4片真叶，将发育良好的体细胞胚苗以基质配比为珍珠岩、草木灰、蛭石体积比为1：4：1的移栽基质进行移栽，每种处理30株幼苗分为3组，栽好后用清水浇透，将体胚苗放入遮阳网中遮阳，保持良好的的湿度条件，经炼苗1周后，将其移栽到混合基质中进行培养，3个周后统计移栽成活率为28.87％。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种核桃体细胞胚生根和炼苗移栽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述核桃次生体细胞胚是由核桃初生体细胞胚经增殖培养得到；增殖培养所采用的培养基为添加有1.0mg·L^-16-BA、2.0mg·L^-1 KT、0.01mg·L^-1 IBA、30g·L^-1蔗糖和7g·L^-1琼脂的DKW培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基础培养基为添加有20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养过程中每隔1周转接1次新鲜的基础培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述萌发培养基为添加有1.0～3.0mg·L^-1 GA3、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述昼夜光照周期培养的条件为：光照处理16h·d^-1，光照强度为3000～3500lx，温度24～26℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述生根培养基为添加有1.0～3.0mg·L^-1 6-BA、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，每个含有生根培养基的培养瓶中接种2～3个体细胞胚。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述炼苗处理具体为：将体细胞胚苗的培养瓶连同体细胞胚苗移出培养架，适应1d后逐渐打开培养瓶的封口膜；2～3d后取出体细胞胚苗，将体细胞胚苗上的培养基冲洗干净，移栽至由珍珠岩、草木灰和蛭石按体积比1:2:1组成的移栽基质中，移栽后用清水浇透，将体细胞胚苗放入遮阳网中遮阳，保持相对湿度在75％以上，炼苗1周。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述混合基质的成分以体积比计为：珍珠岩：草木灰：蛭石＝1：2：1。