CN101297637A - 薄皮核桃的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新疆薄皮核桃的组织培养和快速繁殖方法，该方法由获得无菌苗；芽的增殖；芽的生根；练苗与移栽步骤完成，提供了大田核桃枝条的消毒处理方法、最佳的芽增殖培养基和芽生根培养基。本发明具有方法简单，繁殖速率快，稳定性好，培育周期短，生根率高，根质量好，移栽易于成活的优点，在实际生产应用中具有较强的可行性，适用于新疆薄皮核桃的产业化育苗，有利于解决长期以来优良品种苗木供应匮乏的现实问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养和快速繁殖领域，具体地说涉及新疆薄皮核桃的组织培养和快速繁殖方法。
背景技术
核桃(Juglans regia L.)古称胡桃或羌桃，属核桃科(Juglandaceae)，核桃属，原产于欧洲东南部及亚洲西部，我国也是核桃原产地之一。由于核桃是果材兼用的优良经济树种，又作为世界四大干果(核桃、扁桃、腰果、榛子)之一，所以它以其很高的经济、生态及社会效益在世界各地广泛栽培。我国栽培核桃已有2000多年以上历史，相传两千多年前西汉的张骞出使西域，从波斯(今伊朗)将核桃引进我国，从此核桃成为我国北方各地的重要干果之一。
核桃是新疆主要的经济林树种之一，也是新疆林果业中最具市场竞争力的特色产品，也是近年来南疆林果业中规模面积扩张最快的树种。就新疆而言，每年种植核桃的面积都会在1.3万公顷以上。所以，每年将需要大量的优良核桃苗木，培育优良核桃苗木就有巨大的商业价值和市场前景。
新疆核桃栽培历史悠久，其源于天山西部和昆仑山的野核桃，距今已有1300多年的栽培历史。由于世代实生繁殖，在其实生群体中，混生着早、晚实两种性状的核桃类群，经长期自然相互杂交，一方面形成了高度混杂群体，使得种质资源变得异常丰富多彩(王国安，新疆早实核桃丰产技术讲座(一)农村科技2006(1)39)；另一方面使得植株间、品种间良莠不齐，形成了很多复杂的群体。例如，核桃的出仁率在30-80％之间，品种的区域差异性很大。品种的差别对核桃生产的发展和产量的提高影响很大。因此，选择优质、丰产、抗逆性强以及早实的优良品种是核桃丰产的重要途径。但是常规选种方法选出的优良单株，其后代仍用种子繁殖，核桃在自由授粉的实生后代中，在坚果大小、重量等方面会出现较大变异，不能使优良品种长久保持其优良性状。为了防止实生苗的变异退化，就必须采用营养繁殖，即嫁接、扦插和组培等繁殖方法。但是目前除嫁接外，几乎不能用其他方法进行营养繁殖，扦插不易生根，嫁接又因接口处易发生氧化褐变而难以成活，嫁接成活率很低，而且还要先培育砧木，较费工费力。因此，组培快速繁殖技术是解决核桃无性繁殖的很好办法。
发明内容
本发明涉及新疆薄皮核桃的组织培养和快速繁殖方法，该方法由获得无菌苗、芽的增殖、诱导芽生根和练苗与移栽四个步骤完成，提供了大田外植体的消毒处理方法、最佳的芽增殖培养基和诱导芽生根培养基。可以在短时间里获得大量新疆薄皮核桃种苗，适用于新疆薄皮核桃的产业化育种，也为新疆薄皮核桃的优良品种选择和转基因研究奠定了基础。
发明所述的薄皮核桃的组织培养和快速繁殖方法，由获得无菌苗、芽的增殖、芽的生根和练苗与移栽步骤完成，具体操作按下列步骤进行：
a、剪取大田核桃枝条，用自来水流动冲洗10-180min，然后将枝条剪切成1-2cm茎段，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒10-180s，0.1％升汞灭菌1-30min，15％双氧水处理10-120min，无菌水冲洗4-6次；
b、将步骤a中处理后的茎段接入诱导培养基DKW+TDZ 0.1-2.0mg/L+IBA0.01-0.5mg/L中，温度23±1℃，光照2500-3000lx，时间16h/d，20-35d进行诱导培养；
c、将步骤b中诱导培养出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段，接入培养基DKW+6-BA 0.1-2.0mg/L+IBA 0.001-0.5mg/L中，置于温度23±1℃，光照3000-4000lx，时间16h/d进行培养；
d、将步骤c中1.0-2.0cm的幼苗切下，接入培养基(1/8-1)DKW+IBA 1-20mg/L中，置于温度23±1℃，黑暗处理1-20天诱导根源基生成；
或将步骤c中1.0-2.0cm的幼苗切下，将其根部放入经常规灭菌后的IBA溶液中处理10-180min，再接入培养基(1/8-1)DKW中并于置于温度23±1℃，黑暗处理1-20天条件下诱导根源基生成；
e、将步骤d中的经黑暗处理的幼苗，接入培养基(1/8-1)DKW中并于置于温度23±1℃，光照3000-4000lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
或将步骤d中的幼苗取消黑暗处理，置于温度23±1℃，光照3000-4000lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将步骤e中生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗2-6d，洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
步骤a中的剪切的茎段为每一茎段含一个腋芽。
该方法中所用的培养基DKW均为固体培养基。
步骤d中IBA溶液浓度为5-200mg/L。
步骤g中腐殖土∶珍珠岩∶蛭石为3∶1∶1。
本发明所述新疆薄皮核桃的组织培养和快速繁殖方法其优点在于：
方法简单，遗传稳定性好。本发明所采用组织培养方法，简单实用，对设备和条件的要求较低，快繁出的试管苗遗传稳定性好。
生根方法简单，根质量好，易于移栽成活。本发明所采用的两种生根方法简单，可操作性强，生根率高，根质量好，移栽易于成活，解决了新疆核桃组培快繁长期以来的技术瓶颈。
繁殖速率快，培育周期短。避免了用叶片等组织诱导成苗必须要经过的愈伤阶段，保证繁殖速率快，培育周期短。本发明经过大量试验结果表明：在培养条件温度23±1℃，光照3000-4000lx，时间16h/d下，培养基DKW+6-BA 0.1-2.0mg/L+IBA 0.001-0.5mg/L上的平均芽增殖率为3-5。按培养周期1个月计算，理论上一棵无菌苗一年能产生5×104-2×108棵苗，满足优良核桃苗木市场供不应求的状况。
不受季节限制，可实现工厂化育苗。本发明所采用组织培养方法不受季节限制，可常年连续生产，克服了常规营养繁殖扦插、嫁接的季节限制。
附图说明
图1为本发明高效消毒方法获得的腋芽萌动图
图2为本发明诱导茎段腋芽生成的幼苗图
图3为本发明腋芽增殖20-30d后的效果图
图4为本发明用于生根的幼苗
图5为本发明诱导生根30d时的效果
图6为本发明炼苗时期图
图7为本发明移栽存活后的苗图
具体实施方式
本发明采用新疆优良薄皮核桃品种新温185号或新新2号的茎段为快繁对象：
实施例1：
a、剪取新温185号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗10min，然后将枝条剪切成1cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒10s，0.1％升汞灭菌1min，15％双氧水处理10min，无菌水冲洗4次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ 0.1mg/L+IBA0.01mg/L中，温度23±1℃，光照2500lx，时间16h/d，20d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 0.1mg/L+IBA 0.001mg/L中，置于温度23±1℃，光照3000lx，时间16h/d进行培养；
d、将培养1.0cm的幼苗切下，接入固体培养基1/8DKW+IBA 1mg/L中并于置于温度23±1℃，黑暗处理1天条件下诱导根源基生成；
e、将经黑暗处理的幼苗，接入固体培养基1/8DKW中并置于温度23±1℃，光照3000lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗2d，洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例2：
a、剪取新新2号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗30min，然后将枝条剪切成1cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒30s，0.1％升汞灭菌5min，15％双氧水处理14min，无菌水冲洗4次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ 0.5mg/L+IBA0.05mg/L中，温度23±1℃，光照2500lx，时间16h/d，22d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 0.5mg/L+IBA0.001mg/L中，置于温度23±1℃，光照3000lx，时间16h/d进行培养；
d、将培养1.2cm的幼苗切下，将其根部放入经常规灭过菌的IBA溶液中处理10min，IBA溶液浓度为5mg/L，再接入固体培养基1/8DKW中并置于温度23±1℃，黑暗处理1天条件下诱导根源基生成；
e、将幼苗取消黑暗处理，置于温度23±1℃，光照3300lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗2d，后洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例3：
a、剪取新温185号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗1.5h，然后将枝条剪切成2cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒70s，0.1％升汞灭菌12min，15％双氧水处理30min，无菌水冲洗5次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ1.2mg/L+IBA0.15mg/L中，温度23±1℃，光照2700lx，时间16h/d，25d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 1.2mg/L+IBA 0.008mg/L中，置于温度23±1℃，光照3200lx，时间16h/d进行培养；
d、将培养1.5cm的幼苗切下，接入固体培养基1/4DKW+IBA 6mg/L中并于置于温度23±1℃，黑暗处理7天条件下诱导根源基生成；
e、将经黑暗处理的幼苗，接入固体培养基1/4DKW中置于温度23±1℃，光照3500lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗4d，后洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例4：
a、剪取新新2号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗2h，然后将枝条剪切成2cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒100s，0.1％升汞灭菌20min，15％双氧水处理60min，无菌水冲洗6次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ1.8mg/L+IBA0.25mg/L中，温度23±1℃，光照2800lx，时间16h/d，28d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 1.8mg/L+IBA 0.03mg/L中，置于温度23±1℃，光照3500lx，时间16h/d进行培养；
d、将1.5cm的幼苗切下，将其根部放入经常规灭过菌的IBA溶液中处理100min，IBA溶液浓度为90mg/L，接入固体培养基1/4DKW中，并置于温度23±1℃，黑暗处理10天条件下诱导根源基生成；
e、或将步骤d中的幼苗取消黑暗处理，置于温度23±1℃，光照3000lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗4d，洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例5：
a、剪取新新2号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗3h，然后将枝条剪切成1cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒160s，0.1％升汞灭菌30min，15％双氧水处理110min，无菌水冲洗6次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ 1.4mg/L+IBA0.1mg/L中，温度23±1℃，光照3000lx，时间16h/d，30d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 0.4mg/L+IBA 0.1mg/L中，置于温度23±1℃，光照4000lx，时间16h/d进行培养；
d、将步骤c中2.0cm的幼苗切下，接入固体培养基1/2DKW+IBA16mg/L中并于置于温度23±1℃，黑暗处理16天条件下诱导根源基生成；
e、将经黑暗处理的幼苗，接入培养基1/2DKW中并置于温度23±1℃，光照4000lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗6d，后洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例6：
a、剪取新温185号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗60min，然后将枝条剪切成2cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒30s，0.1％升汞灭菌4min，15％双氧水处理50min，无菌水冲洗6次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ 1.0mg/L+IBA0.5mg/L中，温度23±1℃，光照3000lx，时间16h/d，35d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L中，置于温度23±1℃，光照4000lx，时间16h/d进行培养；
d、将2.0cm的幼苗切下，将其根部放入经常规灭过菌的IBA溶液中处理180min，IBA溶液浓度为200mg/L，后接入固体培养基1/2DKW中并于置于温度23±1℃，黑暗处理20天条件下诱导根源基生成；
e、将幼苗取消黑暗处理，置于温度23±1℃，光照3800lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗2-6d，后洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例7：
a、剪取新温185号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗55min，然后将枝条剪切成1.5cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒180s，0.1％升汞灭菌30min，15％双氧水处理120min，无菌水冲洗5次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ 1.3mg/L+IBA0.03mg/L中，温度23±1℃，光照2900lx，时间16h/d，26d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.005mg/L中，置于温度23±1℃，光照3300lx，时间16h/d进行培养；
d、将1.2cm的幼苗切下，接入固体培养基DKW+IBA 2mg/L中并于置于温度23±1℃，黑暗处理3天条件下诱导根源基生成；
e、将经黑暗处理的幼苗，接入固体培养基DKW中并于置于温度23±1℃，光照3300lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗2d，洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
实施例8：
a、剪取新新2号大田核桃枝条，用自来水流动冲洗2.5h，然后将枝条剪切成2cm茎段，每一茎段含一个腋芽，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒90s，0.1％升汞灭菌25min，15％双氧水处理110min，无菌水冲洗6次；
b、将处理后的茎段接入启动诱导固体培养基DKW+TDZ 0.2mg/L+IBA0.2mg/L中，温度23±1℃，光照2900lx，时间16h/d，33d进行诱导培养；
c、将诱导出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段接入固体培养基DKW+6-BA 1.8mg/L+IBA 0.5mg/L中，置于温度23±1℃，光照3900lx，时间16h/d进行培养；
d、将1.9cm的幼苗切下，将其根部放入经常规灭过菌的IBA溶液中处理170min，IBA溶液浓度为150mg/L，接入固体培养基DKW中并于置于温度23±1℃，黑暗处理16天条件下诱导根源基生成；
e、将幼苗取消黑暗处理，置于温度23±1℃，光照4000lx，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗3d，洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石(3∶1∶1)混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
Claims (5)
1、一种薄皮核桃的组织培养和快速繁殖方法，其特征在于由获得无菌苗、芽的增殖、芽的生根和练苗与移栽步骤完成，具体操作按下列步骤进行：
a、剪取大田核桃枝条，用自来水流动冲洗10-180min，然后将枝条剪切成1-2cm茎段，然后将茎段在超净工作台上用75％酒精表面消毒10-180s，0.1％升汞灭菌1-30min，15％双氧水处理10-120min，无菌水冲洗4-6次；
b、将步骤a中处理后的茎段接入诱导培养基DKW+TDZ 0.1-2.0mg/L+IBA0.01-0.5mg/L中，温度23±1℃，光照2500-3000lx，时间16h/d，20-35d进行诱导培养；
c、将步骤b中诱导培养出的新长腋芽苗切成带一个腋芽的茎段，接入培养基DKW+6-BA 0.1-2.0mg/L+IBA 0.001-0.5mg/L中，置于温度23±1℃，光照3000-40001x，时间16h/d进行培养；
d、将步骤c中1.0-2.0cm的幼苗切下，接入培养基(1/8-1)DKW+IBA 1-20mg/L中，置于温度23±1℃，黑暗处理1-20天诱导根源基生成；
或将步骤c中1.0-2.0cm的幼苗切下，将其根部放入经常规灭菌后的IBA溶液中处理10-180min，再接入培养基(1/8-1)DKW中并于置于温度23±1℃，黑暗处理1-20天条件下诱导根源基生成；
e、将步骤d中的经黑暗处理的幼苗，接入培养基(1/8-1)DKW中并于置于温度23±1℃，光照3000-40001x，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
或将步骤d中的幼苗取消黑暗处理，置于温度23±1℃，光照3000-40001x，时间24h/d进行培养，诱导根的生成；
f、将步骤e生根的幼苗，先打开封口膜于温室中炼苗2-6d，洗去苗根部的培养基，移入用灭菌剂处理过的腐殖土∶珍珠岩∶蛭石混合的介质中，置于温室，每天敞开薄膜，通风数次，20d后幼苗成活率达45％。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中的剪切的茎段为每一茎段含一个腋芽。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法中所用的培养基DKW均为固体培养基。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中IBA溶液浓度为5-200mg/L。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g中腐殖土∶珍珠岩∶蛭石为3∶1∶1。
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