CN101455179A - 一种老龄秤锤树的组织培养方法 - Google Patents

一种老龄秤锤树的组织培养方法 Download PDF

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Abstract

一种老龄秤锤树的组织培养方法，采用多年生秤锤树腋芽茎段为外植体，经消毒灭菌后，接种于启动培养基中，先置于黑暗条件下10－15天，再置于普通日光灯下，每日照光15小时，温度20－25℃、湿度50％－60％，培养45天，分化长成试管芽苗；将长成的芽苗，剪切，转接于经消毒增殖培养基中，进行增殖培养，不断增殖，将增殖的试管芽苗剪切后接种于经消毒壮苗培养基中，进行壮苗培养，35天后去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3－4片叶片，接种于经消毒的生根处理产生根原基培养的培养基中，进行生根培养7－10天，取出清洗，移栽到含有泥炭∶黄心土＝1∶1(体积比)的基质中，20天后生根成活，生根率达90％以上。

Description

一种老龄秤锤树的组织培养方法
技术领域
本发明涉及植物培养组织进行快速繁殖的方法，具体为老龄秤锤树的组织培养方法。
背景技术
秤锤树，英文名：Weighttree，学名：Sinojackia xylocarpa Hu，隶属安息香科秤锤树属，为我国北亚热带东部特有树种。秤锤树枝叶浓密，色泽苍翠，初夏盛开白色小花，洁白可爱，秋季落叶后宿存的悬挂果实，宛如秤锤一样，具有较高的观赏价值。由于秤锤树种子自然状态繁殖极其困难，已被列为国家二级保护濒危树种。国内外学者对该树种开展了一系列的研究工作，如花粉的形态研究、花粉的超低温储藏、植物地理分布、叶片脉序比较、生物学特性与种子繁殖、种子休眠与萌发，扦插、嫁接、组培快繁，以及分子手段探讨其系统学位置等积累了不少资料。在现有繁殖技术中，组织培养的方法已有报道，但报道中研究对象为3-5年生的幼龄秤锤树，采用原有方法对南京中山陵风景区明孝陵60年生的老龄大树开展组织培养研究未能成功。原因是利用原有方法培养时，发现外植体启动培养困难、增殖系数低、不生根等问题，说明原方法进行老龄秤锤树组织培养的主要技术环节有明显缺陷。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适合老龄秤锤树的组织培养方法，提高培养的成活率。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种老龄秤锤树的组织培养方法，按下列步骤进行：
(1)：外植体的接种
采用经选育的老龄秤锤树腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒50秒，再用0.1％的升汞溶液(添加Tween-20 1-2滴/100毫升)消毒10-12分钟，用无菌水冲洗3-5次，作为外植体进行培养；
(2)：芽苗培养
在超净的工作台上，无菌条件下，将外植体接种在经消毒的含有启动培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10-15天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光15小时，温度20-25℃、湿度为50％-60％，培养45天，分化长成试管芽苗，
所述的启动培养基由以下重量含量的原料组成：
每升基本培养基含：
玉米素(ZT)1.0-2.0毫克；
6-苄基嘌呤(BA)0.5-2.0毫克；
α-萘乙酸(NAA)0.01-0.2毫克；
(3)：增殖培养
将上述(2)步中长成的芽苗，剪切，转接于经消毒的含有增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要达1500-2000瓶进入下一步，
所述的增殖培养基为：
每升基本培养基含：
玉米素(ZT)1.5-2.5毫克；
6-苄基嘌呤1.0-2.0毫克；
α-萘乙酸(NAA)0.01-0.1毫克；
柠檬酸(Citric acid)50-100毫克；
(4)：壮苗培养
将(3)中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，35天后进入下一步。
所述的壮苗培养基为：
每升基本培养基含：
玉米素(ZT)0.5-1.0毫克、
6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、
α-萘乙酸(NAA)0.05-0.2毫克
柠檬酸(Citric acid)50-100毫克。
(5)：生根培养
将(4)步中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养的培养基的三角瓶中，进行生根培养7-10天。
所述的生根处理产生根原基培养基为：
每升基本培养基含：
α-萘乙酸(NAA)0.3-0.8毫克；
吲哚乙酸(IAA)0.5-1.0毫克；
柠檬酸(Citric acid)100-150毫克；
(6)、移栽
将(5)步生长的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭：黄心土＝1∶1(体积比)的基质中，浇透水，保持温度25℃左右，相对湿度85％以上，遮光(前7天)70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达90％以上，45天左右，全光照。
上述老龄秤锤树的组织培养方法，所有培养基其pH值均调至5.8左右，所述的基本培养基配方见表1。
表1每升基本培养基中含有物质种类和质量
 
化学名称 中文名称 浓度mg/L
Ca(NO3)2·4H2O 硝酸钙 371-417
NH4NO3 硝酸铵 268-300
KNO3 硫酸钾 600-675
MgSO4·7H2O 硫酸镁 248-278
KH2PO4 磷酸二氢钾 115-128
CaCl2·2H2O 氯化钙 72-96
MnSO4·4H2O 硫酸锰 22.5
ZnSO4·7H2O 硫酸锌 8.6
H3BO3 硼酸 6.2
CuSO4·5H2O 硫酸铜 0.25
 
Na2MoO4·2H2O 钼酸钠 0.25
FeSO4·7H2O 硫酸亚铁 34.1
Na2-EDTA 乙二胺四乙酸钠 46.6
thiamine·HCl(维生素B1) 盐酸硫胺素VB1 1.0
pyridoin·HCl(维生素B6) 盐酸吡哆辛VB6 0.5
nicotinic acid(Vit B5) 烟酸VB5 0.5
Glycine 甘氨酸 2.0
myo-inositol 肌醇 100
蔗糖 20000
卡拉胶 6500
本发明的有益效果是：本发明的老龄秤锤树的组织培养方法，能保持老龄树种优良性状，在短期内生产大量优质种苗，繁殖速度快，促进该濒危植物的保护、利用。
具体实施方式
实施例1
老龄秤锤树的组织培养所用的基本培养基配方如表2
表2  每升基本培养基中含有物质种类和质量
 
化学名称 中文名称 mg/L
Ca(NO3)2·4H2O 硝酸钙 371
NH4NO3 硝酸铵 268
KNO3 硫酸钾 600
MgSO4·7H2O 硫酸镁 248
KH2PO4 磷酸二氢钾 115
CaCl2·2H2O 氯化钙 72
MnSO4·4H2O 硫酸锰 22.5
ZnSO4·7H2O 硫酸锌 8.6
H3BO3 硼酸 6.2
 
CuSO4·5H2O 硫酸铜 0.25
Na2MoO4·2H2O 钼酸钠 0.25
FeSO4·7H2O 硫酸亚铁 34.1
Na2-EDTA 乙二胺四乙酸钠 46.6
thiamine·HCl(维生素B1) 盐酸硫胺素VB1 1.0
pyridoxin·HCl(维生素B6) 盐酸吡哆辛VB6 0.5
nicotnic acid(Vit B5) 烟酸VB5 0.5
Glycine 甘氨酸 2.0
myo-inositol 肌醇 100
蔗糖 20000
卡拉胶 6500
启动培养基：每升基本培养基+ZT 1.0mg+BA 2.0mg+NAA 0.01mg；
增殖培养基：每升基本培养基+ZT 1.5mg+BA 2.0mg+NAA 0.01mg+柠檬酸50mg；
壮苗培养：每升基本培养基+ZT 0.5mg+BA 1.0mg+NAA 0.05mg+柠檬酸50mg；
生根处理产生根原基培养：每升基本培养基+NAA 0.3mg+IAA 1.0mg+柠檬酸100mg。
将上述启动培养基注入三角瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1Kg/cm2)20分钟，待用。
1、采用经选育的60年生的老龄秤锤树腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒50秒，再用0.1％的升汞溶液消毒10-12分钟(添加Tween20 1-2滴/100毫升)，用无菌水冲洗3-5次；
2、在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在经消毒的含有启动培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10-15天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光15小时，温度20-25℃、湿度为50％-60％，培养45天，分化长成试管芽苗；
3、将从步骤2中长成的芽苗，剪切，转接于经消毒的含有增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，一个周期35天的繁殖倍数为4.5，生长高度达3.8cm，视繁殖生产需要达1500-2000瓶时进入下一步；
4、将步骤3中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，35天后进入下一步；
5、将步骤4中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，按步骤2接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养的培养基的三角瓶中，进行生根培养7-10天；
6、将步骤5中生长的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭：黄心土＝1∶1(体积比)的基质中，浇透水，保持温度25℃左右，相对湿度85％以上，遮光(前7天)70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达93％，45天左右，全光照，可实现老龄秤锤树的规模化生产。
实施例2
本实施例按实施例1的步骤进行操作，只是培养基的重量配比和原料组分不同，本实施例所用的基本培养基配方如表3，培养后生根率为95％。
表3  每升基本培养基中含有物质种类和质量
 
化学名称 中文名称 mg/L
Ca(NO3)2·4H2O 硝酸钙 417
NH4NO3 硝酸铵 300
KNO3 硫酸钾 675
MgSO4·7H2O 硫酸镁 278
KH2PO4 磷酸二氢钾 128
CaCl2·2H2O 氯化钙 96
MnSO4·4H2O 硫酸锰 22.5
ZnSO4·7H2O 硫酸锌 8.6
H3BO3 硼酸 6.2
CuSO4·5H2O 硫酸铜 0.25
 
Na2MoO4·2H2O 钼酸钠 0.25
FeSO4·7H2O 硫酸亚铁 34.1
Na2-EDTA 乙二胺四乙酸钠 46.6
thiamine·HCl(维生素B1) 盐酸硫胺素B1 1.0
pyridoxin·HCl(维生素B6) 盐酸吡哆辛B6 0.5
nicotinic acid(Vit B5) 烟酸VB5 0.5
Glycine 甘氨酸 2.0
myo-inositol 肌醇 100
蔗糖 20000
卡拉胶 6500
启动培养基：每升基本培养基+ZT 2.0mg+BA 0.5mg+NAA 0.2mg；
增殖培养基：每升基本培养基+ZT 2.5mg+BA 1.0mg+NAA 0.1mg+柠檬酸100mg；
壮苗培养：每升基本培养基+ZT 1.0mg+BA 0.5mg+NAA 0.2mg+柠檬酸100mg；
生根处理产生根原基培养：每升基本培养基+NAA 0.8mg+IAA 0.5mg+柠檬酸150mg。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种老龄秤锤树的组织培养方法，其特征是按下列步骤进行：
(1)、采用经选育的多年生老龄秤锤树腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒40-50秒，再用0.1％的升汞溶液灭菌10-12分钟(添加吐温201-2滴/100毫升)，用无菌水冲洗3-5次；
(2)、在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在经消毒的含有启动培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10-15天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光15小时，温度20-25℃、湿度为50％-60％，培养45天，分化长成试管芽苗；
所述的启动培养基为：每升基本培养基含：玉米素(ZT)1.0-2.0毫克、6-苄基嘌呤(BA)0.5-2.0毫克和α-萘乙酸(NAA)0.01-0.2毫克；
(3)、将从(2)步中长成的芽苗，剪切，转接于经消毒的含有增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产规模需要达1500-2000瓶进入下一步；
所述的增殖培养基为：每升基本培养基含：玉米素(ZT)1.5-2.5毫克、6-苄基嘌呤1.0-2.0毫克、α-萘乙酸(NAA)0.01-0.1毫克和柠檬酸(Citric acid)50-100毫克；
(4)、将(3)步中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，35天后进入下一步；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基含：玉米素(ZT)0.5-1.0毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸(NAA)0.05-0.2毫克和柠檬酸(Citric acid)50-100毫克；
(5)、将(4)步中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养的培养基的三角瓶中，进行生根培养7-10天；
所述的生根处理产生根原基培养基为：每升基本培养基含：α-萘乙酸(NAA)0.3-0.8毫克、吲哚乙酸0.5-1.0毫克和柠檬酸(Citric acid)100-150毫克；
(6)、将(5)步中生长的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭:黄心土＝1:1(体积比)的基质中，浇透水，保持温度25℃左右，相对湿度85％以上，遮光(前7天)70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达90％以上，45天左右，全光照。
2.根据权利要求1所述的老龄秤锤树的组织培养方法，其特征是所述的基本培养基的配方为：每升基本培养基中含有：硝酸钙371-417mg，硝酸铵268-300mg，硫酸钾600-675mg，硫酸镁248-278mg，磷酸二氢钾115-128mg，氯化钙72-96mg，硫酸锰22.5mg，硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，硫酸铜0.25mg，钼酸钠0.25mg，硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖20000mg，卡拉胶6500mg。
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