CN102367263A - 一种分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品为原料分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法，即取积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品进行柱层析，用含有β-环糊精的流动相洗脱，分别收集流份，浓缩干燥，即得积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷。采用本发明的上述技术方案，可以从积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品中分离出积雪草三萜酸单葡萄糖苷纯品，而且本发明的方法操作简单，成本较低，适于大规模生产应用。
Description
技术领域
本发明属天然药物领域，涉及一种以积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品为原料分离纯化多种积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法。
背景技术
积雪草(Centella asiatica(L.)Urb)又称落得打、崩大碗、半边钱，为伞形科积雪草属植物，其始载于《神农本草经》，列为中品。其性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效，主要用于湿热黄疸，中暑腹泻，砂淋血淋，痈肿疮毒，跌打损伤。积雪草是民间广东地区常用中草药，利用积雪草外用及内服治病在我国已有两千多年历史。现代研究表明，积雪草具有抗菌消炎、抗抑郁、抗肿瘤、促进创伤愈合和治疗增生性瘢痕的作用，积雪草提取物对硬皮病及烧伤瘢痕等纤维化疾病有明显的疗效，能有效地促进伤口愈合。积雪草通过增加角质化细胞中MCP-1的表达从而促进VEGF的生成，同时促进MCP-1巨噬细胞生成IL-1β，提高烧伤处血管的生成而达到治疗烧伤的目的。
积雪草主要含积雪草苷(asiaticoside)、羟基积雪草苷(madecassoside)、积雪草苷B(asiaticoside B)、积雪草二糖苷(asiaticodiglycoside)、羟基积雪草二糖苷(centellasaponin B)、scheffoleoside A、centellasaponin B、积雪草酸(asiatic acid)和羟基积雪草酸(brahmic acid)等化学成分。中国发明专利201110234306.X公开了一种使用β-葡萄糖苷酶或能产生β-葡萄糖苷酶的微生物转化积雪草提取物中的三糖苷和二糖苷生成单糖苷组合物的方法及其转化产物的含量测定方法，该积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物主要包含积雪草酸单葡萄糖苷(asiatic acid-28-O-β-D glucopyranoside)、切布苷II(chebuloside II)和羟基积雪草酸单葡萄糖苷(centelloside C)。β-葡萄糖苷酶以及能产生β-葡萄糖苷酶的微生物还能水解积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草二糖苷、羟基积雪草二糖苷、scheffoleoside和Acentellasaponin B生成积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷等积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品。至今为止，还未见有从积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品中分离纯化积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷等积雪草三萜酸单葡萄糖苷的研究报道。
发明内容
本发明旨在提供一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷的制备方法，即以积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品为原料，经柱层析得到切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品包括积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物以及含有切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷中一种或一种以上成分的混合物，取所述积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品进行柱层析，用含有β-环糊精的流动相洗脱，分别收集流份，浓缩干燥，即得积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷。
本发明的方法包括ODS C18柱层析和硅胶与ODS C18组合柱层析两种，具体步骤如下：
(1)将积雪草酸单葡萄糖苷粗品溶解或混悬于溶剂中，溶剂与积雪草酸单葡萄糖苷粗品的用量比为0.5-5mL/g，溶剂为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液；
(2)上样于粗品重量30-300倍的ODS C18层析柱的上端，用质量百分浓度为0.05％-2％β-环糊精溶液洗脱；
所述β-环糊精溶液以水和有机溶剂混合物为溶剂；
所述有机溶剂与水体积比为1∶1～1∶10；有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；
(3)分别收集切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的流份，40-70℃减压浓缩至干即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
取所得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷分别用体积含量40％～100％的醇溶液重结晶1～3次，并干燥，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷纯品；所述的醇为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合物。
或，硅胶与ODS C18组合柱层析法，包括以下步骤：
(1)硅胶柱层析：将积雪草酸单葡萄糖苷粗品溶解或混悬于溶剂，溶剂与积雪草酸单葡萄糖苷粗品的用量比为0.5-5mL/g，溶剂为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液；
加入粗品重量0.5-2倍量硅胶，搅拌均匀，挥干溶剂，碾碎成均匀细颗粒，上样于该粗品重量50-200倍量硅胶柱的上端，用氯仿∶甲醇或乙醇体积比为10∶1-10∶5的洗脱液洗脱，收集积雪草酸单葡萄糖苷流份；
再用氯仿∶甲醇或乙醇∶水的体积比为10∶(1～5)∶(0.05～0.5)的洗脱液洗脱，收集羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物流份；两个流份分别于40-70℃减压浓缩至干，即得积雪草酸单葡萄糖苷以及羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物；
(2)ODS C18柱层析：将羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物溶解于溶剂，溶剂与羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物的用量比为0.5-5mL/g，溶剂为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液，上样于粗品重量30-300倍的ODS C18层析柱的上端，用质量百分浓度为0.05％-2％β-环糊精溶液洗脱；
所述β-环糊精溶液以有机溶剂和水的混合物为溶剂；所述有机溶剂与水体积比为1∶1～1∶10；有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；
分别收集切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份，40-70℃减压浓缩至干，即得切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷。
所得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷还可进行一步结晶纯化步骤：
取步骤(1)和(2)所得积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷，分别用体积含量40％～100％醇溶液重结晶1～3次并干燥即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷纯品；所述的醇为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合物。
以上积雪草三萜酸单葡萄糖苷的制备方法，其硅胶柱层析和ODSC18柱层析均包括半制备型和制备型液相色谱层析系统。
采用本发明的上述技术方案，可以从积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品中分离出积雪草三萜酸单葡萄糖苷纯品，其纯度超过95％；而且本发明的方法操作简单，成本较低，适于大规模生产应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
实施例1
将积雪草酸单葡萄糖苷组合物1g溶解或混悬于0.5mL甲醇，采用配置有30g ODS C18柱的半制备型液相色谱仪进行层析，用含有质量百分比为0.05％β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶2，分别收集切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的流份，40℃减压浓缩至干，加入50％甲醇水溶液，加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶1次，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为97.6％、96.3％和94.1％。
实施例2
将积雪草酸单葡萄糖苷组合物10g溶解或混悬于50mL甲醇，采用配置有2kg ODS C18柱的制备型液相色谱仪进行层析，用含有质量百分比为0.4％的β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶4，分别收集切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的流份，40℃减压浓缩至干，加入50％甲醇水溶液，加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶2次，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为98.6％、98.3％和98.1％。
实施例3
将积雪草酸单葡萄糖苷组合物10g溶解或混悬于30mL甲醇，采用配置有3kg ODS C18柱的制备型液相色谱仪进行层析，用含有质量百分比为0.4％的β-环糊精的乙醇水溶液洗脱，其中乙醇∶水体积比为1∶4，分别收集切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的流份，60℃减压浓缩至干，加入50％乙醇水溶液，加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶3次，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II的质量百分含量分别为98.3％、97.3％和99.1％。
实施例4
称取积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品100g，置坩埚中，加入50mL甲醇，搅拌溶解，加入50g薄层层析硅胶，搅拌均匀，室温挥干甲醇，搅拌碾碎使硅胶颗粒分散均匀，加入到一个预先装好2.5kg硅胶(200-300目)的半制备型玻璃层析柱上端，用氯仿∶甲醇体积比为10∶1的洗脱液常压洗脱，收集积雪草酸单葡萄糖苷流份；再用氯仿∶甲醇∶水的体积比为10∶1∶0.05的洗脱液洗脱，收集羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物流份，40℃减压浓缩、干燥，粉碎，即得切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷混合物。
将切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷混合物溶解或混悬于30mL甲醇，上样于3kg的ODS C18层析柱的上端，用含有质量百分比为0.05％β-环糊精的甲醇水溶液常压洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶1，分别收集切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份。
分别将切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的流份于40℃减压浓缩至干，加入甲醇加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶1次，干燥，粉碎，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为97.2％、96.7％和95.9％。
实施例5
称取积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品100g，置坩埚中，加入200mL甲醇，搅拌溶解，加入100g薄层层析硅胶，搅拌均匀，室温挥干甲醇，搅拌碾碎使硅胶颗粒分散均匀，加入到一个预先装好5kg硅胶(200-300目)的半制备型不锈钢层析柱上端，用氯仿∶甲醇体积比为10∶3的洗脱液洗脱，收集积雪草酸单葡萄糖苷流份；再用氯仿∶甲醇∶水的体积比为10∶3∶0.2的洗脱液洗脱，收集羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物流份，50℃减压浓缩、干燥，粉碎，即得切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷混合物。
将羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物溶解或混悬于120mL甲醇，上样于10kg的ODS C18层析柱的上端，用含有质量百分比为0.4％β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶3，分别收集切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份。
分别将积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份于50℃减压浓缩至干，加入甲醇加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶2次，干燥，粉碎，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II的质量百分含量分别为98.2％、98.7％和98.9％。
实施例6
称取积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品100g，置坩埚中，加入500mL乙醇，搅拌溶解，加入200g薄层层析硅胶，搅拌均匀，室温挥干甲醇，搅拌碾碎使硅胶颗粒分散均匀，加入到一个预先装好20kg硅胶(200-300目)的制备型玻璃层析柱上端，用氯仿∶乙醇体积比为10∶5的洗脱液洗脱，收集积雪草酸单葡萄糖苷流份；再用氯仿∶乙醇∶水的体积比为10∶5∶0.5的洗脱液洗脱，收集羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II羟基积雪草酸单葡萄糖苷混合物流份，60℃减压浓缩、干燥，粉碎，即得羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物。
将羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物溶解或混悬于300mL乙醇，上样于30kg的ODS C18层析柱的上端，用含有质量百分比为2％β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶6，分别收集切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份。
分别将积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份于60℃减压浓缩至干，加入乙醇加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶3次，干燥，粉碎，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为98.2％、99.1％和98.2％。
实施例7
称取积雪草酸单葡萄糖苷粗品100g，置坩埚中，加入500mL乙醇，搅拌溶解，加入200g薄层层析硅胶，搅拌均匀，室温挥干甲醇，搅拌碾碎使硅胶颗粒分散均匀，加入到一个预先装好20kg硅胶(200-300目)的制备型玻璃层析柱上端，用氯仿∶乙醇体积比为10∶5的洗脱液洗脱，收集积雪草酸单葡萄糖苷流份，60℃减压浓缩、干燥，粉碎，即得积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为97.1％。
实施例8
将羟基积雪草酸单葡萄糖苷粗品10g溶解或混悬于50mL甲醇，采用配置有300g ODS C18柱的制备型液相色谱仪进行层析，用含有质量百分比为0.4％的β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶4，收集羟基积雪草酸单葡萄糖苷流份，40℃减压浓缩至干，加入适量50％甲醇水溶液，加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶2次，即得羟基积雪草酸单葡萄糖苷。
HPLC测定含量，结果羟基积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为96.8％。
实施例9
将切布苷II粗品10g溶解或混悬于50mL甲醇，采用配置有300gODS C18柱的制备型液相色谱仪进行层析，用含有质量百分比为2％的β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶4，收集切布苷II流份，40℃减压浓缩至干，加入50％甲醇水溶液，加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶2次，即得切布苷II。
HPLC测定含量，结果切布苷II的质量百分含量分别为96.8％。
实施例10
将切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷混合物10g溶解或混悬于50mL甲醇，采用配置有300g ODS C18柱的制备型液相色谱仪进行层析，用含有质量百分比为0.4％的β-环糊精的甲醇水溶液洗脱，其中甲醇∶水体积比为1∶4，收集切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷流份，40℃减压浓缩至干，加入50％甲醇水溶液，加热溶解成饱和溶液，冷却结晶，重结晶2次，即得切布苷II。
HPLC测定含量，结果切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为97.2％和95.9％。
Claims (6)
1.一种分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法，以积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品为原料，所述积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品包括积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物以及含有切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷中一种或一种以上成分的混合物；其特征在于，步骤包括：
取所述积雪草三萜酸单葡萄糖苷粗品进行柱层析，用含有β-环糊精的流动相洗脱，分别收集流份，浓缩干燥，重结晶，即得积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷。
2.权利要求1所述的分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法，其特征在于，采用ODS C18柱层析法制取，包括以下步骤：
(1)将积雪草酸单葡萄糖苷粗品溶解或混悬于溶剂中，溶剂与积雪草酸单葡萄糖苷粗品的用量比为0.5-5mL/g，溶剂为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液；
(2)上样于粗品重量30-300倍的ODS C18层析柱的上端，用质量百分浓度为0.05％-2％β-环糊精溶液洗脱；
所述β-环糊精溶液以水和有机溶剂混合物为溶剂；
所述有机溶剂与水体积比为1∶1～1∶10；有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；
(3)分别收集切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷的流份，40-70℃减压浓缩至干即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷。
3.权利要求2所述的分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括纯化步骤：取步骤(3)所得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷分别用体积含量40％～100％的醇溶液重结晶1～3次，并干燥，即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷纯品；所述的醇为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液。
4.权利要求1所述的分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法，其特征在于，采用硅胶和ODS C18组合柱层析法制取，包括以下步骤：
(1)硅胶柱层析：将积雪草酸单葡萄糖苷粗品溶解或混悬于溶剂，溶剂与积雪草酸单葡萄糖苷粗品的用量比为0.5-5mL/g，溶剂为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液；
加入粗品重量0.5-2倍量硅胶，搅拌均匀，挥干溶剂，碾碎成均匀细颗粒，上样于该粗品重量50-200倍量硅胶柱的上端，用氯仿∶甲醇或乙醇体积比为10∶1-10∶5的洗脱液洗脱，收集积雪草酸单葡萄糖苷流份；
再用氯仿∶甲醇或乙醇∶水的体积比为10∶(1～5)∶(0.05～0.5)的洗脱液洗脱，收集羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物流份；两个流份分别于40-70℃减压浓缩至干，即得积雪草酸单葡萄糖苷以及羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物；
(2)ODS C18柱层析：将羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物溶解于溶剂，溶剂与羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II混合物的用量比为0.5-5mL/g，溶剂为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液，上样于粗品重量30-300倍的ODS C18层析柱的上端，用质量百分浓度为0.05％-2％β-环糊精溶液洗脱；
所述β-环糊精溶液以有机溶剂和水的混合物为溶剂；所述有机溶剂与水体积比为1∶1～1∶10；有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；
分别收集切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷的流份，40-70℃减压浓缩至干，即得切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷。
5.权利要求4所述的分离纯化积雪草三萜酸单葡萄糖苷的方法，其特征在于，还包括结晶纯化步骤：取步骤(1)和(2)所得积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II和羟基积雪草酸单葡萄糖苷，分别用体积含量40％～100％醇溶液重结晶1～3次并干燥即得切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和积雪草酸单葡萄糖苷纯品；所述的醇为甲醇、乙醇或甲醇与乙醇的混合溶液。
6.权利要求2或4所述的积雪草三萜酸单葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，ODS C18柱层析包括半制备型和制备型液相色谱层析。
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