CN102361856A - 囊性纤维化跨膜传导调节因子的调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中R是COOH或CH₂OH。

Description

囊性纤维化跨膜传导调节因子的调节剂

优先权要求

本申请要求2009年3月20日提交的美国临时申请顺序号US 61/162,130的优先权，将该文献完整引入本文参考。

本发明的技术领域

本发明涉及囊性纤维化跨膜传导调节因子(“CFTR”)的调节剂，其组合物及其方法。本发明也涉及使用这些CFTR调节剂治疗疾病的方法。

发明背景

囊性纤维化(CF)在美国是一种影响约30,000儿童和成年人并且在欧洲影响约30,000儿童和成年人的隐性遗传疾病。尽管在治疗CF方面已经取得了进展，但是无法治愈。

CF因编码负责有助于调节各种组织中盐和水吸收和分泌的上皮氯离子通道的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因中的突变导致。称作增加CFTR通道开放可能性的增强剂的小分子药物代表治疗CF的一种潜在治疗策略。

特别地，CFTR是在多种细胞类型(包括吸收和分泌上皮细胞)中表达的cAMP/ATP-介导的阴离子通道，其中它调节跨膜的阴离子流通，并调节其它离子通道和蛋白质的活性。在上皮细胞中，CFTR的正常功能对于维持包括呼吸和消化组织在内的整个身体的电解质转运是非常关键的。CFTR是由约1480个氨基酸构成的，这些氨基酸编码由跨膜区的串联重复体构成的蛋白质，每个重复体包含6个跨膜螺旋和1个核苷酸结合域。2个跨膜区通过一个具有多个磷酸化位点的大的、极性的、调节性(R)-域相连，所述磷酸化位点调节通道活性和细胞运输。

已经鉴定出了编码CFTR的基因并测定了其序列(参见Gregory，R.J.等人，(1990)Nature 347：382-386；Rich，D.P.等人，(1990)Nature 347：358-362)，(Riordan，J.R.等人，(1989)Science 245：1066-1073)。这个基因的缺陷引起CFTR突变，导致囊性纤维化(“CF”)，是人体最常致命的遗传性疾病。在美国，囊性纤维化影响约2，500分之一的婴儿。在一般的美国人口中，高达1千万的人携带单独1个这样的缺陷基因，但没有明显的不良效果。与此不同的是，携带2个与CF有关的基因的个体会发生CF的致虚弱和致命作用，包括慢性肺病。

在患CF的患者中，在呼吸上皮中内源性表达的CFTR突变导致顶膜的阴离子分泌减少，使离子和液体转运失衡。所导致的阴离子转运的减少使得CF患者的肺粘液蓄积增加并伴随最终导致死亡的微生物感染。除了呼吸性疾病，CF患者典型地具有胃肠方面的问题和胰功能不全，如果不治疗的话，会导致死亡。此外，大部分患有囊性纤维化的男性都不能生育，而患囊性纤维化的女性则生育力降低。与2个和CF有关的基因所带来的严重后果不同的是，携带有1个与CF有关的基因的个体显示出对霍乱和腹泻导致的脱水的抵抗力增强——可能解释了CF基因在这个人群中的相对高频率出现。

CF染色体的CFTR基因的序列分析显示了很多导致疾病的突变。(Cutting，G.R.等人，(1990)Nature 346：366-369；Dean，M.等人，(1990)Cell 61：863：870；和Kerem，B-S.等人，(1989)Science 245：1073-1080；Kerem，B-S等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：8447-8451)。迄今为止，已经鉴定出了1000种以上的引起疾病的CF基因突变(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app)。最常见的突变是在CFTR氨基酸序列的508位上苯丙氨酸的缺失，一般称作ΔF508-CFTR。这种突变在约70％的囊性纤维化病例中都会发生，与严重的疾病有关。

ΔF508-CFTR中第508位残基的缺失妨碍了初生蛋白的正确折叠。这导致该突变蛋白不能退出ER，和通过质膜。结果，膜中存在的通道数量远小于表达野生型CFTR的细胞中所观察到的数量。除了运输受损，该突变导致通道门控缺陷。这样加起来，膜中通道数量减少和门控缺陷导致通过上皮的阴离子转运减少，导致离子和液体转运出现缺陷。(Quinton，P.M.(1990)，FASEB J.4：2709-2727)。但是，研究已经显示出，尽管比野生型CFTR少，膜中ΔF508-CFTR的数量减少是有用的。(Dalemans等人，(1991)，Nature Lond.354：526-528；Denning等人，出处同前；Pasyk和Foskett(1995)，J.Cell.Biochem.270：12347-50)。除了ΔF508-CFTR，导致运输、合成和/或通道门控缺陷的其它的引起疾病的CFTR突变可以被向上或向下调节，以改变阴离子分泌并改变疾病进程和/或严重性。

尽管除了阴离子外CFTR还转运多种分子，但是显然，这种作用(转运阴离子)代表了跨上皮细胞转运离子和水的重要机制中的一个要素。其它要素包括上皮Na⁺通道、ENaC、Na⁺/2Cl^-/K⁺共转运体、Na⁺-K⁺-ATP酶泵和基底外侧膜K⁺通道，它们负责将氯离子吸收到细胞中。

这些要素一起运作，以通过它们在细胞中的选择性表达和定位实现跨上皮细胞的定向转运。通过存在于顶膜上的ENaC和CFTR与在细胞的基底外侧表面上表达的Na⁺-K⁺-ATP酶泵和Cl^-通道之间的协调性活性，发生了氯离子的吸收。氯离子从腔侧的继发性主动转运导致细胞内的氯离子蓄积，接着被动地通过Cl^-通道离开细胞，导致矢量转运。基底外侧表面上的Na⁺/2Cl^-/K⁺共转运体、Na⁺-K⁺-ATP酶泵和基底外侧膜K⁺通道和腔侧上的CFTR的排列，通过腔侧上的CFTR来协调氯离子的分泌。由于水可能从不自己主动转运，因此它依靠钠和氯离子的总体流量产生的微小的跨上皮渗透梯度流过上皮。

如上讨论，据认为，ΔF508-CFTR中508残基的缺失会妨碍初生蛋白正确折叠，导致该突变蛋白不能退出ER，并通过质膜。结果，质膜中存在的成熟蛋白量不足，上皮组织内的氯离子转运显著减少。事实上，经由ER机制加工ABC转运体的ER缺陷的这种细胞现象已经显示出，其不仅是CF疾病的潜在基础，也是范围广泛的其它独立和遗传疾病的潜在基础。

因此，需要CFTR活性的调节剂及其组合物，其可以用于调节哺乳动物的细胞膜中的CFTR的活性。

需要使用这种CFTR活性调节剂治疗CFTR中突变导致的疾病的方法。

需要在哺乳动物的离体细胞膜中调节CFTR活性的方法。

发明概述

在一个方面中，本发明涉及式I的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R是COOH或CH₂OH。

在一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包括式I化合物或其药学上可接受的盐，其中R如上述所定义，和药学上可接受的载体或辅助剂。

在药物组合物的一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在药物组合物的另一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

该方面的实施方案还可以包括包含另外的活性剂的药物组合物，所述另外的活性剂选自溶粘蛋白剂、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、CFTR调节剂或营养剂。

在一个方面中，本发明包括调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使该生物样品接触式I化合物或其药学上可接受的盐的步骤，其中R如上述所定义。

在调节CFTR活性的方法的一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在调节CFTR活性的方法的另一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在另一个方面中，本发明还提供了治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一，且上述疾病选自囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰功能不全、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育症、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色病、凝血-纤溶缺陷，例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷，例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积症，例如I-细胞病/假性胡尔勒综合征、粘多糖症、桑霍夫病/泰-萨病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺乏症、尿崩症(DI)、神经生长性DI(neurophysealDI)、肾性DI、夏-马-图综合征、佩-梅病、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍，例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病，例如遗传性克-雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、格-斯-施综合征、COPD、干眼病或斯耶格伦病、骨质疏松症、骨质减少、骨愈合和骨生长(包括骨修复、骨再生、减少骨质吸收和增加骨沉积)、戈勒姆综合征、氯化物通道病变，例如先天性肌强直(Thomson和Becker形式)、III型巴特综合征、登特病、惊跳病(hyperekplexia)、癫痫症、惊跳病、溶酶体贮存病、安格曼综合征和原发性纤毛运动障碍(PCD)，即纤毛结构和/或功能遗传障碍的术语，包括具有左右转位的PCD(也称作卡特金纳综合征)、不具有左右转位的PCD和纤毛发育不良。

在治疗或减轻疾病严重性的方法的另一个实施方案中，所述疾病选自CF、COPD、吸烟诱发的COPD、胰腺炎和鼻窦炎。

在一些实施方案中，所述疾病是囊性纤维化。

在治疗或减轻疾病严重性的方法的一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在治疗或减轻疾病严重性的方法的另一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在另一个方面中，本发明提供用于在体外或体内测定生物样品中CFTR或其片段活性的试剂盒，所述试剂盒包括(i)包含式I化合物或任意上述实施方案的组合物；和(ii)用于如下内容的说明书：a)将该组合物与生物样品接触；和b)测定所述CFTR或其片段的活性。

在该方面的一个实施方案中，试剂盒进一步包括用于下列内容的说明书：a)将另外的组合物与该生物样品接触；b)在所述另外的化合物存在下测定所述CFTR或其片段的活性；和c)将在另外的化合物存在下的CFTR或其片段的活性与在式I的组合物存在下的CFTR或其片段的密度进行比较。

在优选的实施方案中，试剂盒用于测定CFTR或其片段的密度。

在进一步的优选实施方案中，试剂盒用于测定该CFTR或其片段的密度，且比较所述CFTR或其片段的活性的步骤提供所述CFTR或其片段的密度的测量。

在用于测定CFTR活性的试剂盒的一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

在用于测定CFTR活性的试剂盒的另一个实施方案中，化合物具有如下结构：

或其药学上可接受的盐。

式I化合物提供有利的特性，例如、但不限于增加的极性、有利的水溶性、较低的分布体积和较低的组织穿透力。

详细描述

定义

本发明的化合物包括上述一般描述的那些，且进一步由本文公开的类型、亚类和种类示例。除非另有指示，否则本文所用的如下定义应适用。

本文使用的术语“ABC-转运体”是指ABC-转运蛋白或其包含至少一个结合域的片段，其中所述蛋白或其片段存在于体内或体外。本文使用的术语“结合域”是指可以与调节剂结合的ABC-转运体上的一个区域。参见，例如Hwang，T.C.等人，J.Gen.Physiol.(1998)：111(3)，477-90。

本文使用的术语“CFTR”是指囊性纤维化跨膜传导调节因子或其具有调节活性的突变体，包括但不限于ΔF508 CFTR和G551D CFTR(参见，例如，http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/，CFTR突变体)。

本文使用的术语“调节”是指以可测定量增加或减少。

为了本发明的目的，根据元素周期表，CAS版，Handbook ofChemistry and Physics，第75版，来鉴定化学元素。此外，在“OrganicChemistry”，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999，以及“March′s Advanced Organic Chemistry”，第5版，Ed.：Smith，M.B.和March，J.，John Wiley & Sons，New York：2001中描述了有机化学的一般原理，将其全部内容通过参考引入本文。

应当理解，措辞“任选取代的”与措辞“取代或未取代的”是可互换使用的。一般而言，术语“取代”无论前面有无术语“任选”，都表示给定结构中的氢原子团被指定取代基的原子团所代替。除非另有指示，任选取代的基团可以在该基团每一可取代的位置上具有取代基，若任意给定结构中一个以上位置可以被一个以上选自指定组的取代基所取代，则取代基可以在每个位置上是相同或不同的。本发明所关注的取代基组合优选地是能形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。本文中使用的短语“稳定的或化学上可行的”是指当出于本文所述的一种或多种目的而受到允许它们的生产、检测、优选回收、纯化、以及使用的条件处理时，基本上没有改变的化合物。在一些实施方案中，稳定的化合物或化学上可行的化合物是在没有水分或没有其它化学反应性条件的存在下，在40℃或更低的温度保持至少一周时，基本上没有改变的化合物。

本文所用的术语“保护基”表示指定防止官能团在合成操作过程中发生不期望的反应的那些基团，例如醇、胺、羧基、羰基等。常用保护基公开在Greene和Wuts的Protective Groups in OrganicSynthesis，第3版(John Wiley & Sons，New York，1999)中，将该文献引入本文参考。氮保护基的实例包括酰基、芳酰基或氨基甲酰基例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻-硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基和手性助剂例如被保护或未保护的D，L或D，L-氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；磺酰基例如苯磺酰基、对-甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯基例如苄氧羰基、对-氯苄氧羰基、对-甲氧基苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对-溴苄氧羰基、3，4-二甲氧基苄氧羰基、3，5-二甲氧基苄氧羰基、2，4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4，5二甲氧基苄氧羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲氧基羰基、叔丁氧羰基、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基、2，2，2，-三氯乙氧基羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧羰基、环戊氧羰基、金刚烷氧羰基、环己氧基羰基、苯基硫羰基等、芳基烷基例如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等和甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基等。优选的N-保护基是叔丁氧羰基(Boc)。

有用的酸保护基的实例是取代的烷基酯类，例如9-芴基甲基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、甲氧基乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、苄氧基甲基、新戊酰氧基甲基、苯基乙酰氧基甲基、三异丙基甲硅烷基(triisopropropylsysilyl)甲基、氰基甲基、丙酮醇、苯酰基、取代的苯酰基酯类、2，2，2-三氯乙基、2-卤代乙基、ω-氯烷基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-甲硫基乙基、叔丁基、3-甲基-3-戊基、二环丙基甲基、环戊基、环己基、烯丙基、甲代烯丙基、肉桂基(cynnamyl)、苯基。甲硅烷基酯类、苄基和取代的苄基酯类、2，6-二烷基苯基酯类例如五氟苯基、2，6-二烷基苯基(pyhenyl)。优选的酸保护基是甲基或乙基酯类。

添加(一般称作“保护”的方法)和除去(一般称作“脱保护”的方法)这样的胺和酸保护基的方法是本领域众所周知的且可以从P.J.Kocienski，Protecting Groups，Thieme，1994(将该文献完整引入本文参考)和Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第3版(John Wiley & Sons，New York，1999)中得到。

除非另有指定，否则本发明化合物的全部互变体形式均属于本发明的范围。即，式I化合物可以作为互变体存在：

另外，除非另有说明，本文中所述结构还意指包括仅在存在一种或多种同位素富集的原子方面不同的化合物。例如，具有本发明结构但是用氘或氚置换氢或者用富含¹³C-或¹⁴C-的碳置换碳的化合物也在本发明的范围内。这种化合物可用于例如作为生物检验中的分析工具或探针，或者作为治疗剂。

适合的溶剂的实例是但不限于水、甲醇、二氯甲烷(DCM)、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯(EtOAc)、异丙醇(IPA)、乙酸异丙酯(IPAc)、四氢呋喃(THF)、甲基乙基酮(MEK)、叔丁醇和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。

适合的偶合剂的实例是但不限于1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、2-氯-1，3-二甲基-2-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-H-苯并三唑鎓-1-[双(二甲氨基)亚甲基]-5-氯六氟磷酸盐(HCTU)、2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪和2-丙膦酸酐

适合的碱的实例是但不限于K₂CO₃、N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺(TEA)、二异丙基-乙胺(DIEA)、吡啶、氢氧化钾、氢氧化钠和甲醇钠。

化合物

在一个实施方案中，本发明包括式I化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R是COOH或CH₂OH。

在一些实施方案中，R是CH₂OH。

在一些实施方案中，R是COOH。

在另一个实施方案中，本发明包括如下结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明包括如下结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明包括药物组合物，其包含式I化合物和药学上可接受的载体或辅助剂。

在另一个实施方案中，本发明包括药物组合物，其包含如下结构的化合物：

和药学上可接受的载体或辅助剂。

在另一个实施方案中，本发明包括药物组合物，其包含如下结构的化合物：

和药学上可接受的载体或辅助剂。

在另一个实施方案中，药物组合物进一步包含另外的活性剂，其选自溶粘蛋白剂、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、CFTR调节剂或营养剂。

III.一般合成

可以根据合成路线1来合成式I化合物。

合成路线1

在合成路线1中，使式II的苯胺类，其中R和OH任选和独立地在其上带有保护基，与式III的羧酸中间体在偶合条件下反应，形成式IV化合物。然后可以使带有一个或多个保护基的式IV化合物脱保护，得到式I的衍生物。

可以通过将反应剂溶于适合的溶剂、用适合的偶合试剂任选地在适合的碱的存在下处理进行合成路线1中所述的偶合反应。

可以根据合成路线2来合成式III的喹啉衍生物。

合成路线2

可以根据合成路线3来合成式II的苯胺类，其中R是-CH₂OH。

合成路线3

可以根据合成路线4来合成式II的苯胺类，其中R是-COOH。

合成路线4

应用和使用方法

药学上可接受的组合物

在本发明的另一个方面，提供药学上可接受的组合物，其中这些组合物包含如本文所述的任意化合物、和任选地包含药学上可接受的载体、辅助剂或赋形剂。在一些实施方案中，这些组合物任选地进一步包含一种或多种另外的治疗剂。

也应认识到，本发明的某些化合物可以以游离形式存在用于治疗，或者如果适当可以以其药学上可接受的衍生物或前药的形式存在。根据本发明，药学上可接受的衍生物或前药包括但不限于，药学上可接受的盐、酯、这些酯的盐或者在给予于有此需要的患者时能直接或间接提供本文所述化合物或其代谢产物或残留物的任何另外的加合物或衍生物。

本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内，适用于与人和低级动物的组织接触而没有异常毒性、刺激性、过敏反应等的那些盐，而且具有合理的收益/风险比。“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何无毒性的盐或酯盐，当给予于接受者时，能够直接或间接提供本发明化合物或其具有抑制活性的代谢产物或残留物。

药学上可接受的盐是本领域公知的。例如S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19中详细描述了药学上可接受的盐，将其引入本文作参考。本发明化合物的药学上可接受的盐包括由适当的无机和有机的酸和碱产生的盐。药学上可接受的无毒性的酸加成盐的例子是与无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸形成的氨基盐，或是与有机酸例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的氨基盐，或通过使用本领域使用的其它方法例如离子交换法而形成的氨基盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。由碱衍生的适当的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N⁺(C_1-4烷基)₄盐。本发明也包括本文所述化合物的任何碱性含氮基团的季化形式。通过这种季化可以获得水或油溶性或可分散于水或油中的产物。代表性的碱或碱土金属盐类包括钠、锂、钾、钙、镁盐等。在适当时，进一步的药学上可接受的盐包括无毒的铵盐、季铵盐，以及使用抗衡离子，例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的胺阳离子盐。

如上所述，本发明的药学上可接受的组合物进一步包含药学上可接受的载体、辅助剂或赋形剂，其在本文中使用时，包括任何和所有的溶剂、稀释剂或其它液体赋形剂、助分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，其适合所需的特定剂型。Remington′s Pharmaceutical Sciences，SixteenthEdition，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)描述了在配制药学上可接受的组合物中使用的各种载体和已知的制备技术。除了例如由于产生任何不希望的生物学效应或以有害的方式干扰该药学上可接受的组合物的任何其它组分而与本发明化合物不相容的任何常规的载体介质以外，其使用也涵盖在本发明的范围内。可以用作药学上可接受的载体的物质的一些例子包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、羊毛脂、糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油，例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和豆油；二醇类；例如丙二醇或聚乙二醇；酯类例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒性的相容性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，此外根据配制者的判断，该组合物中也可以存在着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

化合物和药学上可接受的组合物的应用

在另一个方面，本发明提供治疗与CFTR突变有关的病症、疾病或障碍或减轻其严重性的方法。在一些实施方案中，本发明提供治疗与CFTR活性不足有关的病症、疾病或障碍的方法，该方法包括给有此需要的受试者，优选哺乳动物给予包含式I化合物的组合物。

在另一个方面中，本发明还提供了治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一，且上述疾病选自囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰功能不全、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育症、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色病、凝血-纤溶缺陷，例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷，例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积症，例如I-细胞病/假性胡尔勒综合征、粘多糖症、桑霍夫病/泰-萨病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺乏症、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图综合征、佩-梅病、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍，例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病，例如遗传性克-雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、格-斯-施综合征、COPD、干眼病或斯耶格伦病、骨质疏松症、骨质减少、骨愈合和骨生长(包括骨修复、骨再生、减少骨质吸收和增加骨沉积)、戈勒姆综合征、氯化物通道病变，例如先天性肌强直(Thomson和Becker形式)、III型巴特综合征、登特病、惊跳病、癫痫症、惊跳病、溶酶体贮存病、安格曼综合征和原发性纤毛运动障碍(PCD)，即纤毛结构和/或功能遗传障碍的术语，包括具有左右转位的PCD(也称作卡特金纳综合征)、不具有左右转位的PCD和纤毛发育不良。

在一些实施方案中，该方法包括治疗患者囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一些实施方案中，所述患者具有人CFTR的突变形式。在其他实施方案中，所述患者具有一种或多种人CFTR的如下突变：ΔF508、R117H和G551D。在一个实施方案中，该方法包括治疗具有人CFTR的ΔF508突变患者的囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括治疗具有人CFTR的G551D突变患者的囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括治疗在至少一个等位基因上具有人CFTR的ΔF508突变患者的囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括治疗在两个等位基因上具有人CFTR的ΔF508突变患者的囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括治疗在至少一个等位基因上具有人CFTR的G551D突变患者的囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括治疗在两个等位基因上具有人CFTR的G551D突变患者囊性纤维化或减轻其严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。

在一些实施方案中，该方法包括减轻患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一些实施方案中，所述患者具有人CFTR的突变形式。在其他实施方案中，所述患者具有一种或多种人CFTR的如下突变：ΔF508、R117H和G551D。在一个实施方案中，该方法包括减轻具有人CFTR的ΔF508突变的患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括减轻具有人CFTR的G551D突变的患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括减轻在至少一个等位基因上具有人CFTR的ΔF508突变的患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括减轻在两个等位基因上具有人CFTR的ΔF508突变的患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括减轻在至少一个等位基因上具有人CFTR的G551D突变的患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。在一个实施方案中，该方法包括减轻在两个等位基因上具有人CFTR的G551D突变的患者囊性纤维化的严重性，包括对该患者给予如本文所定义的组合物之一。

在一些方面中，本发明提供了治疗患者骨质疏松症或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，治疗患者骨质疏松症或减轻其严重性的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

在一些方面中，本发明提供了治疗患者骨质减少或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，治疗患者骨质减少或减轻其严重性的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

在一些方面中，本发明提供了患者骨愈合和/或骨修复的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，患者骨愈合和/或骨修复的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

在一些方面中，本发明提供了减少患者骨质吸收的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些方面中，本发明提供了增加患者骨沉积的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，增加患者骨沉积的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

在一些方面中，本发明提供了治疗患者COPD或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，治疗患者COPD或减轻其严重性的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

在一些方面中，本发明提供了治疗患者吸烟诱发的COPD或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，治疗患者吸烟诱发的COPD或减轻其严重性的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

在一些方面中，本发明提供了治疗患者慢性支气管炎或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予式1化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，治疗患者慢性支气管炎或减轻其严重性的方法包括对该患者给予如本文所述的药物组合物。

根据一个可替代的优选实施方案，本发明提供一种治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括对所述哺乳动物给予组合物的步骤，该组合物包含本发明化合物。

根据本发明，化合物或药学上可接受的组合物的“有效量”是有效治疗如上所述一种或多种疾病、障碍或病症或减轻其严重性的用量。

本发明的另一个方面提供给予药物组合物的方法，通过对患者每天至少一次口服给予包含式1化合物的药物组合物来进行。在一个实施方案中，该方法包括每隔24小时给予一次包含式1化合物的药物组合物。在另一个实施方案中，该方法包括每隔12小时给予一次包含式1化合物的药物组合物。在进一步的实施方案中，该方法包括每天给予三次包含式1化合物的药物组合物。在更进一步的实施方案中，该方法包括每隔4小时给予一次包含式1化合物的药物组合物。

根据本发明的方法，化合物和组合物可以使用能有效治疗如上所述的一种或多种疾病或减轻其严重性的任何用量和任何给药途径来给予。

在一些实施方案中，本发明的化合物和组合物可以用于治疗患者的囊性纤维化或减轻其严重性，该患者的呼吸或非呼吸上皮细胞的顶膜中显示残留的CFTR活性。使用本领域已知的方法，例如标准的电生理学、生物化学或组织化学技术可以容易地检测上皮细胞表面残留的CFTR活性的存在。这些方法使用体内或离体的电生理技术、汗液或唾液的Cl^-浓度测定或者离体生物化学或组织化学技术来监测细胞表面密度，以鉴定CFTR活性。使用这些方法，可以容易地在各种不同突变体的杂合或纯合的患者，包括最常见的突变体ΔF508的杂合或纯合的患者中检测残留的CFTR活性。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可以用于治疗患者的囊性纤维化或减轻其严重性，该患者具有用药理学方法或基因疗法诱导或增强的残留CFTR活性。这些方法增加细胞表面上存在的CFTR的量，因此在患者中诱导迄今不存在的CFTR活性或在患者中提高残留CFTR活性的现存水平。

在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可以用于治疗患者的囊性纤维化或减轻其严重性，该患者具有某些显示残留CFTR活性的基因型，例如，III类突变(调节或门控受损)、IV类突变(传导改变)或V类突变(合成减少)(Lee R.Choo-Kang，Pamela L.，Zeitlin，TypeI，II，III，IV，and V cystic fibrosis Tansmembrane ConductanceRegulator Defects and Opportunities of Therapy；Current Opinionin Pulmonary Medicine 6：521-529，2000)。显示残留CFTR活性的其他患者基因型包括这些类型之一的纯合或任何其他类型突变体的杂合的患者，所述其他类型的突变包括I类突变、II类突变或无分类的突变。

在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可以用于治疗患者的囊性纤维化或减轻其严重性，该患者具有某些临床显型，例如，典型地与上皮细胞顶膜上的残留CFTR活性的量相关的轻度至中度临床显型。这些显型包括显示胰功能不全的患者或者诊断为特发性胰腺炎和先天性双侧输精管缺失或者轻度肺病的患者。

所需的确切的量对于不同的受治疗者而言是不同的，这取决于受治疗者的种类、年龄和一般状况、感染的严重度、具体的药物、其给药方式等。本发明的化合物优选配制成易于给药和剂量均匀的剂量单位形式。本文使用的表述“剂量单位形式”是指适合所要治疗的患者的药物的物理上分离的单位。但是，应当理解，本发明的化合物和组合物的每日总使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何具体的患者或生物体的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括所要治疗的疾病和该疾病的严重性；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所使用的具体化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物联合或同时使用的药物等，以及医学领域公知的其它因素。本文使用的术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，最优选人。

本发明的药学上可接受的组合物可以通过口服、直肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏、滴剂或贴剂)、经颊以及作为口腔或鼻喷雾剂等方式给予于人和其它动物，这取决于所要治疗的感染的严重性。在一些实施方案中，本发明的化合物可以以每日约0.01mg/kg至约50mg/kg，优选约0.5mg/kg至约25mg/kg患者体重的剂量水平经口服或胃肠外给予，每日一次或多次，以获得所需的治疗效果。

用于口服的液体剂型包括但不限于，药学上可接受的乳剂、微乳、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，该液体剂型可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂，该口服组合物也可以包含辅助剂，例如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可以根据已知的技术，使用适当的分散或湿润剂和助悬剂配制可注射制剂，例如无菌注射用水或油性混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、混悬液或乳剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体或溶剂是水、林格液，U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油一般也用作溶剂或助悬介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可以用于注射制剂中。

注射制剂可以通过例如细菌截留性过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，其中所述无菌固体组合物可以在临用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。

为了延长本发明化合物的效果，经常需要缓慢地吸收皮下或肌内注射的化合物。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬液来实现。那么，化合物的吸收速率将取决于其溶出速度，溶出速度又可能取决于晶体大小和晶型。可替代地，延迟胃肠外给药的化合物形式的吸收可以通过将该化合物溶解或混悬于油性载体中来实现。制备可注射的储库型(长效型)剂型，包括在生物可降解的聚合物例如聚乳酸-聚乙醇酸交酯中形成化合物的微囊基质。根据化合物与聚合物的比例和所使用的具体聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其它生物可降解的聚合物的例子包括聚(正酯)和聚(酸酐)。储库型注射剂也可以通过将化合物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

直肠或阴道给予的组合物优选是栓剂，其可以通过将本发明的化合物与适当的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡混合来制备，其中所述赋形剂或载体在环境温度下是固体，但在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。

口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体例如为柠檬酸钠或磷酸二钙、和/或a)填充剂或增充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解阻滞剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵类化合物，g)湿润剂，例如十六醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型也可以包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可以在软和硬的填充性明胶胶囊中用作填充剂，胶囊使用例如乳糖或奶糖，以及高分子聚乙二醇等赋形剂。可以用包衣和壳例如肠溶衣和药物配制领域公知的其它包衣材料来制备片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂等固体剂型。它们任选可以包含遮光剂，也可以是这样一种组合物：它们只在或优选在肠道的某一部分(任选地以延迟方式)释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物也可以在软和硬的填充性明胶胶囊中用作填充剂，胶囊所用赋形剂例如为乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等。

活性化合物也可以存在于具有一种或多种上述赋形剂的微囊中。可以用包衣和壳例如药物配制领域公知的肠溶衣和其它包衣材料来制备片剂、糖衣片、胶囊、丸剂和颗粒等固体剂型。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。这些剂型也可以例如如一般实践，包含惰性稀释剂以外的其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，该剂型也可以包含缓冲剂。它们任选可以包含遮光剂，也可以是这样一种组合物：它们只在或优选在肠道的某一部分任选地以延迟方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物和蜡。

本发明化合物的局部或经皮给药的剂型包括软膏、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发明的范围内。此外，本发明涵盖透皮贴剂的使用，它的附加优点在于向机体可控地递送化合物。这类剂型可以通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制备。也可以使用吸收增强剂来增加化合物通过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。

在本发明中用作CFTR调节剂的化合物的活性可以根据本领域一般所述的方法和在本文实施例中所述的方法来测定。

同时应当认识到，本发明的化合物和药学上可接受的组合物可以用在联合治疗中，也就是说，本发明的化合物和药学上可接受的组合物可以在一种或多种另外的所需治疗或医学操作的同时、之前或之后给予。在联合治疗方案中使用的治疗(治疗或操作)的具体组合将考虑所需的治疗和/或操作与所要实现的所需治疗效果之间的相容性。也应当认识到，所使用的治疗可以对相同的疾病达到期望的效果(例如，本发明的化合物可以与另一种用于治疗相同疾病的药物同时给予)，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制任何不良反应)。本文所用的通过正常给药来治疗或预防特定疾病或病症的另外的治疗剂被称作“适合所要治疗的疾病或病症”。

在一个实施方案中，另外的治疗剂选自溶粘蛋白剂、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、本发明化合物以外的CFTR调节剂或营养剂。

在一个实施方案中，另外的活性剂是抗生素。本文有用的典型抗生素包括妥布霉素，包括妥布霉素吸入粉末(TIP)；阿奇霉素；氨曲南，包括氨曲南的气雾剂形式；阿米卡星，包括其脂质体制剂；环丙沙星，包括其适合于通过吸入给药的制剂；左氧氟沙星，包括其气雾剂形式；和两种抗生素的组合，例如磷霉素和妥布霉素。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是溶粘蛋白剂。本文有用的典型溶粘蛋白剂包括

在另一个实施方案中，另外的活性剂是支气管扩张剂。典型的支气管扩张剂包括沙丁胺醇、硫酸奥西那林(metaprotenerol sulfate)、醋酸吡布特罗、沙美特罗或硫酸tetrabuline。

在另一个实施方案中，另外的活性剂有效恢复肺气道表面液体。这种活性剂改善细胞内和外部盐的运动，使得肺气道中的粘液更多地被水化，且由此更易于清除。典型的这种活性剂包括高张生理盐水、地纽福索钠([[(3S，5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羟基氧戊环-2-基]甲氧基-羟基磷酰基][[[(2R，3S，4R，5R)-5-(2，4-二氧代嘧啶-1-基)-3，4-二羟基氧戊环-2-基]甲氧基-羟基磷酰基]氧基-羟基磷酰氯]磷酸氢盐)或bronchitol(甘露醇吸入制剂)。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是抗炎剂，即可以减轻肺中炎症的活性剂。本文有用的典型的这种活性剂包括布洛芬、二十二碳六烯酸(DHA)、西地那非、可吸入谷胱甘肽、吡格列酮、羟氯喹或斯伐他汀。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是非化合物1的CFTR调节剂，即具有调节CFTR活性的效果的活性剂。典型的这种活性剂包括阿他卢仑(

；3-[5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基]苯甲酸)、西那普肽、杜拉霉素、地来司他(人重组中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂)、考前列酮(7-{(2R，4aR，5R，7aR)-2-[(3S)-1，1-二氟-3-甲基戊基]-2-羟基-6-氧代八氢环戊[b]吡喃-5-基}庚酸)或(3-(6-(1-(2，2-二氟苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷甲酰氨基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸。在另一个实施方案中，另外的活性剂是(3-(6-(1-(2，2-二氟苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷甲酰氨基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是营养剂。典型的这种活性剂包括胰脂肪酶(胰腺酶替代物)，包括

或

(在先的)、

或谷胱甘肽吸入物。在一个实施方案中，另一种营养剂是胰脂肪酶。

其他治疗剂在本发明组合物中的含量将不超过在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中通常的给药量。优选地，其他治疗剂在目前所公开的组合物中的量将是通常的包含该药物作为唯一治疗活性剂的组合物中的含量的约50％-100％。

本发明化合物或其药学上可接受的组合物也可以引入到涂覆可植入医药装置的组合物中，如假肢、人工瓣膜、脉管移植物、斯坦特印模和导管。因此，在另一个方面中，本发明的包括用于涂覆可植入装置的组合物，其包含一般如上所述和本文的类型和亚类中的本发明化合物和适合于涂覆所述可植入装置的载体。在另一个方面中，本发明包括可植入装置，其上涂覆了一般如上所述和本文的类型和亚类中的本发明化合物和适合于涂覆所述可植入装置的载体。适合的涂料和涂覆可植入装置的一般制备方法描述在美国专利US 6,099,562、5,886,026和5,304,121中。涂料典型地是生物可相容的聚合材料，如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯乙酸乙烯酯共聚物和它们的混合物。涂料可以任选地进一步被适合的氟硅酮、多糖、聚乙二醇、磷脂或其组合的表层所覆盖，以赋予组合物的控释特征。

本发明的另一个方面涉及在生物样品或患者中调节CFTR活性的方法(例如体外或体内)，该方法包括对所述患者给予或使所述生物样品接触式I化合物或包含所述化合物的组合物。本文所用的术语“生物样品”包括但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物或其提取物获得的活组织检查材料；和血液、唾液、尿、粪便、精液、泪液或其他体液或者其提取物。

调节生物样品中的CFTR用于本领域技术人员公知的不同目的。这种目的的实例包括但不限于研究生物学和病理学现象中的CFTR；和新CFTR调节剂的对比评价。

在另一个实施方案中，提供了调节体外或体内阴离子通道活性的方法，所述方法包括使所述通道接触式I化合物的步骤。在优选的实施方案中，阴离子通道是氯离子通道或碳酸氢根离子通道。在其他优选的实施方案中，阴离子通道是氯离子通道。

根据可替代选择的实施方案，本发明提供了增加细胞膜中功能性CFTR数量的方法，所述方法包括使所述细胞接触式I化合物的步骤。

根据另一个优选的实施方案，通过测定跨膜电位来确定CFTR活性。用于测定生物样品中跨膜电位的方式可以使用任意本领域公知的方法，例如光学膜电位测定法或其他电生理学方法。

光学膜电位测定法使用Gonzalez和Tsien所述的电压-敏感性FRET传感器(参见Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1995)“Voltagesensing by fluorescence resonance energy transfer in singlecells.”Biophys J 69(4)：1272-80，和Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1997)；“Improved indicators of cell membrane potentialthat use fluorescence resonance energy transfer”Chem Biol 4(4)：269-77)以及用于测定荧光改变的仪器例如电压/离子探针读取器(Voltage/Ion Probe Reader)(VIPR)(参见Gonzalez，J.E.，K.Oades等人，(1999)“Cell-based assays and instrumentation forscreening ion-channel targets”Drug Discov Today 4(9)：431-439)。

这些电压敏感性测定法基于膜-可溶性、电压敏感性染料DiSBAC₂(3)与附着于质膜外叶并且作为FRET供体起作用的荧光磷脂CC2-DMPE之间的荧光共振能量转移(FRET)改变。膜电位(V_m)改变导致带负电荷的DiSBAC₂(3)重新分布通过质膜且能量由此因CC2-DMPE改变而转移。可以使用VIPR^TM II监测荧光发射改变，所述VIPR^TM II是集成的液体处理机和荧光检测器，设计它是为了进行基于细胞的96-或384-孔微量滴定板上的筛选。

在一个实施方案中，本发明提供了调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使所述生物样品接触式I化合物或其药学上可接受的盐的步骤，其中R如上述所定义。

在一个实施方案中，本发明提供了调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使所述生物样品接触如下结构化合物或其药学上可接受的盐的步骤：

在一个实施方案中，本发明提供了调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使所述生物样品接触如下结构化合物或其药学上可接受的盐的步骤：

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，其中R如上述所定义，且所述疾病选自囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰功能不全、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育症、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色病、凝血-纤溶缺陷，例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷，例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积症，例如I-细胞病/假性胡尔勒综合征、粘多糖症、桑霍夫病/泰-萨病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺乏症、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图综合征、佩-梅病、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍，例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病，例如遗传性克-雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、格-斯-施综合征、COPD、干眼病或斯耶格伦病。

在一个实施方案中，该方法包括治疗患者疾病或减轻其严重性，通过对该患者给予有效量的具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐来进行：

在另一个实施方案中，该方法包括治疗患者疾病或减轻其严重性，通过对该患者给予有效量的具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐来进行：

在一个进一步的实施方案中，所述疾病是囊性纤维化。

在另一个方面中，本发明提供了用于测定体外或体内生物样品中CFTR或其片段活性的试剂盒，包含(i)包含式I化合物或任意上述实施方案的组合物；和(ii)如下的说明书：a)将该组合物与生物样品接触；和b)测定所述CFTR或其片段的活性。

在一个实施方案中，试剂盒进一步包括用于下列内容的说明书：a)将另外的组合物与该生物样品接触；b)在所述另外的化合物存在下测定所述CFTR或其片段的活性；和c)将在另外的化合物存在下的CFTR或其片段的活性与在式I的组合物存在下的CFTR或其片段的密度进行比较。

在优选的实施方案中，试剂盒用于测定CFTR密度。

在一个实施方案中，试剂盒包括包含具有如下结构的化合物的组合物：

或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，试剂盒包括包含具有如下结构的化合物的组合物：

或其药学上可接受的盐。

为了更完整地理解本文所述的本发明，举出下列实施例。应理解这些实施例仅用于示例目的，而不用来以任何方式限定本发明。

实施例

制备1：4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸(26)的全合成

4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸乙酯(25)的制备方法

将化合物23(4.77g，47.7mmol)滴加到N₂气流界面下的化合物22(10g，46.3mmol)中，以使乙醇在低于30℃挥发0.5小时。然后将该溶液加热至100-110℃，搅拌2.5小时。在将该混合物冷却至低于60℃后，加入二苯基醚。将得到的溶液滴加到已经在N₂气流界面下加热至228-232℃ 1.5小时的二苯基醚中，以使乙醇挥发。将该混合物在228-232℃再搅拌2小时，冷却至100℃以下，然后加入庚烷以沉淀产物。将得到的淤浆在30℃搅拌0.5小时。然后过滤固体，用庚烷洗涤滤饼，真空干燥，得到化合物25，为棕色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ12.25(s)，δ8.49(d)，δ8.10(m)，δ7.64(m)，δ7.55(m)，δ7.34(m)，δ4.16(q)，δ1.23(t)。

4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸(26)的制备方法

方法1

将化合物25(1.0eq)混悬于HCl(10.0eq)和H₂O(11.6vol)溶液。将该淤浆加热至85-90℃，不过，可替代选择的温度也适合于这种水解步骤。例如，可以在约75-约100℃的温度进行水解。在一些情况中，在约80-约95℃的温度进行水解。在其他情况中，在约82-约93℃(例如约82.5-约92.5℃或约86-约89℃)进行水解步骤。在约85-90℃搅拌约6.5小时后，采样反应体系用于反应完成。在任意适合于水解的温度下进行搅拌。然后将该溶液冷却至20-25℃，过滤。用H₂O(2vol×2)冲洗反应器/滤饼。然后用2vol H₂O将滤饼洗涤至pH≥3.0。然后在60℃真空干燥滤饼，得到化合物26。

方法2

将化合物25(11.3g，52mmol)加入到10％NaOH(水溶液)(10mL)和乙醇(100mL)混合物中。将该溶液加热至回流16小时，冷却至20-25℃，然后用8％HCl将pH调节至2-3。然后将该混合物搅拌0.5小时，过滤。用水(50mL)洗涤滤饼，然后真空干燥，得到化合物26，为棕色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ15.33(s)，δ13.39(s)，δ8.87(s)，δ8.26(m)，δ7.87(m)，δ7.80(m)，δ7.56(m)。

实施例1：N-(2-叔丁基-5-羟基-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(27)的全合成

化合物27合成的总体合成路线如下所示，然后进行每一合成中间体的合成操作。

2-羟基-5-叔丁基苯甲醛(2)的制备方法

在N₂气氛中向搅拌的化合物1(700g，4.66mol)在CH₃CN(7.0L)中的溶液中加入MgCl₂(887g，9.32mol)、多聚甲醛(1190g)和TEA(2.5L，17.9mol)。将该混合物加热至回流5小时。冷却至室温后，向该混合物中加入2L冰水，然后加入6L 3M HCl(水溶液)。将该混悬液保持搅拌至溶液变澄清。分离有机层，用MTBE(3L×3)萃取水层。合并有机层，浓缩至干。将残余物溶于MTBE(4000mL)，用水(1000mL×2)和盐水(1000mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，然后浓缩至得到化合物2，为淡黄色固体，将其不经进一步干燥或纯化用于下一步。¹HNMR(CDCl₃；400MHz)δ10.86(s)，δ9.89(s)，δ7.59(m)，δ7.51(d)，δ6.94(d)，δ10.61(s)。

2-(苄氧基)-5-叔丁基苯甲醛(3)的制备方法

向搅拌的化合物2(614.5g，3.33mol)在DMF(3.5L)中的溶液中加入K₂CO₃(953g，6.90mol)和苄基氯(480g，3.80mol)。将该混合物加热至90℃，保持搅拌3小时。将该混悬液冷却至室温，然后加入MTBE(2L)，然后加入水(12L)。然后将该混合物搅拌10分钟，分离水层，用MTBE(2L×3)萃取。合并有机层，用水(2L×2)和盐水(1.5L×1)洗涤，浓缩至得到化合物3，为淡黄色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ10.42(s)，δ7.71(m)，δ7.51(m)，δ7.43(m)，δ7.35(m)，δ7.24(m)，δ5.27(s)，δ1.26(s)。

2-(苄氧基)-5-叔丁基苄醇(4)的制备方法

在0-20℃向搅拌的化合物3(974g，3.63mol)在MeOH(4000mL)中的混悬液中缓慢加入NaBH₄(121g，3.20mol)。将该溶液在15℃保持搅拌3小时，然后冷却至0℃。在低于20℃滴加2N HCl(水溶液)(1300mL)。然后过滤该溶液，蒸发至干，将残余物溶于MTBE(5L)。然后用水(2L×2)和盐水(1.5L×1)洗涤该溶液。蒸发溶剂，得到化合物4，为淡黄色固体，将其不经进一步纯化用于下一步。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.40(m)，δ7.32(m)，δ7.17(m)，δ6.91(m)，δ5.09(s)，δ5.00(t)，δ4.56(d)，δ1.26(s)。

2-(苄氧基)-5-叔丁基苄基氯(5)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物4(963g，3.56mol)在无水DCM(2000mL)中的溶液中缓慢加入SOCl₂(535g，4.5mol)。将该混合物在20℃保持搅拌2小时，然后真空浓缩，得到化合物5，为油状物，将其不经进-步干燥或纯化用于下一步。

2-(苄氧基)-5-叔丁基苄腈(6)的制备方法

向搅拌的化合物5(1045g，3.54mol)在无水DMF(1000mL)中的溶液中加入KCN(733g，11.3mol)。将该混合物在35℃搅拌24小时，然后倾入水(10L)。加入乙酸乙酯(4L)，将该混合物搅拌30分钟。然后分离有机层，用乙酸乙酯(3000mL×2)萃取水层。合并有机层，用水(4L×2)和盐水(3L×1)洗涤，然后真空浓缩，得到化合物6，为黄色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.51(m)，δ7.37(m)，7.02(d)，δ5.17(s)，δ3.88(s)，1.26(s)。

2-(2-(苄氧基)-5-叔丁基苯基)-2-甲基丙腈(7)的制备方法

在20℃向搅拌的NaH(86g，2.15mol，60％的矿物油溶液)在DMF(1000mL)中的混悬液中滴加化合物6(100.0g，0.358mol)在DMF(500mL)中的溶液。搅拌30分钟后，在低于30℃在2小时期限过程中滴加MeI(205g，1.44mol)的DMF(500mL)溶液。将该混悬液在25-30℃搅拌1.5小时，然后缓慢加入冰(100g)，直到无气体生产为止。通过缓慢添加2N HCl将pH调节至约7。用水(4L)和MTBE(2L)稀释该混合物。分离有机层，用MTBE(500mL×2)萃取水层。用水和盐水洗涤合并的有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，然后真空浓缩，得到化合物7，为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.56(m)，δ7.40(m)，δ7.34(m)，δ7.10(d)，δ5.21(s)，δ1.73(s)，δ1.27(s)。

2-(2-(苄氧基)-5-叔丁基苯基)-2-甲基丙醇(8)的制备方法

在约-60至-50℃向搅拌的化合物7(20g，0.065mol)在甲苯(300mL)中的溶液中滴加DIBAH(80mL，1M的甲苯溶液)。在搅拌2小时后，将6N HCl(300mL)加入到反应混合物中，持续搅拌30分钟。然后分离有机层，用2N HCl、然后用NaHCO₃溶液、然后还用盐水溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩，得到化合物8，为油状物。将产物不经进一步纯化用于下一步反应。¹H NMR(CDCl₃；400MHz)δ9.61(s)，δ7.36(m)，δ7.25(m)，δ6.87(m)，δ5.06(m)，δ1.43(s)，δ1.33(s)。

2-(2-(苄氧基)-5-叔丁基苯基)-2-甲基丙-1-醇(9)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物8(9.21g，0.030mol)在MeOH(150mL)中的溶液中缓慢加入NaBH₄(2.3g，0.061mol)。在20℃将该混合物搅拌3小时后，加入12mL 6N HCl，将该混合物再搅拌30分钟。然后将该溶液浓缩至约原体积的四分之一，用EtOAc萃取。分离有机层，用水和盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤，然后真空浓缩，得到化合物9，为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.47(m)，δ7.42(m)，δ7.34(m)，δ7.28(m)，δ7.16(m)，δ6.94(m)，δ5.08(s)，δ4.45(t)，δ3.64(d)，δ1.28(s)，δ1.25(s)。

2-(2-羟基-5-叔丁基苯基)-2-甲基丙-1-醇(10)的制备方法

将Pd(OH)₂(1g)和化合物9(9.26g，0.030mol)的MeOH(200mL)溶液在20-30psi压力下、在氢气气氛中搅拌16-18小时。然后通过C盐

过滤该混合物，浓缩滤液，得到化合物10，为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ9.16(s)，δ7.16(d)，δ7.00(m)，δ6.65(m)，δ4.71(t)，δ3.62(d)，δ1.27(s)，δ1.22(s)。

1-((甲氧羰基)氧基)-2-(1-((甲氧羰基)氧基)-2-甲基丙-2-基)-4-叔丁基苯(11)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物10(23.2g，0.10mol)、DMAP(1.44g)和DIEA(72.8g，0.56mol)在无水DCM(720mL)中的溶液中滴加氯甲酸甲酯(43.5g，0.46mol)的DCM(160mL)溶液。在将该混合物在20℃搅拌16小时后，用水、1N HCl和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，真空浓缩。使用硅胶柱色谱法(1∶20 EtOAc∶石油醚)纯化残余物，得到化合物11，为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.32(m)，δ7.10(d)，δ4.26(s)，δ3.84(s)，δ3.64(s)，δ1.31(s)，δ1.28(s)。

1-((甲氧羰基)氧基)-2-(1-((甲氧羰基)氧基)-2-甲基丙-2-基)-4-叔丁基-5-硝基苯(12)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物11(32g，0.095mol)在DCM(550mL)中的溶液中滴加98％H₂SO₄(43g，0.43mol)。在0℃搅拌20分钟后，在0℃向该混合物中加入65％HNO₃(16.2g，0.17mol)。然后将该混合物在1-10℃搅拌4小时，然后加入冰水(200mL)。分离有机层，用DCM(200mL×3)萃取，用水(水溶液)、NaHCO₃和盐水洗涤合并的有机层，然后用MgSO₄干燥，真空浓缩。使用硅胶柱色谱法(1∶20EtOAc∶石油醚)纯化残余物，得到化合物12，为油状物。

2-叔丁基-5-((甲氧羰基)氧基)-4-(1-((甲氧羰基)氧基)-2-甲基丙-2-基)苯胺(13)的制备方法

在室温在氢气气氛中在20-30psi压力下将Pd/C(2.6g)和化合物12(14g，粗品)在MeOH(420mL)中搅拌16-18小时。然后用硅藻土过滤该混合物，真空浓缩滤液。通过硅胶柱色谱法纯化残余物(1∶10EtOAc∶石油醚)，得到化合物13，为灰色固体。¹HNMR(CDCl₃；400MHz)δ7.26(s)，δ7.19(s)，δ4.26(s)，δ3.89(s)，δ3.74(s)，δ1.40(s)，δ1.35(s)。

N-(2-叔丁基-5-((甲氧羰基)氧基)-4-(1-((甲氧羰基)氧基)-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(14)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物26(5.0g，0.026mol)在无水DMF(120mL)中的溶液中加入EDCI(5.6g，0.029mol)、HOBT(3.8g，0.028mol)和DIEA(6.6g，0.051mol)。搅拌1小时后，在0℃将该混合物滴加入化合物13(3.0g，0.008mol)在DCM(30mL)中的溶液。将该混合物在25℃搅拌72小时，然后真空浓缩。将残余物溶于EtOAc(225mL)，用水(120mL×1)、1N HCl(120mL)和盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物(1∶1EtOAc∶石油醚)，得到化合物14，为白色固体。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ12.34(s，1H)，11.58(s，1H)，9.07(s，1H)，8.42(d，1H)，7.66(s，1H)，7.51(s，1H)，7.47(s，1H)，7.39(s，1H)，6.72(s，1H)，4.34(s，2H)，3.82(s，3H)，3.74(s，3H)，1.41(s，9H)，1.40(s，6H)。

N-(2-叔丁基-5-羟基-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(27)的制备方法

在0℃向搅拌的KOH(1.2g，0.02mol)在MeOH(80mL)中的溶液中加入化合物14(1.9g，0.0036mol)。在5-15℃搅拌2-3小时后，将该混合物浓缩至干。然后将残余物与水(10mL)一起研磨，过滤，用DCM洗涤，真空干燥24小时，得到化合物27，为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ12.77(s)，δ8.86(s)，δ8.20(d)，δ7.55(d)，δ7.42(t)，δ7.16(q)，δ7.02(s)，δ6.85(m)，δ3.55(s)，δ1.55(s)，δ1.35(s)，δ1.27(s)。MS测定值(M+H)409.2。

实施例2：N-(2-叔丁基-5-羟基-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(27)可替代选择的全合成

2-(5-叔丁基-2-羟基-4-硝基苯基)-2-甲基丙酸甲酯(38)的制备方法：

将2-溴-4-叔丁基-5-硝基苯酚(15.00g，54.72mmol)、双(三-叔丁膦)钯(0)(1.422g，2.783mmol)、氟化锌(2.82g，27.27mmol)、甲基三甲基甲硅烷基二甲基乙烯酮缩醛(dimethylketeneacetal)(MTDA)(19.35g，111.0mmol)和二甲基甲酰胺(150mL)的混合物在70℃加热18h。将该混合物冷却至室温，用水稀释。搅拌1小时后，用MTBE萃取水相。真空干燥有机相，得到粗产物，为棕色固体。通过在正庚烷中研磨纯化产物。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ10.38(s，1H)；7.37(s，1H)；6.79(s，1H)；3.54(s，3H)；1.45(s，6H)；1.32(s，9H)。

4-叔丁基-2-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)-5-硝基苯酚(39)的制备方法：

将1M氢化铝锂的THF溶液(11.80mL，11.80mmol)加入到2-(5-叔丁基-2-羟基-4-硝基苯基)-2-甲基丙酸甲酯(5.36g，18.15mmol)在THF(50mL)中的溶液中。将该混合物在环境温度搅拌3h，然后用甲醇稀释。用1N HCl酸化该混合物(pH 1-2)，用MTBE萃取水相。真空干燥有机相，得到4-叔丁基-2-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)-5-硝基苯酚，将其不经进一步纯化用于下一步。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ10.12(s，1H)；7.37(s，1H)；6.80(s，1H)；4.77(s，1H)；3.69-3.65(m，2H)；1.30(s，9H)；1.29(s，6H)。

碳酸4-叔丁基-2-(2-甲氧羰基氧基-1，1-二甲基-乙基)-5-硝基-苯基]甲基酯(12)的制备方法

在0℃向4-叔丁基-2-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)-5-硝基苯酚(1.92g，7.18mmol)、三乙胺(1.745g，17.24mmol)和二甲氨基吡啶(87.74mg，0.718mmol)在二氯甲烷(30mL)中的溶液缓慢加入氯甲酸甲酯(2.376g，25.14mmol)，保持温度低于5℃。添加后，将该混合物温至环境温度，搅拌至HPLC显示原料完全转化(2-8h)。用水稀释该反应混合物，用1N HCl(pH 1-2)酸化。用DCM萃取水相，真空干燥合并的有机相。使粗琥珀色半固体从甲醇和二氯甲烷中重结晶，得到标题化合物，为黄色结晶固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ7.67(s，1H)；7.52(s，1H)；4.30(s，2H)；3.86(s，3H)；3.64(s，3H)；1.35(s，9H)；1.35(s，6H)

碳酸5-氨基-4-叔丁基-2-(2-甲氧羰基氧基-1，1-二甲基-乙基)苯基]甲基酯(13)的制备方法：

用氮气净化碳酸[4-叔丁基-2-(2-甲氧羰基氧基-1，1-二甲基-乙基)-5-硝基-苯基]甲基酯(1.27g，3.313mmol)和Pd/C(75mg，0.035mmol)在甲醇(50mL)中的混合物。用氢气净化烧瓶后，在环境温度和压力下将该混合物氢化18小时。通过C盐

过滤该溶液，真空干燥，得到产物，为固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ6.99(s，1H)；6.39(s，1H)；4.92(s，2H)；4.13(s，2H)；3.82(s，3H)；3.65(s，3H)；1.32(s，9H)；1.23(s，6H)。

N-(2-叔丁基-5-羟基-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(27)的制备方法：

向碳酸[5-氨基-4-叔丁基-2-(2-甲氧羰基氧基-1，1-二甲基-乙基)苯基]甲基酯(103mg，0.29mmol)、4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸(50mg，0.26mmol)和吡啶(42mg，0.53mmol)在2-MeTHF(3.0mL)中的混合物中加入作为50wt％的2-MeTHF溶液的T3P(286mg，0.45mmol)。将该混合物加热至50℃18h。冷却至环境温度后，用水稀释该混合物。分离水相，再用水洗涤。向有机相中加入甲醇钠(39mg，0.72mmol)，将该溶液搅拌2小时。用1N HCl猝灭，分离各相后，用0.1N HCl洗涤有机相。然后真空干燥有机相，得到化合物27，为固体。¹H-NMR光谱与上述不报道的一致。

实施例3：2-(5-叔丁基-2-羟基-4-(4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰氨基)苯基)-2-甲基丙酸(28)的全合成：

2-(5-叔丁基-2-羟基苯基)-2-甲基丙腈(15)的制备方法

将Pd(OH)₂/C(2.0g)和化合物7(20.0g，0.104mo l)在MeOH(150mL)中在室温下在氢气气氛中在10psi压力下搅拌16-18小时。然后通过C盐垫过滤该混合物，浓缩滤液，得到化合物15，将其不经进一步纯化用于下一步反应。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ9.83(s)，δ7.24(s)，δ7.18(m)，δ6.80(m)，δ1.71(s)，δ1.24(s)。

碳酸4-叔丁基-2-(2-氰基丙-2-基)苯基甲基酯(16)的制备方法

在0℃、在2小时内向搅拌的化合物15(126.6g，0.564mol)、DMAP(6.0g)和DIEA(188g，1.46mol)在无水DCM(1500mL)中的混合物中滴加氯甲酸甲酯(110g，1.17mol)的无水DCM(300mL)溶液。在0℃搅拌12小时后，加入冰水(1.5L)，将该混合物在0℃搅拌30分钟。分离有机层，用1N HCl、水和盐水洗涤。用MgSO₄干燥DCM溶液，真空浓缩，得到化合物16，为黄色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.47(m)，δ7.39(d)，δ7.24(d)，δ3.84(s)，δ1.71(s)，δ1.30(s)。

碳酸2-(1-氨基-2-甲基-1-氧代丙-2-基)-4-叔丁基-5-硝基苯基甲基酯(17)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物16(10.0g，36.3mmol)和KNO₃(5.51g，54.5mmol)在DCM(1000mL)中的混合物中滴加98％H₂SO₄(145.4g，1.45mol)。将该混合物在30℃搅拌4天。然后分离H₂SO₄层，倾入冰水(50g)，然后用DCM(100mL×3)萃取。用水、NaHCO₃水溶液和盐水洗涤合并的有机层，然后用MgSO₄干燥，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物(石油醚/EtOAc 20∶1→10∶1→5∶1→3∶1)，得到化合物17，为黄色固体。¹H NMR(CDCl₃；400MHz)δ8.05(s)，δ7.74(s)，δ7.61(s)，δ7.32(s)，δ5.32(s)，δ3.91(s)，δ3.92(s)，δ1.62(s)，δ1.59(s)，δ1.42(s)，δ1.38(s)。

2-(5-叔丁基-2-羟基-4-硝基苯基)-2-甲基丙酸(18)的制备方法

向化合物17(7.3g，21.6mmol)在甲醇(180mL)中的混合物中加入水(18mL)和NaOH(8.64g，216mmol)。加热该溶液，维持在回流3天。真空蒸发溶剂，将残余物溶于140mL水。然后通过添加2N HCl将该溶液酸化至pH 2。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水相，用水和盐水洗涤合并的有机相，用无水Na₂SO₄干燥，然后浓缩，得到化合物18，为黄色固体，将其不经进一步纯化用于下一步反应。

5-叔丁基-3，3-二甲基-6-硝基苯并呋喃-2(3H)-酮(19)的制备方法

向化合物18(7.10g，25.2mmol)在710mL无水THF中的溶液中加入EDCI(14.5g，75.6mmol)。将得到的混悬液保持在30℃搅拌过夜。过滤沉淀，用DCM充分洗涤。浓缩滤液至干，将残余物溶于DCM(100mL)。用水(50mL×2)和盐水(50mL×1)洗涤该溶液。然后用无水Na₂SO₄干燥DCM层，浓缩，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法纯化(石油醚/EtOAc200∶1→100∶1→50∶1)，得到化合物19，为白色固体。¹H NMR(CDCl₃；400MHz)δ7.36(s)，δ7.10(s)，δ1.53(s)，δ1.41(s)。

6-氨基-5-叔丁基-3，3-二甲基苯并呋喃-2(3H)-酮(20)的制备方法

在25℃、在氢气气氛中在30psi将Pd/C(1.50g)和化合物19(3.00g，1.14mmol)混悬于THF(1500mL)4小时。然后通过C盐

垫过滤该混合物，真空浓缩滤液，得到化合物20，为白色固体。¹HNMR(DMSO-d₆；400MHz)δ7.05(s)，δ6.49(s)，δ5.01(s)，δ1.35(s)，δ1.33(s)。

N-(5-叔丁基-3，3-二甲基-2-氧代-2，3-二氢苯并呋喃-6-基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(21)的制备方法

将HATU(17.6g，46.3mol)和化合物26(8.36g，44.2mmol)在无水乙腈(1L)中的混悬液在室温搅拌1小时。将化合物20(3.40g，14.6mmol)加入到该混悬液中，然后滴加DIEA(11.5g，89.0mmol)。将该混合物在45℃搅拌4天。过滤得到的沉淀，用DCM充分洗涤。浓缩滤液至干，将残余物溶于DCM(200mL)，用1N HCl(200mL×2)、然后用5％NaHCO₃水溶液(200mL×3)、然后用盐水(200mL×1)洗涤。然后用Na₂SO₄干燥该混合物，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物(CH₂Cl₂/MeOH 100∶1→50∶1)，得到化合物21，为淡黄色固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ12.96(d J 6.4Hz，1H)；12.1(s，1H)；8.9(d，J 6.4Hz，1H)；8.33(d，J 8Hz，1H)；7.84-7.75(m，2H)；7.55-7.48(m，3H)；1.47(s，6H)；1.45(s，9H)。

2-(5-叔丁基-2-羟基-4-(4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰氨基)苯基)-2-甲基丙酸(28)的制备方法

在0℃向搅拌的化合物21(0.9g，2.45mmol)在MeOH(50mL)中的溶液中加入NaOH(1.5g，37.5mmol)。在40℃搅拌16小时后，真空蒸发溶剂，然后将残余物溶于H₂O(50mL)。过滤沉淀，用DCM(100mL×1)和乙酸乙酯(100mL×1)洗涤滤液。用2N HCl将水层酸化至pH 1-2。过滤沉淀，用H₂0(80mL)和庚烷(50mL)洗涤。真空干燥，得到化合物28，为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆；400MHz)δ12.85(s)，δ11.84(s)，δ11.77(s)，δ9.39(s)，δ8.86(s)，δ8.33(s)，δ7.79(m)，δ7.52(m)，δ7.18(s)，δ7.09(s)，δ1.44(s)，δ1.40(s)。MS测定值(M+H)423.08。

实施例4：N-(2-叔丁基-5-羟基-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(27)的第二种可替代选择合成

给3-颈50mL圆底烧瓶安装磁力搅拌器、氮气起泡器和热电偶。向烧瓶中加入化合物21(514mg，1.27mmol)和2-MeTHF(4mL)。在室温搅拌该反应混合物，加入作为固体的氢化铝锂(204mg，6.6mmol)，直到使用HPLC监测得到100％转化率。向该反应混合物中加入四水合2，3-二羟基丁二醇钠钾(Potassium sodium 2，3-dihydroxybutanedioate)(50mL的400g/L溶液)和MTBE(50mL)。将得到的溶液搅拌15分钟，然后保持静置15min。分离有机层，通过添加酒石酸将水层的pH调节至pH约6-7。用MTBE萃取水层。浓缩有机层，在高真空下干燥，得到标题化合物，为黄白色粉末。¹H-NMR光谱与上述报道的一致。

实施例5：2-(5-叔丁基-2-羟基-4-(4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰氨基)苯基)-2-甲基丙酸(28)可替代选择的全合成：

碳酸2-溴化物，4-叔丁基苯基酯甲基酯(35)的制备方法

给3-颈2L圆底烧瓶安装磁力搅拌器、氮气起泡器和热电偶。加入2-溴-4-叔丁基苯酚(50g，211.7mmol)，然后加入DCM(1.75L)、DMAP(1.29g，10.58mmol)和Et₃N(44.3mL，317.6mmol)。将该反应混合物冷却至0℃。向该反应混合物中滴加氯甲酸甲酯(19.62mL，254mmol)。将该混合物温至室温，同时搅拌过夜。当反应完成时，通过烧结漏斗过滤该混合物。将滤液转入1L分液漏斗。为了猝灭，将1N HCl(300mL)加入滤液，分离有机层。然后用291mL饱和NaHCO₃和100mL水的混合物洗涤有机层。分离各层，测定水层的pH约为8。浓缩有机层，在高真空下干燥约16小时，得到标题化合物，为澄清黄色油状物，将其不经进一步纯化用于下一步。¹H-NMR(400MHz.DMSO-d6)7.66(d，J 2.0 Hz，1H)，7.46(dd，J 8.4，2.0Hz，1H)，7.32(d，J 8.4 Hz，1H)，3.86(s，3H)，1.28(s，9H)

碳酸(2-溴-4-叔丁基-5-硝基-苯基)甲基酯(36)的制备方法

给3-颈2L圆底烧瓶安装磁力搅拌器、氮气起泡器和热电偶。向烧瓶中加入化合物35(176g，612.9mmol)和浓硫酸(264mL)。将该反应混合物冷却至-5℃至0℃。滴加硝酸(28.6mL，612.9mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌2小时。完成时，加入水(264mL)，然后加入MTBE(264mL)。将该溶液搅拌15分钟，然后静置15分钟。分离有机层，浓缩，在高真空下干燥，得到标题化合物，为深棕色油状物，将其不经进一步纯化用于下一步。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)7.96(s，1H)，7.92(s，1H)，3.89(s，3H)，1.34(s，9H)。

2-溴-4-叔丁基-5-硝基-苯酚(37)的制备方法

将碳酸(2-溴-4-叔丁基-5-硝基-苯基)甲基酯(72.9g，219.5mmol)加入到反应器中，加入DCM(291.6mL)。使用冰浴将黄色溶液冷却。在2.2-6.9℃逐步加入甲醇钠(67.04g，69.11mL，5.4M，373.2mmol)。完成添加后，将该反应体系缓慢温至环境温度。完成时，将该反应体系冷却至0℃，用1M HCl(373.2mL，373.2mmol)猝灭。将双相混合物搅拌20min，转入分液漏斗。分离有机层，用水(300mL)，然后用盐水(300mL)洗涤。浓缩有机层，在高真空下干燥粗产物。再使用应用Berger MultiGram III(Mettler Toledo AutoChem，Newark DE)的超临界流体色谱法(SFC)分离纯化产物。方法条件是使用来自PrincetonChromatography的PPU柱(30*150)，20％甲醇，在250mL/min，100巴，35C，220nm。注射3.5mL的55-70mg/mL溶液。使用SFC ProNTo软件采集数据。从SFC纯化中回收的纯化产物是甲醇溶剂合物。为了除去甲醇，进行共沸蒸馏。将深黄色固体2-溴，4-叔丁基，5-硝基苯酚甲醇溶剂合物(111.3g，59.9mmol)加入到1L圆底烧瓶中，然后加入庚烷(500mL)。将该淤浆加热至64℃，得到澄清溶液。减压(649mbar)蒸馏溶剂30分钟，然后反萃取至干。将该过程重复三次，直到通过¹H-NMR未检测到MeOH。在高真空下干燥产物16小时，得到产物，为深黄色半固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ11.2(b s，OH)，7.69(s，1H)；7.03(s，1H)；1.30(s，9H)。

5-叔丁基-3，3-二甲基-6-硝基苯并呋喃-2(3H)-酮(19)的制备方法

将二氟锌(6.093g，58.92mmol)加入到充氮气的圆底烧瓶中。然后在氮气流中加入Pd(tBu₃P)₂(2g，3.835mmol)。然后向烧瓶中加入溶于DMF(80.75mL)的2-溴-4-叔丁基-5-硝基-苯酚(16.15g，58.92mmol)。该反应混合物是橙色混悬液。向该混合物中加入(1-甲氧基-2-甲基-丙-1-烯氧基)三甲基硅烷(21.61g，25.13mL，117.8mmol)，将得到的混合物加热至80℃，搅拌16h。完成时，将该反应混合物冷却至环境温度，通过C盐

过滤。用MTBE(536.0mL)洗涤滤饼，向滤液中加入水(893.3mL)。将该混合物搅拌15min，再沉降15min。分离各层，将0.5MHCl(500mL，250.0mmol)加入到有机相中。分离各层，用水(500mL)洗涤有机层。分离各层，用NaCl(500mL；8wt％)洗涤有机层。分离有机层，真空除去溶剂。得到粗产物，为棕色结晶固体，然后通过硅胶垫使用己烷∶MTBE 20∶1-10∶1作为洗脱剂纯化。合并包含产物的级分，真空除去溶剂，得到纯产物，为白色结晶固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ7.80(s，1H)；7.62(s，1H)；1.49(s，6H)；1.34(s，9H)

6-氨基-5-叔丁基-3，3-二甲基苯并呋喃-2(3H)-酮(20)的制备方法

在氮气流中将钯/碳(湿；5wt％)放入圆底烧瓶。然后向容器中加入5-叔丁基-3，3-二甲基-6-硝基-苯并呋喃-2-酮(4.7g，17.85mmol)。然后在氮气气氛中向容器中谨慎加入甲醇(120mL)。然后用N₂净化容器，抽真空，然后加入氢气。给容器抽真空，再加入氢气，然后连续导入氢气流。完成后，通过C盐

过滤该反应体系，用MeOH(300mL)洗涤滤饼。真空除去溶剂，在高真空下干燥产物，得到白色结晶固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ7.05(s，1H)；6.48(s，1H)；5.02(s，2H，NH₂)；1.34(s，6H)；1.30(s，9H)。

N-(5-叔丁基-3，3-二甲基-2-氧代-2，3-二氢苯并呋喃-6-基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(21)的制备方法

向反应容器中加入化合物26(2.926g，15.43mmol)、化合物20(4.32g，18.52mmol)、2-MeTHF(35.99mL)，然后加入50％T3P的2-MeTHF溶液(13.36g，21.00mmol)。加入吡啶(2.441g，2.496mL，30.86mmol)，将该混悬液在47.5℃±5℃加热18h。完成后，将该反应体系冷却至环境温度，加入2-MeTHF(36)和水(30mL)。分离各层，用10wt％柠檬酸溶液(30mL)、水(30mL)洗涤有机层，用NaHCO₃(20mL)洗涤两次。用盐水(50mL)洗涤有机层，分离，真空除去溶剂。将粗产物溶于MTBE(100mL)，加入作为抗溶剂的庚烷(200mL)。固体沉淀，将得到的淤浆搅拌2小时.通过抽滤收集固体，用己烷洗涤滤饼。在55℃在真空烘箱内在氮气气氛中干燥得到的产物，得到标题化合物，为浅褐色固体。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ12.96(d J 6.4 Hz，1H)；12.1(s，1H)；8.9(d，J 6.4 Hz，1H)；8.33(d，J 8Hz，1H)；7.84-7.75(m，2H)；7.55-7.48(m，3H)；1.47(s，6H)；1.45(s，9H)。

2-(5-叔丁基-2-羟基-4-(4-氧代-1，4-氢喹啉-3-甲酰氨基)苯基)-2-甲基丙酸(28)的制备方法

将化合物26(81.30mg，0.4288mmol)和化合物20(110mg，0.4715mmol)加入到圆底烧瓶中，然后加入2-MeTHF(1mL)，然后加入50％T3P的2-MeTHF溶液(371.4mg，0.5836mmol)和吡啶(67.84mg，69.37μL，0.8576mmol)的2-MeTHF溶液。将该混悬液在47.5℃±5℃加热过夜。完成后，将该反应体系冷却至环境温度。加入2-MeTHF(1.014mL)和水(811.2μL)。分离各层，用(811.2μL)水洗涤有机层，用NaHCO₃(2mL)洗涤两次。将有机层转入圆底烧瓶。加入溶于水(2mL)的LiOH(38.6mg，0.9mmol)，将该反应体系加热至45℃。完成后，分离各层，弃去有机层。用冰浴冷却水层，向溶液中加入盐酸(10.72mL的1.0M，10.72mmol)，直到pH达到pH约为3-4。用2-MeTHF(5mL)将水层萃取两次，合并有机层，用盐水(5ml)洗涤。分离有机层，真空除去溶剂。在50℃、在氮气气氛中用真空烘箱干燥得到的固体，得到标题化合物。¹H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)δ12.89(d，J 6.8 Hz，1H)；11.84(s，1H)；11.74(s，1H)；9.36(s，1H)；8.87-8.61(d，J 6.4 Hz，1H)；8.34-8.32(d，J 9.1 Hz 1H)；7.83-7.745(m，2H)；7.17-7.09(m，1H)；7.17(s，1H)；7.09(s，1H)；1.43(s，6H)；1.40(s，9H)。

实施例6：N-(2-叔丁基-5-羟基-4-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)苯基)-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(27)和2-(5-叔丁基-2-羟基-4-(4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-甲酰氨基)苯基)-2-甲基丙酸(28)的生物合成方法

龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)(DSM 40260)作为冷冻培养物购自DSMZ。该培养物用于接种维持并且贮存在4℃的琼脂斜面。制备包含酵母提取物(4g/L)、麦芽提取物(10g/L)和大豆粉(5g/L)的酵母提取物-麦芽提取物-胨(YMP)，在130℃灭菌60分钟。给包含1L YMP培养基的5个烧瓶直接接种来自琼脂斜面的龟裂链霉菌。使培养物在30℃与约100rpm的适度搅拌下生长2-3天。在这些条件下，观察到两种生长类型，即混浊溶液或在烧瓶底部上聚集的球形颗粒。后面的生长类型显示向化合物27的更高的转化率。然后旋降细胞，收集，重新混悬于包含1L 0.1M磷酸钾缓冲液pH 7.0的两个烧瓶。向烧瓶中加入5.0g在50mL N，N二甲基甲酰胺(DMF)中的化合物34。使反应在30℃与约100rpm的适度搅拌下进行24小时，此时通过HPLC显示化合物27的转化率为7.59％且化合物28的转化率为1.17％。

合并两烧瓶，以3500rpm离心10分钟，重新混悬于500mL甲醇。将该混悬液剧烈搅拌30分钟，然后以6000rpm旋降10分钟。收集有机层，将该过程重复两次。真空浓缩甲醇萃取物，分别得到2.50g、1.57g和1.11g固体物质。来自这些萃取物的固体显示包含74.78-91.96％化合物34、7.66-19.73％化合物27和0.39-5.49％化合物28。在从生物氧化产物中采集部分化合物34的尝试中，合并来自两次萃取的固体，混悬于250mL甲醇，剧烈搅拌1小时，真空过滤。尽管滤液中富含化合物27和28(分别为22.09和6.14％)，但是固体仍然包含化合物27(8.96％)和化合物28(0.50％)。

使包含约2.2g溶解的固体的甲醇滤液吸附在4.5g二氧化硅上，通过使用100％二氯甲烷-88∶12二氯甲烷/甲醇梯度的快速色谱法纯化。真空浓缩包含化合物27的级分，通过冷冻干燥进一步干燥，得到130mg化合物27(通过HPLC证实纯度为98.5％)。还真空浓缩包含不纯化合物28的级分，得到少于10mg的固体。

将细胞沉淀(pellet)重新混悬于500mL甲醇，在BeadBeater中匀化，以破碎细胞，回收任何遗留的产物。通过以6000rpm将匀化混悬液离心10分钟得到有机层。将其加入从第三次萃取中得到的固体和从前两次萃取的淤浆富集中过滤的固体中，在回流状态搅拌成淤浆过夜。然后冷却该淤浆，抽滤，得到1.99g固体。将该固体重新溶于300mL甲醇，然后使其吸附在约5g二氧化硅上，通过使用100％二氯甲烷-94∶6二氯甲烷/甲醇梯度的快速色谱法纯化纯化，得到820mg固体，其包含化合物34和化合物27和其他杂质。将其使用更逐步的溶剂梯度(100％DCM-6％MeOH/94％DCM混合物)再上柱，又得到89mg化合物27。¹H-NMR光谱与上述报道的一致。

实施例7：在pH 7.4下测试溶解度的一般方法

高通量摇瓶测定法用于测定化合物在pH 7.4缓冲液中的溶解度。为了计算化合物在溶液中的浓度，每种化合物运行两种条件：300uM的100％DMSO溶液和200uM的包含2％DMSO的pH 7.4磷酸盐缓冲液溶液。将每一样品保持振摇过夜，然后注射在HPLC-UV上，以使用下列条件测定峰面积：Phenomenex 00A-4251-B0-30x2.00mm Luna 3u C18(2)100A柱；0.8mL/min流速；20uL注射体积；含有0.1％甲酸的HPLC级水和含有0.1％甲酸的HPLC级乙腈流动相；在254nm测定峰面积。使用下列方程计算以uM计的溶解度：浓度＝(峰面积pH 7.4)/(峰面积300uM DMSO标准条件)*300uM标准条件浓度。基于在300uM DMSO标准条件下的最大面积峰的保留时间(RT)的缓冲液条件鉴定所关注的峰。

活性测定

实施例8：用于活性测定的一般方法

用于检测和测量化合物的ΔF508-CFTR增强作用的分析

用于测定化合物的ΔF508-CFTR调节性质的跨膜电位光学方法

该测定法使用荧光电压传感染料以使用荧光板读出器测定跨膜电位改变(例如FLIPR III，Molecular Devices，Inc.)作为NIH 3T3细胞中功能性ΔF508-CFTR增加的读出值。对该响应的驱动力在于在预先用化合物处理细胞、然后加载电压传感染料后，通过单一液体添加步骤生成与通道活化相关的氯离子梯度。

增强剂化合物的鉴定

为了鉴别ΔF508-CFTR增强剂，研发了双重-添加HTS测定方式。该HTS分析使用荧光电压传感染料以测定FLIPR III上跨膜电位改变作为温度校准的ΔF508 CFTR NIH 3T3细胞中ΔF508 CFTR门控增加的测量值(电导)。对该响应的驱动力在于在预先用增强剂化合物(或DMSO媒介物对照品)处理细胞、然后加载再分布染料后，与使用荧光板读出器例如FLIPR III进行通道活化相关的Cl^-离子梯度。

溶液

浴溶液#1：(以mM计)NaCl 160，KCl 4.5，CaCl₂ 2，MgCl₂ 1，HEPES10，pH 7.4与NaOH。

不含氯化物的浴溶液：浴溶液#1中的氯化物盐被葡糖酸盐取代。

细胞培养将稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于膜电位的光学测定。将细胞维持在37℃、在5％CO₂和90％湿度中的在175cm²培养烧瓶中的改进的Eagle培养基中，该培养基补充了2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA、β-ME、1X青霉素/氯霉素和25mMHEPES。就所有光学测定而言，以20,000/孔将细胞接种在384-孔基质胶包被的培养板上并且在37℃培养2hrs，然后在27℃培养24小时，以用于增强剂测定。就纠正测定而言，将细胞在27℃或37℃与和不与化合物一起培养16-24小时。测定化合物ΔF508-CFTR调节特性的电生理试验。

1.Ussing室测定

对表达ΔF508-CFTR的极化气道上皮细胞进行Ussing室实验，以进一步表征在光学测定法中鉴别的ΔF508-CFTR调节剂。从支气管组织中分离非-CF和CF气道上皮，如上所述培养(Galietta，L.J.V.，Lantero，S.，Gazzolo，A.，Sacco，O.，Romano，L.，Rossi，G.A.，& Zegarra-Moran，O.(1998)In Vitro Cell.Dev.Biol.34，478-481)，在用NIH3T3-条件培养基预包被的

Snapwell^TM滤器上铺。4天后，除去顶部培养基，使细胞在空气液体界面上生长＞14天，然后使用。这产生单层完全分化的柱状细胞，它们具纤毛、特征在于气道上皮特征。从没有已知任何肺病的不吸烟者中分离非-CFHBE。从对ΔF508-CFTR而言纯合的患者中分离CF-HBE。

将生长在

Snapwell^TM细胞培养插入物上的HBE固定在Ussing室(Physiologic Instruments，Inc.，San Diego，CA)上，使用电压钳系统(Department of Bioengineering，University of Iowa，IA)测定在基底外侧到顶端Cl^-梯度(I_SC)的存在下的经上皮电阻和短路电流。简言之，在电压钳记录条件下(V_保持＝0mV)、在37℃检验HBE。基底外侧溶液包含(以mM计)145NaCl、0.83K₂HPO₄、3.3KH₂PO₄、1.2MgCl₂、1.2CaCl₂、10葡萄糖、10HEPES(用NaOH将pH调节至7.35)，顶端溶液包含(以mM计)145葡糖酸钠、1.2MgCl₂、1.2CaCl₂、10葡萄糖、10HEPES(用NaOH将pH调节至7.35)。

增强剂化合物的鉴定

典型的方案使用基底外侧至顶端膜的Cl^-浓度梯度。为了产生该梯度，对基底外侧膜使用正常的林格液(ringer)，同时用等摩尔的葡糖酸钠(用NaOH滴定至pH 7.4)代替顶膜的NaCl，以得到跨上皮的大幅的Cl^-浓度梯度。将福斯柯林(10μM)和所有受试化合物加入到细胞培养嵌入物的两侧。比较推测的ΔF508-CFTR增强剂与已知增强剂染料木黄酮的效果。

2.膜片钳记录

如上所述使用穿孔的膜片记录监测ΔF508-NIH3T3细胞中的总Cl^-电流(Rae，J.，Cooper，K.，Gates，P.，& Watsky，M.(1991)J.Neurosci.Methods 37，15-26)。使用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instruments Inc.，Foster City，CA)在22℃进行电压钳记录。移取管溶液包含(以mM计)150N-甲基-D-葡萄糖胺(NMDG)-Cl、2MgCl₂、2CaCl₂、10EGTA、10HEPES和240μg/ml两性霉素-B(用HCl将pH调节至7.35)。胞外培养基包含(以mM计)150NMDG-Cl、2MgCl₂、2CaCl₂、10HEPES(用HCl将pH调节至7.35)。使用安装了Digidata1320A/D界面与Clampex 8(Axon Instruments Inc.)的PC进行脉冲发生、数据采集和分析。为了活化ΔF508-CFTR，向浴中加入ΔF508-CFTR、10μM福司柯林和20μM染料木黄酮，每隔30秒监测一次电流-电压相关性。

增强剂化合物的鉴定

还用穿孔膜片记录技术研究了ΔF508-CFTR强化剂增加稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3细胞中宏观ΔF508-CFTR Cl^-电流(I_ΔF508)的能力。从光学测定法中鉴别的强化剂引起与在光学测定法中观察到的类似效力和功效的I_ΔF508剂量依赖性增加。在所有检验的细胞中，施加强化剂前和过程中的逆转电位约为-30mV，它是计算的E_C1(-28mV)。

细胞培养

将稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于全细胞记录。将细胞维持在37℃、在5％CO₂和90％湿度中的在175cm²培养烧瓶中的改进的Eagle培养基中，该培养基补充了2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA、β-ME、1X青霉素/氯霉素和25mM HEPES。就全细胞记录而言，将2,500-5,000细胞接种在聚-L-赖氨酸-包被的玻璃盖玻片上并且在27℃培养24-48hrs，然后用于测试增强剂活性，并且将细胞在37℃与和不与纠正化合物一起温育以测定纠正剂活性。

3.单通道记录

使用如上所述切下的膜内侧翻外膜片(Dalemans，W.，Barbry，P.，Champigny，G.，Jallat，S.，Dott，K.，Dreyer，D.，Crystal，R.G.，Pavirani，A.，Lecocq，J-P.，Lazdunski，M.(1991)Nature 354，526-528)、应用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instruments Inc.)观察NIH3T3细胞中表达的wt-CFTR和温度校准的ΔF508-CFTR的门控活性。移取管包含(以mM计)：150NMDG、150天冬氨酸、5CaCl₂、2MgCl₂和10HEPES(用Tris碱将pH调节至7.35)。浴包含(以mM计)：150NMDG-Cl、2MgCl₂、5EGTA、10TES和14Tris碱(用HCl将pH调节至7.35)。在切下后通过添加1mM Mg-ATP、75nM的cAMP-依赖性蛋白激酶催化亚单位(PKA；Promega Corp.Madison，WI)和10mM NaF活化wt-和ΔF508-CFTR，以抑制蛋白磷酸酶，从而防止电流衰减。将移取管电位维持在80mV。分析来自包含≤2活性通道的膜片中通道活性。同时开放的最大值确定了实验过程中活性通道的数量。为了测定单通道电流振幅，在100Hz“离线”过滤从120秒ΔF508-CFTR活性记录的数据，然后用于构建所有点的振幅直方图，使用Bio-PatchAnalysis软件(Bio-Logic Comp.France)与多高斯函数拟合。根据120秒的通道活性确定总微型电流和开放概率(P_o)。使用Bio-Patch软件或根据相关性P_o＝I/i(N)测定P_o，其中I＝平均电流，i＝单通道电流振幅，且N＝膜片中活性通道的数量。

细胞培养

将稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于切下膜的膜片钳记录。将细胞维持在37℃、在5％CO₂和90％湿度中的在175cm²培养烧瓶中的改进的Eagle培养基中，该培养基补充了2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA、β-ME、1X青霉素/氯霉素和25mM HEPES。就单通道而言，将2,500-5,000细胞接种在聚-L-赖氨酸-包被的玻璃盖玻片上并且在27℃培养24-48hrs，然后使用。

使用实施例3中指定的方法测试化合物27和28的溶解度并且使用实施例4的测定法中指定的方法测试其活性。结果如表1中所示。如果测定EC₅₀(或IC₅₀)小于2.0μM，则使用“+++”表示化合物活性；如果测定活性为2μM-5.0μM，则使用“++”表示化合物活性；如果测定活性大于5.0μM，则使用“+”表示化合物活性；如果未得到数据，则使用“-”表示化合物活性。如果功效计算为大于100％，则使用“+++”表示功效；如果功效计算为100％-25％，则使用“++”表示功效；如果功效计算为小于25％，则使用“+”表示功效；如果未得到数据，则使用“-”表示功效。

表1：式I化合物的活性和功效的实例

其他实施方案

将本说明书中涉及的全部公开文献和专利引入本文参考，就如同将每篇公开文献或专利申请各自特别和分别引入作为参考的情况一样。如果在作为参考引入的任意专利或公开文献中的术语的含义与本说明书中使用的术语含义发生矛盾，则指定本说明书中的术语含义为准。此外，上述讨论仅公开并且描述本发明的典型实施方案。本领域技术人员从这种讨论和附图和权利要求中易于认可可以在不脱离如下面的权利要求所定义的本发明精神和范围的情况下对其中进行各种改变、变型和修改。

Claims (21)

1.式I化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R是COOH或CH₂OH。

2.权利要求1的化合物，其中R是CH₂OH。

3.权利要求1的化合物，其中R是COOH。

4.如下结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。

5.如下结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。

6.药物组合物，该组合物包含：

权利要求1的式I化合物；和

药学上可接受的载体或辅助剂。

7.药物组合物，该组合物包含如下结构的化合物：

和药学上可接受的载体或辅助剂。

8.药物组合物，该组合物包含如下结构的化合物：

和药学上可接受的载体或辅助剂。

9.权利要求6-8任一项的药物组合物，进一步包含另外的活性剂，其选自溶粘蛋白剂、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、CFTR调节剂或营养剂。

10.调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使所述生物样品与权利要求1的式I化合物接触的步骤。

11.调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使所述生物样品与如下结构的化合物或其药学上可接受的盐接触的步骤：

12.调节生物样品中CFTR活性的方法，所述方法包括使所述生物样品与如下结构的化合物或其药学上可接受的盐接触的步骤：

13.治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，所述方法包括对该患者给予有效量的权利要求1的式I化合物，其中所述疾病选自囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰功能不全、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育症、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色病、凝血-纤溶缺陷，例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷，例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积症，例如I-细胞病/假性胡尔勒综合征、粘多糖症、桑霍夫病/泰-萨病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺乏症、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图综合征、佩-梅病、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍，例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病，例如遗传性克-雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、格-斯-施综合征、COPD、干眼病或斯耶格伦病。

14.权利要求13的方法，其中式I化合物具有如下结构：

15.权利要求13的方法，其中式I化合物具有如下结构：

16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。

17.用于在体外或体内测定生物样品中CFTR或其片段的活性的试剂盒，包括：

i.包含权利要求1的式I化合物的组合物；和

ii.用于下列内容的说明书：

a.将该组合物与生物样品接触；和

b.测定所述CFTR或其片段的活性。

18.权利要求17的试剂盒，进一步包括用于下列内容的说明书：

i.将另外的化合物与该生物样品接触；

ii.在所述另外的化合物存在下测定所述CFTR或其片段的活性；和

iii.将在另外的化合物存在下的CFTR或其片段的活性与在式I的组合物存在下的CFTR或其片段的活性进行比较。

19.权利要求18的试剂盒，其中将所述CFTR或其片段的活性进行比较的步骤提供所述CFTR或其片段的密度的测量。

20.权利要求17-19任一项的试剂盒，其中式I化合物具有如下结构：

21.权利要求17-19的试剂盒，其中式I化合物具有如下结构：