MX2011009868A - Moduladores del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quistica. - Google Patents

Moduladores del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quistica.

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MX2011009868A
MX2011009868A MX2011009868A MX2011009868A MX2011009868A MX 2011009868 A MX2011009868 A MX 2011009868A MX 2011009868 A MX2011009868 A MX 2011009868A MX 2011009868 A MX2011009868 A MX 2011009868A MX 2011009868 A MX2011009868 A MX 2011009868A
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pharmaceutically acceptable
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MX2011009868A
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Martyn C Botfield
Peter D J Grootenhuis
Gregor Zlokarnik
Xiaoqing Yang
Sara S Hadida Ruah
Fredrick F Van Goor
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Vertex Pharma
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Abstract

Esta invención se relaciona con un compuesto de la Fórmula I (ver fórmula (I)) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.

Description

MODULADORES DEL REGULADOR DE CONDUCTANCIA TRANSMEMBRANA DE FIBROSIS QUÍSTICA REIVINDICACIÓN DE PRIORIDAD Esta solicitud reivindica la prioridad para la solicitud provisional de los Estados Unidos No. de Serie 61/162,130, presentada el 20 de marzo de 2009 que se incorpora como referencia en la presente en su total idad .
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con moduladores del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística ( " CFTR" ) , las composiciones de los mismos, y los métodos con los mismos. La presente invención también se relaciona con los métodos para tratar enfermedades utilizando los moduladores del CFTR.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética recesiva que afecta a aproximadamente 30,000 niños y adultos en los Estados Unidos y aproximadamente 30,000 niños y adultos en Europa. A pesar de los avances en el tratamiento de la FQ, no existe ninguna cura.
La FQ se provoca por mutaciones en el gen regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quistica (CFTR) que codifica para un canal iónico de cloruro epitelial responsable de ayudar en la regulación de la absorción de sal y agua y la secreción en diversos tejidos. Fármacos de moléculas pequeñas, conocidos como potenciadores que aumentan la probabilidad de que la apertura del canal del CFTR represente una estrategia terapéutica potencial para el tratamiento de la FQ .
Específicamente, el CFTR es un canal aniónico suministrado por cAMP/ATP que se expresa en una variedad de tipos de células, que incluye células epiteliales de absorción y de secreción, donde regula el flujo de aniones a través de la membrana, así como la actividad de otros canales iónicos y proteínas. En las células epiteliales, el funcionamiento normal del CFTR es decisivo para el mantenimiento del transporte de electrólitos a través del cuerpo, incluyendo el tejido respiratorio y digestivo. El CFTR se compone de aproximadamente 1480 aminoácidos que codifican para una proteína formada por una repetición en tándem de los dominios transmembrana, cada uno con seis hélices transmembrana y un dominio de unión de nucleótidos. Los dos dominios transmembrana se enlazan por un gran (R) -dominio regulador, polar, con múltiples sitios de fosforilación que regulan la actividad del canal y el tráfico celular.
Se ha identificado y secuenciado el gen que codifica para el CFTR (Véase, Gregory, R. J. et al. (1990) Nature 347:382-386; Rich, D. P. et al. (1990) Nature 347:358-362), (Riordan, J. R. et al. (1989) Science 245:1066-1073) . Un defecto en este gen provoca mutaciones en el CFTR lo que resulta en fibrosis quística ("CF"), la enfermedad genética mortal más común en los seres humanos. La fibrosis quística afecta a aproximadamente uno de cada 2,500 niños en los Estados Unidos. Dentro de la población general de Estados Unidos, hasta 10 millones de personas portan una sola copia del gen defectuoso, sin efectos evidentes de la enfermedad. Por el contrario, los individuos con dos copias del gen asociado con la FQ sufren los efectos debilitantes y fatales de la FQ, incluyendo la enfermedad pulmonar crónica .
En los pacientes con FQ, las mutaciones en el CFTR endógenamente expresado en el epitelio respiratorio llevan a una secreción reducida de aniones apicales provocando un desequilibrio en el transporte de iones y fluidos. La disminución resultante en el transporte de aniones contribuye a una mayor acumulación de moco en los pulmones y las consiguientes infecciones microbianas que por último provocan la muerte en los pacientes con FQ . Además de la enfermedad respiratoria, los pacientes con FQ por lo general sufren de problemas gastrointestinales e insuficiencia pancreática los cuales, si no se tratan, dan por resultado en la muerte. Además, la mayoría de los hombres con fibrosis quística son infértiles y la fertilidad es reducida en las mujeres con fibrosis quística. En contraste con los graves efectos de las dos copias del gen asociado con la FQ, los individuos con una sola copia del gen asociado con la FQ presentan una mayor resistencia al cólera y a la deshidratación resultante de la diarrea -tal vez lo que explica la frecuencia relativamente alta del gen de la FQ en la población.
El análisis de secuencias del gen CFTR de los cromosomas de la FQ ha revelado una variedad de mutaciones que provocan la enfermedad (Cutting, G. R. et al. (1990) Nature 346:366-369; Dean, M. et al. (1990) Cell 61:863:870 ; y Kerem, B-S. et al. (1989) Science 245:1073-1080 ; Kerem, B-S et al. (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 87:8447-8451) . Hasta la fecha, se han identificado más de 1000 mutaciones que provocan la enfermedad en el gen de la FQ (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app) . La mutación más frecuente es una supresión de fenilalanina en la posición 508 de la secuencia de aminoácidos del CFTR , y se denomina comúnmente como AF508-CFTR. Esta mutación se presenta en aproximadamente el 70% de los casos de fibrosis quística y se asocia con una enfermedad grave.
La supresión del residuo 508 en AF508-CFTR impide que la proteína creciente se pliegue correctamente. Esto da por resultado en la incapacidad de la proteína mutante para salir del ER, y el tráfico hacia la membrana plasmática. Como resultado, el número de canales presentes en la membrana es mucho menor que el observado en las células que expresan el CFTR tipo silvestre. Además del tráfico alterado, la mutación da por resultado en una activación defectuosa de canales. En conjunto, el número reducido de canales en la membrana y la activación defectuosa conducen a un transporte reducido de aniones a través de los epitelios conduciendo a un transporte defectuoso de iones y fluidos. (Quinton, P. M. (1990), FASEB J. 4: 2709-2727) . Sin embargo, los estudios han mostrado que los números reducidos de AF508-CFTR en la membrana son funcionales, aunque menos que los del CFTR tipo silvestre. (Dalemans et al. (1991), Nature Lond . 354: 526-528; Denning et al., supra; Pasyk y Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270: 12347-50) . Además del AF508-CFTR, otras mutaciones que provocan la enfermedad en el CFTR que dan por resultado en tráfico, síntesis y/o activación de canales defectuosos se podrían sobre- o sub-regular para alterar la secreción de aniones y modificar la progresión y/o gravedad de la enfermedad.
Aunque el CFTR transporta una gran variedad de moléculas además de aniones, es evidente que esta función (el transporte de aniones) representa un elemento en un importante mecanismo para transporte de iones y agua a través del epitelio. Los otros elementos incluyen el canal Na+ epitelial, ENaC, el co- transportador Na+/2C1"/ +, la bomba de Na+ - K+-ATPasa y los canales de la membrana K+ basolateral, que son responsables de la absorción de cloruro en la célula.
Estos elementos trabajan en conjunto para alcanzar el transporte direccional a través del epitelio vía su expresión y localización selectivas dentro de la célula. La absorción de cloruro se lleva a cabo mediante la actividad coordinada de ENaC y CFTR presentes en la membrana apical y la bomba de Na+- K+-ATPasa y los canales de iones Cl expresados en la superficie basolateral de la célula. El transporte activo secundario de cloruro desde el costado luminal conduce a la acumulación de cloruro intracelular , que luego puede dejar pasivamente a la célula vía los canales de Cl", lo que resulta en un transporte vectorial. La disposición del co-transportador de Na+/2C1"/ +, la bomba de Na+ - K+ -ATPasa y los canales de K+ en la membrana basolateral sobre la superficie basolateral y el CFTR sobre el costado luminal coordinan la secreción de cloruro vía el CFTR sobre el costado luminal. Debido a que probablemente el agua nunca se transportará activamente por sí misma, su flujo a través de los epitelios depende de diminutos gradientes osmóticos transepiteliales generados por el flujo masivo de sodio y cloruro.
Como se mencionó anteriormente, se cree que la supresión del residuo 508 en AF508-CFTR impide que la proteína creciente se pliegue correctamente, lo que da por resultado en la incapacidad de esta proteína mutante para salir de la ER, y el tráfico hacia la membrana plasmática. Como resultado, cantidades insuficientes de la proteína madura se presentan en la membrana plasmática y se reduce significativamente el transporte de cloruro dentro de los tejidos epiteliales. De hecho, se ha mostrado que este fenómeno celular del procesamiento defectuoso de ER de los transportadores ABC mediante la maquinaria de ER será la base fundamental no sólo para la enfermedad de FQ , sino que también para una amplia gama de otras enfermedades aisladas y hereditarias .
Por consiguiente, existe una necesidad de moduladores de la actividad del CFTR, y sus composiciones, que se pueden utilizar para modular la actividad del CFTR en la membrana celular de un mamí fero .
Existe una necesidad por métodos para tratar las enfermedades provocadas por la mutación en el CFTR utilizando estos moduladores de la actividad del CFTR .
Existe una necesidad por métodos para modular la actividad del CFTR en una membrana celular ex vivo de un mamífero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, esta invención se relaciona con un compuesto de Fórmula I: H o una sal farmacéuticamente aceptable del mi donde R es COOH o CH2OH.
En una modalidad, el compuesto tiene estructura : H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, el compuesto tiene estructura : H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto, esta invención se relaciona con una composición farmacéutica que incluye un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente, y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad de la composición farmacéutica, el compuesto tiene la estructura: H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad de la composición farmacéutica, el compuesto tiene la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las modalidades de este aspecto también pueden incluir una composición farmacéutica que contiene un agente adicional seleccionado de un agente mucolítico, un broncodilatador , un antibiótico, un agente ant i - infeccioso , un agente anti-inf lamatorio, un modulador del CFTR, o un agente nutricional.
En un aspecto, esta invención incluye un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente.
En una modalidad del método para modular la actividad del CFTR, el compuesto tiene la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad del método para modular actividad del CFTR, el compuesto tiene la estructura o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la invención también proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente, y la enfermedad se selecciona de fibrosis quistica, asma, COPD inducida por fumar, bronquitis crónica, rinosinusitis , estreñimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina provocada por ausencia congénita bilateral de los conductos deferentes (CBAVD, por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA, por sus siglas en inglés) , enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de fibrinolisis en la coagulación, tales como deficiencia de la proteína C, angioedema hereditario Tipo 1, deficiencias en el procesamiento de lípidos, tales como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia Tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades por depósito lisosomal, tales como la enfermedad por células I/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis , Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Naj j r tipo II, poliendocrinopatía/hiperinsulemia , Diabetes mellitus, enanismo Laron, deficiencia por mileoperoxidasa , hipoparat iroidismo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipof ibrinogenemia hereditaria, deficiencia por ACT, diabetes insípida (DI) , DI neurofiseal, DI neprogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Perli zaeus -Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, plasy supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos por poliglutaminas tales como enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, palidoluisiana dentatorúbrica , y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como la enfermedad hereditaria de Creutzfeldt- Jakob (debida a un defecto en el procesamiento de la proteína prión) , enfermedad de Fabry, síndrome Straussler-Scheinker , COPD, enfermedad de queratoconj untivitis seca, o enfermedad de Sjogren, Osteoporosis , Osteopenia, cicatrización ósea y crecimiento óseo (incluyendo reparación ósea, regeneración ósea, reducción de la reabsorción ósea y aumento de la deposición ósea) , síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro, tales como miotonía congénita (formas Thomson y Becker) , síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperecplexia, epilepsia, hiperecplexia, enfermedad por depósito lisosomal, síndrome de Angelman, y Discinesia Ciliar Primaria (PCD, por sus siglas en inglés), un término para trastornos hereditarios de la estructura y/o función de los cilios, incluyendo la PCD con situs inversus (también conocido como síndrome de Kartagener) , la PCD, sin situs inversus y aplasia ciliar.
En otra modalidad del método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad, la enfermedad se selecciona de FQ, COPD, COPD inducida por fumar, pancreatitis, y rinosinusitis .
En ciertas modalidades, la enfermedad es fibrosis quística.
En una modalidad del método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad, el compuesto tiene la estructura: H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad del método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad, el compuesto tiene la estructura: H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para utilizarse en la medición de la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en una muestra biológica in vitro o in vivo, que comprende (i) una composición que comprende un compuesto de Fórmula I o cualquiera de las modalidades anteriores, y (ii) las instrucciones para: a) poner en contacto la composición con la muestra biológica y b) medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo.
En una modalidad de este aspecto, el kit incluye además las instrucciones para a) poner en contacto una composición adicional con la muestra biológica, b) medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional, y c) comparar la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional con la densidad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia de una composición de la Fórmula I .
En modalidades preferidas, el kit se utiliza para medir la densidad del CFTR o un fragmento del mismo .
En una modalidad preferida adicional, el kit se utiliza para medir la densidad del CFTR o un fragmento del mismo y el paso de comparar la actividad del CFTR o un fragmento del mismo proporciona una medida de la densidad del CFTR o un fragmento del mismo.
En una modalidad del kit para utilizarse en medir la actividad del CFTR , el compuesto tiene la estructura : o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad del kit para utilizarse en medir la actividad del CFTR, el compuesto tiene la estructura: H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos de la Fórmula I proporcionan propiedades ventajosas, tales como, de manera enunciativa, polaridad aumentada, solubilidad acuosa favorable, menor volumen de distribución y baja penetración en tejidos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones Los compuestos de esta invención incluyen aquellos descritos en general anteriormente, y se ilustran adicionalmente por las clases, subclases y especies descritas en la presente. En el sentido en que se utilizan en la presente, se deberán aplicar las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario .
El término "transportador de ABC", en el sentido en que se utiliza en la presente, significa una proteína transportadora de ABC o un fragmento de la misma que comprende al menos un dominio de unión, en donde la proteína o fragmento de la misma está presente in vivo o in vitro. El término "dominio de unión" , en el sentido en que se utiliza en la presente, significa un dominio en el transportador de ABC que se puede unir a un modulador. Véase, por ejemplo, Hwang, TC et al., J. Gen. Fisiol. (1998) : 111 (3) , 477-90.
El término "CFTR" , en el sentido en que se utiliza en la presente, significa regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística o una mutación del mismo con capacidad para una actividad reguladora, incluyendo de manera enunciativa, AF508 CFTR y G551D CFTR (véase, por ejemplo, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/, para las mutaciones del CFTR) .
El término "modular" , en el sentido en que se utiliza en la presente, significa aumentar o disminuir una cantidad mensurable.
Para los fines de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a. Ed. Adicionalmente, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry" , Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March's Advanced Organic Chemistry", 5a. Ed., Ed.: Smith, M.B. y March, J . , John Wiley & Sons, New York: 2001, el contenido total de los mismos se incorpora como referencia.
Como se describe en la presente, los compuestos de la invención se pueden sustituir opc ionalmente con uno o más sust i tuyentes , tal como se ilustraron en general anteriormente, o como se ejemplifican por las clases, subclases, y especies particulares de la invención. Se debe apreciar que la frase "sustituido opcionalmente" se utiliza indistintamente con la frase "sustituido o sin sustituir". En general, el término "sustituido", ya sea precedido por el término "opcionalmente" o no, se relaciona con la sustitución de radicales hidrógeno en una estructura determinada con el radical de un sustituyente especifico. A menos que se indique lo contrario, un grupo sustituido opcionalmente puede tener un sustituyente en cada posición que se pueda sustituir del grupo, y cuando se pueda sustituir más de una posición en cualquier estructura determinada con más de un sustituyente seleccionado de un grupo específico, el sustituyente puede ser ya sea igual o diferente en cada posición. Las combinaciones de sus t ituyentes previstas por esta invención de preferencia son aquellas que dan por resultado en la formación de compuestos estables o químicamente factibles. El término "estable", en el sentido en que se utiliza en la presente, se relaciona con compuestos que no se modifican sus tancialmente cuando se someten a condiciones para permitir su producción, detección, y de preferencia su recuperación, purificación, y el uso para uno o más de los propósitos descritos en la presente. En algunas modalidades, un compuesto estable o un compuesto químicamente factible es uno que no se altere sus tancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40°C o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante al menos una semana .
El término "grupo protector" (GP) , en el sentido en que se utiliza en la presente, representa aquellos grupos destinados a proteger un grupo funcional, tal como, por ejemplo, un alcohol, amina, carboxilo, carbonilo, etc., contra reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos. Los grupos protectores comúnmente utilizados se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a. Edición (John Wiley & Sons, New York, 1999) , que se incorpora en la presente como referencia. Los ejemplos de grupos protectores de nitrógeno incluyen grupos acilo, aroilo, o carbamilo tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo , 2-cloroacetilo, 2 -bromoacet ilo , trif luoroacetilo, tricloroacet ilo , ftalilo, o-ni trofenoxiacet ilo , a- clorobut irilo , benzoilo, 4-clorobenzoilo, 4 -bromobenzoilo , 4 -nitrobenzoilo y auxiliares quirales tales como D, L o D, L-aminoácidos protegidos o sin proteger tales como alanina, leucina, fenilalanina y lo semejante; grupos sulfonilo tales como bencensulfonilo, p-toluensulfonilo y lo semejante; grupos carbamato tales como benc i loxicarboni lo , p-clorobenc i loxicarboni lo , p -metoxibenz i lox carboni lo , - ni trobenc i loxicarboni lo , 2 - ni trobenc i loxicarboni lo , p-bromobenc i loxicarboni lo, 3 , 4 - dimetoxibenc i loxi -carbonilo, 3 , 5 -dimetoxibenciloxicarbonilo , 2,4-dimetoxibenc i loxicarboni lo , 4 -metoxibenc i lo i -carbonilo, 2-nitro-4, 5 -dimetoxibenciloxicarbonilo , 3,4,5- trimetoxibenc i loxicarboni lo , l-(p-bifenilil)-l-meti letoxicar oni lo , a , - dimeti 1 -3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidri loxicarboni lo , t-butiloxicarbonilo, di isopropi Imetoxicarboni lo , isopropiloxicarbonilo , etoxicarboni lo , metoxicarbonilo , aliloxicarbonilo , 2,2,2,-tricloroetoxicarbonilo , fenoxicarbonilo , 4-nitrofenoxi carbonilo, fluorenil - 9 -metoxicarbonilo , ciclopenti loxicarbonilo , adamant i loxicarboni lo , ciclohexiloxicarbonilo , fenilt iocarbonilo y lo semejante, grupos arilalquilo tales como los grupos bencilo, trifenilmetilo , benciloximet ilo y lo semejante y grupos sililo tales como trimetilsililo y lo semejante. Los grupos N-protec tores preferidos son ter- but i loxicarboni lo (Boc) .
Los ejemplos de grupos protectores útiles para ácidos son alquil ásteres sustituidos, tales como 9 - f luoreni lmetilo , metoximetilo , metiltiomet ilo , tetrahidropiranilo , tetrahidrofuranilo , metoxietoximetilo , 2 - (trimetilsilil ) etoximetilo , benciloximetilo, pivaloi lo imetilo , fenilacetoximetilo, triisopropilsililmetilo , cianometilo, acetol, fenacilo, fenacil esteres sustituidos, 2 , 2 , 2 -tricloroetilo, 2-haloetilo, ?-cloroalquilo , 2 -( trimetilsilil ) etilo , 2-met ilt ioet ilo , t-butilo, 3 -metil - 3 -pentilo , diciclopropilmetilo , ciclopentilo , ciclohexilo, alilo, metalilo, cinamilo, fenilo, silil ásteres, bencilo y bencil ésteres sustituidos, 2,6-dialqui 1 feni 1 ésteres tales como pentaf luorofeni lo , 2 , 6 - dialqui 1 fenilo . Los grupos protectores preferidos para ácidos son metil o etil ésteres.
Los métodos para agregar (un proceso en general denominado como "protección") y retirar (un proceso en general denominado como "desprotección" ) tales como los grupos protectores de amina y ácido son bien conocidos en la técnica y están disponibles, por ejemplo, en P . J . Koc ienski , Protecting Groups , Thieme, 1994, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad y Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis , 3a. Edición (John Wiley & Sons, New York, 1999) .
A menos que se establezca de otra manera, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la invención están dentro del alcance de la invención. Es decir, los compuestos de la Fórmula I pueden existir como tautómeros: Adicionalmente, a menos que se establezca otra manera, también se pretende que las estructuras representadas en la presente incluyan los compuestos que difieren sólo en presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras a excepción de la sustitución de hidrógeno por deuterio o tritio, o la sustitución de un átomo de carbono por un átomo de carbono enriquecido con 13C o 14C están dentro del alcance de esta invención. Estos compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, soluciones de ensayo en análisis biológicos o como agentes terapéuticos .
Los ejemplos de solventes adecuados son, de manera enunciativa, agua, metanol, diclorometano (DCM) , acetoni trilo , dimet i 1 formamida (DMF) , acetato de etilo (EtOAc) , alcohol isopropílico (IPA), acetato de isopropilo (IPAc) , tet rahidrofurano (THF) , metil etil cetona (MEK) , t-butanol y N-metil pirrolidona (NMP) .
Los ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son, de manera enunciativa, clorhidrato de 1- (3- (dimetilamino) propil) - 3 - et i 1 - carbodi imida (EDCI) , hexaf luorofosfato de 2 - ( 1H -benzotriazol - 1 -il) -1, 1, 3 , 3 - tetrametiluronio (HBTU) , 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) , hexaf luorofosfato de 2-(??-7-Azabenzotriazol-l-il) -1, 1,3,3 - te trame til uronio (HATU) , tetraf luoroborato de 2 -cloro- 1 , 3 -dimetil - 2 -imidazolio, 1-H-benzotriazolio-l-[bis (dimetilamino) metilen] - 5 - c lorohexaf luorofosfato (HCTU) , 2 -cloro-4 , 6 -dimetoxi - 1 , 3 , 5 - triazina , y anhídrido 2 -propan- fosfónico (T3P®) .
Los ejemplos de bases adecuadas son, de manera enunciativa, K2C03, N-Met ilmor folina (NMM) , trietilamina (TEA) , di isopropi 1 - e ti 1 amina (DIEA) , piridina, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio, y metóxido de sodio.
Compuestos En una modalidad, la invención incluye un compuesto de la Fórmula I: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.
En ciertas modalidades, R es CH2OH.
En ciertas modalidades, R es COOH.
En otra modalidad, la invención incluye un compuesto de la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, En otra modalidad, la invención incluye un compuesto de la estructura: H I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una modalidad, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula I, y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la estructura: y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable .
En otra modalidad, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la estructura: y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable .
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un agente adicional seleccionado de un agente mucolítico, un broncodi latador , un antibiótico, un agente anti-invectivo [ sic] , un agente ant i - inf lamatorio , un modulador del CFTR, o un agente nutricional.
III. SINTESIS GENERAL Los compuestos de la Fórmula I se pueden sintetizar de acuerdo con el Esquema 1.
Esquema 1 H,N En el Esquema 1, las anilinas de la Fórmula II, en donde R y OH opcional e independientemente portan grupos protectores en los mismos, se hacen reaccionar con los intermediarios de ácido carboxílico de la Fórmula III bajo condiciones de acoplamiento para formar los compuestos de la Fórmula IV. Los compuestos de la Fórmula IV que portan uno o más grupos protectores entonces se pueden desproteger para proporcionar los derivados de la Fórmula I.
La reacción de acoplamiento descrita en el Esquema 1 se puede alcanzar al disolver los reactivos en un solvente adecuado, tratando la solución resultante con un reactivo de acoplamiento adecuado, opcionalmente en presencia de una base adecuada.
Los derivados de quinolina de la Fórmula III se pueden sintetizar de acuerdo con el Esquema 2.
Esquema 2 Las anilinas de la Fórmula II, en donde R es -CH20H se pueden sintetizar de acuerdo con el Esquema 3.
Las anilinas de la Fórmula II, en donde R es -COOH se pueden sintetizar de acuerdo con el Esquema 4.
Esquema 4 (CHO)n. MgClj, TEA BnCI, K2C03 NaBHj SQCI2 CH3CN DMF EIOH CHjCta OH OH OBn 1 2 3 4 KCN H2, Pd(OH)2/C CICOOMe. DMAP DMF DMF MeOH,10Ps¡ DIEA, CH2Cf2 OBn CN CN OBn 5 6 15 US O S Y METODO S DE US O Composiciones farmacéuticamente aceptables En un aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables, en donde estas composiciones comprenden cualquiera de los compuestos como se describe en la presente, y opc ionalmente comprenden un vehículo, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, estas composiciones comprenden además opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales .
También se debe apreciar que ciertos de los compuestos de la presente invención pueden existir en forma libre para el tratamiento, o cuando sea adecuado, como un derivado farmacéuticamente aceptable o un profármaco del mismo. De acuerdo con la presente invención, un derivado farmacéuticamente aceptable o un profármaco incluye, de manera enunciativa, sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, sales de estos ésteres, o cualquier otro aducto o derivado que con la administración a un paciente que necesite del mismo, sea capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto como se describe de otra manera en la presente, o un metabolito o residuo del mismo.
En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "sal farmacéuticamente aceptable" hace referencia a aquellas sales que son, dentro del alcance del criterio médico, adecuadas para utilizarse en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y lo semejante, indebidas, y están de acuerdo con una proporción beneficio/riesgo razonable. Una "sal farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal no tóxica o sal de un éster de un compuesto de esta invención que, cuando se administra a un recipiente, sea capaz de proporcionar, ya sea directa o indirectamente, un compuesto de esta invención o un metabolito inhibidoramente activo o residuo del mismo .
Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S. . Berge, et al describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences , 1977, 66, 1-19, incorporado en la presente como referencia. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen aquellas adecuadas derivadas de ácidos y bases inorgánicas y orgánicas. Los ejemplos de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, no tóxicas son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o al utilizar otros métodos utilizados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencensul fonato , benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato , citrato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodec i lsul fato , edisilato ( etandisul fonato ) , etansul fonato , formiato, fumarato, glucoheptonato , glicerofosfato , gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi - etansul fonato , lactobionato , lactato, laurato, lauri lsul fato , malato, maleato, malonato, metansulfonato , 2 -naf talensulfonato , nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3 - fenilpropionato , fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p - toluensulfonato , undecanoato, sales de valerato, y lo semejante. Las sales derivadas de bases adecuadas incluyen sales de metal alcalino, de metal alcalinotérreo , de amonio y N+ ( Ci-4alqui lo ) 4. Esta invención también contempla la quaternización de cualesquiera grupos que contienen nitrógeno básico de los compuestos descritos en la presente. Los productos solubles o dispersables en agua o aceite se pueden obtener mediante esta quaternización. Las sales representativas de metal alcalino o alcalinotérreo , incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y lo semejante. Las sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea adecuado, cationes no tóxicos adecuados de amonio, de amonio cuaternario y de amina formados utilizando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior y sulfonato de arilo.
Como se describió anteriormente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención comprenden adic ionalmente un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, el cual, en el sentido en que se utiliza en la presente, incluye cualquiera y todos los solventes, diluyentes, u otro vehículo líquido, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensoactivos , agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservadores, aglutinantes sólidos, lubricantes y lo semejante, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington' s Pharmaceut ical Sciences, Décima Sexta Edición, E. . Martin (Mack Publishing Co . , Easton, Pa . , 1980) expone diversos portadores utilizados para formular las composiciones farmacéuticamente aceptables y las técnicas conocidas para la preparación de los mismos. Excepto en la medida en que el medio portador convencional sea incompatible con los compuestos de la invención, tal como al producir cualquier efecto biológico indeseable o de otra manera interactúe de una forma perjudicial con cualesquiera otros componentes de la composición farmacéuticamente aceptable, se contempla que su uso queda dentro del alcance de esta invención. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadors farmacéuticamente aceptables incluyen, de manera enunciativa, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias amortiguadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, o sorbato de potasio, mezclas de glicérido parcial de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrólitos, tales como sulfato de protamina, fosfato dibásico de sodio, fosfato dibásico de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos , ceras, polímeros en bloque de pol iet i leno - o1 ioxi et i leno , grasa de lana, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa, almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa, celulosa y sus derivados tales como carboximet ilcelulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa, tragacanto en polvo, malta, gelatina, talco, excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorio, aceites tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí; aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya, glicoles; tales como propilen glicol o polietilen glicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores; tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógejios; solución salina isotónica,- solución de Ringer; alcohol etílico, y soluciones amortiguadoras de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de desmoldeo, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, también pueden estar presentes en la composición conservadores y antioxidantes, de acuerdo con el criterio del formulador.
Usos de los compuestos y composiciones farmacéuticamente aceptables En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una condición, enfermedad o trastorno implicados por la mutación el CFTR. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para tratar una condición, enfermedad o trastorno implicados por una deficiencia de la actividad del CFTR, el método comprende administrar una composición que comprende un compuesto de la Fórmula I a un sujeto, de preferencia un mamífero, que necesita del mismo.
En otro aspecto, la invención también proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente, y la enfermedad se selecciona de fibrosis quística, asma, COPD inducida por fumar, bronquitis crónica, rinosinusi tis , estreñimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina provocada por ausencia bilateral congénita de los conductos deferentes (CBAVD) , enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) , enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de fibrinolisis en la coagulación, tales como deficiencia de la proteina C, angioedema hereditario Tipo 1, deficiencias en el procesamiento de lípidos, tales como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia Tipo 1, abetal ipoprote inemia , enfermedades por depósito lisosomal, tales como la enfermedad de células I/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis , Sandhof /Tay-Sachs , Crigler- Najjar tipo II, poliendocrinopat ía/hiperinsulemia , Diabetes mellitus, enanismo Laron, deficiencia de mileoperoxidasa , hipoparat iroidismo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipof ibrinogenemia hereditaria, deficiencia por ACT, diabetes insípida (DI), DI neurofiseal, DI neprogénica, síndrome de Charcot -Marie Tooth, enfermedad de Perlizaeus-Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como ,1a enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, Plasy supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos por pol iglutamina tales como la enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, dentatorúbrica palidoluisiana, y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como la enfermedad de Creutzfeldt- Jakob hereditaria (debido a un defecto en el procesamiento de la proteína prión) , enfermedad de Fabry, síndrome Straussler- Scheinker , COPD, enfermedad de queratoconj unt ivit is seca, o enfermedad de Sjogren, osteoporosis , osteopenia, cicatrización ósea y crecimiento óseo (incluyendo reparación ósea, regeneración ósea, reducción de la reabsorción ósea y aumento de la deposición ósea) , síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro tales como miotonía congénita (formas de Tomson y Becker) , síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent , hiperecplexia , epilepsia, hiperecplexia , enfermedad por depósito lisosomal, síndrome de Angelman, y Discinesia Ciliar Primaria (PCD ), un término para los trastornos hereditarios de la estructura y/o función de los cilios, incluyendo la PCD con situs inversus (también conocida como síndrome de Kartagener) , la PCD sin situs inversus y aplasia ciliar .
En algunas modalidades, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En ciertas modalidades, el paciente posee formas mutantes del CFTR humano. En otras modalidades, el paciente posee una o más de las siguientes mutaciones AF508, R117H, y G551D del CFTR humano. En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación AF508 del CFTR humano que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D del CFTR humano que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación AF508 del CFTR humano en al menos un alelo que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación ??508 del CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D del CFTR humano en al menos un alelo que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D del CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente .
En algunas modalidades, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En ciertas modalidades, el paciente posee las formas mutantes del CFTR humano. En otras modalidades, el paciente posee una o más de las siguientes mutaciones AF508, R117H, y G551D del CFTR humano. En una modalidad, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación AF508 del CFTR humano que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D del CFTR humano que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación AF508 del CFTR humano en al menos un alelo que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación AF508 del CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D del CFTR humano en al menos un alelo que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente. En una modalidad, el método incluye disminuir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación mutación G551D del los CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar al paciente una de las composiciones como se define en la presente .
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de la osteoporosis en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para tratar o disminuir la gravedad de la osteoporosis en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente .
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de la osteopenia en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para tratar o disminuir la gravedad de la osteopenia en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para la cicatrización ósea y/o reparación ósea en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para la cicatrización ósea y/o reparación ósea en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para reducir la resorción ósea en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para aumentar la deposición ósea en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para aumentar la deposición ósea en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de la COPD en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para tratar o disminuir la gravedad de la COPD en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de la COPD inducida por fumar en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para tratar o disminuir la gravedad de la COPD inducida por fumar en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente .
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de la bronquitis crónica en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto de la Fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades, el método para tratar o disminuir la gravedad de la bronquitis crónica en un paciente comprende administrar al paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente .
De acuerdo con una modalidad alternativa preferida, la presente invención proporciona un método para tratar la fibrosis quística que comprende el paso de administrar al mamífero una composición que comprende un compuesto de la presente invención.
De acuerdo con la invención, una "cantidad efectiva" del compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable es aquella cantidad efectiva para tratar o disminuir la gravedad de uno o más enfermedades, trastornos o condiciones como se mencionaron anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para administrar una composición farmacéutica al administrar oralmente a un paciente al menos una vez al día la composición que comprende un compuesto de la Fórmula 1. En una modalidad, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula 1 cada 24 horas. En otra modalidad, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula 1 cada 12 horas. En otra modalidad, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula 1 tres veces al día. Todavía en otra modalidad, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula 1 cada 4 horas .
Los compuestos y composiciones, de acuerdo con el método de la presente invención, se pueden administrar utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para tratar o disminuir la gravedad de una o más enfermedades, trastornos o condiciones como se mencionaron anteriormente.
En ciertas modalidades, los compuestos y composiciones de la presente invención son útiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes que exhiben una actividad residual del CFTR en la membrana apical de los epitelios respiratorios y no respiratorios. La presencia de la actividad residual del CFTR en la superficie epitelial se puede detectar fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas, electrof isiológicas , bioquímicas, o histoquímicas estándar. Estos métodos identifican la actividad del CFTR utilizando técnicas electrof isiológicas in vivo o ex vivo, la medición del sudor o las concentraciones de Cl" en la saliva, o técnicas bioquímicas o histoquímicas ex vivo para supervisar la densidad de la superficie celular. Al utilizar estos métodos, se puede detectar fácilmente la actividad residual del CFTR en pacientes heteroc igotos u homocigotos para una variedad de diferentes mutaciones, incluyendo los pacientes homocigotos o heterocigotos para la mutación más común, AF508.
En otra modalidad, los compuestos y composiciones de la presente invención son útiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes que tienen una actividad residual del CFTR inducida o aumentada utilizando métodos farmacológicos o de terapia génica. Estos métodos aumentan la cantidad del CFTR presente en la superficie celular, induciendo con esto una actividad hasta ahora ausente del CFTR en un paciente o aumentando el nivel existente ( de la actividad residual del CFTR en un paciente.
En una modalidad, los compuestos y composiciones de la presente invención son útiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes dentro de ciertos genotipos que exhiben actividad residual del CFTR, por ejemplo, las mutaciones clase III (una regulación o activación deficiente), mutaciones clase IV (conductancia alterada) o las mutaciones clase V (síntesis reducida) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Tansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportuni ties of Therapy; Current Opinión in Pulmonary Medicine 6:521-529, 2000) . Otros genotipos de pacientes que exhiben actividad residual del CFTR incluyen pacientes homocigotos para una de estas clases o heterocigotos con cualquier otra clase de mutaciones, incluyendo las mutaciones clase I, las mutaciones clase II, o una mutación que carece de clasificación.
En una modalidad, los compuestos y composiciones de la presente invención son útiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes dentro de ciertos fenotipos clínicos, por ejemplo, un fenotipo clínico moderado a leve que se correlaciona típicamente con la cantidad de la actividad residual del CFTR en la membrana apical de los epitelios. Estos fenotipos incluyen pacientes que exhiben insuficiencia pancreática o pacientes con diagnóstico de pancreatitis idiopática y ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, o enfermedad pulmonar leve.
La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y estado general del sujeto, la gravedad de la infección, el agente particular, su modo de administración, y lo semejante. Los compuestos de la invención se formulan de preferencia en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La expresión "forma de dosificación unitaria", en el sentido en que se utiliza en la presente, se refiere a una unidad físicamente discreta de un agente adecuado para el paciente que será tratado. Sin embargo, se debe entender que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención se decidirá por el médico tratante dentro del alcance del criterio médico. El nivel específico de dosis efectiva para cualquier paciente u organismo particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el trastorno que será tratado y la gravedad del trastorno, la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración, y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento, los fármacos utilizados en combinación o en coincidencia con el compuesto específico empleado, y los factores bien conocidos en las técnicas médicas. El término "paciente", en el sentido en que se utiliza en la presente, significa un animal, de preferencia un mamífero, y de mayor preferencia un ser humano.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se pueden administrar a seres humanos y otros animales oral, rectal, parenteral, intracisternal , intravaginal , intraperitoneal , tópica (como mediante polvos, pomadas, gotas o parches) , bucalmente, como un aerosol oral o nasal, o lo semejante, dependiendo de la gravedad de la infección que será tratada. En ciertas modalidades, los compuestos de la invención se pueden administrar oral o parenteralmente a niveles de dosificación entre aproximadamente 0.01 mg/kg y 50 mg/kg y de preferencia entre aproximadamente 0.5 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal del sujeto al día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Las formas líquidas de dosificación para administración oral incluyen, de manera enunciativa, emulsiones, microemulsiones , soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas líquidas de dosif icacións pueden contener diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropí lico , carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1,3-butilenglicol , dimet i 1 formamida , aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de nuez molida, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de ajonjolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurí lico , polietilenglicoles y ésteres de sorbitán con ácido graso, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butandiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear se encuentran: agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convenc ionalmente aceites grasos estériles como un medio solvente o de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite graso insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de soluciones inyectables se utilizan ácidos grasos tales como ácido oleico.
Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro para retención de bacterias, o incorporar agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de utilizarse.
Con el fin de prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, con frecuencia es conveniente reducir la absorción del compuesto de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede alcanzar mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del compuesto entonces depende de su velocidad de disolución lo cual, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de compuesto administrado parenteralmente se lleva a cabo al disolver o suspender el compuesto en un vehículo oleoso. Las formas inyectables de depósito se producen al formar matrices microencapsuladas del compuesto en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido . Dependiendo de la proporción de compuesto a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del compuesto. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres) y poli (anhídridos ) . Las formulaciones de depósito inyectables también se preparan al atrapar del compuesto en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con los tejidos corporales .
Las composiciones para administración rectal o vaginal de preferencia son supositorios que se se pueden preparar al mezclar los compuestos de esta invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, poliet ilenglicol o una cera para supositorio que sean sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo .
Las formas sólidas de dosificación para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y granulos. En estas formas sólidas de dosificación, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte, farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) materiales de relleno o expansores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa, y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de solución tales como parafina, f) aceleradores de absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, tabletas y pildoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes amortiguadores.
Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como material de relleno en cápsulas rellenas de gelatina suave y dura al utilizar excipientes como lactosa o azúcar láctea, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y lo semejante. Las formas sólidas de dosificación de las tabletas, grageas, cápsulas, pildoras, y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Los mismos opcionalmente pueden contener agentes opacif icantes y también pueden ser de una composición que los mismos liberen los ingredientes activos únicamente, o de preferencia, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como materiales de relleno en cápsulas rellenas de gelatina suave y dura, al utilizar excipientes tales como lactosa o azúcar láctea, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y lo semejante.
Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes como se señaló anteriormente. Las formas sólidas de dosificación de las tabletas, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos para control de liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En estas formas sólidas de dosificación el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Estas formas de dosificación también pueden comprender, como es la práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para formación de tabletas y otros auxiliares para formación de tabletas tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina . En el caso de las cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes amortiguadores. Los mismos opcionalmente pueden contener agentes opacif icantes y también pueden ser de una composición que los mismos liberen los ingredientes activos únicamente, o de preferencia, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente , de una manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualesquiera conservadores o tampones necesarios según se pueda requerir. También se contemplan dentro del alcance de esta invención formulaciones oftálmicas, gotas para los oídos y gotas para los ojos. Adicionalmente , la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos , que tienen la ventaja agregada de proporcionar un suministro controlado de un compuesto al cuerpo. Estas formas de dosificación se preparan al disolver o despachar el compuesto en el medio adecuado. También se pueden utilizar intensif icadores de absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad se puede controlar ya sea al proporcionar una membrana para control de la velocidad o al dispersar el compuesto en una matriz polimérica o gel.
La actividad de un compuesto utilizado en esta invención como un modulador del CFTR se puede analizar de acuerdo con los métodos descritos en general en la técnica y en los Ejemplos en la presente .
También se apreciará que los compuestos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden emplear en terapias de combinación, es decir, los compuestos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar concurrentemente con, antes o después de uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. La combinación particular de terapias (terapias o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación tomará en cuenta la compatibilidad de los terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se alcanzará. También se apreciará que las terapias empleadas pueden alcanzar un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invención se puede administrado concurrentemente con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno) , o pueden alcancar distintos efectos (por ejemplo, el control de cualesquiera efectos adversos) . En el sentido en que se utiliza en la presente, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad o condición particular, se conocen como "adecuados para la enfermedad o condición que se está tratando . " En una modalidad, el agente adicional se selecciona de un agente mucolítico, un broncodilatador , un antibiótico, un agente antiinfeccioso, un agente ant i - inflamatorio , un modulador del CFTR que sea distinto de un compuesto de la presente invención, o un agente nutricional.
En una modalidad, el agente adicional es un antibiótico. Los antibióticos útiles ilustrativos en la presente incluyen tobramicina, incluyendo polvo de tobramicina inhalada (TIP) , azitromicina , aztreonam, incluyendo la forma en aerosol de aztreonam, amikacina, incluyendo las formulaciones liposomales de los mismos, c iprof loxacina , incluyendo las formulaciones de la misma, adecuadas para administración mediante inhalación, levof laxacina , incluyendo las formulaciones en aerosol de la misma, y combinaciones de dos antibióticos, por ejemplo, fosfomicina y tobramicina.
En otra modalidad, el agente adicional es un mucolítico. Los mucolíticos ilustrativos útiles en la presente incluyen Pulmozyme®.
En otra modalidad, el agente adicional es un broncodilatador . Los broncodialtores ilustrativos incluyen albuterol, sulfato de metaprotenerol , acetato de pirbuterol, salmeterol, o sulfato de tetrabulina .
En otra modalidad, el agente adicional es eficaz para restaurar el líquido superficial de las vías respiratorias del pulmón. Estos agentes mejoran el movimiento de la sal dentro y fuera de las células, permitiendo que la mucosidad en las vías respirato ias del pulmón sea más hidratada y, por tanto, se limpie más fácilmente. Los agentes ilustrativos incluyen solución salina hipertónica, fosfato ácido de ( [ [ ( 3S , 5R) - 5 - ( 4 - amino - 2 -oxo irimidin - 1 - il ) - 3 - hidroxioxolan- 2 - il ] metoxi -hidroxifosforil] [ [ [ (2R,3S,4R,5R) -5- (2,4-dioxopirimidin- 1 - il ) -3,4 -dihidroxioxolan- 2 - il ] metoxi -hidroxifosforil] oxi -hidroxifosforilo] ) denufosol tetrasódico, o bronquitol (formulación inhalada de manitol) .
En otra modalidad, el agente adicional es un agente ant i - inflamatorio , es decir, un agente que puede reducir la inflamación en los pulmones. Los agentes ilustrativos útiles en la presente incluyen ibuprofeno, ácido docosahexanoico (DHA) , sildenafil, glutatión inhalado, piogli tazona , hidroxic loroquina , o simavastat ina .
En otra modalidad, el agente adicional es un modulador del CFTR distinto del compuesto 1, es decir, un agente que tiene el efecto de modular la actividad del CFTR. Estos agentes ilustrativos incluyen ataluren ("PTC 124®", ácido 3- [5- (2-fluorofenil) - 1 , 2 , - oxadiazol - 3 - il ] enzoico ) , sinapultide, lancovutide, depelestat (un inhibidor de neutróf ilo elastasa recombinante humana) , cobiprostona (ácido 7-{(2R, 4aR, 5R, 7aR) - 2 - [ ( 3S ) -l,l-difluoro-3-metilpentil]-2 -hidroxi - 6 -oxooctahidrociclopenta [b] piran- 5 - il }heptanoico) , o ácido (3- (6- (1- (2 , 2-dif luorobenzo [d] [ 1 , 3 ] dioxol - 5 - il ) ciclopropancarboxamido) -3-metilpiridin-2-il) benzoico. En otra modalidad, el agente adicional es ácido (3- (6- (1- (2 , 2-dif luorobenzo [d] [ 1 , 3 ] dioxol - 5 -il) ciclopropancarboxamido) - 3 -met i lpiridin- 2 -i 1 ) benzoico .
En otra modalidad, el agente adicional es un agente nutricional. Estos agentes ilustrativos incluyen pancrelipasa (reemplazo de la enzima pancreat izante ) , incluyendo Pancrease®, Pancreacarb® , Ultrase®, o Creon®, Liprotornase® (anteriormente Trizytek®) , Aquadeks®, o inhalación de glutatión. En una modalidad, el agente nutricional adicional es pancrel ipasa .
La cantidad del agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la cantidad que normalmente se podría administrar en una composición que comprende ese agente terapéutico como el único agente activo. De preferencia, la cantidad del agente terapéutico adicional en las composiciones actualmente descritas variará entre aproximadamente 50% y 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende el agente como el único agente terapéuticamente activo.
Los compuestos de esta invención o las composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos también se pueden incorporar en las composiciones para el recubrimiento de un dispositivo médico implantable, tal como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, endoprótesis y catéteres. Por consiguiente, la presente invención, en otro aspecto, incluye una composición para el recubrimiento de un dispositivo implantable que comprende un compuesto de la presente invención como se describió en general, anteriormente, y en las clases y subclases en la presente, y un portador adecuado para el recubrimiento del dispositivo implantable. Todavía en otro aspecto, la presente invención incluye un dispositivo implantable recubierto con una composición que comprende un compuesto de la presente invención como se describió en general, anteriormente, y en las clases y subclases en la presente, y un portador adecuado para el recubrimiento del dispositivo implantable. Los recubrimientos adecuados y la preparación general de los dispositivos implantables recubiertos se describen en las patentes de los Estados Unidos 6,099,562, 5,886,026, y 5,304,121. Los recubrimientos típicamente son materiales poliméricos biocompatibles tales como un polímero de hidrogel, polimet ildisiloxano , policaprolactona , polietilenglicol, ácido poliláctico, acetato etilen vinílico y mezclas de los mismos. Los recubrimiento, opcionalmente se pueden recubrir por una capa adecuada de f luorosilicona , polisacáridos , polietilenglicol, fosfolípidos o combinaciones de los mismos para impartir características de liberación controlada en la composición.
Otro aspecto de la invención se relaciona con la modulación de la actividad del CFTR en una muestra biológica o un paciente (por ejemplo, in vitro o in vivo) , el método comprende administrar al paciente, o poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la Fórmula I o una composición que comprende el compuesto. El término "muestra biológica" , en el sentido en que se utiliza en la presente, incluye, sin limitación, cultivos celulares, o extractos de los mismos, material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos del mismo, y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas, u otros fluidos corporales o extractos de los mismos .
La modulación del CFTR en una muestra biológica es útil para una variedad de propósitos que se conocen por alguien con experiencia en la técnica. Los ejemplos de estos propósitos incluyen, de manera enunciativa, el estudio del CFTR en fenómenos biológicos y patológicos; y la evaluación comparativa de los moduladores novedosos del CFTR.
Todavía en otra modalidad, se proporciona un método para modular la actividad de un canal aniónico in vitro o in vivo, que comprende el paso de poner en contacto el canal con un compuesto de la Fórmula I.
En modalidades preferidas, el canal aniónico es un canal de cloruro o un canal de bicarbonato. En otras modalidades preferidas, el canal aniónico es un canal de cloruro.
De acuerdo con una modalidad alternativa, la presente invención proporciona un método para aumentar el número del CFTR funcional en una membrana de una célula, que comprende el paso de poner en contacto la célula con un compuesto de la Fórmula I.
De acuerdo con otra modalidad preferida, la actividad del CFTR se mide al medir el potencial de voltaje t ansmembrana. Los medios para medir el potencial de voltaje a través de una membrana en la muestra biológica pueden emplear cualesquiera de los métodos conocidos en la técnica, tales como el análisis potencial de la membrana óptica u otros métodos electrof isiológicos .
El análisis del potencial de membrana óptica utiliza detectores FRET sensibles al voltaje descritos por González y Tsien (Véase, González, J. E. y R. Y. Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells." Biophys J 69(4) : 1272-80, y González, J. E. y R. Y. Tsien (1997); "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer" Che Biol 4(4) : 269-77) en combinación con la instrumentación para medir los cambios de fluorescencia tales como el Lector de Soluciones de Ensayo Voltaje/Ion (VIPR) (Véase, González, J. E., K. Oades, et al. (1999) "Cell-based assays and ins trumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4 (9) : 431-439) .
Estos análisis sensibles al voltaje se basan en el cambio en la transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET) entre el tinte sensible al voltaje, soluble en la membrana, DiSBAC2(3), y un fosfolípido fluorescente, CC2-DMPE, que se une a la laminilla externa de la membrana plasmática y actúa como un donador de FRET. Los cambios en el potencial de la membrana (Vm) provocan que el DiSBAC2(3) con carga negativa se redistribuya a través de la membrana plasmática y por consiguiente cambia la cantidad de transferencia de energía desde CC2-DMPE. Los cambios en la emisión de fluorescencia se pueden supervisar utilizando VIPR™ II, que es un controlador integrado de líquidos y detector de fluorescencia diseñado para llevar a cabo selecciones de base ceular en placas microtituladoras de 96 o 384 cavidades .
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la estructura: H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto de la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente, y la enfermedad se selecciona de fibrosis quística, asma, COPD inducida por fumar, bronquitis crónica, rinosinusi t is , estreñimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina provocada por ausencia bilateral congénita de los conductos deferentes (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) , enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de fibrinolisis en la coagulación, tales como deficiencia de la proteína C, angioedema hereditario Tipo 1, deficiencias en el procesamiento de lípidos, tales como hipercolesterolemia familiar, qui lomicronemia Tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades por depósito lisosomal, tales como la enfermedad por células i/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis , Sandhof /Tay-Sachs , Crigler- Naj j ar tipo II, poliendocrinopatia/hiperinsulemia , diabetes mellitus, enanismo Laron, deficiencia de mileoperoxidasa , hipoparat iroidismo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipof ibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, Diabetes insípida (DI), DI neurofiseal, DI neprogénica, síndrome de Charcot -Marie Tooth, enfermedad Perlizaeus -Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, plasy supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos por pol iglutamina tales como Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, palidoluisiana dentatorúbrica , y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como enfermedad de Creutzfeldt - Jakob hereditaria (debida a un defecto en el procesamiento de la proteína prión) , enfermedad de Fabry, síndrome de St aussler- Scheinker , COPD, enfermedad de queratoconj unt ivitis seca o enfermedad de Sjogren.
En una modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente al administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, el método incluye tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente al administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una modalidad adicional, la enfermedad es fibrosis quística.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para utilizarse en medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en una muestra biológica in vitro o in vivo, que comprende: (i) una composición que comprende un compuesto de la Fórmula I o cualquiera de las modalidades anteriores, y (ii) las instrucciones para: a) poner en contacto la composición con la muestra biológica y b) medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo.
En una modalidad, el kit comprende además las instrucciones para: a) poner en contacto una composición adicional con la muestra biológica; b) medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional, y c) comparar la actividad del CFTR en presencia del compuesto adicional con la densidad del CFTR en presencia de una composición de la Fórmula I.
En modalidades preferidas, el kit se utiliza para medir la densidad del CFTR.
En una modalidad, el kit incluye una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura : H I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una modalidad, el kit incluye una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura : H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; Con el fin de que la invención descrita en la presente se pueda comprender mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos son sólo para fines ilustrativos y no se deben considerar como limitantes de la invención de ninguna forma.
EJEMPLOS Preparación 1: Síntesis total del ácido 4 - oxo -1,4 dihidroquinol in-3 - carboxíl ico (26 ) "i .0 _ NH, 100-110°C fenil éter 228-232°C o 22 23 24 O O HCI/H20 OEt ^>H Método 2 H 1. 2N NaOH 25 2. 2N HCI 26 Procedimiento para la preparación de 4 - oxo -1,4-dihidroquinol in- 3 -carboxíl ato de etilo (25) o o ' O O ^ NH ^'^ Vo |-- + JL 2 oo-iio°c t NH fenil éter _ loí^ '^Y^OEt H O 22 23 24 25 El compuesto 23 (4.77 g, 47.7 mmol) se agregó gota a gota al compuesto 22 (10 g, 46,3 mmol) con el flujo de N2 subsuperf icial para llevar al etanol a menos de 30°C durante 0.5 horas. La solución luego se calentó a 100-110°C y se agitó durante 2.5 horas.
Después de enfriar la mezcla a menos de 60°C, se agregó difenil éter. La solución resultante se agregó gota a gota al difenil éter que se había calentado a 228-232°C durante 1.5 horas con un flujo de N2 subsuperf icial para expulsar el etanol . La mezcla se agitó a 228-232°C durante 2 horas adicionales, se enfrió a menos de 100°C y luego se agregó heptano para precipitar el producto. La suspensión resultante se agitó a 30°C durante 0.5 horas. Los sólidos luego se filtraron, y la torta se lavó con heptano y se secó in vacuo para proporcionar el compuesto 25 como un sólido marrón. 1H RMN (DMSO-d6; 400 Hz) 612.25 (s) , 58.49 (d) , 58.10 (m) , 57.64 (m) , 57.55 (m) , 57.34 (m) , 54.16 (q) , 5 1.23 (t) .
Procedimiento para la preparación del ácido 4-oxo 1,4 -dihidroquinolin- 3 -carboxílico (26 ) Método 1 Método 2 H 1. 2N NaOH H 25 2. 2N HCI 26 Método 1 El compuesto 25 (1.0 eq) se suspendió en una solución de HCI (10.0 eq) y H20 (11.6 vol) . La suspensión se calentó a 85-90°C, aunque para este paso de hidrólisis también son adecuadas temperaturas alternativas. Por ejemplo, la hidrólisis alternativamente se puede realizar a una temperatura entre aproximadamente 75 y 100°C. En algunos casos, la hidrólisis se realiza a una temperatura entre aproximadamente 80 y 95°C. En otros casos, el paso de hidrólisis se realiza a una temperatura entre aproximadamente 82 y 93°C (por ejemplo, entre aproximadamente 82.5 y 92.5°C o entre aproximadamente 86 y 89°C) . Después de agitar a 85-90°C durante aproximadamente 6.5 horas, la reacción se muestreó para completar la reacción. La agitación se puede realizar a cualquiera de las temperaturas adecuadas para la hidrólisis. La solución luego se enfrió a 20-25°C y se filtró. El reactor/ torta se lavó con H20 (2 vol x 2) . La torta luego se lavó con 2 vol H20 hasta el pH >3.0. La torta luego se secó al vacío a 60°C para proporcionar el compuesto 26.
Método 2 El compuesto 25 (11.3 g, 52 mmol) se agregó a una mezcla de NaOH al 10% (aq) (10 mi) y etanol (100 mi) . La solución se calentó a reflujo durante 16 horas, se enfrió a 20-25°C y luego el pH se ajustó a 2-3 con HC1 al 8%. La mezcla luego se agitó durante 0.5 horas y se filtró. La torta se lavó con agua (50 mi) y luego se secó in vacuo para proporcionar el compuesto 26 como un sólido marrón. ?? RMN (DMSO-dg; 400 Hz) 615.33 (s) , 613.39 (s) , 58.87 (s) , 68.26 (m) , 67.87 (m) , 67.80 (m) , 67.56 (m) .
Ejemplo 1; Síntesis total de N- ( 2 - ter-bu ti 1 - 5 -hidroxi -4 - ( 1 -hidroxi - 2 -metilpropan- 2 - i 1 ) fenil ) -4 -oxo -1,4 -dihidroquinolin- 3 -carboxamida (27 ) El Esquema general de la síntesis del compuesto 27 se muestra a continuación, seguido por el procedimiento para la síntesis de cada intermediario sintético. 10 CICOOMe CH2CI2 11 12 13 1 2 A una solución agitada del compuesto 1 (700 g, 4.66 mol) en CH3CN (7.0 L) se agregó MgCl2 (887 g, 9.32 mol), Para- formaldehído (1190 g) y TEA (2.5 L, 17.9 mol) bajo N2. La mezcla se calentó a reflujo durante 5 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agregaron a la mezcla 2L de agua helada, seguida por 6 L de HC1 3M (aq) . La suspensión se dejó en agitación hasta que la solución se tornó clara. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con MTBE (3 LX3) . Las capas orgánicas se combinaron y se concentraron a sequedad. El residuo se disolvió en MTBE (4000 mi), se lavó con agua (1000 mLx2 ) y salmuera (1000 mL) , se secó sobre Na2S04( se filtró, luego se concentró para proporcionar el compuesto 2 como un sólido amarillo claro que se utilizó en la siguiente reacción sin secado o purificación adicional. 1H RMN (CDC13, 400 Hz) d 10.86 (s) , 59.89 (s), 57.59 (m) , 57.51 (d) , 56.94 (d) , 510.61 ( s) .
Procedimiento para la preparación de 2 - (benciloxi ) - 5 -ter-butilbenzaldehído (3) 2 3 A una solución agitada del compuesto 2 (614.5 g, 3.33 mol) en DMF (3.5 L) se agregó K2C03 (953 g, 6.90 mol) y cloruro de bencilo (480 g, 3.80 mol) . La mezcla se calentó a 90°C y se dejó en agitación durante 3 horas. La suspensión se enfrió a temperatura ambiente, luego se agregó MTBE (2 L) , seguido por agua (12 L) . La mezcla luego se agitó durante 10 minutos y la capa acuosa se separó y se extrajo con MTBE (2 LX3) . Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua (2 LX2) y salmuera (1.5 Lxl) y se concentraron para proporcionar el compuesto 3 como un sólido amarillo claro. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) d 10.42 (s), 57.71 (m) , 57.51 (m) , 57.43 (m) , 57.35 (m) , 57.24 (mí, 55.27 (s) , 51.26 (s) .
Procedimiento para la preparación (benciloxi ) -5- ter-butilbencílico (4 ) OBn OBn 3 4 A una suspensión agitada del compuesto 3 (974 g, 3.63 mol) en MeOH (4000 mi) se agregó lentamente NaBH4 (121 g, 3.20 mol) a 0-20°C. La solución luego se dejó en agitación a 15°C durante 3 horas, y luego se enfrió a 0°C. 2N HCl (aq) (1300 mi) se agregó gota a gota a menos de 20°C. La solución se filtró y se evaporó a sequedad, y el residuo se disolvió en MTBE (5 L) . La solución luego se lavó con agua (2 Lx2) y salmuera (1.5 Lxl) . La evaporación del solvente proporcionó el compuesto 4 como un sólido amarillo claro que se utilizó en la siguiente reacción sin purificación adicional. ^"H RMN (DMSO-d6< 400 MHz) 57.40 (m), 57.32 (m) , 57.17 (m) , 66.91 (m) , d 5.09 (s) , 55.00 (t), 54.56 (d) , d 1.26 (s) .
Procedimiento para la preparación de cloruro de 2-(benciloxi ) - 5 - ter-butilbencilo (5) A una solución agitada del compuesto 4 (963 g, 3.56 mol) en DCM anhidro (2000 mi) se agregó lentamente SOCl2 (535 g, 4.5 mol) a 0°C. La mezcla luego se agitó a 20°C durante 2 horas, luego se concentró in vacuo para proporcionar el compuesto 5 como un aceite, que se utilizó en la siguiente reacción sin secado o purificación adicional .
Procedimiento para la preparación de nitrilo de 2-(benciloxi ) -5- ter-butilbencilo (6) OBn OBn 5 6 A una solución agitada del compuesto 5 (1045 g, 3.54 mol) en DMF anhidra (1000 mi) se agregó KCN (733 g, 11.3 mol) . La mezcla se agitó a 35°C durante 24 horas, luego se vació en agua (10 L) . Se agregó acetato de etilo (4 L) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La capa orgánica luego se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3000 mL x 2) . Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua (4 Lx2) y salmuera (3 Lxl) , luego se concentraron in vacuo para proporcionar el compuesto 6 como un sólido amarillo. 1H RMN (DMS0-d6, 400 MHz) 67.51 (m) , 57.37 (m) , 7.02 (d) , 55.17 (s) , 53.88 (s) , 1.26 (s) .
Procedimiento para la preparación de 2- (2-(benciloxi ) - 5 -ter-butilfenil ) - 2 -metilpropanonitrilo 17) 6 7 A una suspensión agitada de NaH (86 g, 2.15 mol, 60% en aceite mineral) en DMF (1000 mi) se agregó gota a gota una solución del compuesto 6 (100.0 g, 0.358 mol) en DMF (500 mi) a 20°C. Después de agitar durante 30 minutos, se agregó gota a gota Mel (205 g, 1.44 mol) en DMF (500 mi) a menos de 30°C durante un período de 2 horas. La suspensión se agitó durante 1.5 horas a 25-30°C, luego se agregó lentamente hielo (100 g) hasta que ya no se generó gas. El pH se ajustó a aproximadamente 7 mediante la adición lenta de HC1 2N. La mezcla se diluyó con agua (4 L) y MTBE (2 L) . La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con MTBE (500 mLx2 ) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y luego se concentraron in vacuo para proporcionar el compuesto 7 como un sólido blanco. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 57.56 (m) , 57.40 (m) , 57.34 (m) , 57.10 (d) , 55.21 (s) , 51.73 (s), 51.27 (s) .
Procedimiento para la preparación de 2- (2-(benciloxi ) -5- ter-butilfenil ) - 2 -metilpropanal ( 8 ) A una solución agitada del compuesto 7 (20 g, 0.065 mol) en tolueno (300 mi) , se agregó gota a gota DIBAH (80 mi, 1 M en tolueno) a aproximadamente -60 a -50°C. Después de agitar durante 2 horas, a la mezcla de reacción se agregó HC1 6 N (300 mL) y se continuó la agitación durante 30 minutos. La capa orgánica luego se separó, se lavó con HC1 2 N seguido por una solución de NaHC03 , luego una solución de salmuera, se secó sobre Na2S0 y se concentró in vacuo para proporcionar el compuesto 8 como un aceite. El producto se utilizó en la siguiente reacción sin purificación adicional. 1H RMN (CDC13, 400 MHz) 69.61 (s) , 57.36 (m) , 67.25 (m) , 66.87 (m) , 65.06 (m) , 61.43 (S) , 61.33 (S) .
Procedimiento para la preparación de 2- (2-(benciloxi ) -5 - ter-butilfenil ) -2-metil-l-ol (9) 8 9 A una solución agitada del compuesto 8 (9.21 g, 0.030 mol) en MeOH (150 inL) se agregó lentamente NaBH4 (2.3 g, 0.061 mol) a 0°C. Después la mezcla se agitó a 20°C durante 3 horas, se agregaron 12 mL de HC1 6 N, y la mezcla se agitó durante 30 minutos adicionales. La solución luego se concentró a aproximadamente un cuarto del volumen original y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera, se secó con Na2S04, se filtró y luego se concentró in vacuo para proporcionar el compuesto 9 como un sólido blanco. 1H RMN (DMSO-dg; 400 Hz) d 7.47 (m), d 7.42 (m), d 7.34 (m) , 67.28 (m) , 57.16 (m) , 86.94 (m) , 55.08 (s), 54.45 (t), 53.64 (d) , 51,28 (s), d 1.25 (s) .
Procedimiento para la preparación de 2 - (2 -hidroxi - 5 -ter-butilfenil ) -2 -me til -l-ol (10) 10 Bajo hidrógeno se agitaron Pd(0H)2 (1 g) y el compuesto 9 (9.26 g, 0.030 mol) en MeOH (200 mL) a una presión de 20-30 psi durante 16-18 horas. La mezcla luego se filtró a través de Celite®, y el filtrado se concentró para proporcionar el compuesto 10 como un sólido blanco. 1H RMN (DMS0-d6, 400 MHz) 69.16 (s) , 57.16 (d) , 87.00 (m) , 86.65 (m) , 84.71 (t) , 83.62 (d) . 81,27 (s) , 81.22 (s) .
Procedimiento para la preparación de ( (metilcarboxi ) oxi ) - 2 - ( 1 - ( (metilcarboxi ) oxi ) -2 -metilpropan-2 -il ) -4 - ter-butil benceno (11) 1 CICOOMe í| *) OH ' T ° A una solución agitada del compuesto 10 (23.2 g, 0.10 mol) , DMAP (1.44 g) y DIEA (72.8 g, 0.56 mol) en DCM anhidro (720 mi) se agregó gota a gota cloroformiato de metilo (43.5 g, 0.46 mol) en DCM (160 mL) a 0°C. Después la mezcla se agitó a 20°C durante 16 horas, se lavó con agua, HCl 1 N y salmuera, se secó con MgS04 y se concentró in vacuo. El residuo se purificó utilizando cromatografía en columna sobre gel de sílice (1:20 EtOAc: Petróleo éter) para proporcionar el compuesto 11 como un sólido blanco. XH RMN (DMSO-d6, 400 MHz ) d 7.32 (m) , 67.10 (d) , 64.26 (s) , 63.84 (s) , 63.64 (s) , d 1.31 (s) , 61.28 (s) .
Procedimiento para la preparación ( (metilcarboxi ) oxi ) -2 - ( 1 - ( (metilcarboxi ) oxi ) -2 metilpropan-2 -il ) -4 -ter-butil - 5 -ni tro benceno A una solución agitada del compuesto 11 (32 g, 0.095 mol) en DCM (550 mi) se agregó gota a gota 98% de H2S04 (43 g, 0.43 mol) a 0°C. Después de agitar durante 20 minutos a 0°C, se agregó a la mezcla gota a gota a 0°C 65% de HN03 (16.2 g, 0.17 mol) . La mezcla luego se agitó a 1-10°C durante 4 horas y luego se agregó agua helada (200 mL) . La capa acuosa se separó y se extrajo con DCM (200 mL x 3) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (aq) , NaHC03 y salmuera, luego se secaron con MgS04 y se concentraron in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (1:20 EtOAc : Petróleo éter) para proporcionar el compuesto 12 crudo como un aceite.
Procedimiento para la preparación de 2 - ter-butil - 5 -( (metilcarboxi ) oxi ) -4 - ( 1 - ( (metilcarboxi ) oxi ) -2 -metllpropan- 2 - 11 ) anilina (13) 12 13 Pd/C (2.6 g) y el compuesto 12 (14 g, crudo) se agitaron en MeOH (420 mL) a temperatura ambiente bajo atmósfera de hidrógeno a una presión de 20-30 psi durante 16-18 horas. La mezcla luego se filtró con kieselguhr® , y el filtrado se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (1:10 EtOAc : Pe tróleo éter) para proporcionar el compuesto 13 como un sólido gris. 1H RMN (CDC13, 400 MHz) d 7.26 (s) , 67.19 (s) , 64.26 (s) , 63.89 (s) , 63.74 (s) , 61.40 (s) , 61.35 (s) .
Procedimiento para la preparación de N- (2 - ter-J util 5 - ( ( etilcarboxi ) oxi ) -4 - (1- ( (metilcarboxi ) oxi ) -2-metilpropan- 2 - il ) fenil ) - 4-oxo -1,4 - dihidroquinolin- 3 -carboxamida (14) A una solución agitada del compuesto 26 (5.0 g, 0.026 mol) en D F anhidra (120 mi) se agregó EDCI (5.6 g, 0.029 mol) , HOBT (3.8 g, 0.028 mol) y DIEA (6.6 g, 0.051 mol) a 0°C. Después de agitar durante 1 hora, la mezcla se agregó gota a gota una solución del compuesto 13 (3.0 g, 0.008 mol) en DCM (30 mi) a 0°C. La mezcla se agitó a 25°C durante 72 horas, y luego se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en EtOAc (225 mi) y se lavó con agua (120 mLxl ) , HC1 1N (120 mL) y salmuera, se secó con Na2S04 y se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (1:1 EtOAc : Pe tróleo éter) para proporcionar el compuesto 14 como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz , CDC13) d 12.34 (s, 1H) , 11.58 (s, 1H) , 9.07 (s, 1H) , 8.42 (d, 1H), 7.66 (s, 1H) , 7.51 (s, 1H) , 7.47 (s, 1H) , 7.39 (s, 1H) , 6.72 (S, 1H) , 4.34 (s, 2H) , 3.82 (s, 3H) , 3.74 (s, 3H) , 1.41 (s, 9H) , 1.40 (s, 6H) .
Procedimiento para la preparación de N- (2 - ter-J u til -5 -hidroxi -4 - ( 1 -hidroxi -2 -metilpropan-2 -il ) fenil ) -4 -oxo-1, -dihidroquinolin- 3 - carboxamida (27 ) A una solución agitada de KOH (1.2 g, 0.02 mol) en MeOH (80 mL) se agregó el compuesto 14 (1.9 g, 0.0036 mol) a 0°C. Después de agitar durante 2-3 horas a 5-15°C, la mezcla se concentró a sequedad. El residuo luego se trituró en agua (10 mi) , se filtró, se lavó con DCM y se secó in vacuo durante 24 horas para proporcionar el compuesto 27 como un sólido blanco. 1U RMN (DMS0-de, 400 MHz) d 12.77 (s) , 68.86 (s) , 68.20 (d) , 67.55 (d), 67.42 (t) , 67.16 (q) , 67.02 (S) , 66.85 (m) , 63.55 (s), 61.55 (s) , 61.35 (s), 61.27 (s) . MS encontrado (M + H) 409.2 Ejemplo 2 : Síntesis Alternativa Total de N- ( 2 -ter-butil - 5 -hidroxi -4- ( 1-hidroxi - 2 -m tilpropan- 2 -il ) fenil ) - 4 -oxo-1 , 4 -dihi droguinolin-3 - carboxamida (27) 12 13 38 Una mezcla de 2 -bromo- 4 - ter-but i 1 - 5 -nitrofenol (15.00 g, 54.72 mmol), bis (tri-ter-butilfosf ina) paladio ( 0 ) (1.422 g, 2.783 mmol), fluoruro de zinc (2.82 g, 27.27 mmol) , metil trimetilsilil dimetilqueten acetal (MTDA) (19.35 g, 111.0 mmol) y dimetilformamida (150 mi) se calentó a 70°C durante 18 h. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con agua. Después de agitar durante una hora, la fase acuosa se extrajo con MTBE . La fase orgánica se secó in vacuo para proporcionar el producto crudo como un sólido marrón. La purificación del producto se realizó mediante trituración en n-heptano. 1H - RMN (400 Hz, DMSO-d6) 510.38 (s, 1?) , 7.37 (s, 1H) , 6.79 (s, 1H) , 3.54 (s, 3H) , 1.45 (s, 6H ) , 1.32 (s, 9H) Procedimiento para la preparación de 4 - ter-J u til -2 -( 1 -hidroxi -2 -metilpropan-2 -il )- 5 -nitrofenol (39): Una solución 1M de hidruro de litio aluminio en THF (11.80 mL , 11.80 mmol) se agregó a una solución de 2 - ( 5 - ter-but il - 2 -hidroxi - 4 -ni trofenil ) - 2 -met i lpropanoato (5.36 g, 18.15 mmol) en THF (50 mi) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se diluyó con metanol . La mezcla se acidificó con HC1 1N (pH 1-2) y la fase acuosa se extrajo con MTBE . La fase orgánica se secó in vacuo para proporcionar 4 - ter-butil - 2 - ( 1 -hidroxi - 2 -met i lpropan- 2 - il ) - 5 -ni t rof enol que se utilizó sin purificación adicional en el siguiente paso. 1H-RMN (400 MHz, DMS0-d6) d ??.12 (s, 1H) , 7.37 (s, 1H) , 6.80 (S, 1H) , 4.77 (s, 1H) , 3.69-3.65 (m, 2H) , 1.30 (s, 9H) , 1.29 (s, 6H) Procedimiento para la preparación de carbonato de 4-ter-butil -2 - (2 -metoxi carboniloxi - 1 , 1 -dimetil -etil ) -5 -nitro - fenil ]metilo (12) A una solución de 4 - ter-butil - 2 - ( 1 - hidroxi - 2 -meti lpropan- 2 - i 1 ) - 5 - nitrofenol (1.92 g, 7.18 mmol), trietilamina (1.745 g, 17.24 mmol), y dimeti laminopiridina (87.74 mg, 0.718 mmol) en diclorometano (30 mL) a 0°C se cargó lentamente metilcloroformato (2.376 g, 25.14 mmol), manteniendo la temperatura a menos de 5°C. Después de la adición, la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó hasta que la HPLC mostró una conversión completa del material de partida (2-8 h) . La mezcla de reacción se diluyó con agua y se acidificó con HC1 1N (pH 1-2) . La fase acuosa se extrajo con DCM y los orgánicos combinados se secaron in vacuo. El semi-sólido ámbar crudo se re-cristalizó a partir de metanol y diclorometano para proporcionar el compuesto del título como un sólido cristalino amarillo. 1H - R N (400 MHz, DMS0-d6) d 7.67 (S, 1H) , 7.52 (S, 1H) , 4.30 (s, 2H) , 3.86 (s, 3H) , 3.64 (s, 3H) , 1.35 (s, 9H) , 1.35 (s, 6H) Procedimiento para la preparación de carbonato de 5 amino - 4 - ter -butil - 2 - (2 -metoxicarboniloxi -1,1 -dimetil -etil ) fenil ]metilo (13): 12 13 Una mezcla de carbonato de [4 - ter-but il - 2 - ( 2 -metoxicarboni loxi -1,1 - dime t i 1 -etil) -5-nitro -fenil] metilo (1.27 g, 3.313 mmol) y Pd/C (75 mg , 0.035 mmol) en metanol (50 mi) se purgó con nitrógeno. Después de purgar el matraz con hidrógeno, la mezcla se hidrogenó durante 18 horas a temperatura ambiente y a presión. La solución se filtró a través de Celite® y se secó in vacuo para obtener el producto como un sólido. XH-RMN (400 MHz, 0MS0-d5) 56.99 (s, 1H) , 6.39 (S, 1H) , 4.92 (s, 2H) , 4.13 (s, 2H) , 3.82 (s, 3H) , 3.65 (s, 3H) , 1.32 (s, 9H) , 1.23 (s, 6H) Procedimiento para la preparación de N- (2 - ter-butil -5 -hidroxi -4 - ( 1 -hidroxi -2 -metilpropan-2 -il ) fenil ) - 4 -oxo - 1 , -dihidroquinolin- 3 - carboxamida (27) : 27 A una mezcla de carbonato de [ 5 - amino- 4 - ter-butil - 2 - ( 2 -metoxicarbóni loxi -1,1 - dimet i 1 -etil ) fenil] metilo (103 mg, 0.29 mmol), ácido 4-oxo-1 , 4 -dihidroquinolin-3 -carboxílico (50 mg, 0.26 mmol) y piridina (42 mg , 0.53 mmol) en 2- eTHF (3.0 mL) se cargó T3P como una solución al 50% en peso en 2-MeTHF (286 mg, 0.45 mmol). La mezcla se calentó a 50°C durante 18 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con agua. La fase orgánica se separó y se lavó nuevamente con agua. A la fase orgánica se cargó metóxido de sodio (39 mg, 0.72 mmol) y la solución se agitó durante 2 horas. La reacción se inactivo con HC1 1N, y después de separar las fases, la fase orgánica se lavó con HC1 0.1 N. La fase orgánica luego se secó in vacuo para proporcionar el compuesto 27 como un sólido. El espectro XH-RMN fue consistente con el reportado anteriormente .
Ejemplo 3; Síntesis total del ácido 2 - ( 5 - ter-butil -2 -hidroxi -4 - (4 -oxo-1 , 4 - dihídroquinolin- 3 -carboxami do ) fenil ) -2 -metilpropanoioo (28) : Procedimiento para la preparación de 2 - ( 5 - ter-buti 2 2 -hidroxifenil ) -2 -metilpropanoni trilo (15) 7 15 agitaron Pd (OH)2/C (2.0 g) y el compuesto 7 (20.0 g, 0.104 mol) en MeOH (150 mL) a temperatura ambiente bajo atmósfera de hidrógeno a presión de 10 psi durante 16-18 horas. La mezcla luego se filtró a través de una capa de Celite®, y el filtrado se concentró para proporcionar el compuesto 15, que se utilizó en la siguiente reacción sin purificación adicional. ? RMN (DMSO-d6, 400 MHz ) d 9.83 (s) , 67.24 (s) , 67.18 (m) , 66.80 (m) , 61.71 (s) , 61.24 (s) .
Procedimiento para la preparación de carbonato de 4-ter -butil - 2 - (2 - cianopropan-2 - il ) fenil metilo (16) O 15 16 A una mezcla agitada del compuesto 15 (126.6 g, 0.564 mol) , DMAP (6.0 g) y DIEA (188 g, 1.46 mol) en DCM anhidro (1500 mi) se agregó gota a gota cloroformiato de metilo (110 g, 1.17 mol) en DCM anhidro (300 mi) a 0°C durante 2 horas. Después de agitar durante 12 horas a 0°C, se agregó agua con hielo (1.5 L) y la mezcla se agitó a 0°C durante 30 minutos. La capa orgánica se separó y se lavó con HC1 1N, agua y salmuera. La solución de DCM se secó sobre MgS04 y se concentró in vacuo para proporcionar el compuesto 16 como un sólido amarillo. 1H RMN (DMSO-dg, 400 MHz) 57.47 (m) , 57.39 (d) , 57.24 (d) , 53.84 (s), 51.71 (s), 51.30 (s) .
Procedimiento para la preparación de carbonato de 2-( 1 -amino-2 -metil-1 -oxopropan-2 - il ) -4 -ter-butil -5-nitrofenil metilo (17) A una mezcla agitada del compuesto 16 (10.0 mmol) y KN03 (5.51 g, 54.5 mmol) en DCM (1000 mL) se agregó gota a gota H2S04 al 98% (145.4 g, 1.45 mol) a 0°C. La mezcla se agitó a 30°C durante 4 días . La capa de H2S04 luego se separó y se vació en agua con hielo (50 g) y luego se extrajo con DCM (100 mLx3 ) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, solución acuosa de NaHC03 y salmuera, luego se secaron sobre MgS04 y se concentraron in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Petróleo éter/EtOAc 20:1 —> 10:1 —> 5 : 1 —> 3:1) para proporcionar el compuesto 17 como un sólido amarillo. 1E RMN (CDC13 , 400 MHz) 68.05 (s), 67.74 (s) , 67.61 (s) , 67.32 (s) , 65.32 (s) , 63.91 (s) , 63.92 (S) , 61.62 (s) , 61.59 (s) , 61.42 (s) , 61.38 (s) .
Procedimiento para la preparación del ácido 2 - ( 5 -ter-butil - 2 -hidroxi -4 -ni trofenil ) - 2 -metilpropanoico (18) COOH 17 A una mezcla del compuesto 17 (7.3 g, 21.6 mmol) en metanol (180 mi) se agregó agua (18 mL) y NaOH (8.64 g, 216 mmol) . La solución se calentó y se mantuvo a reflujo durante 3 días. El solvente se evaporó in vacuo y el residuo se disolvió en 140 mL de agua. Luego la solución se acidificó a pH 2 mediante la adición de HC1 2N. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (100 mLx3) , y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2S04 y luego se concentraron para proporcionar el compuesto 18 como un sólido amarillo, que se utilizó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento para la preparación de 5- ter-butil -3, 3 -dimetil -6 -ni trobenzofuran- 2 ( 3H) -ona (19 ) 18 19 A una solución del compuesto 18 (7.10 g, 25.2 mmol) en 710 mL de THF anhidro se agregó EDCI (14.5 g, 75.6 mmol) . La suspensión resultante se dejó en agitación a 30°C durante la noche. El precipitado se filtra y se lavó completamente con DCM. El filtrado se concentró a sequedad y el residuo se disolvió en DCM (100 mL) . La solución se lavó con agua (50 mLx2) y salmuera (50 mLxl) . La capa de DCM se secó sobre Na2S04 anhidro y se concentró para proporcionar el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Petróleo éter/EtOAc 200:1 -> 100:1 -> 50:1) para proporcionar el compuesto" 19 como un sólido blanco. XH RMN ( CDC13 , 400 MHz) d 7.36 (s) , 67.10 (s) , 61.53 (s) , d 1.41 (s) .
Procedimiento para la preparación de 6-amino-5-ter-butil -3 , 3 -dimetilbenzofuran- 2 ( 3H) -ona (20 ) 19 20 Se suspendieron Pd/C (1.50 g) y el compuesto 19 (3.00 g, 1.14 mmol) en THF (1500 mL ) a 25°C ba o atmósfera de hidrógeno a 30 psi durante 4 horas. La mezcla luego se filtró a través de una almohadilla de Celite®, y el filtrado se concentró in vacuo para proporcionar el compuesto 20 como un sólido blanco. XH RMN (DMSO-d6í 400 MHz ) 67.05 (s) , 66.49 (s) , 65.01 (s) , 61.35 (s) , 61.33 (s) .
Procedimiento para la preparación de N- ( 5 - ter-bu til - 3.3 - dime ti 1 - 2 -oxo-2 , 3 - dihi drobenzofuran - 6 - il ) - 4 -oxo - 1.4 - dihidroquinolin- 3 -carboxamida (21) Una suspensión de HATU (17.6 g, 46.3 mol) y el compuesto 26 (8.36 g, 44.2 mmol) en acetonitrilo anhidro (1 L) se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El compuesto 20 (3.40 g, 14.6 mmol) se agregó a la suspensión, y luego se agregó gota a gota DIEA (11.5 g, 89.0 mmol) . La mezcla se agitó a 45°C durante 4 días. El precipitado resultante se filtró y se lavó completamente con DCM. El filtrado se concentró a sequedad y el residuo se disolvió en DCM (200 mL) y se lavó con HC1 1N (200 mLx2 ) seguido por NaHC03 acuoso al 5% (200 mLx3 ) y luego salmuera (200 mLxl) . La mezcla luego se secó sobre Na2S04 y se concento in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/ eOH 100:1 -> 50:1) para proporcionar el compuesto 21 como un sólido amarillo claro. 1H - RMN (400 MHz , DMSO-d6) 612.96 (d J 6.4 Hz, 1H) , 12.1 (s, 1H) , 8.9 (d, J 6.4Hz, 1H) , 8.33 (d, J 8Hz, 1H) , 7.84-7.75 (m, 2H) , 7.55-7.48 (m, 3H) , 1.47 (s, 6H) ; 1.45 (S, 9H) .
Procedimiento para la preparación del ácido 2 - ( 5 -ter-butil -2 -hidroxi -4-14 -oxo-1 , 4 -dihidroquinolin- 3 -carboxamido ) fenil ) - 2 -metílpropanoico (28) A una solución agitada del compuesto 21 (0.9 g, 2.45 mmol) en MeOH (50 mL) se agregó NaOH (1.5 g, 37.5 mmol) a 0°C. Después de agitar durante 16 horas a 40°C, el solvente se evaporó in vacuo, luego el residuo se disolvió en H20 (50 mL) . El precipitado se filtró y el filtrado se lavó con DCM (100 mLxl) y acetato de etilo (100 mLxl) . La capa acuosa se acidificó con HC1 2N a pH 1-2. El precipitado se filtró y se lavó con H20 (80 mL) y heptano (50 mL) . Se secó in vacuo para proporcionar el compuesto 28 como un sólido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 Hz) 612.85 (s) , 611.84 (s), 611.77 (s) , 69.39 (S) , 68.86 (s) , 68.33 (s) , 67.79 (m) , 67.52 (m), 67.18 (s) , 67.09 (s), 61.44 (s) , 61.40 (s) . MS encontrado (M + H) 423.08 Ejemplo 4; Segunda Síntesis Alternativa de N- (2 -ter-butil - 5 -hidroxi -4- ( 1-hidroxi -2 -metilpropan- 2 -il ) fenil ) - 4 -oxo-1 , 4 - dihidroquinolin-3 - ca.rboxa.mi da. (27) Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos. de 50 mL, se equipó con agitador magnético, borboteador de nitrógeno, y termopar. Se cargaron al matraz el compuesto 21 (514 mg, 1.27 mmol) y 2- eTHF (4 mL) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Se agregó hidruro de litio aluminio (204 mg, 6.6 mmol) como un sólido hasta que se alcanzó la conversión del 100%, lo cual se supervisó utilizando HPLC . A la mezcla de reacción se agregaron sal te trahidratada de 2 , 3 -dihidroxibutandioato de sodio y potasio (50 mL de una solución de 400 g/L) y MTBE (50 mL) . La solución resultante se agitó durante 15 minutos y luego se dejó reposar durante 15 min. La capa orgánica se separó y el pH de la capa acuosa se ajustó a un pH de aproximadamente 6-7 al agregar ácido tartárico. La capa acuosa se extrajo con MTBE. La capa orgánica se concentró y se secó a alto vacío para proporcionar el compuesto del título como un polvo blanquecino. El espectro de 1H-RMN fue consistente con el reportado anteriormente.
Ejemplo 5: Síntesis Total Alternativa del Ácido ter-butil-2 -hidroxi -4 - ( 4 -oxo - 1 , 4 - dihi droquinol in carboxamido ) fenil ) -2 -metilpropanoico (28) : MeOCCI HN03, HZSOÍ NaOMe NEt3, DCM DCM, 0 °C DCM Procedimiento para la preparación del Ácido 2 -bromuro carbónico , fenil éster metil áster de 4-ter-butilo (35) 35 Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 2 L se equipó con agitador mecánico, borboteador de nitrógeno y termopar. Se agregó 2 -bromo-4 - tertbutil fenol (50 g, 211.7 mmol) seguido por DCM (1.75 L) , DMAP (1.29 g, 10.58 mmol) y Et3N (44.3 mi, 317.6 mmol) . La mezcla de reacción se enfrió a 0°C. A la mezcla de reacción se agregó gota a gota c lorof ormiat o de metilo (19.62 mi, 254 mmol) . La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente mientras continuó la agitación durante la noche. Cuando la reacción se completó, la mezcla se filtró a través de un embudo sinterizado. El filtrado se transfirió en el embudo de separación de 1 L. Para inactivar, se agregó HC1 1N (300 raL) para filtrar y la capa orgánica se separó. La capa orgánica luego se lavó con una mezcla de 291 mL de NaHC03 saturado y 100 mL de agua. Las capas se separaron, y se determino que la capa acuosa tiene un pH de aproximadamente 8. La capa orgánica se concentró y se secó bajo alto vacío durante 16 horas para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo claro, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. 1H-RMN (400 MHz . DMSO-d6) 7.66 (d, J 2.0 Hz, 1H) , 7.46 ( dd , J 8.4, 2.0 Hz , 1H) , 7.32 (d, J 8.4 Hz, 1H) , 3.86 (s, 3H) , 1.28 (s, 9H) Procedimiento para la preparación de carbonato de (2-bromo - 4 -ter-b til -5 -ni tro - fenil ) metilo (36 ) o O 35 36 Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 2 L se equipó con agitador mecánico, borboteador de nitrógeno y termopar. Se cargaron al matraz el compuesto 35 (176 g, 612.9 mmol) y ácido sulfúrico concentrado (264 mL) . La mezcla de reacción se enfrió a -5°C-0°C. Se agregó gota a gota ácido nítrico (28.6 mi, 612.9 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 2 horas. Cuando se completó, se agregó agua (264 mL) seguida por MTBE (264 mL) . La solución se agitó durante 15 minutos, luego se dejó reposar durante 15 minutos. La capa orgánica se separó, se concentró y se secó a alto vacío para proporcionar el compuesto del título como un aceite marrón oscuro, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. 1H - RMN (400 MHz . DMSO-d5 7.96 (s, 1H) , 7.92 (s, 1H) , 3.89 (s, 3H), 1.34 (s, 9H) Procedimiento para la preparación de 2 -bromo- 4 - ter -butil-5 -nitro- fenol (37) Se cargó a un reactor carbonato de (2-bromo-4 - ter-butil - 5 -nitro- fenil ) metilo (72.9 g, 219.5 mmol) y se agregó DCM (291.6 mL) . La solución de reacción amarilla se enfrió utilizando un baño con hielo. Se agregó en porciones a 2.2-6.9°C metóxido de sodio (67.04 g, 69.11 mL de 5.4 M, 373.2 mmol) . Después de completar la adición, la reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente. Cuando se completó, la reacción se enfrió a 0°C y se inactivo con HC1 1 (373.2 mL , 373.2 mmol) . La mezcla bifásica se agitó durante 20 minutos y se transfirió a un embudo de separación. La capa orgánica se separó y se lavó con agua (300 mL) , seguido por salmuera (300 mL) . La capa orgánica se concentró y el producto crudo se secó bajo alto vacío. El producto se purificó adicionalmente al utilizar separación por Cromatografía de Fluidos Supercríticos (SFC) en un Berger Multigram III ( ettler Toledo AutoChem, Newark DE) . Las condiciones del método fueron metanol al 20% a 250mL/min sobre una columna de PPU (30*150) de Princeton Chromat ography , 100 bar, 35C, 220 nm. Se inyectaron 3.5 mL de 55 a 70 mg/ml de solución. Los datos se recolectaron utilizando el software SFC ProNTo. El producto purificado recibido de la purificación SFC fue un solvato de metanol. Para retirar el metanol, se llevó a cabo una destilación azeotrópica. El sólido amarillo oscuro, 2-bromo, 4-terbutilo, solvato de 5-nitro fenol metanol, (111.3 g, de 59.9 mmol) se cargó a un matraz de fondo redondo de 1 L, seguido por heptano (500 mL) . La mezcla se calentó a 64°C para obtener una solución clara. El solvente se destiló bajo presión reducida (649 mbar) durante 30 minutos y luego se destiló hasta sequedad. Este procedimiento se repitió tres veces hasta que no se detectó MeOH mediante 1H - RMN . El producto se secó bajo alto vacío durante 16 horas para proporcionar el producto como un semisólido amarillo oscuro. 1H - RMN (400 Hz, DMSO-d6) d 11.2 (bs, OH) , 7.69 (s, 1H) , 7.03 (s, 1H) , 1.30 (S, 9H) Procedimiento para la preparación de 5 - ter-butil - 3 , 3 -dime ti 1 - 6 -ni trobenzofuran- 2 ( 3H) -ona ( 19 ) A un matraz de fondo redondo se agregó difluorozinc (6.093 g, 58.92 mmol), que se inundó con nitrógeno. Luego se agregó bajo corriente de nitrógeno Pd (tBu3P)2 (2 g, 3.835 mmol) . Al matraz luego se agregó 2 -bromo- 4 - ter-butil - 5 -nitro- fenol (16.15 g, 58.92 mmol) en DMF (80.75 mL) . La mezcla de reacción fue una suspensión naranja. Se agregó a la mezcla ( 1 -metoxi - 2 -met il -prop - 1 -enoxi) trimetilsilano (21.61 g, 25.13 mi, 117.8 mmol) y la mezcla resultante se calentó a 80°C y se agitó durante 16 h. Cuando se completó, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de Celite®. La torta de filtro se lavó con MTBE (536.0 mL) y al filtrado se agregó agua (893.3 mL) . La mezcla se agitó durante 15 minutos y se dejó sedimentar durante 15 minutos adicionales. Las capas se separaron y a la fase orgánica se agregó HC1 0.5 M (500 mi, 250.0 mmol) . Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con agua (500 mL) . Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con NaCl (500 mL , 8% en peso) . La capa orgánica se separó y el solvente se retiró in vacuo. El producto crudo se obtuvo como un sólido cristalino marrón y luego se purificó utilizando un tapón de sílice, utilizando hexano:MTBE 20:01 -10:1 como eluyente . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y el solvente se retiró in vacuo para proporcionar el producto puro como un sólido cristalino blanco. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d£) 57.80 (s, 1H) , 7.62 (s, 1H) , 1.49 (s, 6H) ; 1.34 (s, 9H) Procedimiento para la preparación de 6 - amino - 5 - ter -butil-3 , 3 -dimetilbenzofuran- 2 ( 3H) -ona (20 ) 19 En un matraz de fondo redondo bajo flujo de nitrógeno se colocó paladio sobre carbono (húmedo, 5% en peso) . Luego se agregó al recipiente 5-ter-butil- 3 , 3 - dimet i 1 - 6 -nitro-benzofuran- 2 - ona (4.7 g, 17.85 mmol) . Bajo atmósfera de nitrógeno luego se cargo cuidadosamente metanol (120 mL) . El recipiente luego se purgó con N2 , evacuado, luego se cargó con gas de hidrógeno. El recipiente se evacuó y se volvió a cargar con gas de hidrógeno, y luego se introdujo una corriente continua de gas de hidrógeno. Después de terminar, la reacción se filtró a través de Celite® y la torta se lavó con MeOH (300 mL) . El solvente se retiró in vacuo y el producto se secó bajo alto vacío para proporcionar un sólido cristalino blanco. 1H-RMN (400 Hz, DMSO-dS) 57.05 (s, 1H) , 6.48 (s, 1H) , 5.02 (S, 2H, NH2) , 1.34 (s, 6H); 1.30 (s, 9H) Procedimiento para la preparación de N- (5 - ter-butil - 3.3 - dime ti 1 -2 -oxo-2 , 3 -dihidrobenzof ran- 6-il ) -4 -oxo- 1.4 - dihi droquinol in- 3 - carboxamida (21) O o 20 Un recipiente de reacción se cargó con el compuesto 26 (2.926 g, 15.43 mmol), el compuesto 20 (4.32 g, 18.52 mmol) , 2-MeTHF (35.99 mL), y posteriormente T3P al 50% en 2-MeTHF (13.36 g, 21.00 mmol) . Se agregó piridina (2.441 g, 2.496 mL , 30.86 mmol) y la suspensión se calentó a 47.5°C ±5°C durante 18 h. Después de terminar, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agregaron 2-MeTHF (36) y agua (30 mi) . Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con solución de ácido cítrico al 10% en peso (30 mi) , agua (30 mi) y dos veces con NaHC03 (20 mi) . La capa orgánica se lavó con salmuera (50 mi) , se separó y el solvente se retiró in vacuo. El producto crudo se disolvió en MTBE (100 mi) y hexano (200 mi) se agregó como un ant i - solvente . Se precipitó un sólido y durante dos horas se agitó la mezcla resultante. El sólido se recolectó mediante filtración por succión y la torta se lavó con hexano. El producto resultante se secó en un horno de vacío a 55°C con purga de nitrógeno para proporcionar el compuesto del título como un sólido beige. 1H-RMN (400 MHz, DMS0-d6) 512.96 (d J 6.4 Hz , 1H) , 12.1 (s, 1H) , 8.9 (d, J 6.4Hz, 1H) , 8.33 (d, J 8 Hz, 1H), 7.84 -7.75 (m, 2H), 7.55-7.48 (m, 3H), 1.47 (s, 6H); 1.45 (S, 9H) .
Procedimiento para la preparación del ácido 2 - ( 5 -ter-butil - 2 -hidroxi -4- ( 4 -oxo -1 , 4 -dihidroquinolin-3 -carboxamido ) fenil ) -2 -metilpropanoico (28) A un matraz de fondo redondo se cargaron el compuesto 26 (81.30 mg , 0.4288 mmol) y el compuesto 20 (110 mg, 0.4715 mmol) . 2 -MeTHF (1 mL) , seguido por T3P al 50% en 2 - MeTHF (371.4 mg, 0.5836 mmol) y luego se agregó piridina (67.84 mg, 69.37 µ?., 0.8576 mmol) en 2-MeTHF. La suspensión se calentó a 47.5°C ±5°C durante la noche. Después de la terminación, la reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se agregaron 2-MeTHF (1.014 mL) y agua (811.2 ^L) . Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con agua (811.2 ^L) y dos veces con NaHC03 (2 mL) . La capa orgánica se transfirió en un matraz de fondo redondo. Se agregó LiOH (38.6 mg, 0.9 mmol) disuelto en agua (2 itiL) y la reacción se calentó a 45°C. Después de la terminación, las capas se separaron y la capa orgánica se desechó. La capa acuosa se enfrió con un baño con hielo y se agregó a la solución ácido clorhídrico (10.72 mL de 1.0 M, 10.72 mmol) hasta que el pH alcanzó un pH de 3-4. La capa acuosa se extrajo dos veces con 2-MeTHF (5 mL) , y las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera (5 mL) . La capa orgánica se separó y el solvente se retiró in vacuo. El sólido resultante se secó en un horno de vacío con purga de nitrógeno a 50°C para proporcionar el compuesto del título. 1H-RMN (400 MHz , DMS0-d6) d 12.89 (d, J 6.8 Hz, 1H), 11.84 (s, 1H) , 11.74 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 8.87-8.61 (d, J 6.4 Hz, 1H) ; 8.34-8.32 (d, J 9.1 Hz 1H) ; 7.83 a 7.745 (m, 2H) , 7.17-7.09 (m, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.09 (s, 1H) , 1.43 (s, 6H) ; 1.40 (s, 9H) Ejemplo 6; Procedimiento para la biosíntesis de N-(2-ter-butil - 5 -hidroxi -4 - ( 1 -hidroxi -2 -metilpropan -2 -il ) fenil ) - 4 -oxo-1 , 4 -dihidroquinolin-3 -carboxamida (27) y ácido 2 - ( 5 - ter-buti 1 - 2 -hidroxi - 4 - ( 4 -oxo - 1 , 4 -dihi droquinolin- 3 -carboxamido ) fenil ) -2 -metilpropanoico (28) Se adquirió de DSMZ como cultivo congelado Streptomyces rimosus (DSM 40260) . Este cultivo se utilizó para inocular slants de agar, que se mantuvieron y almacenaron a 4°C. Se preparó medio de extracto de levadura-extracto de malta-peptona (YMP) que contiene extracto de levadura (4 g/L) , extracto de malta (10 g/L) y harina de soya (5 g/L) y se esterilizó a 130°C durante 60 minutos. Cinco matraces que contienen 1 litro del medio YMP se inocularon directamente con S . rimosus proveniente de los slants de agar. El cultivo se dejó crecer durante 2-3 días a 30°C con agitación leve de aproximadamente 100 rpm . Bajo estas condiciones, se han observado dos tipos de crecimiento, ya sea una solución turbia o macropart ículas esféricas que se agregan en el fondo del matraz. Se ha mostrado que el último tipo de crecimiento da por resultado en mayores conversiones al Compuesto 27. Las células luego se sometieron a centrifugación, se recolectaron y se volvieron a suspender en dos matraces que contienen 1 L de amortiguador de potasio fosfato 0.1 M, pH 7.0. A los matraces se agregaron 5.0 g del compuesto 34 en 50 inL de N, N-dimetilformamida (DMF) . Las reacciones continuaron durante 24 horas a 30°C con agitación leve de aproximadamente 100 rpm en cuyo punto se indicaron mediante HPLC conversiones de 7.59% del compuesto 27 y 1.17% del compuesto 28.
Los DOS matraces se combinaron, se sometieron a centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos, y se resuspendieron en 500 mL de metanol. Esta suspensión se agitó vigorosamente durante 30 minutos y luego se sometió a centrifugación nuevamente a 6000 rpm durante 10 minutos. La capa orgánica se recolectó y el proceso se repitió dos veces. Los extractos de metanol se concentraron in vacuo para proporcionar 2.50 g, 1.57 y 1.11 g de material sólido, respectivamente. Se mostró que los sólidos de estos extractos contuvieron 74.78-91.96% del compuesto 34 , 7.66-19.73% del compuesto 27 y 0.39-5.49% del compuesto 2 8 . En un esfuerzo por eliminar una porción del Compuesto 34 de los productos de bio-oxidación, los sólidos de las dos primeras extracciones se combinaron, se suspendieron en 250 mL de metanol, se agitaron vigorosamente durante 1 hora y se filtraron in vacuo. Mientras que los compuestos 2 7 y 2 8 se enriquecieron en el filtrado (22.09 y 6.14%, respectivamente), los sólidos también contuvieron todavía el compuesto 27 (8.96%) y el compuesto 2 8 (0.50%) .
El filtrado de metanol que contiene aproximadamente 2.2 g de sólidos disueltos se adsorbió en 4.5 g de sílice y se purificó mediante cromatografía flash utilizando un gradiente de 100% de diclorometaño a 88:12 de diclorometano/me tanol . Las fracciones que contienen el compuesto 27 se concentraron in vacuo y secaron adic ionalmente vía liof ilización para obtener 130 mg del compuesto 27 (98.5% de pureza mediante HPLC) . Una fracción que contiene el compuestos 2 8 impuro también se concentró in vacuo para proporcionar menos de 10 mg del sólido.
El sedimento celular se resuspendió en 500 mL de metanol y se homogeneizó en un BeadBeater para descomponer las células y recuperar cualquier producto restante. La capa orgánica se obtuvo al centrifugar la suspensión homogeneizada a 6000 rpm durante 10 minutos. Esto se agregó al sólido obtenido de la tercera extracción y a los sólidos filtrados del enriquecimiento de la suspensión de las dos primeras extracciones y se suspendió a reflujo durante la noche. La suspensión luego se enfrió y se filtró por succión para obtener 1.99 g del sólido. El sólido se volvió a disolver en 300 mL de metanol que luego se absorbió sobre aproximadamente 5 g de sílice y se purificó mediante cromatografía flash utilizando un gradiente de diclorometano al 100% de 94:6 de diclorometano/metanol para proporcionar 820 mg del compuesto sólido que contiene el compuesto 34 y el compuesto 27, así como otras impurezas. Esto se volvió a someter a columna utilizando un gradiente de solvente más gradual (100% de DCM hasta una mezcla de 6% de MeOH/94% de DCM) para obtener aproximadamente 89 mg adicionales del compuesto 27. El espectro 1H-RMN fue consistente con lo reportado anteriormente.
Ejemplo 7 ; Procedimiento General para Probar la solubilidad a pH 7.4 Un se utilizó matraz de análisis para agitación vigorosa de alto rendimiento para determinar la solubilidad de los compuestos en tampón pH 7.4. Para calcular la concentración de los compuestos en solución, se realizaron dos condiciones por compuesto: 300 uM en DMSO al 100% y 200 uM en amortiguador de fosfato pH 7.4 con DMSO al 2% presente. Cada muestra se dejó agitar vigorosamente durante la noche, luego se inyectó en HPLC-UV para determinar el área pico con las siguientes condiciones: Phenomenex 00A-4251-B0-30x2.00 mm Luna 3u C18(2) columna 100A; magnitud de flujo 0.8 mL/min, 20 uL de volumen de inyección, agua grado HPLC con 0.1% de ácido fórmico y acetonitrilo grado HPLC con fases móviles de ácido fórmico al 0.1%; área pico determinada a 254-nm. La solubilidad en uM se calculó utilizando la siguiente ecuación: conc . (área pico pH 7.4) /(área pico 300 uM DMSO condición estándar) * 300 uM concentración de condición estándar. Los picos de interés se identificaron en condiciones de tampón con base en el tiempo de retención (RT) del área pico mayor en la condición estándar 300 uM DMSO.
ANÁLISIS DE ACTIVIDAD Ejemplo 8; Procedimiento General para los Análisis de Actividad Análisis para la Detectar y Medir las Propiedades de Potenciación del AF508-CFTR de los Compuestos Métodos ópticos del potencial de membrana para analizar las propiedades de modulación del AF508-CFTR de los compuestos El análisis utiliza tintes fluorescentes para detección de voltaje para medir los cambios en el potencial de membrana con un lector de placas fluorescentes (por ejemplo, FLIPR III, Molecular Devices, Inc.) como una lectura para aumento en el AF508-CFTR funcional en células NIH 3T3. La fuerza de- impulso para la respuesta es la creación de un gradiente iónico de cloruro junto con la activación del canal mediante un solo paso de adición de líquido después de que las células se hayan tratado previamente con los compuestos y posteriormente cargadas con un tinte para detección de voltaje.
Identificación de Compuestos Intensif icadores Para identificar los intensif icadores de AF508-CFTR, se desarrolló un formato de análisis HTS de doble adición. Este análisis HTS utiliza tintes fluorescentes para detección de voltaje para medir los cambios en el potencial de membrana en el FLIPR III como una medición para el aumento en la activación (conductancia) del AF508 CFTR en células NIH 3T3 del AF508 CFTR con temperatura corregida. La fuerza conductora para la respuesta es un gradiente iónico de Cl" junto con la activación del canal con forskolina en un solo paso de adición de líquido utilizando un lector de placas fluorescentes tal como FLIPR III después de que las células se hayan tratados previamente con compuestos intensificadores (o un control para vehículo DMSO) y posteriormente cargadas con un tinte de redistribución.
Soluciones Solución para el baño #1: (en mM) NaCl 160, KC1 4.5, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, pH 7.4 con NaOH .
Solución para el baño sin cloruro: Las sales de cloruro en la solución para el baño #1 se sustituyen con sales de gluconato.
Cultivo celular Se utilizaron fibroblastos de ratón NIH3T3 que expresan establemente AF508-CFTR para las mediciones ópticas del potencial de membrana. Las células se mantuvieron a 37°C en C02 al 5% y humedad al 90% en medio de Eagle modificado de Dulbecco y suplementado con glutamina 2 mM, 10% de suero fetal de bovino, 1 X NEAA , ß-??, 1 X penicilina/estreptomicina, y HEPES 25 mM en matraces para cultivo de 175 cm2. Para todos los análisis ópticos, las células se sembraron a ~20 , 000 / cavidad en placas recubiertas con matrigel de 384 cavidades y se cultivaron durante 2 horas a 37°C antes de cultivar a 27°C durante 24 horas, para el análisis intensif icador . Para análisis de corrección, las células se cultivaron a 27°C o 37°C con y sin los compuestos durante 16-24 horas. Los análisis electrof isiológicos para analizar las propiedades de modulación del AF508-CFTR de los compuestos. 1. Análisis en Cámara Ussing Se llevaron a cabo experimentos en cámara Ussing sobre células epiteliales polarizadas de las vías respiratorias que expresan el AF508-CFTR para caracterizar adicionalmente los moduladores del AF508-CFTR identificados en los análisis ópticos. Los epitelios de las vías respiratorias sin FQ y con FQ se aislaron del tejido bronquial, se cultivaron como se describió anteriormente (Galietta, L.J.V., Lantero, S., Gazzolo, A., Sacco, O., Romano, L., Rossi, G.A., & Zegarra Moran, O. (1998) In Vitro Cell. Dev. Biol. 34, 478-481), y se colocaron en placas en filtros Costar® SnapwellMR que se pre-recubrieron con medio acondicionado con NIH3T3. Después de cuatro días los medios apical se retiraron y las células se desarrollaron en una interfaz de aire líquido durante >14 días antes de utilizarse. Esto dio por resultado en una monocapa de células columnares totalmente diferenciadas que fueron ciliadas, rasgos que son característicos de los epitelios de las vías respiratorias. Los HBE sin FQ se aislaron de los no fumadores que no tuvieron ninguna enfermedad pulmonar conocida. Los HBE con FQ se aislaron de los pacientes homocigotos para el AF508-CFTR.
Los HBE desarrollados en insertos de cultivos celulares Costar® Snapwell™ se montaron en una cámara Ussing (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA) , y la resistencia transepitelial y corriente en corto circuito en presencia de un gradiente de Cl" basolateral a apical (Isc) se midieron utilizando un sistema para fijación de voltaje (Department of Bioengineering , University of Iowa, IA) . En resumen, los HBE se examinaron bajo las condiciones de registro para la fijación de voltaje (Vhoid = 0 mV) a 37°C. La solución basolateral contuvo (en mM) NaCl 145, K2HP04 0.83, KH2P04 3.3, MgCl2 1.2, CaCl2 1.2, glucosa 10, HEPES 10 (pH ajustado a 7.35 con NaOH) y la solución apical contuvo (en mM) NaGluconato 145, MgCl2 1.2, CaCl2 1.2, glucosa 10, HEPES 10 (pH ajustado a 7.35 con NaOH) .
Identificación de los compuestos intensif icadores El protocolo típico utilizó un gradiente de concentración Cl" basolateral en la membrana apical . Para ajustar este gradiente, se Utilizaron soluciones de ringer sobre la membrana basolateral, mientras que el NaCl apical se reemplazó por gluconato de sodio equimolar (titulado a pH 7.4 con NaOH) para proporcionar un mayor gradiente de concentración de Cl" a través del epitelio. Se agregaron Forskolina (10 µ?) y todos los compuestos de prueba al costado apical de los insertos de cultivo celular. La eficacia de los supuestos intens if icadores del AF508-CFTR se comparó con la del intensificador conocido genisteína. 2. Registros de la Fijación de Parches El Cl" total real en las células del AF508-NIH3T3 se supervisó utilizando la configuración de registro de un parche perforado como se describió anteriormente (Rae, J . , Cooper, K., Gates, P., & atsky, M. (1991) J. Neurosci. Methods 37, 15-26) . Los registros para fijación de voltaje se realizaron a 22°C utilizando un amplificador para fijación de parche Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA) . La solución en la pipeta contuvo (en mM) W-metil-D-glucamina (NMDG)-Cl 150, MgCl2 2, CaCl2 2, EGTA 10, HEPES 10, y 240 µ /p\1 de anfoteri c ina - B (pH ajustado a 7.35 con HCl) . El medio extracelular contuvo (en mM) NMDG-C1 150, MgCl2 2, CaCl2 2, HEPES 10 (pH ajustado a 7.35 con HCl) . La generación de pulsos, los datos de obtención y los análisis se realizaron utilizando una PC equipada con una interfaz Digidata 1320 A/D junto con Clampex 8 (Axon Instruments Inc.) . Para activar el AF508-CFTR, se agregaron al baño 10 µ? de forskolina y 20 µ? de genisteína y la proporción de corriente-voltaje se supervisó cada 30 segundos.
Identificación de los Compuestos Intensif icadores También se investigó la capacidad de los intens if icadores del AF508-CFTR para aumentar la corriente macroscópico de Cl" del AF508-CFTR (IAFSSOS) en células NIH3T3 que expresan establemente el AF508-CFTR utilizando técnicas de registro en parche perforado. Los intens i f icadores identificados a partir de los análisis ópticos provocaron un aumento dependiente de la dosis en IAFSOS con potencia y eficacia similares observadas en los análisis ópticos. En todas las células examinadas, el potencial inverso antes y durante la aplicación del intensif icador fue de aproximadamente -30 mV, el cual es el Eci calculado (-28 mV) .
Cultivo celular Se utilizaron fibroblastos de ratón NIH3T3 que expresan establemente el AF508-CFTR para los registros de células enteras. Las células se mantuvieron a 37°C en C02 al 5% y humedad al 90% en medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con glutamina 2 mM, 10% de suero fetal de bovino, 1 X NEAA, ß-??, IX de penicilina/estreptomicina, y HEPES 25 mM en matraces para cultivo de 175 cm2. Para los registros de células enteras, se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L- lisina 2,500-5,000 células y. se cultivaron durante 24-48 horas a 27°C antes de utilizarse para probar la actividad de los intensif icadores ; y se incubaron con o sin el compuesto de corrección a 37°C para medir la actividad de los correctores. 3. Registros en canal individual Se observó la actividad de activación del CFTR tipo silvestre y el AF508-CFTR con temperatura corregida expresado en las células NIH3T3 utilizando los registros del parche extirpada dentro-fuera de la membrana como se describió anteriormente (Dalemans, W., Barbry, P., Champigny, G., Jallat, S., Dott, K . , Dreyer, D., Crystal, R.G., Pavirani, A., Lecocq, J-P., Lazdunski, . (1991) Nature 354, 526-528) utilizando un amplificador para fijación de parches Axopatch 200B (Axon Instruments Inc.) . La pipeta contuvo (en mM) : NMDG 150, ácido aspártico 150, CaCl2 5, MgCl2 2, y HEPES 10 (pH ajustado a 7.35 con base Tris) . El baño contuvo (en mM) : NMDG-C1 150, MgCl2 2, EGTA 5, TES 10, y base Tris 14 (pH ajustado a 7.35 con HC1) . Después de la excisión, se activaron tanto el AF508-CFTR como el AF508-CFTR tipo mediante la adición de Mg -ATP 1 mM, 75 nM de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de cAMPc ( PKA ; Promega Corp. Madison, WI) , y NaF 10 mM para inhibir las fosfatasas proteínicas, lo que impidió la reducción de corriente. El potencial de la pipeta se mantuvo a 80 mV . La actividad del canal se analizó a partir de los parches de membrana que contuvieron =2 canales activos. El número máximo de aberturas simultáneas determinó el número de canales activos en el curso de un experimento. Para determinar la amplitud de corriente de un solo canal, los datos registrados de 120 segundos de la actividad del AF508-CFTR se filtraron "fuera de línea" a 100 Hz y luego se utilizaron para constituir los histogramas de amplitud de todos los puntos que se ajustaron con funciones mult igausianas utilizando el software para análisis Bio-Patch (Bio-Logic Com . Francia) . La corriente microscópica total y la probabilidad de abertura (P0) se determinaron a partir de los 120 segundos de la actividad del canal. La P0 se determinó utilizando el software Bio-Patch o a partir de la relación P0 = E/i(N) , en donde I = corriente media, i = amplitud de corriente del canal individual, y N = número de canales activos en el parche .
Cultivo celular Los fibroblastos de ratón NIH3T3 que expresan establemente el AF508-CFTR se utilizaron para los registros para fijación de parche de la membrana extirpada. Las células se mantuvieron a 37°C en C02 al 5% y humedad al 90% en medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con glutamina 2 mM, 10% de suero fetal de bovino, 1 X NEAA, ß-??, 1 X de penicilina/estreptomicina, y HEPES 25 itiM en matraces para cultivo de 175 cm2. Para los registros de canal individual, se sembraron 2,500-5,000 células sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L- lisina y se cultivan durante 24-48 horas a 27°C antes de útil izarse .
Los compuestos 27 y 28 se probaron para solubilidad mediante el procedimiento proporcionado en el Ejemplo 3 y para la actividad utilizando el procedimiento proporcionado en los análisis del Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 1. La actividad del compuesto se ilustra con "+++" si el EC50 (o IC50) se midió para ser menor de 2.0 µ? "++" si la actividad se midió para ser de 2 µ? hasta 5.0 µ?, " + " si la actividad se midió para ser mayor que 5.0 µ?, y "-"si no se dispone de datos. La eficacia se ilustra con " + + + " si la eficacia se calculó para ser mayor del 100%, " + + " si la eficacia se calculó para ser del 100% hasta el 25%, " + " si la eficacia se calculó para ser menor del 25%, y "-" si no se dispone de datos.
Tabla 1: Ejemplos de las actividades y eficacias los compuestos de la Fórmula I OH i Estructura H H Compuesto 27 Compuesto 28 Solubilidad de HTSF 87 uM >200 uM @ pH = 7.4 EC50 óptico +++ ++ ?508-??? +++ +++ ECS0 A508/G551D-HBE +++ ++ EC50 HL /RL (% restante ++ +++ @ 30 min) CaV 1.2 IC50 + - OTRAS MODALIDADES Todas las publicaciones y patentes relacionadas con esta exposición se incorporan en la presente como referencia al mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara que se incorpora específica e individualmente como referencia. Si el significado de los términos en cualquiera de las patentes o publicaciones incorporadas como referencia entran en conflicto con el significado de los términos utilizados en esta exposición, se pretende que prevalezca el significado de los términos en esta exposición. Además, el análisis anterior expone y describe las modalidades simplemente ilustrativas de la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente a partir de este análisis y a partir de los dibujos y demandas anexos, que se pueden realizar en la presente diversos cambios, modificaciones y variaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. compuesto de la Fórmula R I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en donde R es CH2OH.
3. Un compuesto según la reivindicación 1, en donde R es COOH.
4 Un compuesto de la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. Un compuesto de la estructura: o una sal farmacéu icamente aceptable del mismo.
6. Una composición farmacéutica que comprende : un compuesto de la Fórmula I, según la reivindicación 1; y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
7. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la estructura: H i y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable .
8. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la estructura: y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable .
9. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende además un agente adicional seleccionado de un agente mucolítico, un broncodi latador , un antibiótico, un agente anti- invectivo [sic] , un agente antiinflamatorio, un modulador del CFTR, o un agente nutricional .
10. Un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la Fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1.
11. Un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1, en donde la enfermedad se selecciona de fibrosis quística, asma, COPD inducida por fumar, bronquitis crónica, rinosinusitis , estreñimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina provocada por ausencia bilateral congénita de los conductos deferentes (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) , enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de fibrinolisis en la coagulación, tales como deficiencia de la proteína C, angioedema hereditario Tipo 1, deficiencias en el procesamiento de lípidos, tales como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia Tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades por depósito lisosomal, tales como la enfermedad de células I/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis , Sandhof /Tay- Sachs , Crigler-Najjar tipo II, poliendocrinopatía/hiperinsulemia , Diabetes mellitus, enanismo Laron, deficiencia de mi leoperoxidasa [ s ic ] , hipoparat iroidi smo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipof ib inogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, Diabetes insípida (DI), DI neurofiseal, DI neprogénica, síndrome de Charcot -Marie Tooth, enfermedad de Per1 i zaeus - Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, plasy supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos por poliglutamina tales como Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, la atrofia muscular espinal y bulbar, palidoluisiana dentatorúbrica , y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como la enfermedad hereditaria de Creutzfeldt-Jakob (debida a un defecto en el procesamiento de la proteína prión) , enfermedad de Fabry, síndrome de Straussler- Scheinker , COPD, enfermedad de queratoconj unt ivi t is seca o enfermedad de Sjogren.
14. El método según la reivindicación 13, en donde el compuesto de la Fórmula I tiene la estructura:
15. El método según la reivindicación 13, donde el compuesto de la Fórmula I tiene estructura :
16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde la enfermedad es fibrosis quística.
17. Un kit para utilizarse en medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en una muestra biológica in vitro o in vivo, que comprende: i. una composición que comprende un compuesto de la Fórmula I, según la reivindicación 1, y ii. las instrucciones para: a. poner en contacto la composición con la muestra biológica, y b. medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo.
18. El kit según la reivindicación 17, que comprende además las instrucciones para: i. poner en contacto un compuesto adicional con la muestra biológica, ii. medir la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional, y iii. comparar la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional con la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia de una composición de la Fórmula I .
19. El kit según la reivindicación 18, en donde el paso de comparar la actividad del CFTR o un fragmento del mismo proporciona una medida de la densidad del CFTR o un fragmento del mismo.
20. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en donde el compuesto de la Fórmula I tiene la estructura:
21. El kit según las reivindicaciones 17-en donde el compuesto de la Fórmula I tiene estructura :
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