ES2683633T3 - Moduladores de regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística - Google Patents

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ES2683633T3 ES10710748.4T ES10710748T ES2683633T3 ES 2683633 T3 ES2683633 T3 ES 2683633T3 ES 10710748 T ES10710748 T ES 10710748T ES 2683633 T3 ES2683633 T3 ES 2683633T3
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Sara S. Hadida Ruah
Peter D.J. Grootenhuis
Fredrick F. Van Goor
Martyn C. Botfield
Gregor Zlokarnik
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Abstract

Un compuesto de Fórmula I:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.

Description

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DESCRIPCION
Moduladores de regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis qmstica CAMPO TECNICO DE LA INVENCION
[0001] La presente invencion se refiere a moduladores de regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qmstica ("CFTR"), composiciones de los mismos, y su uso en terapia. La presente invencion tambien se refiere a metodos para tratar enfermedades usando moduladores de CFTR.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0002] La fibrosis qmstica (FQ) es una enfermedad genetica recesiva que afecta a aproximadamente 30.000 ninos y adultos en los Estados Unidos y aproximadamente 30.000 ninos y adultos en Europa. A pesar del progreso en el tratamiento de la FQ, no hay cura.
[0003] La FQ es causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qmstica (CFTR) que codifica un canal de ion de cloruro epitelial responsable de ayudar en la regulacion de la absorcion y secrecion de agua y sal en diversos tejidos. Los farmacos de molecula pequena, conocidos como potenciadores que aumentan la probabilidad de apertura del canal de CFTR, representan una estrategia terapeutica potencial para tratar la FQ.
[0004] Espedficamente, CFTR es un canal de aniones mediado por AMPc/ATP que se expresa en una variedad de tipos de celulas, incluyendo absorcion y celulas epiteliales secretoras, donde regula flujo de aniones a traves de la membrana, asf como la actividad de otros canales ionicos y protemas. En las celulas del epitelio, el funcionamiento normal del CFTR es fundamental para el mantenimiento del transporte de electrolitos en todo el cuerpo, incluidos los tejidos respiratorios y digestivos. CFTR esta compuesto por aproximadamente 1.480 aminoacidos que codifican una protema compuesta por una repeticion en tandem de dominios de transmembrana, cada uno con seis helices transmembrana y un dominio de union a nucleotidos. Los dos dominios transmembrana estan unidos por un dominio regulatorio (R) grande y polar con multiples sitios de fosforilacion que regulan la actividad del canal y el trafico celular.
[0005] El gen que codifica CFTR se ha identificado y secuenciado (Vease Gregory, RJ et al (1990) Nature 347: 382386; Rich, DP et al (1990) Nature 347: 358-362), (Riordan, JR y otros (1989) Science 245: 1066 - 1073). Un defecto en este gen causa mutaciones en CFTR que producen fibrosis qmstica ("FQ"), la enfermedad genetica mortal mas comun en los seres humanos. La fibrosis qmstica afecta aproximadamente a uno de cada 2.500 bebes en los Estados Unidos. Dentro de la poblacion general de los Estados Unidos, hasta 10 millones de personas portan una sola copia del gen defectuoso sin aparentes efectos negativos. Por el contrario, las personas con dos copias del gen asociado a la FQ padecen los efectos debilitantes y fatales de la FQ, incluida la enfermedad pulmonar cronica.
[0006] En pacientes con FQ, las mutaciones en CFTR expresado endogenamente en el epitelio respiratorio conducen a reduccion de la secrecion de aniones apical causando un desequilibrio en transporte de iones y fluidos. La disminucion resultante en el transporte de aniones contribuye a una mayor acumulacion de moco en el pulmon y las infecciones microbianas que las acompanan y que finalmente causan la muerte en pacientes con FQ. Ademas de la enfermedad respiratoria, los pacientes con FQ suelen padecer problemas gastrointestinales e insuficiencia pancreatica que, si no se tratan, ocasionan la muerte. Ademas, la mayona de los hombres con fibrosis qmstica son infertiles y la fertilidad disminuye entre las mujeres con fibrosis qmstica. En contraste con los efectos severos de dos copias del gen asociado a FQ, los individuos con una copia unica del gen asociado a FQ exhiben una mayor resistencia al colera y a la deshidratacion resultante de la diarrea, quizas explicando la frecuencia relativamente alta del gen de FQ en la poblacion.
[0007] El analisis de secuencia del gen CFTR de cromosomas de FQ ha revelado una variedad de mutaciones causantes de enfermedades (Cutting, GR et al (1990) Nature 346: 366-369; Dean, M. et al (1990) Cell 61: 863: 870 y Kerem, BS et al., (1989) Science 245: 1073 - 1080, Kerem, B-S y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 8447 - 8451). Hasta la fecha, se han identificado mas de 1.000 mutaciones que causan enfermedades en el gen de la FQ (
http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app). La mutacion mas prevalente es una delecion de fenilalanina en la posicion 508 de la secuencia de aminoacidos CFTR, y se denomina comunmente AF508-CFTR. Esta mutacion ocurre en aproximadamente el 70% de los casos de fibrosis qmstica y se asocia con una enfermedad grave.
[0008] La supresion de residuo 508 en AF508-CFTR evita que la protema naciente se pliegue correctamente. Esto da como resultado la incapacidad de la protema mutante para salir de la sala de emergencias y el trafico a la membrana plasmatica. Como resultado, el numero de canales presentes en la membrana es mucho menor que el observado en las celulas que expresan CFTR de tipo salvaje. Ademas del trafico deteriorado, la mutacion resulta en un canal defectuoso. Juntos, la reduccion del numero de canales en la membrana y la activacion defectuosa conducen a un transporte anionico reducido a traves de los epitelios, lo que produce un transporte defectuoso de iones y fluidos. (Quinton, PM (1990), FASEB J. 4: 2709 - 2727). Los estudios han demostrado, sin embargo, que los
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numeros reducidos de AF508-CFTR en la membrana son funcionales, aunque menos que el tipo salvaje CFTR. (Dalemans et al., (1991), Nature Lond., 354: 526 - 528, Denning et al., Supra, Pasyk y Foskett (1995), J. Cell, Biochem., 270: 12347 - 50). Ademas de AF508-CFTR, otras mutaciones que causan enfermedades en CFTR que dan como resultado trafico defectuoso, smtesis y/o canalizacion pueden regularse hacia arriba o hacia abajo para alterar la secrecion de aniones y modificar la progresion y/o severidad de la enfermedad.
[0009] Aunque CFTR transporta una variedad de moleculas, ademas de aniones, es evidente que este papel (el transporte de aniones) representa un elemento en un importante mecanismo de transporte de iones y agua a traves del epitelio. Los otros elementos incluyen el canal epitelial Na+, ENaC, co-transportador Na+/2ClVK+, bomba Na+-K+- ATPasa y los canales de la membrana basolateral K+, que son responsables de la absorcion de cloruro en la celula.
[0010] Estos elementos trabajan juntos para conseguir el transporte direccional a traves del epitelio a traves de su expresion selectiva y la localizacion dentro de la celula. La absorcion de cloruro tiene lugar por la actividad coordinada de ENaC y CFTR presente en la membrana apical y la bomba Na+-K+-ATPasa y los canales ionicos Cl expresados en la superficie basolateral de la celula. El transporte activo secundario de cloruro desde el lado luminal conduce a la acumulacion de cloruro intracelular, que despues puede salir pasivamente de la celula a traves de canales de Cl', dando como resultado un transporte vectorial. La disposicion del co-transportador Na+/2Cl'/K+, bomba Na+-K+-ATPasa y la membrana basolateral de los canales de K+ en la superficie basolateral y CFTR en el lado luminal coordinan la secrecion de cloruro a traves de CFTR en el lado luminal. Debido a que el agua probablemente nunca se transporte activamente, su flujo a traves del epitelio depende de pequenos gradientes osmoticos transepiteliales generados por el flujo masivo de sodio y cloruro.
[0011] Como se discutio anteriormente, se cree que la supresion de residuo 508 en AF508-CFTR impide que la protema naciente se pliegue correctamente, dando como resultado la incapacidad de esta protema mutante para salir del ER, y el trafico a la membrana plasmatica. Como resultado, cantidades insuficientes de la protema madura estan presentes en la membrana plasmatica y el transporte de cloruro dentro de los tejidos epiteliales se reduce significativamente. De hecho, este fenomeno celular del procesamiento ER defectuoso de los transportadores ABC por la maquinaria ER ha demostrado ser la base subyacente no solo para la enfermedad de la FQ, sino tambien para una amplia gama de otras enfermedades aisladas y hereditarias.
[0012] Por consiguiente, existe la necesidad de moduladores de la actividad de CFTR y composiciones de los mismos, que se pueden usar para modular la actividad del CFTR en la membrana celular de un mairnfero.
[0013] Hay una necesidad de metodos de tratamiento de enfermedades causadas por mutacion en CFTR al utilizar tales moduladores de la actividad de CFTR.
[0014] Hay una necesidad de metodos para modular la actividad de CFTR en una membrana celular ex vivo de un marnffero. Los documentos WO2009/036412 A1 y WO2006/002421 A2 describen moduladores para transportadores ABC que incluyen CFTR. El documento WO2007/075901 A2 describe profarmacos de moduladores de transportadores ABC, particularmente de moduladores CFTR.
SUMARIO DE LA INVENCION
[0015] En un aspecto, esta invencion se refiere a un compuesto de Formula I:
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una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.
[0016] En una realizacion, el compuesto tiene la estructura:
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[0017] En otra realizacion, el compuesto tiene la estructura:
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una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0018] En un aspecto, esta invencion se refiere a una composicion farmaceutica que incluye un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente, y un vehnculo o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
[0019] En una realizacion de la composicion farmaceutica, el compuesto tiene la estructura:
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una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0020] En otra realizacion de la composicion farmaceutica, el compuesto tiene la estructura:
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una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0021] Las realizaciones de este aspecto tambien pueden incluir una composicion farmaceutica que contiene un agente adicional seleccionado entre un agente mucolftico, un broncodilatador, un antibiotico, un agente antiinfeccioso, un agente antiinflamatorio, un modulador de CFTR o un agente nutricional.
[0022] Se describe aqrn un metodo in vitro para modular la actividad CFTR en una muestra biologica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biologica con un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente.
[0023] En una realizacion del metodo in vitro de modular la actividad de CFTR descrita aqrn, el compuesto tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0024] En otra realizacion del metodo in vitro de modular la actividad de CFTR descrita aqm, el compuesto tiene la estructura:
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una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0025] En otro aspecto, la invencion tambien proporciona una composicion como se define en el presente documento para su uso en un metodo para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones tal como se define en el presente documento, y que dicha enfermedad es seleccionada de fibrosis qrnstica, asma, EPOC inducida por humo, bronquitis cronica, rinosinusitis, estrenimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreatica, infertilidad masculina causada por ausencia congenita bilateral del conducto deferente (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopatica, aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA), hepatopatia, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de coagulacion-fibrinolisis, tal como deficiencia de protema C, angioedema hereditario de tipo 1, deficiencias de procesamiento de lfpidos, como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia de tipo 1, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosomal, tal como enfermedad de celulas I/pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar de tipo II, poliendocrinopatfa/hiperinsulinemia, diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, glicanosis CDG de tipo 1, hipertiroidismo congenito, osteogenesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de TCA, diabetes insfpida (DI), neurohipofisis DI, DI nefrogena, smdrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus- Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, paralisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurologicos de la poliglutamina como Huntington, espinocerebelar ataxia de tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentatorubral pallidoluysiana y distrofia miotonica, asf como encefalopatfas espongiformes, como enfermedad hereditaria de Creutzfeldt-Jakob (debido a un defecto en el procesamiento de la protema prionica), enfermedad de Fabry, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, EPOC, enfermedad de ojo seco o enfermedad de Sjogren, osteoporosis, osteopenia, curacion osea y crecimiento oseo (incluida la reparacion osea, regeneracion osea, reduccion de la retencion osea y aumento de la deposicion osea), smdrome de Gorham, canalopatfas por cloruro como miotoma congenita (formas de Thomson y Becker), smdrome de Bartter tipo III, Enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hipereplexia, enfermedad de almacenamiento lisosomal, smdrome de Angelman y Discinesia Ciliar Primaria (DCP), un termino para trastornos hereditarios de la estructura y/o funcion de los cilios, que incluye DCP con situs inversus (tambien conocido como smdrome de Kartagener), DCP sin situs inversus y aplasia ciliar.
[0026] En otra realizacion, la enfermedad se selecciona de FQ, la EPOC, EPOC inducida por humo, pancreatitis, y rinosinusitis.
[0027] En ciertas realizaciones, la enfermedad es fibrosis qrnstica.
[0028] En una realizacion, la composicion comprende el compuesto que tiene la estructura:
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[0029] En otra realizacion, la composicion comprende el compuesto que tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0030] En otro aspecto, la presente invencion proporciona un kit para uso en la medicion de la actividad de CFTR o un fragmento del mismo en una muestra biologica in vitro o in vivo que comprende (i) una composicion que comprende un compuesto de Formula I o cualquiera de las realizaciones anteriores; e (ii) instrucciones para a) poner en contacto la composicion con la muestra biologica y b) medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo.
[0031] En una realizacion de este aspecto, el kit comprende ademas instrucciones para a) poner en contacto una composicion adicional con la muestra biologica; b) medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo en presencia de dicho compuesto adicional, y c) comparar la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional con la densidad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia de dicha composicion que comprende un compuesto de Formula I.
[0032] En realizaciones preferidas, el kit se usa para medir la densidad de CFTR o un fragmento del mismo.
[0033] En una realizacion preferida adicional, el kit se usa para medir la densidad de dicho CFTR o un fragmento del mismo y la etapa de comparar la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo proporciona una medida de la densidad de dicho CFTR o un fragmento del mismo.
[0034] En una realizacion del kit para su uso en la medicion de la actividad de CFTR, el compuesto tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0035] En otra realizacion del kit para su uso en la medicion de la actividad de CFTR, el compuesto tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0036] Los compuestos de Formula I proporcionan propiedades ventajosas tales como, pero no limitados al aumento de la polaridad, solubilidad acuosa favorable, el volumen de distribucion inferior y penetracion en el tejido inferior.
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DESCRIPCION DETALLADA
DEFINICIONES
[0037] Los compuestos de esta invencion incluyen los descritos en general anteriormente, y se ilustran adicionalmente mediante las clases, subclases, y especies descritas aqrn. Como se usa en el presente documento, se aplicaran las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario.
[0038] El termino "transportador ABC" como se usa en este documento significa una protema ABC-transportadora o un fragmento de la misma que comprende al menos un dominio de union, donde dicha protema o fragmento de la misma esta presente in vivo o in vitro. El termino "dominio de union" como se usa en el presente documento significa un dominio en el transportador ABC que puede unirse a un modulador. Vease, por ejemplo, Hwang, TC et al., J. Gen. Physiol. (1998): 111 (3), 477 - 90.
[0039] El termino "CFTR" como se usa en este documento significa CFTR o una mutacion del mismo capaz de actividad reguladora, incluyendo, pero no limitado a, AF508 CFTR y G551D CFTR (vease, por ejemplo,
http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/, para mutaciones de CFTR).
[0040] El termino "modular" como se usa en la presente memoria significa aumentar o disminuir en una cantidad medible.
[0041] Para los propositos de esta invencion, los elementos qmmicos se identifican de acuerdo con la Periodic Table of Elements, version CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a ed. Ademas, los principios generales de la qmmica organica se describen en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999 y "March's Advanced Organic Chemistry”, 5a edicion, Ed.: Smith, MB y March, J., John Wiley & Sons, Nueva York: 2001, cuyos contenidos completos se incorporan aqrn como referencia.
[0042] El termino "estable", como se usa aqrn, se refiere a compuestos que no se alteran sustancialmente cuando se someten a condiciones para permitir su produccion, deteccion, y preferentemente su recuperacion, purificacion y uso para uno o mas de los propositos revelados aqrn. En algunas realizaciones, un compuesto estable o un compuesto qmmicamente factible es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 4o°C o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones qmmicamente reactivas, durante al menos una semana.
[0043] El termino "grupo protector" (PG) como se usa en el presente documento, representa a aquellos grupos destinados a proteger un grupo funcional, tal como, por ejemplo, un alcohol, amina, carboxilo, carbonilo, etc., contra reacciones indeseables durante los procedimientos sinteticos. Los grupos protectores usados comunmente se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Systems, 3a Edicion (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999), que se incorpora aqrn como referencia. Ejemplos de grupos protectores de nitrogeno incluyen grupos acilo, aroMo o carbamilo tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutirilo, benzoilo, 4-clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoflo y auxiliares quirales tales como D, L o D, L-aminoacidos protegidos o no protegidos tales como alanina, leucina, fenilalanina y similares; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y similares; grupos de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, p- nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5- dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 2-nitro-4,5- dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1 -(p-bifenililo)-1 -metiletoxicarbonilo, a,a-dimetilo-3,5- dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetonaxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2, -tricloroetoxicarbonilo, fenoxocarbonilo, 4-nitrofenoxi carbonilo, fluorenilo-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares, grupos arilalquilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y similares y grupos sililo tales como trimetilsililo y similares. Los grupos N-protectores preferidos son terc- butiloxicarbonilo (Boc).
[0044] Los ejemplos de grupos protectores utiles para los acidos son esteres de alquilo sustituidos tales como 9- fluorenilmetilo, metoximetilo, metiltiometilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, metoxietoximetilo, 2- (trimetilsililo)etoximetilo, benciloximetilo, pivaloiloximetilo, fenilacetoximetilo, triisopropropilsisililmetilo, cianometilo, acetol, fenacilo, esteres de fenacilo sustituidos, 2,2,2-tricloroetilo, 2-haloetilo, m-cloroalquilo, 2-(trimetilsililo)etilo, 2- metiltioetilo, t-butilo, 3-metilo-3-pentilo, diciclopropilmetilo, ciclopentilo, ciclohexilo, alilo, metalilo, cinamilo, fenilo, esteres de sililo, esteres de bencilo y de bencilo sustituido, esteres de 2,6-dialquilfenilo tales como pentafluorofenilo, 2,6-dialquilfenilo. Los grupos protectores preferidos para los acidos son esteres mertlicos o etflicos.
[0045] Los metodos de adicion (un proceso generalmente denominado "proteccion") y eliminacion (proceso generalmente denominado "desproteccion") de tales grupos protectores de amina y acido son bien conocidos en la tecnica y estan disponibles, por ejemplo en P.J.Kocienski, Protecting Groups, Thieme, 1994, que se incorpora aqrn por referencia en su totalidad y en Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Edicion (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999).
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[0046] A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautomericas de los compuestos de la invencion estan dentro del alcance de la invencion. Es decir, los compuestos de Formula I pueden existir como tautomeros:
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[0047] Ademas, a menos que se indique otra cosa, las estructuras representadas en el presente documento tambien pretenden incluir compuestos que difieren solo en la presencia de uno o mas atomos isotopicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las estructuras presentes, excepto por la sustitucion de hidrogeno por deuterio o tritio, o la sustitucion de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C, estan dentro del alcance de esta invencion. Tales compuestos son utiles, por ejemplo, como herramientas analfticas, sondas en ensayos biologicos o como agentes terapeuticos.
[0048] Ejemplos de disolventes adecuados son, pero no se limitan a, agua, metanol, diclorometano (DCM), acetonitrilo, dimetilformamida (DMF), acetato de etilo (EtOAc), alcohol isopropflico (IPA), acetato de isopropilo (IPAC), tetrahidrofurano (THF), metiletilcetona (MEK), t-butanol y N-metilpirrolidona (NMP).
[0049] Ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son, pero no se limitan a, 1-(3-(dimetilamino)propilo)-3- etilo-carbodiimida (EDCI), hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), 1- hidroxibenzotriazol (HOBT), hexafluorofosfato de uronio 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametilo (HATU), tetrafluoroborato de 2-cloro-1,3-dimetilo-2-imidazolio, 1-H-benzotriazolio-1-[bis(dimetilamino)metileno]-5- clorohexifluorofosfato (HCTU), 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina y anhfdrido fosfonico de 2-propano (T3P®).
[0050] Ejemplos de bases adecuadas son, pero no se limitan a, K2CO3, N-metilmorfolina (NMM), trietilamina (TEA), amina de diisopropilo-etilo (DIEA), piridina, hidroxido de potasio, hidroxido de sodio, y metoxido de sodio.
COMPUESTOS
[0051] En una realizacion, la invencion incluye un compuesto de Formula I:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.
[0052] En algunas realizaciones, R es CH2OH.
[0053] En algunas realizaciones, R es COOH.
[0054] En otra realizacion, la invencion incluye un compuesto de la estructura:
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[0055] En otra realizacion, la invencion incluye un compuesto de la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0056] En una realizacion, la invencion incluye una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula I, y un vehfculo o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
[0057] En otra realizacion, la invencion incluye una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la estructura:
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y un vehfculo o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
[0058] En otra realizacion, la invencion incluye una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la estructura:
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[0059] En otra forma de realizacion, la composicion farmaceutica comprende ademas un agente adicional seleccionado entre un agente mucolttico, un broncodilatador, un antibiotico, un agente anti-invectivo, un agente anti- inflamatorio, un modulador de CFTR, o un agente nutricional.
III. SfNTESIS GENERAL
[0060] Los compuestos de Formula I se pueden sintetizar de acuerdo con el Esquema 1.
Esquema 1
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[0061] En el Esquema 1, las anilinas de formula II, en donde R y OH opcional e independientemente llevan grupos protectores sobre el mismo, se hacen reaccionar con intermedios de acido carboxflico de Formula III en condiciones de acoplamiento para formar compuestos de Formula IV. Los compuestos de Formula IV que llevan uno o mas grupos protectores se pueden desproteger a continuacion para proporcionar derivados de Formula I.
[0062] La reaccion de acoplamiento descrito en el Esquema 1 puede lograrse mediante la disolucion de los reactivos en un disolvente adecuado, tratando la solucion resultante con un reactivo de acoplamiento adecuado, opcionalmente en presencia de una base adecuada.
[0063] Los derivados de quinolina de Formula III se pueden sintetizar de acuerdo con el Esquema 2.
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[0064] Las anilinas de formula II, en donde R es -CH2OH se pueden sintetizar segun el Esquema 3.
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[0065] Las anilinas de Formula II, en donde R es -COOH pueden sintetizarse de acuerdo con el Esquema 4. Esquema 4
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USOS Y METODOS DE USO Composiciones farmaceuticamente aceptables
[0066] En un aspecto de la presente invencion, se proporcionan composiciones farmaceuticamente aceptables, en las que estas composiciones comprenden cualquiera de los compuestos como se describe en el presente documento, y comprenden opcionalmente un portador, adyuvante o vetnculo farmaceuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, estas composiciones opcionalmente comprenden adicionalmente uno o mas agentes terapeuticos adicionales.
[0067] Tambien se apreciara que ciertos de los compuestos de presente invencion pueden existir en forma libre para el tratamiento, o cuando sea apropiado, como un derivado farmaceuticamente aceptable o un profarmaco del mismo. De acuerdo con la presente invencion, un derivado o profarmaco farmaceuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, sales, esteres, sales de tales esteres farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro aducto o derivado que, tras la administracion a un paciente que lo necesita, es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto como se describe aqrn de otro modo, o un metabolito o residuo del mismo.
[0068] Tal como se utiliza aqrn, el termino "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del juicio medico, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritacion, respuesta alergica y similares, y son acordes con una relacion beneficio/riesgo razonable. Una "sal farmaceuticamente aceptable" significa cualquier sal o sal no toxica de un ester de un compuesto de esta invencion que, tras la administracion a un receptor, es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto de esta invencion o un metabolito inhibidor activo o residuo del mismo.
[0069] Las sales farmaceuticamente aceptables son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, SM Berge, et al.
describe sales farmaceuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de esta invencion incluyen los derivados de acidos y bases inorganicas y organicas adecuadas. Ejemplos de sales de adicion de acido no toxicas farmaceuticamente aceptables son sales de un grupo amino formado con acidos inorganicos tales como acido clortndrico, acido bromtudrico, acido fosforico, acido sulfurico y acido perclorico o con acidos organicos tales como acido acetico, acido oxalico, acido maleico, acido tartarico, acido dtrico, acido succmico o acido malonico o usando otros metodos usados en la tecnica tales como el intercambio ionico. Otras sales farmaceuticamente aceptables incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, edisilato (etanodisulfonato), etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-
etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2- naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato, y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metal alcalino, metal alcalinoterreo, amonio y N+(Ci_4alquilo)4. Esta invencion tambien preve la cuaternizacion de cualquier grupo basico que contenga nitrogeno de los compuestos descritos en este documento. Pueden obtenerse productos solubles o dispersables en agua o aceite mediante dicha cuaternizacion. Las sales de metales alcalinos o alcalinoterreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmaceuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, amonio no toxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidroxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilsulfonato inferior y arilsulfonato.
[0070] Como se describio anteriormente, las composiciones farmaceuticamente aceptables de la presente invencion comprenden adicionalmente un portador farmaceuticamente aceptable, adyuvante o vetnculo, que, como se usa aqrn, incluye cualquiera y todos los disolventes, diluyentes, u otro vetnculo lfquido, dispersion o adyuvantes de suspension, agentes tensioactivos, agentes isotonicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes solidos, lubricantes y similares, adecuados para la forma de dosificacion particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Decimosexta edicion, EW Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) describe diversos vetnculos utilizados en la formulacion de composiciones farmaceuticamente aceptables y tecnicas conocidas para la preparacion de los mismos. Excepto en la medida en que cualquier medio de vetnculo convencional sea incompatible con los compuestos de la invencion, tal como mediante la produccion de cualquier efecto biologico indeseable o mediante la interaccion de otra manera de manera perjudicial con cualquier otro componente de la composicion farmaceuticamente aceptable, se contempla que su uso sea dentro del alcance de esta invencion. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vetnculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protemas sericas, tales como albumina serica humana, sustancias reguladoras tales como fosfatos, glicina, acido sorbico o sorbato de potasio, mezclas parciales de gliceridos de acidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disodico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sflice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, ceras, polfmeros de bloque de polietileno- polioxipropileno, grasa de lana, azucares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidon de mafz y almidon de patata; celulosa y sus derivados tales como celulosa de sodio de carboximetilo, celulosa de etilo y
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acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon; aceite de cartamo; aceite de sesamo; aceite de oliva; aceite de mafz y aceite de soja; glicoles; tal propilenglicol o polietilenglicol; esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua libre de pirogenos; solucion salina isotonica; la solucion de Ringer; las soluciones de alcohol etflico y tampon de fosfato, asf como otros lubricantes no toxicos compatibles como sulfato de laurilo sodico y estearato de magnesio, asf como agentes colorantes, agentes liberadores, agentes de revestimiento, edulcorantes, aromatizantes y conservantes, conservantes y antioxidantes tambien pueden estar presentes en la composicion, conforme al juicio del formulador.
Usos de compuestos y composiciones farmaceuticamente aceptables
[0071] En aun otro aspecto, se describe aqrn un metodo para tratar, o reducir la gravedad de una afeccion, enfermedad, o trastorno implicado por mutacion de CFTR. En ciertas realizaciones, se describe un metodo para tratar una afeccion, enfermedad o trastorno implicado por una deficiencia de la actividad CFTR, comprendiendo el metodo la administracion de una composicion que comprende un compuesto de Formula I a un sujeto, preferiblemente un mairnfero, que lo necesita.
[0072] En otro aspecto, se describe un metodo para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente que comprende la administracion a dicho paciente de una de las composiciones definidas aqrn, y dicha enfermedad se selecciona de fibrosis qrnstica, asma, EPOC inducida por humo, bronquitis cronica, rinosinusitis, estrenimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreatica, infertilidad masculina causada por ausencia congenita bilateral del conducto deferente (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopatica, aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA), enfermedad hepatica, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, coagulacion -deficiencias de fibrinolisis, como deficiencia de protema C, angioedema hereditario de tipo 1, deficiencias de procesamiento de lfpidos, como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia de tipo 1, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosomal, como enfermedad de celulas I/pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar de tipo II, poliendocrinopatia/hiperinsulinemia, diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, glicanosis CDG de tipo 1, hipertiroidismo congenito, osteogenesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insfpida (DI), DI neurohipofisaria, DI nefrogena, smdrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, paralisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurologicos de poliglutamina como Huntington, ataxia espinocerebelosa de tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentallubral pallidoluysiana y distrofia miotonica, asf como encefalopatfas espongiformes, como la enfermedad hereditaria de Creutzfeldt-Jakob (debido a un defecto en el procesamiento de la protema del prion), Enfermedad de Fabry, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, EPOC, enfermedad del ojo seco o enfermedad de Sjogren, osteoporosis, osteopenia, curacion osea y crecimiento oseo (incluida la reparacion osea, la regeneracion osea, la reduccion de la resorcion osea y el aumento de la deposicion osea), el smdrome de Gorham, canalopatfas de cloruro como miotoma congenita (formas de Thomson y Becker), smdrome de Bartter de tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hipereplexia, enfermedad de almacenamiento lisosomal, smdrome de Angelman y discinesia ciliar primaria (DCP), un termino para trastornos hereditarios de la estructura y/o funcion de los cilios, incluyendo DCP con situs inversus (tambien conocido como smdrome de Kartagener), DCP sin situs inversus y aplasia ciliar.
[0073] El metodo descrito en este documento incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones tal como se define en el presente documento. Como se describe en este documento, el paciente posee formas mutantes de CFTR humano. En otras realizaciones, el paciente posee una o mas de las siguientes mutaciones AF508, R117H, y G551D de CFTR humano. Como se describe en este documento, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que posee la mutacion AF508 de CFTR humana que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que posee la mutacion G551D de CFTR humana que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que posee la mutacion AF508 de CFTR humana en al menos un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que posee la mutacion AF508 de CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe aqrn, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que posee la mutacion G551D de CFTR humana en al menos un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en un paciente que posee la mutacion G551D de CFTR humana en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento.
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[0074] El metodo descrito en este documento incluye reducir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que comprende la administracion a dicho paciente de una de las composiciones tal como se define en el presente documento. Como se describe en este documento, el paciente posee formas mutantes de CFTR humano. En otras realizaciones, el paciente posee una o mas de las siguientes mutaciones AF508, R117H, y G551D de CFTR humano. Como se describe en este documento, el metodo incluye disminuir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que posee la mutacion AF508 de CFTR humano que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en el presente documento, el metodo incluye disminuir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que posee la mutacion G551D de CFTR humana que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye disminuir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que posee la mutacion AF508 de CFTR humano en al menos un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye disminuir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que posee la mutilacion AF508 de CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye disminuir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que posee la mutacion G551D de CFTR humana en al menos un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento. Como se describe en este documento, el metodo incluye disminuir la gravedad de la fibrosis qmstica en un paciente que posee la mutacion G551D de CFTR humana en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se define en este documento.
[0075] En algunos aspectos, se describe aqm un metodo para tratar o disminuir la gravedad de la osteoporosis en un paciente que comprende administrar a dicho compuesto de paciente de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0076] Como se describe aqm, el metodo de tratar o disminuir la gravedad de la osteoporosis en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una composicion farmaceutica como se describe aqm.
[0077] En algunos aspectos, se describe en el presente documento un metodo para tratar o disminuir la gravedad de la osteopenia en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0078] Como se describe en el presente documento, el metodo de tratar o disminuir la gravedad de la osteopenia en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una composicion farmaceutica como se describe aqm.
[0079] En algunos aspectos, se describe aqm un metodo de curacion del hueso y/o la reparacion osea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0080] Como se describe aqm, el metodo de curacion del hueso y/o la reparacion osea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una composicion farmaceutica como se describe aqm.
[0081] En algunos aspectos, se describe aqm un metodo de reduccion de la resorcion osea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0082] En algunos aspectos, se describe en el presente documento un metodo para aumentar la deposicion osea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0083] Como se describe aqm, el metodo de aumento de la deposicion osea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una composicion farmaceutica como se describe aqm.
[0084] En algunos aspectos, se describe aqm un metodo para tratar o disminuir la gravedad de la EPOC en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0085] Como se describe aqm, el metodo de tratar o disminuir la gravedad de la EPOC en un paciente comprende la administracion a dicho paciente de una composicion farmaceutica como se describe aqm.
[0086] En algunos aspectos, se describe aqm un metodo para tratar o disminuir la gravedad de la EPOC inducida por humo en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0087] Como se describe aqm, el metodo de tratar o disminuir la gravedad de humo inducida por la EPOC en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una composicion farmaceutica como se describe aqm.
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[0088] En algunos aspectos, se describe aqrn un metodo para tratar o disminuir la gravedad de la bronquitis cronica en un paciente que comprende administrar a dicho paciente compuesto de Formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0089] Como se describe aqrn, el metodo de tratar o disminuir la gravedad de la bronquitis cronica en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composicion farmaceutica como se describe en el presente documento. De acuerdo con una realizacion alternativa preferida, se describe en la presente un metodo para tratar la fibrosis qrnstica que comprende la etapa de administrar a dicho mairnfero una composicion que comprende un compuesto de la presente invencion.
[0091] Segun la invencion, una "cantidad eficaz" del compuesto o composicion farmaceuticamente aceptable es la cantidad eficaz para tratar o disminuir la gravedad de una o mas de las enfermedades, trastornos o condiciones como se menciona anteriormente.
[0092] Descrito con mas detalle en el presente documento es un metodo de administracion de una composicion farmaceutica mediante la administracion oral a un paciente al menos una vez por dfa de la composicion que comprende un compuesto de Formula 1. Como se describe aqrn, el metodo comprende administrar una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula 1 cada 24 horas. Como se describe en este documento, el metodo comprende administrar una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula 1 cada 12 horas. Como se describe en este documento, el metodo comprende administrar una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula 1 tres veces al dfa. Como se describe en este documento, el metodo comprende administrar una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de Formula 1 cada 4 horas.
[0093] Los compuestos y composiciones, de acuerdo con el metodo de la presente invencion, pueden administrarse usando cualquier cantidad y cualquier via de administracion eficaz para tratar o disminuir la gravedad de una o mas de las enfermedades, trastornos o condiciones como se menciona anteriormente.
[0094] En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones de la presente invencion son utiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en pacientes que exhiben actividad CFTR residual en la membrana apical de los epitelios respiratorios y no respiratorios. La presencia de actividad de CFTR residual en la superficie epitelial puede detectarse facilmente usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, tecnicas electrofisiologicas, bioqmmicas o histoqmmicas estandar. Tales metodos identifican la actividad CFTR utilizando tecnicas electrofisiologicas in vivo o ex vivo, la medicion de concentraciones Cl- de sudor o saliva, o tecnicas bioqmmicas o histoqmmicos ex vivo para controlar la densidad de la superficie celular. Usando tales metodos, la actividad de CFTR residual puede detectarse facilmente en pacientes heterocigotos u homocigotos para una variedad de diferentes mutaciones, que incluyen pacientes homocigotos o heterocigotos para la mutacion mas comun, AF508.
[0095] En otra realizacion, los compuestos y composiciones de la presente invencion son utiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en pacientes que tienen actividad CFTR residual inducida o aumentada utilizando metodos farmacologicos o de terapia genica. Tales metodos aumentan la cantidad de CFTR presente en la superficie celular, induciendo de este modo una actividad de CFTR hasta ahora ausente en un paciente o aumentando el nivel existente de actividad de CFTR residual en un paciente.
[0096] En una realizacion, los compuestos y composiciones de la presente invencion son utiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en los pacientes dentro de ciertos genotipos que presentan actividad de CFTR residual, por ejemplo, mutaciones de clase III (de regulacion o de compuerta deteriorada), mutaciones de clase IV (conductancia alterada), o mutaciones de clase V (smtesis reducida) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, fibrosis qrnstica de tipo I, II, III, IV y V Tansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy; Current Opinion in Pulmonary Medicine 6: 521 - 529, 2000). Otros genotipos de pacientes que muestran actividad de CFTR residual incluyen pacientes homocigotos para una de estas clases o heterocigotos con cualquier otra clase de mutaciones, que incluyen mutaciones de clase I, mutaciones de clase II o una mutacion que carece de clasificacion.
[0097] En una realizacion, los compuestos y composiciones de la presente invencion son utiles para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis qrnstica en pacientes dentro de ciertos fenotipos clmicos, por ejemplo, un fenotipo clmico moderado a leve que por lo general se correlaciona con la cantidad de actividad de CFTR residual en la membrana apical del epitelio. Dichos fenotipos incluyen pacientes que presentan insuficiencia pancreatica o pacientes diagnosticados con pancreatitis idiopatica y ausencia bilateral congenita del conducto deferente o enfermedad pulmonar leve.
[0098] La cantidad exacta requerida variara de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, y condicion general del sujeto, la gravedad de la infeccion, el agente particular, su modo de administracion, y similares. Los compuestos de la invencion se formulan preferiblemente en forma de unidad de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La expresion "forma de unidad de dosificacion" como se usa en el presente documento se refiere a una unidad ffsicamente discreta de agente apropiada para el paciente a tratar. Se entendera, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invencion sera
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decidido por el medico tratante dentro del alcance del buen criterio medico. El nivel de dosis efectivo espedfico para cualquier paciente u organismo particular dependera de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se trata y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; medicamentos usados en combinacion o coincidentes con el compuesto espedfico empleado, y factores similares bien conocidos en las artes medicas. El termino "paciente", como se usa en el presente documento, significa un animal, preferiblemente un mairnfero, y lo mas preferiblemente un ser humano.
[0099] Las composiciones farmaceuticamente aceptables de esta invencion pueden administrarse a seres humanos y otros animales por via oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, topica (como mediante polvos, unguentos, gotas o parche), bucal, como un spray oral o nasal, o similar, dependiendo de la gravedad de la infeccion que se trata. En ciertas realizaciones, los compuestos de la invencion se pueden administrar por via oral o parenteral a niveles de dosificacion de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por dfa, una o mas veces al dfa, para obtener el efecto terapeutico deseado.
[0100] Las formas de dosificacion lfquidas para administracion oral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas de los compuestos activos, las formas de dosificacion lfquidas pueden contener diluyentes inertes usados comunmente en la tecnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, semilla de algodon, mam, mafz, germenes, oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfunlico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan, y mezclas de los mismos. Ademas de los diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.
[0101] Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables esteriles se pueden formular de acuerdo con la tecnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension adecuados. La preparacion inyectable esteril tambien puede ser una solucion, suspension o emulsion inyectable esteril en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vehnculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan el agua, la solucion de Ringer, la USP y la solucion isotonica de cloruro de sodio. Ademas, los aceites fijos esteriles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspension. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo blando incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, los acidos grasos tales como el acido oleico se usan en la preparacion de inyectables.
[0102] Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtracion a traves de un filtro de retencion de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas esteriles que pueden disolverse o dispersarse en agua esteril u otro medio inyectable esteril antes de su utilizacion.
[0103] Para prolongar el efecto de un compuesto de la presente invencion, a menudo es deseable disminuir la absorcion del compuesto de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspension lfquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorcion del compuesto depende entonces de su velocidad de disolucion que, a su vez, puede depender del tamano del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorcion retardada de una forma de compuesto administrada por via parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehnculo de aceite. Las formas de deposito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del compuesto en polfmeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolido. Dependiendo de la relacion de compuesto a polfmero y la naturaleza del polfmero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberacion del compuesto. Los ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhndridos). Las formulaciones inyectables de deposito tambien se preparan atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
[0104] Las composiciones para administracion rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de esta invencion con excipientes o vehnculos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son solidos a temperatura ambiente pero lfquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derriten en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
[0105] Las formas de dosificacion solidas para administracion oral incluyen capsulas, comprimidos, pfldoras, polvos, y granulos. En tales formas de dosificacion solidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o vetnculo inerte, farmaceuticamente aceptable tal como citrato sodico o fosfato dicalcico y/o a) cargas o extendedores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y acido silfcico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arabiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido
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algmico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardadores de la solucion tales como parafina, f) aceleradores de la absorcion tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetflico y monoestearato de glicerol; h) absorbentes tales como caolm y arcilla de bentonita, y i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de capsulas, tabletas y pfldoras, la forma de dosificacion tambien puede comprender agentes tamponantes.
[0106] Las composiciones solidas de un tipo similar tambien se pueden emplear como cargas en capsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azucar de la leche asf como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificacion solidas de tabletas, grageas, capsulas, pfldoras y granulos se pueden preparar con revestimientos y cubiertas tales como revestimientos entericos y otros recubrimientos bien conocidos en la tecnica de formulacion farmaceutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y tambien pueden ser de una composicion en la que liberan el (los) ingrediente(s) activo(s) solo(s), o preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de forma retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusion que se pueden usar incluyen sustancias polimericas y ceras. Tambien se pueden emplear composiciones solidas de un tipo similar como cargas en capsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azucar de la leche asf como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
[0107] Los compuestos activos tambien pueden estar en forma microencapsulada con uno o mas excipientes como se ha indicado anteriormente. Las formas de dosificacion solidas de tabletas, grageas, capsulas, pfldoras y granulos se pueden preparar con revestimientos y cubiertas tales como revestimientos entericos, recubrimientos que controlan la liberacion y otros revestimientos bien conocidos en la tecnica de formulacion farmaceutica. En tales formas de dosificacion solidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidon. Dichas formas de dosificacion tambien pueden comprender, como es practica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes de formacion de comprimidos y otros auxiliares de formacion de comprimidos, tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de capsulas, tabletas y pfldoras, las formas de dosificacion tambien pueden comprender agentes tamponantes. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y tambien pueden ser de una composicion en la que liberan el (los) ingrediente(s) activo(s) solo, o preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de forma retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusion que se pueden usar incluyen sustancias polimericas y ceras.
[0108] Las formas de dosificacion para administracion topica o transdermica de un compuesto de esta invencion incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla en condiciones esteriles con un vehfculo farmaceuticamente aceptable y cualquier conservante o tampon necesario segun se requiera. La formulacion oftalmica, gotas para los ofdos y gotas para los ojos tambien se contemplan dentro del alcance de esta invencion. Adicionalmente, la presente invencion contempla el uso de parches transdermicos, que tienen la ventaja adicional de proporcionar la administracion controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificacion se preparan disolviendo o dispensando el compuesto en el medio apropiado. Los potenciadores de la absorcion tambien pueden usarse para aumentar el flujo del compuesto a traves de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz o gel de polfmero.
[0109] La actividad de un compuesto utilizado en esta invencion como un modulador de CFTR puede ensayarse segun los metodos descritos en general en la tecnica y en los ejemplos de la presente memoria.
[0110] Tambien se apreciara que los compuestos y composiciones farmaceuticamente aceptables de la presente invencion se pueden emplear en terapias de combinacion, es decir, los compuestos y composiciones farmaceuticamente aceptables pueden administrarse simultaneamente con, antes de, o posteriormente a, uno o mas procedimientos terapeuticos o medicos deseados. La combinacion particular de terapias (terapeuticas o procedimientos) para empleo en un regimen de combinacion tendra en cuenta la compatibilidad de los tratamientos y/o procedimientos terapeuticos deseados y el efecto terapeutico deseado a alcanzar. Tambien se apreciara que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invencion se puede administrar simultaneamente con otro agente usado para tratar el mismo trastorno), o pueden lograr diferentes efectos (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso). Como se usa en el presente documento, los agentes terapeuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion particular se conocen como "apropiados para la enfermedad o afeccion que se trata".
[0111] En una realizacion, el agente adicional se selecciona de un agente mucolftico, broncodilatador, un agente anti-biotico, anti-infeccioso, un agente antiinflamatorio, un modulador CFTR distinto de un compuesto de la presente invencion, o un agente nutricional.
[0112] En una realizacion, el agente adicional es un antibiotico. Los ejemplos de antibioticos utiles en la presente invencion incluyen tobramicina, que incluye polvo inhalado de tobramicina (TlP), azitromicina, aztreonam, incluyendo la forma aerosolizada de aztreonam, amicacina, incluyendo formulaciones liposomales de los mismos,
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ciprofloxacina, incluyendo formulaciones de los mismos adecuadas para administracion por inhalacion, levoflaxacina, incluyendo formulaciones aerosolizadas de las mismas, y combinaciones de dos antibioticos, por ejemplo, fosfomicina y tobramicina.
[0113] En otra realizacion, el agente adicional es un mucolito. Los ejemplos de mucolitos utiles en la presente incluyen Pulmozyme®.
[0114] En otra realizacion, el agente adicional es un broncodilatador. Ejemplos de broncodilatadores incluyen albuterol, sulfato de metaprotenerol, acetato de pirbuterol, salmeterol o sulfato de tetrabulina.
[0115] En otra realizacion, el agente adicional es eficaz para restaurar el lfquido de la superficie de las vfas respiratorias pulmonares. Tales agentes mejoran el movimiento de la sal dentro y fuera de las celulas, permitiendo que la mucosidad de las vfas respiratorias del pulmon este mas hidratada y, por lo tanto, se aclare mas facilmente. Ejemplos de tales agentes incluyen solucion salina hipertonica, denufosol tetrasodico ([[(3S, 5R)-5-(4-amino-2- oxopirimidina-1-ilo)-3-hidroxioxolano-2-ilo]metoxi-hidroxifosforil] [[[(2R, 3S, 4R, 5R)-5-(2,4-dioxopirimidina-1-ilo)-3, 4- dihidroxioxolano-2-ilo]metoxi-hidroxifosforilo]oxihidroxifosforilo] hidrogenofosfato), o bronchitol (en formulacion ligada de manitol).
[0116] En otra realizacion, el agente adicional es un agente antiinflamatorio, es decir, un agente que puede reducir la inflamacion en los pulmones. Los ejemplos de tales agentes utiles en la presente incluyen ibuprofeno, acido docosahexanoico (DHA), sildenafilo, glutation inhalado, pioglitazona, hidroxicloroquina o simavastatina.
[0117] En otra realizacion, el agente adicional es un modulador CFTR distinto del compuesto 1, es decir, un agente que tiene el efecto de modular la actividad CFTR. Ejemplos de tales agentes incluyen ataluren ("PTC124®"; acido 3- [5-(2-fluorofenilo)-1,2,4-oxadiazol-3-ilo]benzoico), sinapultida, lancovutida, depelestat (un inhibidor de elastasa de neutrofilo recombinante humano), cobiprostona (7-{(2R, 4aR, 5R, 7aR)-2-[(3S)-1,1-difluoro-3-metilpentilo]-2-hidroxi- 6-oxooctahidrociclopenta[b]pirano-5-ilo}acido heptanoico) o acido (3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-ilo) ciclopropanocarboxamido)-3-metilpiridina-2-ilo)benzoico. En otra realizacion, el agente adicional es acido (3-(6-(1- (2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-ilo)ciclopropanocarboxamido)-3-metilpiridina-2-ilo)benzoico.
[0118] En otra realizacion, el agente adicional es un agente nutricional. Ejemplos de tales agentes incluyen pancrelipasa (reemplazo de la enzima pancreante), incluyendo Pancrease®, Pancreacarb®, Ultrase® o Creon®, Liprotomase® (anteriormente Trizytek®), Aquadeks® o inhalacion de glutation. En una realizacion, el agente nutricional adicional es pancrelipasa.
[0119] La cantidad de agente terapeutico adicional presente en las composiciones de esta invencion no sera mas que la cantidad que normalmente se administrana en una composicion que comprende ese agente terapeutico como el unico agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapeutico adicional en las composiciones descritas actualmente variara de aproximadamente 50% a 100% de la cantidad normalmente presente en una composicion que comprende ese agente como el unico agente terapeuticamente activo.
[0120] Los compuestos de esta invencion o composiciones farmaceuticamente aceptables de los mismos tambien pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo medico implantable, tales como protesis, valvulas artificiales, injertos vasculares, stents y cateteres. Por consiguiente, la presente invencion, en otro aspecto, incluye una composicion para recubrir un dispositivo implantable que comprende un compuesto de la presente invencion como se describe en general anteriormente, y en clases y subclases de la presente, y un vehfculo adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable. En otro aspecto mas, la presente invencion incluye un dispositivo implantable recubierto con una composicion que comprende un compuesto de la presente invencion como se describe en general anteriormente, y en clases y subclases de este documento, y un vehfculo adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable. Revestimientos adecuados y la preparacion general de dispositivos implantables revestidos se describen en las patentes de los Estados Unidos 6.099.562; 5.886.026; y 5.304.121. Los revestimientos son tfpicamente materiales polimericos biocompatibles tales como un polfmero de hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenglicol, acido polilactico, acetato de vinilo de etileno y mezclas de los mismos. Los revestimientos pueden estar opcionalmente cubiertos adicionalmente por una capa superior adecuada de fluorosilicona, polisacaridos, polietilenglicol, fosfolipidos o combinaciones de los mismos para impartir caractensticas de liberacion controlada en la composicion.
[0121] Otro aspecto de la descripcion se refiere a la modulacion de la actividad de CFTR en una muestra biologica o un paciente (in vitro), metodo que comprende poner en contacto dicha muestra biologica con un compuesto de Formula I o una composicion que comprende dicho compuesto. El termino "muestra biologica", como se usa en este documento, incluye, sin limitacion, cultivos celulares o extractos de los mismos; material de biopsia obtenido de un mairnfero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lagrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
[0122] La modulacion de CFTR en una muestra biologica es util para una variedad de propositos que son conocidos por un experto en la tecnica. Los ejemplos de tales propositos incluyen, pero no se limitan al estudio de CFTR en fenomenos biologicos y patologicos; y la evaluacion comparativa de nuevos moduladores de CFTR.
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[0123] En otra realizacion mas de la divulgacion, se proporciona un metodo para modular la actividad de un canal anionico in vitro que comprende la etapa de poner en contacto dicho canal con un compuesto de Formula I. En realizaciones preferidas de la divulgacion, el canal anionico es un canal de cloruro o un canal de bicarbonato. En otras realizaciones preferidas, el canal anionico es un canal de cloruro.
[0124] La presente descripcion proporciona un metodo para aumentar el numero de CFTR funcionales en una membrana de una celula, que comprende la etapa de poner en contacto dicha celula con un compuesto de formula I.
[0125] Segun otra realizacion preferida de la descripcion, la actividad del CFTR se mide al medir el potencial de voltaje de transmembrana. Los medios para medir el potencial de voltaje a traves de una membrana en la muestra biologica pueden emplear cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica, tales como el ensayo del potencial de membrana optica u otros metodos electrofisiologicos.
[0126] El ensayo potencial de membrana optica utiliza sensores FRET sensibles al voltaje descritos por Gonzalez y Tsien (Vease, Gonzalez, JE y RY Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells." Biophys J 69 (4): 1272-80, y Gonzalez, JE y RY Tsien (1997); "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer" Chem Biol 4 (4): 269-77) en combinacion con instrumentacion para medir cambios de fluorescencia tales como el lector de sonda de voltaje/iones (VIPR) (Vease, Gonzalez, JE, K. Oades, y otros (1999) "Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4 (9): 431-439).
[0127] Estos ensayos sensibles al voltaje se basan en el cambio en la transferencia de energfa resonante de fluorescencia (FRET) entre el colorante sensible a la tension soluble en la membrana, DiSBAC2(3), y un fosfolfpido fluorescente, CC2-DMPE, que esta unido a la valva externa de la membrana plasmatica y actua como donador de FRET. Los cambios en el potencial de membrana (Vm) hacen que el DiSBAC2(3) con carga negativa se redistribuya a traves de la membrana plasmatica y la cantidad de transferencia de energfa de CC2-DMPE cambia en consecuencia. Los cambios en la emision de fluorescencia se pueden controlar usando VIPRTM II, que es un controlador de lfquidos integrado y un detector fluorescente disenado para realizar pantallas basadas en celulas en placas de microtitulacion de 96 o 384 pocillos.
[0128] Aqrn se describe un metodo para modular la actividad CFTR en una muestra biologica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biologica con un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente.
[0129] Aqrn se describe un metodo in vitro para modular la actividad de CFTR en una muestra biologica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biologica con un compuesto de la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0130] Aqrn se describe un metodo in vitro para modular la actividad de CFTR en una muestra biologica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biologica con un compuesto de la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
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[0131] En una realizacion, la presente invencion proporciona una cantidad efectiva de un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R se define como anteriormente para uso en un metodo para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente y dicha enfermedad se selecciona de fibrosis qmstica, asma, EPOC inducida por humo, bronquitis cronica, rinosinusitis, estrenimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreatica, infertilidad masculina causada por ausencia congenita bilateral del conducto deferente (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopatica, aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA), enfermedad hepatica, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de coagulacion y fibrinolisis, como deficiencia de protema C, angioedema hereditario de tipo 1, deficiencias de procesamiento de lfpidos, como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia de tipo 1, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosomal, tal como enfermedad de celulas I/pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar tipo II, poliendocrinopatia/hiperinsulinemia, diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, glicanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congenito, osteogenesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insfpido (DI), DI neurohipofisario, DI nefrogeno, smdrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, paralisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurologicos de la poliglutamina como Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia pallidoluisiana dentatorubral y distrofia miotonica, asf como encefalopatfas espongiformes, como enfermedad hereditaria de Creutzfeldt-Jakob (debido a un defecto en el procesamiento de la protema prionica), enfermedad de Fabry, smdrome de Gertsmann-Straussler-Scheinker, EPOC, enfermedad del ojo seco o enfermedad de Sjogren.
[0132] Como se describe en este documento, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente administrando a dicho paciente una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0133] Como se describe, el metodo incluye tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente administrando a dicho paciente una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0134] En una realizacion adicional, la enfermedad es fibrosis qmstica.
[0135] En otro aspecto, la presente invencion proporciona un kit para uso en la medicion de la actividad de CFTR o un fragmento del mismo en una muestra biologica in vitro o in vivo que comprende (i) una composicion que comprende un compuesto de Formula I o cualquiera de las realizaciones anteriores; e (ii) instrucciones para a) poner en contacto la composicion con la muestra biologica y b) medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo.
[0136] En una realizacion, el kit comprende ademas instrucciones para a) poner en contacto una composicion adicional con la muestra biologica; b) medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo en presencia de dicho compuesto adicional, y c) comparar la actividad del CFTR en presencia del compuesto adicional con la densidad del CFTR en presencia de dicha composicion que comprende un compuesto de Formula I.
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[0137] En realizaciones preferidas, el kit se usa para medir la densidad de CFTR.
[0138] En una realizacion, el kit incluye una composicion que comprende un compuesto que tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0139] En una realizacion, el kit incluye una composicion que comprende un compuesto que tiene la estructura:
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
[0140] Para que la invencion descrita en este documento pueda entenderse mas completamente, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos de esta invencion de ninguna manera.
EJEMPLOS
Preparacion 1: Sintesis total de acidO4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxnico (26)
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Procedimiento para la preparacion de 4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo (25)
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[0143] Compuesto 23 (4,77 g, 47,7 mmol) se anadio gota a gota al compuesto 22 (10 g, 46,3 mmol) con flujo N2 subsuperficial para expulsar a etanol por debajo de 30°C durante 0,5 horas. La soluciOn luego se calento a 100- 110°C y se agitO durante 2,5 horas. Despues de enfriar la mezcla a menos de 60°C, se anadiO eter difennico. La soluciOn resultante se anadiO gota a gota a eter difemlico que se habfa calentado a 228-232°C durante 1,5 horas con flujo subsuperficial de N2 para expulsar el etanol. La mezcla se agitO a 228-232°C durante otras 2 horas, se enfriO por debajo de 100°C y luego se anadiO heptano para precipitar el producto. La suspensiOn espesa resultante se agitO a 30°C durante 0,5 horas. Los sOlidos se filtraron despues, y la torta se lavO con heptano y se secO a vaco para dar el compuesto 25 como un sOlido marrOn. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 12,25 (s), 8 8,49 (d), 8 8,10 (m), 8 7,64 (m), 8 7,55 (m), 8 7,34 (m), 8 4,16 (q), 8 1,23 (t).
Procedimiento para la preparacion de acidO4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carbox^lico (26)
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Metodo 1
[0145] Compuesto 25 (1,0 eq) se suspendiO en una soluciOn de HCl (10,0 eq) y H2O (11,6 vol). La suspensiOn se calentO a 85 - 90°C, aunque las temperaturas alternativas tambien son adecuadas para esta etapa de hidrOlisis. Por ejemplo, la hidrOlisis puede realizarse alternativamente a una temperatura de aproximadamente 75 a aproximadamente 100°C. En algunos casos, la hidrOlisis se realiza a una temperatura de aproximadamente 80 a aproximadamente 95°C. En otros, la etapa de hidrOlisis se realiza a una temperatura de aproximadamente 82 a aproximadamente 93°C (por ejemplo, de aproximadamente 82,5 a aproximadamente 92,5°C o de aproximadamente 86 a aproximadamente 89°C). Despues de agitarse a 85 - 90°C durante aproximadamente 6,5 horas, se tomaron muestras de la reacciOn para completar la reacciOn. La agitaciOn puede realizarse bajo cualquiera de las temperaturas adecuadas para la hidrOlisis. La soluciOn se enfriO luego a 20 - 25°C y se filtrO. El reactor/torta se aclarO con H2O (2 vol x 2). La torta se lavO luego con 2 vol H2O hasta pH > 3,0. La torta se secO luego a vado a 60°C para dar el compuesto 26.
Metodo 2
[0146] Compuesto 25 (11,3 g, 52 mmol) se anadiO a una mezcla de 10% de NaOH (ac) (10 mL) y etanol (100 mL). La soluciOn se calentO a reflujo durante 16 horas, se enfriO a 20-25°C y luego el pH se ajustO a 2-3 con 8% de HCl. La mezcla se agitO luego durante 0,5 horas y se filtrO. La torta se lavO con agua (50 mL) y luego se secO a vaco para dar el compuesto 26 como un sOlido marrOn. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 15,33 (s), 8 13,39 (s), 8 8,87 (s), 8 8,26 (m), 8 7,87 (m), 8 7,80 (m), 8 7,56 (m).
Ejemplo 1: Smtesis total de N-(2-terc-butilo-5-hidroxi-4-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-ilo)fenilo)-4-oxo-1,4- dihidroquinolina-3-carboxamida (27)
[0147] El esquema general de la smtesis del compuesto 27 se muestra a continuaciOn, seguido por el procedimiento para la smtesis de cada intermedio sintetico.
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Procedimiento para la preparacion de 2-hidroxi-5-terc-butilbenzaldeMdo (2)
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[0149] A una solucion agitada de compuesto 1 (700 g, 4,66 mol) en CH3CN (7,0 L) se anadio MgCl2 (887 g, 9,32 mol), para-formaldel'ndo (1,190 g) y TEA (2,5 L, 17,9 mol) en atmosfera de N2. La mezcla se calento a reflujo durante
5 horas. Despues de enfriarse a temperatura ambiente, se anadieron 2 L de agua con hielo a la mezcla, seguido de
6 L de 3 M HCl (ac). La suspension se dejo en agitacion hasta que la solucion se volvio transparente. La capa organica se separo y la capa acuosa se extrajo con MTBE (3 Lx3). Las capas organicas se combinaron y se concentraron a sequedad. El residuo se disolvio en MTBE (4000 mL), se lavo con agua (1000 mLx2) y salmuera (1000 mL), se seco sobre Na2SO4 anhidro, se filtro, luego se concentro para dar el compuesto 2 como un solido de color amarillo claro que se uso en la siguiente reaccion sin mas secado o purificacion. 1H RMN (CDCh; 400 MHz) 8 10,86 (s), 8 9,89 (s), 8 7,59 (m), 8 7,51 (d), 8 6,94 (d), 8 10,61 (s).
Procedimiento para la preparacion de 2-(benciloxi)-5-terc-butilbenzaldeh^do (3)
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[0151] A una solucion agitada del compuesto 2 (614,5 g, 3,33 mol) en DMF (3,5 L) se anadio K2CO3 (953 g, 6,90 mol) y cloruro de bencilo (480 g, 3,80 mol). La mezcla se calento a 90°C y se dejo en agitacion durante 3 horas. La suspension se enfrio a temperatura ambiente, luego se anadio MTBE (2 L), seguido de agua (12 L). La mezcla se agito despues durante 10 minutos y la capa acuosa se separo y se extrajo con MTBE (2 Lx3). Las capas organicas se combinaron y se lavaron con agua (2 Lx2) y salmuera (1,5 L X 1) y se concentraron para dar el compuesto 3 como un solido amarillo claro. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 10,42 (s), 8 7,71 (m), 8 7,51 (m), 8 7,43 (m), 8 7,35 (m), 8 7,24 (m), 8 5,27 (s), 8 1,26 (s).
Procedimiento para la preparacion de alcohol 2-(benciloxi)-5-terc-butilbencUico (4)
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[0153] A una suspension agitada del compuesto 3 (974 g, 3,63 mol) en MeOH (4000 mL) se anadio lentamente NaBH4 (121 g, 3,20 mol) a 0-20°C. La solucion se dejo en agitacion a 15°C durante 3 horas, y luego se enfrio a 0°C. Se anadio 2N HCl (ac) (1300 mL) gota a gota a menos de 20°C. La solucion se filtro luego y se evaporo a sequedad, y el residuo se disolvio en MTBE (5 L). La solucion se lavo luego con agua (2 Lx2) y salmuera (1,5 L X l). La evaporacion del disolvente dio el compuestO4 como un solido amarillo claro que se uso en la siguiente reaccion sin purificacion adicional. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,40 (m), 8 7,32 (m), 8 7,17 (m), 8 6,91 (m), 8 5,09 (s), 8 5,00 (t), 8 4,56 (d), 8 1,26 (s).
Procedimiento para la preparacion de cloruro de 2-(benciloxi)-5-terc-butilbencilo (5)
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[0155] A una solucion agitada de compuestO4 (963 g, 3,56 mol) en DCM anhidro (2000 mL) se anadio lentamente SOCl2 (535 g, 4,5 mol) a 0°C. La mezcla se agito a 20°C durante 2 horas, luego se concentro a vacfo para dar el compuesto 5 como un aceite, que se uso en la siguiente reaccion sin mas secado o purificacion.
Procedimiento para la preparacion de 2-(benciloxi)-5-terc-butilbencilo nitrilo (6)
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[0157] A una solucion agitada del compuesto 5 (1045 g, 3,54 mol) en DMF anhidro (1000 mL) se le anadio KCN (733 g, 11,3 mol). La mezcla se agito a 35°C durante 24 horas, luego se vertio en agua (10 L). Se anadio acetato de etilo (4 L) y la mezcla se agito durante 30 minutes. La capa organica se separo luego y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3000 mL X 2). Las capas organicas se combinaron y se lavaron con agua (4 Lx2) y salmuera (3 Lxl), luego se concentraron a vado para dar el compuesto 6 como un solido amarillo. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,51 (m), 8 7,37 (m), 7,02 (d), 8 5,17 (s), 8 3,88 (s), 1,26 (s).
Procedimiento para la preparacion de 2-(2-(benciloxi)-5-terc-butilfenilo)-2-metilpropanonitrilo (7)
[0158]
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[0159] A una suspension agitada de NaH (86 g, 2,15 moles, 60% en aceite mineral) en DMF (1000 mL) se anadio gota a gota una solucion del compuesto 6 (100,0 g, 0,358 mol) en DMF (500 mL) a 20°C. Despues de agitarse durante 30 minutos, se anadio Mel (205 g, 1,44 moles) en DMF (500 mL) gota a gota a menos de 30°C durante un pertedo de 2 horas. La suspension se agito durante 1,5 horas a 25-30°C, luego se anadio hielo (100 g) lentamente hasta que no se genero gas. El pH se ajusto a aproximadamente 7 mediante la adicion lenta de 2N HCl. La mezcla se diluyo con agua (4 L) y MTBE (2 L). La capa organica se separo y la capa acuosa se extrajo con MTBE (500 mLx2). Las capas organicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y despues se concentraron a vado para dar el compuesto 7 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,56 (m), 8 7,40 (m), 8 7,34 (m), 8 7,10 (d), 8 5,21 (s), 8 1,73 (s), 8 1,27 (s)
Procedimiento para la preparacion de 2-(2-(benciloxi)-5-terc-butilfenilo)-2-metilpropanal (8)
[0160]
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[0161] A una solucion agitada del compuesto 7 (20 g, 0,065 mol) en tolueno (300 mL), se anadio gota a gota DIBAH (80 mL, 1 M en tolueno) a aproximadamente -60 a -50°C. Despues de agitarse durante 2 horas, se anadio 6 N HCl (300 mL) a la mezcla de reaccion y se continuo la agitacion durante 30 minutos. A continuacion, se separo la capa organica, se lavo con 2 N HCl seguido de una solucion NaHCO3, a continuacion, una solucion de salmuera, se seco sobre Na2SO4 y se concentro a vado para proporcionar el compuesto 8 como un aceite. El producto se uso en la siguiente reaccion sin purificacion adicional. 1H RMN (CDCh; 400 MHz) 8 9,61 (s), 8 7,36 (m), 8 7,25 (m), 8 6,87 (m),
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Procedimiento para la preparacion de 2-(2-(benciloxi)-5-terc-butilfenilo)-2-metilpropano-1-ol (9)
[0162]
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[0163] A una solucion en agitacion del compuesto 8 (9,21 g, 0,030 mol) en MeOH (150 mL) se anadio lentamente NaBH4 (2,3 g, 0,061 mol) a 0°C. Despues de agitar la mezcla a 20°C durante 3 horas, se anadieron 12 mL de 6 N HCl y la mezcla se agito durante 30 minutos adicionales. La solucion luego se concentro a aproximadamente un cuarto del volumen original y se extrajo con EtOAc. La capa organica se separo y se lavo con agua y salmuera, se seco con Na2SO4, se filtro, y despues se concentro a vaco para proporcionar el compuesto 9 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,47 (m), 8 7,42 (m), 8 7,34 (m), 8 7,28 (m), 8 7,16 (m), 8 6,94 (m), 8 5,08 (s), 8 4,45 (t), 8 3,64 (d), 8 1,28 (s), 8 1,25 (s).
Procedimiento para la preparacion de 2-(2-hidroxi-5-terc-butilfenilo)-2-metilpropano-1-ol (10)
[0164]
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[0165] Se agito Pd(OH)2 (1 g) y el compuesto 9 (9,26 g, 0,030 mol) en MeOH (200 mL) en hidrogeno a una presion de 20-30 psi durante 16-18 horas. La mezcla luego se filtro a traves de Celite®, y el filtrado se concentro para dar el compuesto 10 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 9,16 (s), 8 7,16 (d), 8 7,00 (m), 8 6,65 (m), 8 4,71 (t), 8 3,62 (d), 8 1,27 (s), 8 1,22 (s).
Procedimiento para la preparacion de 1-((metilcaroboxi)oxi)-2-(1-((metilcarboxi)oxi)-2-metilpropano-2-ilo)-4- terc-butilbenceno (11)
[0166 ]
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[0167] A una solucion agitada del compuesto 10 (23,2 g, 0,10 mol), DMAP (1,44 g) y DIEA (72,8 g, 0,56 mol) en DCM anhidro (720 mL) se anadio gota a gota cloroformiato de metilo (43,5 g, 0,46 mol) en DCM (160 mL) a 0°C. Despues la mezcla se agito a 20°C durante 16 horas, se lavo con agua, 1 N HCl y salmuera, se seco con MgSO4 y se concentro a vaco. El residuo se purifico usando cromatograffa en columna sobre gel de sflice (1:20 de EtOAc: eter de petroleo) para dar el compuesto 11 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,32 (m), 8 7,10 (d), 8 4,26 (s), 8 3,84 (s), 8 3,64 (s), 8 1,31 (s), 8 1,28 (s).
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Procedimiento para la preparacion de 1-((metilcaroboxi)oxi)-2-(1-((metilcarboxi)oxi)-2-metilpropano-2-ilo)-4- terc-butilo-5-nitro-benceno (12)
[0168]
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[0169] A una solucion agitada de compuesto 11 (32 g, 0,095 mol) en DCM (550 mL) se anadio gota a gota 98% H2SO4 (43 g, 0,43 mol) a 0°C. Despues de agitarse durante 20 minutos a 0°C, 65% HNO3 (16,2 g, 0,17 mol) se anadio a la mezcla gota a gota a 0°C. La mezcla se agito despues a 1-10°C durante 4 horas y luego se anadio agua helada (200 mL). La capa acuosa se separo y se extrajo con DCM (200 mL X 3) y las capas organicas combinadas se lavaron con agua (ac), NaHCO3 y salmuera, luego se secaron con MgSO4 y se concentraron a vach. El residuo se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (EtOAc 1:20: eter de petroleo) para proporcionar el compuesto 12 en bruto como un aceite.
Procedimiento para la preparacion de 2-terc-butilo-5-((metilcaroboxi)oxi)-4-(1-((metilcaroboxi)oxi)-2- metilpropano-2-ilo) anilina (13)
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[0171] Pd/C (2,6 g) y el compuesto 12 (14 g, en bruto) se agitaron en MeOH (420 mL) a temperatura ambiente bajo hidrogeno a 20-30 psi de presion durante 16-18 horas. La mezcla luego se filtro con kieselguhr®, y el filtrado se concentro al vach. El residuo se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (EtOAc 1:10: eter de petroleo) para dar el compuesto 13 como un solido gris. 1H RMN (CDCh; 400 MHz) 8 7,26 (s), 8 7,19 (s), 8 4,26 (s), 8 3,89 (s), 8 3,74 (s), 8 1,40 (s), 8 1,35 (s)
Procedimiento para la preparacion de N-(2-terc-butilo-5-((metilcaroboxi)oxi)-4-(1-((metilcaroboxi)oxi)-2- metilo-propano-2-ilo)fenilo)-4- oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (14)
[0172]
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[0173] Se anadio EDCI (5,6 g, 0,029 mol), HOBT (3,8 g, 0,028 mol) y DIEA (6,6 g, 0,051) a una solucion agitada del compuesto 26 (5,0 g, 0,026 mol) en DMF anhidro (120 mL) mol) a 0°C. Despues de agitarse durante 1 hora, la mezcla se anadio gota a gota a una solucion del compuesto 13 (3,0 g, 0,008 mol) en DCM (30 mL) a 0°C. La mezcla se agito a 25°C durante 72 horas, y luego se concentro al vach. El residuo se disolvio en EtOAc (225 mL) y se lavo
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con agua (120 ml X 1), 1N HCl (120 mL) y salmuera, se seco con Na2SO4 y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de s^lice (EtOAc: eter de petroleo 1:1) para dar el compuesto 14 como un solido blanco. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 12,34 (s, 1H), 11,58 (s, 1H), 9,07 (s, 1H), 8,42 (d, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,47 (s, 1 H), 7,39 (s, 1 H), 6,72 (s, 1 H), 4,34 (s, 2 H), 3,82 (s, 3 H), 3,74 (s, 3 H), 1,41 (s, 9 H), 1,40 (s, 6 H).
Procedimiento para la preparacion de N-(2-terc-butilo-5-hidroxi-4-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)fenilo)-4- oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (27)
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[0175] A una solucion agitada de KOH (1,2 g, 0,02 mol) en MeOH (80 mL) se anadio el compuesto 14 (1,9 g, 0,0036 mol) a 0°C. Despues de agitarse durante 2-3 h a 5-15°C, la mezcla se concentro a sequedad. El residuo se trituro luego en agua (10 mL), se filtro, se lavo con DCM y se seco a vado durante 24 horas para dar el compuesto 27 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 12,77 (s), 8 8,86 (s), 8 8,20 (d), 8 7,55 (d), 8 7,42 (t), 8 7,16 (q), 8 7,02 (s), 8 6,85 (m), 8 3,55 (s), 8 1,55 (s), 8 1,35 (s), 8 1,27 (s). MS Encontrado (M + H) 409,2
Ejemplo 2: Sintesis Total Alternativa de N-(2-terc-butilo-5-hidroxi-4-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)fenilo)-4- oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (27)
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Procedimiento para la preparacion de 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-nitrofenilo)-2-metilpropanoato de metilo (38):
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[0178] Una mezcla de 2-bromo-4-terc-butilo-5-nitrofenol (15,00 g, 54,72 mmol), bis(tri-terc-butilfosfano)paladio(O) (1,422 g, 2,783 mmol), fluoruro de zinc (2,82 g, 27,27 mmol), metilo trimetilsililo dimetilcetena acetal (MtDa) (19,35 g, 111,0 mmol) y dimetilformamida (150 mL) se calento a 70°C durante 18 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con agua. Despues de agitarse durante una hora, la fase acuosa se extrajo con MTBE. La fase organica se seco a vacfo para proporcionar el producto bruto como un solido marron. La purificacion del producto se realizo mediante trituracion en n-heptano. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 6 10,38 (s, 1H); 7,37 (s, 1H); 6,79 (s, 1H); 3,54 (s, 3H); 1,45 (s, 6H); 1,32 (s, 9H)
Procedimiento para la preparacion de 4-terc-butilo-2-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)-5-nitrofenol (39):
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[0180] Una solucion 1M de hidruro de litio y aluminio en THF (11,80 mL, 11,80 mmol) se anadio a una solucion de 2- (5-terc-butilo-2-hidroxi-4-nitrofenilo)-2-metilpropanoato (5,36 g, 18,15 mmol) en THF (50 mL). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 h, y luego se diluyo con metanol. La mezcla se acidifico con IN HCl (pH 1-2) y la fase acuosa se extrajo con MTBE. La fase organica se seco a vacfo para proporcionar 4-terc-butilo-2-(1-hidroxi-2- metilpropano-2-ilo)-5-nitrofenol que se uso sin purificacion adicional en la siguiente etapa. 1H-NMR (400 MHz, DMSO- d6) 6 10,12 (s, 1H); 7,37 (s, 1H); 6.80 (s, 1H); 4,77 (s, 1H); 3,69-3,65 (m, 2H); 1,30 (s, 9H); 1,29 (s, 6 H)
Procedimiento para la preparacion de carbonato de 4-terc-butilo-2-(2-metoxicarboniloxi-1,1-dimetilo-etilo)-5- nitro-fenilo] metilo (12)
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[0182] A una solucion de 4-terc-butilo-2-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)-5-nitrofenol (1,92 g, 7.18 mmol), trietilamina (1,745 g, 17,24 mmol), y dimetilaminopiridina (87,74 mg, 0,718 mmol) en diclorometano (30 mL) a 0°C se cargo
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lentamente con cloroformiato de metilo (2,376 g, 25,14 mmol), manteniendo la temperatura por debajo de 5°C. Despues de la adicion, la mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito hasta que la HPLC mostro la conversion completa del material de partida (2-8 h). La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se acidifico con 1N HCl (pH 1-2). La fase acuosa se extrajo con DCM y los extractos organicos combinados se secaron al vaco. El semisolido ambar bruto se recristalizo en metanol y diclorometano para dar el compuesto del titulo como un solido cristalino amarillo. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 7,67 (s, 1H); 7,52 (s, 1H); 4,30 (s, 2H); 3,86 (s, 3H); 3,64 (s, 3H); 1,35 (s, 9 H); 1,35 (s, 6 H)
Procedimiento para la preparacion de carbonato de 5-amino-4-terc-butilo-2-(2-metoxicarboniloxi-1,1-dimetilo- etilo)fenilo] metilo (13):
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[0184] Una mezcla de carbonato de [4-terc-butilo-2-(2-metoxicarboniloxi-1,1-dimetilo-etilo)-5-nitrofenilo] metilo (1,27 g, 3,313 mmol) y Pd/C (75 mg, 0,035 mmol) en metanol (50 mL) se purgo con nitrogeno. Despues de purgar el matraz con hidrogeno, la mezcla se hidrogeno durante 18 horas a temperatura y presion ambiente. La solucion se filtro a traves de Celite® y se seco a vado para obtener el producto como un solido. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 6,99 (s, 1H); 6.39 (s, 1H); 4,92 (s, 2H); 4,13 (s, 2H); 3,82 (s, 3H); 3,65 (s, 3H); 1,32 (s, 9H); 1,23 (s, 6 H)
Procedimiento para la preparacion de N-(2-terc-butilo-5-hidroxi-4-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)fenilo)-4- oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (27):
[0185]
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[0186] A una mezcla de carbonato de [5-amino-4-terc-butilo-2-(2-metoxicarboniloxi-1,1-dimetilo-etilo)fenilo] metilo (103 mg, 0,29 mmol), acido 4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxflico (50 mg, 0,26 mmol), y piridina (42 mg, 0,53 mmol) en 2-MeTHF (3.0 mL) se cargo T3P como una solucion al 50% en peso en 2-MeTHF (286 mg, 0,45 mmol). La
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mezcla se calento a 50°C durante 18 h. Despues de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla se diluyo con agua. La fase organica se separo y se lavo de nuevo con agua. Metoxido de sodio (39 mg, 0,72 mmol) se cargo a la fase organica y la solucion se agito durante 2 horas. La reaccion se inactivo con 1N HCl, y despues de separar las fases, la fase organica se lavo con 0,1N HCl. La fase organica se seco in vacuo para producir el Compuesto 27 como un solido. El espectro 1H-RMN fue consistente con el reportado anteriormente.
Ejemplo 3: Sintesis total de acido 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-(4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-
carboxamido)fenilo)-2-metilpropanoico (28):
[0187]
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Procedimiento para la preparacion de 2-(5-terc-butilo-2-hidroxifenilo)-2-metilpropanonitrilo (15)
[0188]
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[0189] Se agitaron Pd(OH)2/C (2,0 g) y el compuesto 7 (20,0 g, 0,104 mol) en MeOH (150 mL) a temperatura ambiente bajo hidrogeno a una presion de 10 psi durante 16-18 horas. La mezcla se filtro entonces a traves de una almohadilla de Celite®, y el filtrado se concentro para dar el compuesto 15, que se uso en la siguiente reaccion sin purificacion adicional. 1H RMN (DMSO-da; 400 MHz) 8 9,83 (s), 8 7,24 (s), 8 7,18 (m), 8 6,80 (m), 8 1,71 (s), 8 1,24 (s).
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Procedimiento para la preparacion de metilcarbonato de 4-terc-butilo-2-(2-cianopropano-2-ilo) fenilo (16)
[0190]
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[0191] A una mezcla agitada del compuesto 15 (126,6 g, 0,564 mol), DMAP (6,0 g) y DIEA (188 g, 1,46 mol) en DCM anhidro (1500 mL) se anadio gota a gota cloroformiato de metilo (110 g, 1,17 mol) en DcM anhidro (300 mL) a 0°C en 2 horas. Despues de agitarse durante 12 horas a 0°C, se anadio agua helada (1,5 L) y la mezcla se agito a 0°C durante 30 minutos. La capa organica se separo y se lavo con 1 N HCl, agua y salmuera. La solucion de DCM se seco sobre MgSO4 y se concentro a vach para dar el compuesto 16 como un solido amarillo. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,47 (m), 8 7,39 (d), 8 7,24 (d), 8 3,84 (s), 8 1,71 (s), 8 1,30 (s).
Procedimiento para la preparacion de metilcarbonato de 2-(1-amino-2-metilo-1-oxopropano-2-ilo)-4-terc- butilo-5-nitrofenilo (17)
[0192]
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[0193] A una mezcla agitada del compuesto 16 (10,0 g, 36,3 mmol) y KNO3 (5,51 g, 54,5 mmol) en DCM (1000 mL) se anadio gota a gota 98% H2SO4 (145,4 g, 1,45 mol) a 0°C. La mezcla se agito a 30°C durante 4 dfas. La capa H2SO4 luego se separo y se vertio en hielo-agua (50 g) y despues se extrajo con DCM (100 mLx3). Las capas organicas combinadas se lavaron con agua, NaHCO3 acuosa y salmuera, despues se seco sobre MgSO4 y se concentro a vaco. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (eter de petroleo/EtOAc 20:1 ^ 10:1 ^ 5:1 ^ 3:1) para dar el compuesto 17 como un solido amarillo. 1H RMN (CDCh; 400 MHz) 8 8,05 (s), 8 7,74 (s), 8 7,61 (s), 8 7,32 (s), 8 5,32 (s), 8 3,91 (s), 8 3,92 (s), 8 1,62 (s), 8 1,59 (s), 8 1,42 (s), 8 1,38 (s).
Procedimiento para la preparacion de acido 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-nitrofenilo)-2-metilpropanoico (18)
[0194]
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[0195] A una mezcla de compuesto 17 se anadio agua (7,3 g, 21,6 mmol) en metanol (180 mL) (18 mL) y NaOH (8,64 g, 216 mmol). La solucion se calento y mantuvo a reflujo durante 3 dfas. El disolvente se evaporo al vaco y el
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residuo se disolvio en 140 mL de agua. Luego, la solucion se acidifico a pH2 mediante la adicion de 2N HCl. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (100 mLx3), y las fases organicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se seco sobre Na2SO4 anhidro y despues se concentro para dar el compuesto 18 como un solido amarillo, que se uso en la siguiente reaccion sin purificacion adicional.
Procedimiento para la preparacion de 5-terc-butilo-3,3-dimetilo-6-nitrobenzofurano-2(3H)-ona (19)
[0196]
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[0197] A una solucion del compuesto 18 (7,10 g, 25,2 mmol) en 710 mL de THF anhidro se anadio EDCI (14,5 g, 75,6 mmol). La suspension resultante se dejo en agitacion a 30°C durante la noche. El precipitado se filtro y se lavo a fondo con DCM. El filtrado se concentro a sequedad y el residuo se disolvio en DCM (100 mL). La solucion se lavo con agua (50 mLx2) y salmuera (50 mL X 1). A continuacion se seco la capa de DCM sobre Na2SO4 anhidro y se concentro para dar el producto bruto, que se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (eter de petroleo/EtOAc 200:1 ^ 100:1 ^ 50:1) para dar el compuesto 19 como un solido blanco. 1H RMN (CDCl3; 400 MHz) 8 7,36 (s), 8 7,10 (s), 8 1,53 (s), 8 1,41 (s).
Procedimiento para la preparacion de 6-amino-5-terc-butilo-3,3-dimetilbenzofurano-2(3H)-ona (20)
[0198]
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[0199] Pd/C (1,50 g) y el compuesto 19 (3,00 g,
1,14 mmol) se suspendieron en THF (1500 mL) a 25°C bajo hidrogeno a 30 psi durante 4 horas. La mezcla luego se filtro a traves de una almohadilla de Celite®, y el filtrado se concentro a vaco para dar el compuesto 20 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 MHz) 8 7,05 (s), 8 6,49 (s), 8 5,01 (s), 8 1,35 (s), 8 1,33 (s).
Procedimiento para la preparacion de N-(5-terc-butilo-3,3-dimetilo-2-oxo-2,3-dihidrobenzofurano-6-ilo)-4-oxo- 1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (21)
[0200]
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[0201] Una suspension de HATU (17,6 g, 46,3 mol) y el compuesto 26 (8,36 g, 44,2 mmol) en acetonitrilo anhidro (1 L) se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio el compuesto 20 (3,40 g, 14,6 mmol) a la suspension, y despues se anadio DIEA (11,5 g, 89,0 mmol) gota a gota. La mezcla se agito a 45°C durante 4 dfas. El precipitado
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resultante se filtro y se lavo a fondo con DCM. El filtrado se concentro a sequedad y el residuo se disolvio en DCM (200 mL) y se lavo con 1N HCl (200 mL X 2) seguido de 5% acuoso NaHCO3 (200 mLx3) y despues con salmuera (200 mL X 1). Despues, la mezcla se seco sobre Na2SO4 y se concentro a vaco. El residuo se purifico por medio de cromatograffa en columna sobre gel de sflice (CH2Cl2/MeOH 100:1 ^ 50:1) para dar el compuesto 21 como un solido de color amarillo claro. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 6 12,96 (d J 6,4 Hz, 1H); 12,1 (s, 1H); 8,9 (d, J 6,4 Hz, 1H); 8,33 (d, J 8 Hz, 1H); 7,84 - 7,75 (m, 2H); 7,55 - 7,48 (m, 3H); 1,47 (s, 6 H); 1,45 (s, 9H).
Procedimiento para la preparacion de acido 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-(4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3- carboxamido)fenilo)-2-metilpropanoico (28)
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[0203] A una solucion agitada del compuesto 21 (0,9 g, 2,45 mmol) en MeOH (50 mL) se anadio NaOH (1,5 g, 37,5 mmol) a 0°C. Despues de agitarse durante 16 horas a 40°C, el disolvente se evaporo a vaco, despues el residuo se disolvio en H2O (50 mL). El precipitado se filtro y el filtrado se lavo con DCM (100 mL X 1) y acetato de etilo (100 mL X 1). La capa acuosa se acidifico con 2N HCl a pH 1-2. El precipitado se filtro y se lavo con H2O (80 mL) y heptano (50 mL). Se seco a vaco para dar el compuesto 28 como un solido blanco. 1H RMN (DMSO-d6; 400 mHz) 6 12,85 (s), 6 11,84 (s), 6 11,77 (s), 6 9,39 (s), 6 8,86 (s), 6 8,33 (s), 6 7,79 (m), 6 7,52 (m), 6 7,18 (s), 6 7,09 (s), 6 1,44 (s), 6 1,40 (s). MS encontrado (M + H) 423,08
Ejemplo 4: Segunda sintesis alternativa de N-(2-terc-butilo-5-hidroxi-4-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)fenilo)- 4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (27)
[0204]
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[0205] Un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 50 mL se equipo con agitador magnetico, un borboteador de nitrogeno y termopar. El compuesto 21 (514 mg, 1,27 mmol) y 2-MeTHF (4 mL) se cargan en el matraz. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente. Se anadio hidruro de litio y aluminio (204 mg, 6,6 mmol) como solido hasta que se logro una conversion del 100%, que se controlo usando HPLC. Se anadieron sal de tetrahidrato de 2,3- dihidroxibutanodioato de sodio y potasio (50 mL de una solucion de 400 g/L) y MTBE (50 mL) a la mezcla de reaccion. La solucion resultante se agito durante 15 minutos y luego se dejo reposar durante 15 minutos. La capa organica se separo y el pH de la capa acuosa se ajusto a un pH de aproximadamente 6-7 por adicion de acido tartarico. La capa acuosa se extrajo con MTBE. La capa organica se concentro y se seco a alto vacfo para proporcionar el compuesto del tftulo como un polvo blanquecino. El espectro 1H-RMN fue consistente con el reportado anteriormente.
Ejemplo 5: Smtesis total alternativa de acido 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-(4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3- carboxamida)fenilo)-2-metilpropanoico (28):
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MeOCCI
HNOj, HjSO,
NaOMe
DCM
NElj. DCM
DCM. 0*C
Pd(C). H2
Pd(PPh})2. ZrFj,
MeOH, 100%
DMF. 80%;. 71%
LiOH
MeTHF, 45 °C
T,P. MeTHF
COOH
Plridina, 45 °C
Procedimiento para la preparacion de 2-bromuro de acido carbonico, ester metilico de 4-terc-butilfenilo ester (35)
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[0208] Un matraz de 3 bocas de fondo redondo de 2 L fue equipado con agitador mecanico, burbujeador de nitrogeno y termopar. 2-Bromo-4-terc-butilo fenol (50 g, 211,7 mmol) seguido por DCM (1,75 L), DMAP (1,29 g, 10,58 mmol) y Et3N (44,3 mL, 317,6 mmol). La mezcla de reaccion se enfrio a 0°C. Se anadio cloroformiato de metilo (19,62 mL, 254 mmol) gota a gota a la mezcla de reaccion. La mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente mientras que se agitaba durante la noche. Cuando la reaccion se completo, la mezcla se filtro a traves de un embudo sinterizado. El filtrado se transfirio a un embudo de separacion de 1 L. Para sofocar, se anadio IN HCl (300 mL) al filtrado y la capa organica se separo. Despues, la capa organica se lavo con una mezcla de 291 mL saturada de NaHCO3 y 100 mL de agua. Las capas se separaron, y se determino que la capa acuosa tema un pH de aproximadamente 8. La capa organica se concentro y se seco a alto vacfo durante aproximadamente 16 horas para dar el compuesto del titulo como un aceite amarillo claro, que se uso en el siguiente paso sin purificacion adicional. 1H-RMN (400 MHz. DMSO-C/6J 7,66 (d, J 2,0 Hz, 1H), 7,46 (dd, J 8,4, 2,0 Hz, 1H), 7,32 (d, J 8,4 Hz, 1H), 3,86 (s, 3H), 1.28 (s, 9H)
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Procedimiento para la preparacion de carbonato de (2-bromo-4-terc-butilo-5-nitro-fenil) metilo (36)
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[0210] Un matraz de 3 bocas de fondo redondo de 2 L fue equipado con agitador mecanico, burbujeador de nitrogeno y termopar. El compuesto 35 (176 g, 612,9 mmol) y acido sulfurico concentrado (264 mL) se cargaron en el matraz. La mezcla de reaccion se enfrio a -5°C - 0°C. Se anadio acido nftrico (28,6 mL, 612,9 mmol) gota a gota y la mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 2 horas. Cuando se completo, se anadio agua (264 mL) seguido de MTBE (264 mL). La solucion se agito durante 15 minutos y luego se dejo reposar durante 15 minutos. La capa organica se separo, se concentro y se seco a alto vado para dar el compuesto del tttulo como un aceite marron oscuro, que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. 1H-RMN (400 MHz. DMSO-d6J 7,96 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 3,89 (s, 3H), 1,34 (s, 9H)
Procedimiento para la preparacion de 2-bromo-4-terc-butilo-5-nitro-fenol (37)
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[0212] Se cargo carbonato de (2-bromo-4-terc-butilo-5-nitro-fenilo)metilo (72,9 g, 219,5 mmol) en un reactor y se anadio DCM (291,6 mL). La solucion de reaccion amarilla se enfrio usando un bano de hielo. Se anadio metoxido sodico (67,04 g, 69,11 ml de 5,4 M, 373,2 mmol) en porciones a 2,2 - 6,9°C. Despues de completar la adicion, la reaccion se calento lentamente a temperatura ambiente. Cuando se completo, la reaccion se enfrio a 0°C y se inactivo con 1M HCl (373,2 mL, 373,2 mmol). La mezcla bifasica se agito durante 20 min y se transfirio a un embudo de decantacion. La capa organica se separo y se lavo con agua (300 mL) seguido de salmuera (300 mL). La capa organica se concentro y el producto bruto se seco a alto vado. El producto se purifico adicionalmente usando separacion de cromatograffa de fluido supercritico (SFC) en un Berger MultiGram III (Mettler Toledo AutoChem, Newark DE). Las condiciones del metodo fueron 20% de metanol a 250 mL/min en una columna de PPU (30*150) de Princeton Chromatography, 100 bar, 35C, 220 nm. Se inyecto una inyeccion de 3,5 mL de una solucion de 55-70 mg/mL. Los datos fueron recolectados usando el software SFC ProNTo. El producto purificado recibido de la purificacion de SFC era un solvato de metanol. Para eliminar el metanol, se realizo una destilacion azeotropica. El solido amarillo oscuro, 2-bromo, 4-tertbuilo, el solvato de metanol de 5-nitro fenol, (111,3 g, 59,9 mmol) se cargo en un matraz de fondo redondo de 1 litro, seguido de heptano (500 mL). La suspension se calienta a 64°C para obtener una solucion clara. El disolvente se destilo a presion reducida (649 mbar) durante 30 minutos y luego se destilo hasta sequedad. Este procedimiento se repitio tres veces hasta que no se detecto MeOH por 1H-NMR. El producto se seco a alto vado durante 16 horas para dar el producto como un semisolido amarillo oscuro. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6j 6 11,2 (bs, OH), 7,69 (s, 1H); 7,03 (s, 1H); 1,30 (s, 9H)
Procedimiento para la preparacion de 5-terc-butilo-3,3-dimetilo-6-nitrobenzofurano-2(3H)-ona (19)
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[0214] Se anadio difluorozinc (6,093 g, 58,92 mmol) a un matraz de fondo redondo, que se lavo abundantemente con nitrogeno. Pd(fBu3P)2 (2 g, 3,835 mmol) se anadio entonces bajo corriente de nitrogeno. A continuacion, se anadio 2-bromo-4-terc-butilo-5-nitro-fenol (16,15 g, 58,92 mmol) disuelto en DMF (80,75 mL) al matraz. La mezcla de reaccion fue una suspension naranja. Se anadio (1-metoxi-2-metilo-prop-1-enoxi) trimetilsilano (21,61 g, 25,13 mL, 117,8 mmol) a la mezcla y la mezcla resultante se calento a 80°C y se agito durante 16 h. Cuando se completo, la mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se filtro a traves de Celite®. La torta del filtro se lavo con MTBE (536,0 mL) y se anadio agua (893,3 mL) al filtrado. La mezcla se agito durante 15 minutos y se suspendio durante otros 15 minutos. Las capas se separaron y se anadio 0,5M HCl (500 mL, 250,0 mmol) a la fase organica. Las capas se separaron y la capa organica se lavo con agua (500 mL). Las capas se separaron y la capa organica se lavo con NaCl (500 mL, 8% en peso). La capa organica se separo y el disolvente se elimino a vaco. El producto bruto se obtuvo como un solido cristalino marron y luego se purifico a traves de un tapon de silice, usando hexano: MTBE 20: 1-10: 1 como eluyente. Las fracciones que conteman el producto se combinaron y el disolvente se elimino a vac'to para dar el producto puro como un solido cristalino blanco. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6J 6 7,80 (s, 1H); 7,62 (s, 1H); 1,49 (s, 6 H); 1,34 (s, 9H)
Procedimiento para la preparacion de 6-amino-5-terc-butilo-3,3-dimetilbenzofurano-2(3H)-ona (20)
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[0216] Se coloco paladio sobre carbon (humedo, 5% en peso) en un matraz de fondo redondo bajo atmosfera de nitrogeno. Luego se anadio 5-terc-butilo-3,3-dimetilo-6-nitro-benzofurano-2-ona (4,7 g, 17,85 mmol) al recipiente. Se cargo cuidadosamente metanol (120 mL) al recipiente en atmosfera de nitrogeno. Despues, el recipiente se purgo con N2, se evacuo, despues se cargo con gas de hidrogeno. El recipiente se evacuo y se recargo con gas de hidrogeno, y luego se introdujo una corriente continua de gas de hidrogeno. Despues de completarse, la reaccion se filtro a traves de Celite® y la torta se lavo con MeOH (300 mL). El disolvente se elimino a vaco y el producto se seco a alto vacfo para dar un solido cristalino blanco. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6J 6 7,05 (s, 1H); 6,48 (s, 1H); 5,02 (s, 2H, NH2); 1,34 (s, 6 H); 1,30 (s, 9H)
Procedimiento para la preparacion de N-(5-terc-butilo-3,3-dimetilo-2-oxo-2,3-dihidrobenzofurano-6-ilo)-4-oxo- 1,4-dihidroquinoline-3-carboxamida (21)
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[0218] Se cargo un recipiente de reaccion con el compuesto 26 (2,926 g, 15,43 mmol), Compuesto 20 (4,32 g, 18,52 mmol), 2-MeTHF (35,99 mL), y posteriormente 50% de T3P en 2-MeTHF (13,36 g, 21.00 mmol). Se anadio piridina (2,441 g, 2,496 mL, 30,86 mmol) y la suspension se calento a 47,5°C a +5°C durante 18 h. Despues de completarse, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se anadieron 2-MeTHF (36) y agua (30 mL). Las capas se separaron y la capa organica se lavo con solucion al 10% en peso de acido citrico (30 mL), agua (30 mL) y dos veces con NaHCO3 (20 mL). La capa organica se lavo con salmuera (50 mL), se separo y el disolvente se elimino a vaco. El producto bruto se disolvio en MTBE (100 mL) y se anadio hexano (200 mL) como antidisolvente. Un solido precipito y la suspension resultante se agito durante dos horas. El solido se recogio mediante filtracion por succion y la torta se lavo con hexano. El producto resultante se seco en un horno de vado a 55°C con purga de nitrogeno para dar el compuesto del tftulo como un solido beige. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6j 6 12,96 (d J 6,4 Hz, 1H); 12,1 (s, 1H); 8,9 (d, J 6,4 Hz, 1H); 8,33 (d, J 8 Hz, 1H); 7,84-7,75 (m, 2H); 7,55-7,48 (m, 3H); 1,47 (s, 6 H); 1,45 (s, 9H).
Procedimiento para la preparacion de acido 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-(4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3- carboxamido)fenilo)-2-metilpropanoico (28)
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[0220] El compuesto 26 (81,30 mg, 0,4288 mmol) y el Compuesto 20 (110 mg, 0,4715 mmol) se cargaron en un matraz de fondo redondo. Despues se anadieron 2-MeTHF (1 mL) seguido de 50% de T3P en 2-MeTHF (371,4 mg, 0,5836 mmol) y piridina (67,84 mg, 69,37 pL, 0,8576 mmol) en 2-MeTHF. La suspension se calento a 47,5°C +5°C durante la noche. Despues de completarse, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente. Se agregaron 2-MeTHF (1,014 mL) y agua (811,2 pL). Las capas se separaron y la capa organica se lavo con agua (811,2 pL) y dos veces con NaHCO3 (2 mL). La capa organica se transfirio a un matraz de fondo redondo. Se anadio LiOH (38,6 mg, 0,9 mmol) disuelto en agua (2 mL) y la reaccion se calento a 45°C. Despues de la terminacion, las capas se separaron y la capa organica se descarto. La capa acuosa se enfrio con un bano de hielo y se anadio acido clorlddrico (10,72 ml de 1,0 M, 10,72 mmol) a la solucion hasta que el pH alcanzo un pH de aproximadamente 3-4. La capa acuosa se extrajo dos veces con 2-MeTHF (5 mL), y las capas organicas se combinaron y se lavaron con salmuera (5 mL). La capa organica se separo y el disolvente se elimino a vaco. El solido resultante se seco en un horno de vado con purga de nitrogeno a 50°C para dar el compuesto del tftulo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6J 6 12,89 (d, J 6,8 Hz, 1H); 11,84 (s, 1H); 11,74 (s, 1H); 9,36 (s, 1H); 8,87-8,61 (d, J 6,4 Hz, 1H); 8,34-8,32 (d, J 9,1 Hz 1H); 7,83 - 7,745 (m, 2H); 7,17-7,09 (m, 1H); 7,17 (s, 1H); 7,09 (s, 1H); 1,43 (s, 6H); 1,40 (s, 9H)
Ejemplo 6: Procedimiento para la biosmtesis de N-(2-terc-butilo-5-hidroxi-4-(1-hidroxi-2-metilpropano-2- ilo)fenilo)-4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxamida (27) y acido 2-(5-terc-butilo-2-hidroxi-4-(4-oxo-1,4- dihidroquinolina-3-carboxamido)fenilo)-2-metilpropanoico (28)
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[0222] Se adquirio Streptomyces rimosus (DSM 40260) a partir de DSMZ como cultivo congelado. Este cultivo se uso para inocular inclinados de agar, que se mantuvieron y almacenaron a 4°C. Se preparo un extracto de levadura- extracto de malta-peptona (YMP) que contema extracto de levadura (4 g/L), extracto de malta (10 g/L) y harina de soja (5 g/L) y se esterilizo a 130°C durante 60 minutos. Cinco frascos que conteman 1 L de medio YMP se inocularon directamente con S. rimosus de los inclinados de agar. El cultivo se dejo crecer durante 2 - 3 dfas a 30°C con agitacion suave de aproximadamente 100 rpm. En estas condiciones, se han observado dos tipos de crecimiento, ya sea una solucion turbia o partfculas esfericas que se agregan en el fondo del matraz. Se ha demostrado que el ultimo tipo de crecimiento da como resultado conversiones mas altas al Compuesto 27. Las celulas se centrifugaron, recogieron y resuspendieron en dos matraces que conteman 1 L de tampon de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,0. Se anadieron 5,0 g de Compuesto 34 en 50 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) a los matraces. Las reacciones continuaron durante 24 horas a 30°C con agitacion suave de aproximadamente 100 rpm en cuyo punto las conversiones de 7,59% del Compuesto 27 y 1,17% del Compuesto 28 se indicaron por HPLC.
[0223] Ambos matraces se combinaron, se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos y se resuspendieron en 500 mL de metanol. Esta suspension se agito vigorosamente durante 30 minutos y luego se centrifugo nuevamente a 6000 rpm durante 10 minutos. La capa organica se recogio y el proceso se repitio dos veces. Los extractos de metanol se concentraron al vach para producir 2,50 g, 1,57 g y 1,11 g de material solido, respectivamente. Se ha demostrado que los solidos de estos extractos contienen 74,78 - 91,96% del Compuesto 34, 7,66 - 19,73% del Compuesto 27 y 0,39 - 5,49% del Compuesto 28. En un esfuerzo por eliminar una porcion del Compuesto 34 de los productos de biooxidacion, los solidos de las dos primeras extracciones se combinaron, se suspendieron en 250 mL de metanol, se agitaron vigorosamente durante 1 hora y se filtraron al vado. Mientras que los Compuestos 27 y 28 fueron enriquecidos en el filtrado (22,09 y 6,14%, respectivamente), los solidos tambien conteman el Compuesto 27 (8,96%) y el Compuesto 28 (0,50%).
[0224] El filtrado de metanol que contiene aproximadamente 2,2 g de solidos disueltos se adsorbio sobre 4,5 g de silice y se purifico por cromatograffa ultrarrapida usando un gradiente de 100% de diclorometano a 88:12 de diclorometano/metanol. Las fracciones que conteman el Compuesto 27 se concentraron al vach y se secaron adicionalmente por liofilizacion para obtener 130 mg de Compuesto 27 (98,5% de pureza por HPLC). Una fraccion que contema el Compuesto 28 impuro tambien se concentro al vach para producir menos de 10 mg de solido.
[0225] El sedimento celular se resuspendio en 500 mL de metanol y se homogeneizo en un BeadBeater para separar las celulas y recuperar cualquier producto restante. La capa organica se obtuvo centrifugando la suspension homogeneizada a 6000 rpm durante 10 minutos. Esto se anadio al solido obtenido a partir de la tercera extraccion y los solidos filtrados del enriquecimiento en suspension de las dos primeras extracciones y se suspendio a reflujo durante la noche. La suspension se enfrio luego y se filtro por succion para obtener 1,99 g de solido. El solido se redisolvio en 300 ml de metanol que luego se adsorbio en aproximadamente 5 g de sflice y se purifico por cromatograffa ultrarrapida usando un gradiente de diclorometano al 100% a diclorometano/metanol 94:6 para proporcionar 820 mg de solido que contema Compuesto 34 y Compuesto 27 asf como otras impurezas. Esto se volvio a someter a cromatograffa en columna usando un gradiente de disolvente mas gradual (100% de DCM hasta una mezcla de 6% de MeOH/94% DCM) para obtener 89 mg adicionales del compuesto 27. El espectro 1H-RMN era coherente con el que se informo anteriormente.
Ejemplo 7: Procedimiento general para ensayar la solubilidad a pH 7.4
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[0226] Se uso un ensayo en matraz de agitacion de alto rendimiento para determinar la solubilidad de los compuestos en tampon de pH 7,4. Para calcular la concentracion de compuestos en solucion, se llevaron a cabo dos condiciones por compuesto: 300 pM en 100% de DMSO y 200 pM en tampon fosfato pH 7,4 con DMSO al 2% presente. Cada muestra se dejo agitar durante la noche y luego se inyecto sobre HPLC-UV para determinar el area del pico usando las siguientes condiciones: Phenomenex 00A-4251-B0 - 30x2,00 mm Luna 3u C18(2) 100A columna; Velocidad de flujo de 0,8 mL/min; 20 uL de volumen de inyeccion; agua de grado HPLC con acido formico al 0,1% y acetonitrilo de grado HPLC con fases moviles de acido formico al 0,1%; area de pico determinada a 254 nm. La solubilidad en uM se calculo usando la siguiente ecuacion: conc. = (area de pico pH 7,4) / (area de pico 300 pM de condicion estandar de DMSO) * Concentracion de 300 pM de condicion estandar. Los picos de interes se identificaron en condiciones de tampon basadas en el tiempo de retencion (TR) del pico de area mas grande en la condicion estandar de DMSO 300 uM.
ENSAYOS DE ACTIVIDAD
Ejemplo 8: Procedimiento general para ensayos de actividad
Ensayos para la deteccion y la medicion de propiedades de potenciacion de AF508-CFTR de compuestos
Metodos opticos potenciales de membrana para ensayar propiedades de modulacion 8F508-CFTR de compuestos
[0227] El ensayo utiliza colorantes de deteccion de tension fluorescentes para medir los cambios en el potencial de membrana usando un lector de placas fluorescentes (por ejemplo, FLIPR III, Molecular Devices, Inc.) como una lectura para el aumento en AF508-CFTR funcional en celulas NIH 3T3. La fuerza motriz para la respuesta es la creacion de un gradiente de iones de cloruro en conjuncion con la activacion del canal mediante una unica etapa de adicion de lfquido despues de que las celulas hayan sido tratadas previamente con compuestos y posteriormente cargadas con un tinte sensible a la tension.
Identificacion de compuestos potenciadores
[0228] Para identificar potenciadores de AF508-CFTR, se desarrollo un formato de ensayo HTS de doble adicion. Este ensayo HTS utiliza tintes de deteccion de tension fluorescentes para medir los cambios en el potencial de membrana en FLIPR III como una medida para el aumento en gating (conductancia) de AF508 CFTR en la temperatura correcte celulas AF508 CFTR NIH 3T3. La fuerza motriz para la respuesta es un gradiente de ion Cl- junto con la activacion del canal con forskolina en un solo paso de adicion de lfquido usando un lector de placa fluorescente como FLIPR III despues de que las celulas hayan sido tratadas previamente con compuestos potenciadores (o control del vehfculo DMSO) y posteriormente se cargo con un tinte de redistribucion.
Soluciones
[0229] Solucion de bano n° 1: (en mM) NaCl 160, KCl 4,5, CaCh2, MgCh 1, HEPES 10, pH 7,4 con NaOH.
Solucion de bano sin cloruro: Sales de cloruro en la solucion de bano n.°1 se sustituyen por sales de gluconato.
[0230] Cultivos celulares Los fibroblastos de raton NIH3T3 que expresan establemente AF508-CFTR se usan para mediciones opticas de potencial de membrana. Las celulas se mantuvieron a 37°C en 5% de CO2 y 90% de humedad en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con 2 mM de glutamina, suero bovino fetal al 10%, 1 X NEAA, p-Me, 1 X pen/strep, y 25 mM de HEPES en frascos de cultivo de 175 cm2. Para todos los ensayos opticos, las celulas se sembraron a ~20.000/pocillo en placas recubiertas con matrigel de 384 pocillos y se cultivaron durante 2 horas a 37°C antes de cultivar a 27°C durante 24 horas. para el ensayo de potenciador. Para los ensayos de correccion, las celulas se cultivan a 27°C o 37°C con y sin compuestos durante 16 - 24 horas. Ensayos electrofisiologicos para analizar las propiedades de modulacion de AF508-CFTR de los compuestos.
1. Ensayo de camara Ussing
[0231] Se realizaron experimentos de camara Ussing sobre celulas epiteliales de via aerea polarizadas que expresan AF508-CFTR para caracterizar adicionalmente los moduladores AF508-CFTR identificados en los ensayos opticos. Los epitelios de las vfas respiratorias sin FQ y FQ se aislaron del tejido bronquial, se cultivaron como se describio previamente (Galietta, LJV, Lantero, S., Gazzolo, A., Sacco, O., Romano, L., Rossi, GA y Zegarra-Moran, O. (1998) In Vitro Cell. Dev. Biol. 34, 478 - 481), y se colocaron en placas sobre filtros Costar® Snapwell™ que se pre-recubrieron con medios acondicionados con NIH3T3. Despues de cuatro dfas, los medios apicales se eliminaron y las celulas se cultivaron en una interfaz de lfquido con aire durante >14 dfas antes de su uso. Esto dio como resultado una monocapa de celulas columnares completamente diferenciadas que estaban ciliadas, rasgos que son caractensticos del epitelio de las vfas respiratorias. HBE no FQ se aislaron de no fumadores que no teman ninguna enfermedad pulmonar conocida. HBE de Fq se aislaron de pacientes homocigotos para AF508-CFTR.
[0232] HBE cultivados en insertos de cultivo celular Costar® Snapwell™ en una camara Ussing (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA), y la resistencia transepitelial y la corriente de cortocircuito en presencia de un
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gradiente Cl- basolateral a apical (Isc) se midieron utilizando un sistema de abrazadera de voltaje (Departamento de Bioingeniena, Universidad de Iowa, IA). Brevemente, HBE se examinaron bajo condiciones de grabacion con tension de fijacion (Vsujecion = 0 mV) a 37°C. La solucion basolateral contema (en mM) 145 NaCl, 0,83 K2HPO4, 3,3 KH2PO4, 1,2 MgCl2, 1.2 CaCl2, 10 Glucosa, 10 HEPES (pH ajustado a 7,35 con NaOH) y la solucion apical contenida (en mM) 145 NaGluconato, 1,2 MgCh, 1,2 CaCl2, 10 glucosa, 10 HEPES (pH ajustado a 7,35 con NaOH).
Identificacion de compuestos potenciadores
[0233] El protocolo tipico utilizo un gradiente de concentracion de Cl- de la membrana basolateral a apical. Para configurar este gradiente, se usaron timbres normales en la membrana basolateral, mientras que el NaCl apical se reemplazo por gluconato de sodio equimolar (titulado a pH 7,4 con NaOH) para dar un gran gradiente de concentracion de Cl- grande en todo el epitelio. La forskolina (10 jM) y todos los compuestos de prueba se anadieron al lado apical de los insertos de cultivo celular. La eficacia de los supuestos potenciadores de AF508- CFTR se comparo con la del potenciador conocido, la genistema.
2. Grabaciones pinza de parche
[0234] La corriente de Cl- total en celulas AF508-NIH3T3 se controlo usando la configuracion de grabacion de parche perforado como se describe previamente (Rae, J., Cooper, K., Gates, P., y Watsky, M. (1991) J Neurosci. Methods 37, 15 - 26). Los registros de pinza de tension se realizaron a 22°C usando un amplificador de pinza de parche Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA). La solucion de pipeta contema (en mM) 150 N- metilo-D-glucamina (NmDg)-CI, 2 MgCh, 2 CaCl2, 10 EGtA, 10 HePES, y 240 jg/ml de anfotericina-B (pH ajustado a 7,35 con HCl). El medio extracelular contema (en mM) 150 NMDG-Cl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES (pH ajustado a 7,35 con HCl). La generacion de impulsos, la adquisicion de datos y el analisis se realizaron utilizando una PC equipada con una interfaz Digidata 1320 A/D junto con Clampex 8 (Axon Instruments Inc.). Para activar AF508- CFTR, se anadieron forskolina 10 jM y genistema 20 jM al bano y se controlo la relacion corriente-voltaje cada 30 segundos.
Identificacion de compuestos potenciadores
[0235] La capacidad de potenciadores AF508-CFTR para aumentar la corriente Cl' AF508-CFTR macroscopica (IAf508) en celulas NIH3T3 que expresan establemente AF508-CFTR tambien se investigo utilizando tecnicas de grabacion de parche perforado. Los potenciadores identificados a partir de los ensayos opticos evocaron un aumento dependiente de la dosis en IAf508 con potencia y eficacia similares observadas en los ensayos opticos. En todas las celulas examinadas, el potencial de inversion antes y durante la aplicacion del potenciador fue de alrededor de -30 mV, que es el Eci calculado (-28 mV).
Cultivo de celulas
[0236] Fibroblastos de raton NIH3T3 que expresan establemente AF508-CFTR se utilizan para las grabaciones de celula entera. Las celulas se mantuvieron a 37°C en 5% de CO2 y 90% de humedad en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 2 mM de glutamina, suero bovino fetal al 10%, 1 X NEAA, p-ME, 1 X pen/strep, y 25 mM de HEPES en 175 cm2 de frascos de cultivo. Para grabaciones de celulas completas, se sembraron de 2.500 a 5.000 celulas en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina y se cultivaron durante 24-48 horas a 27°C antes de probar la actividad de los potenciadores; e incubados con o sin el compuesto de correccion a 37°C para medir la actividad de los correctores.
3. Grabaciones de un solo canal
[0237] Se observo la actividad de activacion de wt-CFTR y de AF508-CFTR corregido a temperatura expresada en celulas NIH3T3 usando registros de parche de membrana de dentro hacia afuera extirpados como se describio previamente (Dalemans, W., Barbry, P., Champigny, G., Jallat, S., Dott, K., Dreyer, D., Crystal, RG, Pavirani, A., Lecocq, JP., Lazdunski, M. (1991) Nature 354, 526 - 528) usando un amplificador de pinza de parche Axopatch 200B. (Axon Instruments Inc.). La pipeta contema (en mM): 150 NMDG, 150 de acido aspartico, 5 CaCl2, 2 MgCl2, y 10 HePeS (pH ajustado a 7,35 con base Tris). El bano contema (en mM): 150 NMDG-Cl, 2 MgCl2, 5 EGTA, 10 TES, y base 14 Tris (pH ajustado a 7,35 con HCl). Despues de la escision, tanto wt como AF508-CFTR se activaron mediante la adicion de 1 mM de Mg-ATP, 75 nM de la subunidad catalftica de la quinasa de protema dependiente de AMPc (PKA; Promega Corp. Madison, WI) y 10 mM de NaF para inhibir fosfatasas de protema, lo que impidio el agotamiento actual. El potencial de la pipeta se mantuvo a 80 mV. La actividad del canal se analizo a partir de parches de membrana que contienen < 2 canales activos. El numero maximo de aperturas simultaneas determino la cantidad de canales activos durante el curso de un experimento. Para determinar la amplitud de corriente de un solo canal, los datos registrados a partir de 120 seg de actividad de AF508-CFTR se filtro "fuera de lmea" a 100 Hz y luego se uso para construir histogramas de amplitud de todos los puntos que se ajustaron con funciones multigaussianas usando el software Bio-Patch Analysis (Bio-Logic Comp. Francia). La corriente microscopica total y la probabilidad abierta (Po) se determinaron a partir de 120 s de actividad del canal. El Po se determino usando el software Bio-Patch o la relacion Po = I/i (N), donde I = corriente media, i = amplitud de corriente de un solo canal y N
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= numero de canales activos en el parche.
Cultivo de celulas
[0238] Los fibroblastos de raton de NIH3T3 que expresan de forma estable AF508-CFTR se usan para los registros de pinza de parche de membrana de membrana extirpada. Las celulas se mantuvieron a 37°C en 5% de CO2 y 90% de humedad en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con 2 mM de glutamina, suero bovino fetal al 10%, 1 X NEAA, p-Me, 1 X pen/strep, y 25 mM de HEPES en 175 cm2 de frascos de cultivo. Para grabaciones de un solo canal, se sembraron de 2.500 a 5.000 celulas en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli- L-lisina y se cultivaron durante 24-48 horas a 27°C antes de su uso.
[0239] Se ensayaron los compuestos 27 y 28 para determinar la solubilidad usando el procedimiento dado en el Ejemplo 3 y para la actividad usando el procedimiento dado en los ensayos del Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 1. La actividad del compuesto se ilustra con "+++" si CE50 (o CI50) se midio a ser inferior a 2,0 |jM, "++" si se midio la actividad a ser de 2 jM a 5,0 jiM, "+" si se midio la actividad que sea mayor que 5,0 jiM, y "-" si no hay datos disponibles. La eficacia se ilustra con "+++" si se calculo que la eficacia es mayor que 100%, "++" si se calculo que la eficacia es de 100% a 25%, "+" si se calculo que la eficacia es menor que 25 % y "-" si no hay datos disponibles.
Tabla 1: Ejemplos de actividades y eficacias de los compuestos de Formula I
Estructura
OH | O O ayBT H Compuesto 27 , O 0 0 A^w LJ n Compuesto 28
Solubilidad HTSF @ pH = 7,4
87 uM >200 uM
CE50 optica
+ + + + +
0508-HBE CE50
+ + + + + +
0508/G551D-HBE CE50
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HLM/RLM (% perm. @ 30 min)
+ + + + +
CaV 1.2 CI50
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    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de Formula I:
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    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde R es COOH o CH2OH.
  2. 2. Un compuesto segun la reivindicacion 1, en el que R es CH2OH.
  3. 3. Un compuesto segun la reivindicacion 1, en el que R es COOH.
  4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende:
    un compuesto de Formula I, segun la reivindicacion 1; y un vehuculo o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
  5. 5. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el compuesto de Formula I tiene la estructura:
    imagen2
  6. 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el compuesto de Formula I tiene la estructura:
    imagen3
  7. 7. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende ademas un agente adicional seleccionado de un agente mucolftico, un broncodilatador, un antibiotico, un agente antiincrustante, un agente antiinflamatorio, un modulador de CFTR o un agente nutricional.
  8. 8. Un compuesto de formula I segun la reivindicacion 1 para uso en el tratamiento o disminucion de la gravedad de una enfermedad en un paciente, en donde dicha enfermedad se selecciona de fibrosis qrnstica, asma, EPOC inducida por humo, bronquitis cronica, rinosinusitis, estrenimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreatica, infertilidad masculina causada por ausencia bilateral congenita del conducto deferente (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopatica, aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA), enfermedad hepatica, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de coagulacion y fibrinolisis, como deficiencia de protema C, angioedema hereditario tipo 1, deficiencias de procesamiento de lfpidos, como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia tipo 1, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosomal, como enfermedad de celulas I/pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar tipo II, poliendocrinopatia/hiperinsulinemia, diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congenito, osteogenesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT,
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    diabetes ins^pida (DI), DI neurohipofisaria, DI nefrogena, smdrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas como Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, paralisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurologicos de la poliglutamina como Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia pallidoluisiana dentatorubral y distrofia miotonica, asf como encefalopatias espongiformes, como la enfermedad hereditaria de Creutzfeldt-Jakob (debido a un defecto en el procesamiento de la protema del prion), la enfermedad de Fabry, el smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la EPOC, la enfermedad del ojo seco o la enfermedad de Sjogren.
  9. 9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el compuesto de Formula I tiene la estructura:
    imagen4
  10. 10. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el compuesto de Formula I tiene la estructura:
    imagen5
  11. 11. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha enfermedad es fibrosis qmstica.
  12. 12. Para mejorar la medicion de la actividad de CFTR o el fragmento de la muestra biologica in vitro o in vivo, que comprende:
    i. una composicion que comprende un compuesto de Formula I, segun la reivindicacion 1; e
    ii. instrucciones para:
    a. poner en contacto la composicion con la muestra biologica; y
    b. medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo.
  13. 13. El kit de la reivindicacion 12, que comprende ademas instrucciones para:
    i. poner en contacto un compuesto adicional con la muestra biologica;
    ii. medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo en presencia de dicho compuesto adicional; y
    iii. comparar la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia del compuesto adicional con la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en presencia de dicha composicion que comprende un compuesto de Formula I, de acuerdo con la reivindicacion 1.
  14. 14. El kit segun la reivindicacion 13, en el que
    la etapa de comparar la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo proporciona una medida de la densidad de dicho CFTR o un fragmento del mismo.
  15. 15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el compuesto de Formula I tiene la estructura:
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  16. 16. El kit de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el compuesto de Formula I tiene la estructura:
    imagen7
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