CN102349945B - 大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法，可有效解决从山橿中提取纯化总黄酮，以满足制备治疗胃溃疡及镇痛抗炎药物的问题，方法是，将山橿粉碎成粉，然后加乙醇超声提取，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液加水稀释成山橿提取物溶液；将大孔吸附树脂用乙醇浸泡后，用乙醇清洗，再用蒸馏水洗至无醇味，然后装柱；取山橿提取物溶液上样，上样完成后静置，用纯水冲洗除杂质，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得山橿根有效部位的纯化山橿总黄酮，本发明方法简单，稳定可靠，所得提取物山橿总黄酮，有效用于制备治疗胃溃疡及镇痛抗炎药物，开拓了山橿药用价值，是药物上的创新。

Description

大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法。

背景技术

山橿Lindera reflexa Hemsl.系樟科Lauraceae山胡椒属植物，为灌木或小乔木。主要分布于河南(大别山、桐柏山和伏牛山南部)、江苏、安徽等地，而河南信阳地区分布最广泛，且产量丰富，是山橿的主要产地。山橿根或根皮入药，性温，味辛，具有行气止痛，健脾消积，活血消肿等作用，且山橿在长期的临床应用中收到良好的效果。在河南省民间用于治疗慢性胃炎，胃溃疡已取得确切的临床疗效，而且有很长的历史。由于其良好的临床疗效和丰富的蕴藏资源，被收入《河南省地方药材标准》。

虽然山橿在临床上有确切的治疗脾胃虚寒性胃炎、胃溃疡等作用，由于良好的临床疗效而备受人们关注，但有效部位不明确，缺乏系统的药理跟踪研究。本发明结合临床疗效，建立多个药理模型，以药理实验为导向，进行有效部位和有效成分的系统研究，阐明其疗效的物质基础，以便为山橿的进一步开发利用提供科学的依据。为了明确这一临床却有疗效的有效部位，建立能确切反映该药临床疗效的控制方法，控制有效部位的质量。由于山橿资源广泛，价格低廉，对抗炎、抗溃疡和镇痛的有效部位、活性成分进行深入研究，将其开发成治疗胃病的新药，既会创造显著的经济效益，也将产生良好的社会效益；更重要的是对胃病的治疗将起到很大的推动作用。研究表明，山橿主要活性成分有黄酮类(或称总黄酮)，生物碱类和挥发油类，以球松素为代表的总黄酮为主要有效活性成分，并具有很好的治疗胃溃疡及镇痛抗炎的功效，那么，如何将山橿总黄酮纯化提取出来是本领域技术人员一直在研究解决的问题，但至今未见有公开的报导。

发明内容

针对上述情况，克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法，可有效解决从山橿中提取纯化总黄酮，以满足制备治疗胃溃疡及镇痛抗炎药物的问题。

本发明解决的技术方案是，由以下步骤实现：

1、制备山橿提取物溶液：将山橿粉碎成粉，然后加质量浓度为60-80％的乙醇(或称为60-80％乙醇，以下同)超声提取2-4次，每次提取40-90分钟，每次60-80％乙醇的加入量为山橿重量的10-14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1ml含生药0.05mg(0.05mg/ml生药)的山橿提取物溶液，备用；

2、大孔吸附树脂处理：方法是，将大孔吸附树脂先用95％乙醇浸泡12h后，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用；

3、湿法装柱：取树脂柱子，按树脂柱子直径与柱高比1∶7-9的比例，用步骤2处理过的大孔吸附树脂湿法装柱；

4、上样纯化提取：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4-6倍，上样流速为1.0ml/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂4-6倍重量的纯水冲洗除杂质，再用大孔吸附树脂4-6倍重量的70-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得山橿根有效部位的纯化山橿总黄酮。

本发明方法简单，稳定可靠，所得提取物山橿总黄酮，有效用于制备治疗胃溃疡及镇痛抗炎药物，开拓了山橿药用价值，是药物上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，是由以下步骤操作的：

1、制备山橿提取物溶液：将山橿粉碎成粉，然后加质量浓度为70％的乙醇(或称为70％乙醇，以下同)超声提取3次，每次提取1小时，每次70％乙醇的加入量为山橿重量的12倍；合并三次的提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1ml含生药0.05mg(0.05mg/ml生药)的山橿提取物溶液，备用；

2、大孔吸附树脂处理：方法是，将大孔吸附树脂先用95％乙醇浸泡12h后，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用；

3、湿法装柱：取树脂柱子，按树脂柱子直径与柱高比1∶8的比例，用步骤2处理过的大孔吸附树脂湿法装柱；

4、上样纯化提取：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1.0ml/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗除杂质，再用大孔吸附树脂4倍重量的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得山橿根有效部位的纯化山橿总黄酮。

实施例2

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

1、制备山橿提取物溶液：将山橿粉碎成粉，然后加质量浓度为80％的乙醇(或称为80％乙醇，以下同)超声提取2次，每次提取90分钟，每次80％乙醇的加入量为山橿重量的14倍；合并两次的提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1ml含生药0.05mg(0.05mg/ml生药)的山橿提取物溶液，备用；

2、大孔吸附树脂处理：方法是，将大孔吸附树脂先用95％乙醇浸泡12h后，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用；

3、湿法装柱：取树脂柱子，按树脂柱子直径与柱高比1∶9的比例，用步骤2处理过的大孔吸附树脂湿法装柱；

4、上样纯化提取：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的6倍，上样流速为1.0ml/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂6倍重量的纯水冲洗除杂质，再用大孔吸附树脂6倍重量的90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得山橿根有效部位的纯化山橿总黄酮。

实施例3

本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：

1、制备山橿提取物溶液：将山橿粉碎成粉，然后加质量浓度为60％的乙醇(或称为60％乙醇，以下同)超声提取4次，前两次每次提取60分钟，每次乙醇加入量为山橿重量的12倍，后两次每次提取40分钟，每次乙醇的加入量为山橿重量的10倍；合并四次的提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1ml含生药0.05mg(0.05mg/ml生药)的山橿提取物溶液，备用；

2、大孔吸附树脂处理：方法是，将大孔吸附树脂先用95％乙醇浸泡12h后，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用；

3、湿法装柱：取树脂柱子，按树脂柱子直径与柱高比1∶7的比例，用步骤2处理过的大孔吸附树脂湿法装柱；

4、上样纯化提取：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的5倍，上样流速为1.0ml/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂5倍重量的纯水冲洗除杂质，再用大孔吸附树脂5倍重量的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得山橿根有效部位的纯化山橿总黄酮。

上述方法经多次反复试验，均得到了相同和相近似的结果，表明方法稳定可靠，易操作，其提取物纯化的山橿总黄酮可有效用于制备治疗胃溃疡及镇痛抗炎药物，有关试验资料如下：

一、有关方法稳定可靠性的试验资料

1.材料、试剂与仪器

山橿药材(2010年采自于河南省新县，经鉴定为樟科Lauraceae山胡椒属植物山橿Linderareflexa Hemsl.的根)；球松素(由本实验室从山橿中分离得到，用HPLC法测定其纯度达到99.05％)。

甲醇为色谱纯(天津市四友精细化学品有限公司)；其他试剂为分析纯(天津市化学试剂三厂)；大孔吸附树脂：HPD-450、HPD-600、D101(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，DM130、860021(山东鲁抗立科药物化学有限公司)，HP20(日本三菱化学株式会社)。

高效液相色谱仪LC-20AT(日本岛津公司)，紫外检测器SPD-20A(日本岛津公司)，色谱工作站CBM-102(日本岛津公司)，电子天平(BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

2.实验方法与结果

2.1对照品和样品溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取干燥的球松素标准品，甲醇溶解配制成适当浓度的对照品溶液；样品溶液的制备：取山橿药材粗粉适量，分别加入12倍量70％乙醇超声提取三次，每次1.0h，回收乙醇，静止24h备用。

2.2总黄酮检测方法

分别取适量对照品溶液和样品溶液，在200nm-600nm波长范围扫描，对照品和样品最大吸收波长都在286nm处，确定286nm作为总黄酮紫外检测波长。

2.2.1标准曲线及样品总黄酮检测

取浓度0.22mg/ml的对照品溶液，稀释配制成浓度2.20μg/ml、4.40μg/ml、8.80μg/ml、11.00μg/ml、13.20μg/ml、17.60μg/ml的标准品溶液，分别连续3次测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，平均吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果表明球松素浓度在2.20～17.60μg/mL之间线性关系良好，线性方程为Y＝0.081X+0.008，r＝0.9994。

取样品溶液，浓缩干燥，精密称取0.1g干膏，甲醇溶解并定容至50ml，再精密吸取0.1ml定容至10ml，于286nm测定吸光度，按线性方程计算样品溶液中的总黄酮质量分数(以球松素计)。

2.2.2方法学考察

通过精密度，稳定性，重复性的考察，表明该方法对总黄酮的含量测定稳定、可行。

回收率考察：精密称取适量的山橿药材样品6份，分别加入一定量的球松素标准品，按样品溶液制备方法制备，样品溶液总黄酮检测方法测定，计算平均回收率为99.78％，RSD＝2.94％，表明该方法回收率良好。结果见表1：

表1  回收率考察试验结果

2.3球松素检测方法

2.3.1HPLC色谱条件选择色谱柱：phenomenex luna5μC18(250*4.60mm)，检测波长：297nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相条件按梯度洗脱，能达到较好的分离效果。

表2：流动相条件

A：球松素

2.3.2标准曲线及样品检测

取1.005mg/ml球松素标准品溶液，分别精密吸取2、5、10、15、20μl注入高效液相色谱仪，按上文HPLC条件测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积均值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明：球松素进样量在2.01～20.10μg范围内线性关系良好，线性方程为：Y＝2896600X+50479，r＝0.9997。

取样品溶液按HPLC条件进行测定，按标准曲线方程计算球松素含量。

2.3.3方法学考察

通过精密度，稳定性，重复性的考察，表明该测定方法稳定、可行。

回收率考察精密称取适量的山橿药材样品6份，分别加入一定量的球松素标准品，按样品溶液制备方法制备，球松素含量检测方法测定，平均回收率为99.33％，RSD＝2.69％，表明该方法回收率良好。结果见表3：

表3  回收率考察试验结果

2.4综合评价方法

为了把多个量纲不同的统计指标，转化成无量纲的相对评价值，并综合这些评价值得出一个整体评价，本实验选用了多指标综合评价方法。

运用多指标综合分析时，首先对各变量按相应的方法作标准化变换，消除原变量量纲、数量级的不同带来的影响，本实验选择Z-score法对指标进行变换，公式如下：

$Z_{\mathrm{ij}}=\frac{x_{\mathrm{ij}}-{\stackrel{\‾}{x}}_j}{s_j},$ i＝1，2，...，n；j＝1，2，...，p

其中 ${\stackrel{\‾}{x}}_j=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{x}_{\mathrm{ij}}}{n},$ $s_j^2=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{(x_{\mathrm{ij}}-{\stackrel{\‾}{x}}_j)}^2}{n-1}.$

经过变换后的数据均值为0，方差为1。

数据标准化后，根据各指标对结果的不同影响程度，采用主观赋权法，对不同指标分别赋予不同的权重系数：球松素收率权重系数0.4，收膏率和总黄酮收率权重系数同为0.3，指数系数设定为100，计算综合得分。

综合评分公式为：

Y＝(0.3*ZX1+0.3*ZX2+0.4*ZX3)*100，ZX为标准化的数据。

2.5工艺条件考察

2.5.1大孔吸附树脂型号的选择

树脂预处理：根据树脂的极性、粒径和孔径等参数，初步选择不同厂家的六种型号的树脂进行考察。树脂先用95％乙醇浸泡12h后，湿法装柱，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合(1∶5)不呈白色混浊，蒸馏水洗至无醇味，备用。

取样品液进行动态吸附和解吸附，分别检测，计算吸附率和解吸附率，比较综合评价结果，选择DM130型作为纯化树脂，结果见表4。

表4  不同型号树脂吸附洗脱试验结果

2.5.2上样浓度的考察

样品液稀释至质量浓度为0.02、0.033、0.05、0.1g/ml，分别通过DM130树脂上样，洗脱，检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮收率和球松素收率。综合评价结果，选取上样浓度为0.05g/ml。结果见表5。

表5  不同上样浓度测定结果

2.5.3上样流速的考察

取浓度0.05g/ml样品液，分别按0.5、1.0、1.5、2.0ml/mim的流速进行上样，洗脱，检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮收率和球松素收率。综合评价，选取上样流速为1.0ml/mim。结果见表6。

表6  不同上样流速测定结果

2.5.4上样径高比的考察

样品液0.05g/ml，流速1.0ml/min，分别通过径高比为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的树脂柱进行上样，洗脱，分别检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮收率和球松素收率。综合评价，选取径高比为1∶8。结果见表7。

表7  不同径高比考察结果

2.5.5树脂最大上样量的考察

取DM130型树脂40ml，样品液0.05g/ml按流速1.0ml/min进行上样。分份收集流出液，每10ml收集一份，共收集20份，薄层(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)展开后，喷三氯化铝显色，紫外荧光检视球松素显黄绿色荧光。第14管出现球松素斑点，说明从140ml开始出现泄漏。最大上样量的考察，取DM130型树脂40ml，按流速1.0ml/min分别上样品液(0.05g/ml)120、140、160、180ml，吸附，洗脱，分别检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮收率和球松素收率。综合评价，确定160ml相当于4倍树脂量为最大上样体积。结果见表8。

表8  最大上样量考察结果

2.5.6除杂用水量的考察

取40ml完成上样的DM130树脂，分别加入80ml、120ml、160ml、200ml纯水除杂，洗脱，除杂效果直接影响产物的纯度，分别检测，计算洗脱液中总黄酮和球松素收率和含量，结果见表9。

表9  不同体积水除杂考察结果

洗脱用水量使总黄酮和球松素的含量增加，当用洗脱水量超过160ml(4倍树脂量)时，总黄酮和球松素的收率明显降低，故选取4倍量为除杂用水量。

2.5.7洗脱液浓度的确定

取完成上样并除杂后的树脂柱4根，分别用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，并检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮收率和球松素收率，综合考虑评价结果和生产成本因素，选取70％乙醇作为洗脱液。结果见表10。

表10  不同洗脱液浓度考察结果

2.5.8洗脱速率的考察

取已完成上样的树脂柱4根，按流速1.0ml/min，4倍量纯水除杂后，用70％乙醇按不同流速进行洗脱，分别检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮收率和球松素收率。洗脱流速增大三个指标变化不大，当流速大于1.5ml/min时各项三个收率明显减小，综合考虑评价结果和时间因素，选取1.5ml/min作为洗脱流速。结果见表11。

表11  不同洗脱速率考察结果

2.5.9洗脱液用量的考察

分别用不同量的70％乙醇洗脱，检测，计算收膏率，总黄酮收率和球松素收率。当洗脱液用量为160ml时，总黄酮和球松素基本洗脱完全，选取洗脱液用量160ml(4倍树脂量)。结果见表12。

表12  不同洗脱乙醇量考察结果

2.5.10树脂重复使用次数的考察

用确定上样条件和洗脱条件，连续4次对同一根树脂柱进行重复上样，洗脱。比较不同上样次数的收膏率，总黄酮收率和球松素收率。结果第4次使用时吸附效率显著降低，所以树脂可重复上样3次，需再生。结果见表13。

表13  树脂重复试验次数考察结果

2.6纯化工艺条件验证

按照以上确定的条件：DM130型树脂，按径高比1∶8装柱，4倍量浓度为0.05g/ml样品液，流速1.0ml/min上样，上样完成后静置2h，以4倍量的纯水除杂，4倍量的70％乙醇洗脱，进行工艺验证试验(n＝3)，纯化的总黄酮含量达到50％以上，球松素含量达到9.0％以上。

3.讨论

由于山橿黄酮类成分极性差异较大，所以首先选择了沧州宝恩吸附材料科技有限公司、山东鲁抗立科药物化学有限公司、日本三菱化学株式会社三个厂家的11个型号的树脂进行了静态吸附考察，从中优选了效果较好的6个型号进行动态吸附，最终确定了DM130树脂吸附效果较好，能够获得纯度较高的产物。

为了保证纯化过程中主要成分不流失，本实验选择指标性成分球松素、总黄酮和收膏率三个指标对工艺进行考核，同时用主要特征指纹峰面积的保留率评价山橿总黄酮精制效果，11个主要成分峰全部保留，峰面积比例未改变，说明纯化过程对总黄酮的主要成分组成保留效果较好。

现有的中药研究中多采用单一指标作为考察对象进行分析，多指标的分析也多采用直观分析法或直接分析法，本文采用综合评价法，使结果分析更全面。

二、山橿总黄酮活性的药理试验资料

1 材料与方法

1.1药品及试剂：山橿，采自于河南省新县，经鉴定为樟科山胡椒属植物山橿(Lindera refLexaHemsl.)的根。

胃疼宁片河南羚锐制药股份有限公司批号：071102。水合氯醛天津市化学试剂三厂批号：20080109。冰醋酸开封化学试剂总厂批号20060603。二甲苯洛阳市恒辉精细化学品有限公司批号20060307。

1.2实验动物：清洁级Wistar小鼠，体重18-25g，4-6周龄，雌性，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号：scxk(豫)2007-0013。清洁级Wistar大鼠，体重180-220g，4-6周龄，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号：scxk(豫)2006-0008。

1.3仪器：RE-52A旋转薄膜蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Sartorius电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，YLS-6A智能热板仪(山东省医学科学院设备站)。

1.4方法

1.4.1药物制备

取山橿药材，打粉，过24目筛，加70％乙醇超声提取3次，每次提取1小时，溶剂用量为12倍体积量。合并三次的提取液，减压回收乙醇至无醇味，得浓缩液。取浓缩液，加水稀释成0.05mg/ml(生药)的溶液。取DM130型大孔吸附树脂，先用95％乙醇浸泡12h后，湿法装柱，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。

取纯化用的柱子，按径高比1∶8的比例用处理过的大孔吸附树脂装柱，取4倍体积量浓度为0.05g/ml溶液按流速1.0ml/min上样，静置2h，以4倍的纯水冲洗除杂质，用4倍的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。减压回收溶剂，得山橿根中的总黄酮部位。

另取山橿粗粉500g，用水蒸气蒸馏法提取挥发油得10.5mL。

1.4.2抗胃溃疡模型实验，包括急性胃溃疡模型实验(幽门结扎法)和慢性胃溃疡模型实验(醋酸法)。

1.4.2.1急性胃溃疡模型实验(幽门结扎法)：取体重200±20g的Wistar大鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，每组10只：模型组，阳性对照组，山橿总黄酮组，挥发油组，分别灌胃给药生理盐水、胃疼宁片溶液(0.225g/Kg剂量)及山橿总黄酮溶液、挥发油(均按山橿药材7g/Kg剂量)，每日1次灌胃给药，连续灌胃7天。用幽门结扎法造模，于造模前48小时禁食不禁水，造模后18小时后脱颈椎处死，剖腹，结扎贲门取胃。用肉眼和放大镜观察胃黏膜面，记录每组产生溃疡的鼠数、溃疡数、每个溃疡面的最大直径、溃疡面积及病变情况。计算溃疡指数和溃疡抑制百分率。

溃疡指数按Guth标准由每个溃疡面的最大直径计算其溃疡指数，

(在解剖显微镜下以测微尺测定损伤长度(mm)，以粘膜损伤长度＞1mm者每1mm计1分，损伤宽度＞2mm、、＜3mm计分加倍，＞3mm、＜4mm计分按3倍计，以此类推，计分相加即为该动物的溃疡指数)。

溃疡抑制百分率＝(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数。

1.4.2.2慢性胃溃疡模型实验(醋酸胃溃疡法)：取体重200±20g的Wistar大鼠32只，雌雄各半，半空腹状态下随机分4组，分组方法同1.4.2.1。按醋酸法造模。从手术次日起，分别灌胃给药生理盐水、胃疼宁片溶液(0.225g/Kg剂量)及山橿各溶剂部位提取物溶液(均按山橿药材7g/Kg剂量)，每日1次，连续灌胃12天。第14天处死，观察并记录溃疡情况，计算溃疡指数和溃疡抑制百分率。

1.4.3疼痛模型实验，包括扭体法和热板法。

1.4.3.1扭体法取体重18-25g的清洁级Wistar小鼠，雌性，实验室适应3天后，取同批次小鼠70只，随机分为4组，模型组10只，阳性对照组、山橿总黄酮组、挥发油组各20只。分别灌胃给药生理盐水、胃疼宁片溶液(0.289g/Kg剂量)及山橿总黄酮、挥发油(均按山橿药材9g/Kg剂量)，每天1次，连续灌胃5天。于造模前24小时禁食不禁水，各组小鼠灌胃给药120分钟后，腹腔注射0.6％冰醋酸0.15mL/10g，观察各组小鼠扭体反应潜伏期，记录15分钟内每只小鼠扭体的次数。

1.4.3.2热板法取体重18-25g的清洁级Wistar小鼠，雌性。实验室适应3天后，进行预试：用YLS-6A智能热板仪(55±5)℃筛选热板痛反应时间合格的实验小鼠。取同批次合格小鼠70只，随机分为4组，模型组10只，阳性对照组、山橿总黄酮组、挥发油组各20只。分别灌胃给药生理盐水、胃疼宁片溶液(0.289g/Kg剂量)及山橿总黄酮、挥发油(均按山橿药材9g/Kg剂量)，每天1次，连续灌胃5天。末次灌胃给药后分别在60、120、180分钟时，将小鼠放入热板，测定痛阈值。

1.4.4抗炎实验(小鼠耳廓肿胀法)取体重18-24g的清洁级Wistar小鼠，雌性，70只，随机分为4组，模型组10只，阳性对照组、山橿总黄酮组、挥发油组各20只。分别灌胃给药生理盐水、胃疼宁片溶液(0.289g/Kg剂量)及山橿总黄酮、挥发油(均按山橿药材9g/Kg剂量)，每天1次，连续灌胃5天。末次给药1.5h后，将二甲苯均匀涂于小鼠右耳前后两面，40μL/只，左耳作自身空白对照。1h后将小鼠脱椎处死，用内径9mm打孔器分别在左、右双耳同一部位打下圆耳片，天平上称重，右耳圆片重量减去左耳圆片重量之差为肿胀度，计算肿胀抑制率。

肿胀抑制率＝(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度

1.4.5统计学方法

结果采用SPSS13.0统计软件分析，数值变量采用

进行统计描述，用单因素方差分析方法(One-Way ANOVA)。

2 结果

2.1抗胃溃疡实验

2.1.1急性胃溃疡模型(幽门结扎法)由统计结果显示：总黄酮和挥发油组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。实验结果见表1-1。

表1-1  山橿各部位对幽门结扎法所致大鼠胃溃疡的影响

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05。

2.1.2慢性胃溃疡模型(醋酸法)由统计结果显示：挥发油组、总黄酮组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。实验结果见表1-2。

表1-2  山橿各部位对醋酸法所致大鼠胃溃疡的影响

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05。

2.2疼痛模型实验

2.2.1扭体法

统计结果显示：挥发油组和总黄酮组与模型组比较有差异(P＜0.05)。实验结果见表1-3。

表1-3  山橿各部位对冰醋酸法所致小鼠扭体反应的影响

与模型组比较：*P＜0.05。

2.2.2热板法

统计结果显示：挥发油组和总黄酮组与模型组比较有差异(P＜0.05)。实验结果见表1-4。

表1-4  山橿各部位对热板法小鼠痛域值的影响

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05。

抗炎实验

统计结果显示：挥发油组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)，总黄酮组与模型组比较有差异(P＜0.05)。实验结果见表1-5。

表1-5  山橿各部位对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05。

3 讨论

3.1通过抗胃溃疡实验，发现山橿的总黄酮组和挥发油组均有抑制胃溃疡的作用。在镇痛、抗炎实验中山橿的挥发油及总黄酮部位表现出了明显的镇痛、抗炎作用。综合考虑，山橿治疗胃溃疡及抗炎镇痛作用的部位应为挥发油和总黄酮部位。

3.2山橿为中药“胃疼宁片”的主要原料，“胃疼宁片”的提取工艺为水蒸气蒸馏提取挥发油，残渣水煎煮，浓缩成膏。因此“胃疼宁片”是山橿挥发油与水提取物综合发挥疗效的。而本实验中山橿挥发油及总黄酮提取部位是分别进行实验观察的，所以，各部位疗效作用均弱于阳性对照(胃疼宁片)组，符合实际情况，获得了预期的技术效果。

Claims (1)

1.一种大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、制备山橿提取物溶液：将山橿粉碎成粉，然后加质量浓度为70％的乙醇超声提取3次，每次提取1小时，每次70%乙醇的加入量为山橿重量的12倍；合并三次的提取液,减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1ml含生药0.05mg的山橿提取物溶液，备用；

（2）、大孔吸附树脂处理：方法是，将大孔吸附树脂先用95%乙醇浸泡12h后，用95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用；所述的大孔吸附树脂为DM130；

（3）、湿法装柱：取树脂柱子，按树脂柱子直径与柱高比1︰8的比例，用步骤（2）处理过的大孔吸附树脂湿法装柱；

（4）、上样纯化提取：取步骤（1）制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1.0ml/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗除杂质，再用大孔吸附树脂4倍重量的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得山橿根有效部位的纯化山橿总黄酮。