CN102342495B - 一种竹笋提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种竹笋提取物及其制备方法。本发明所提供的竹笋提取物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)将竹笋粉碎，加水打浆，调节浆液至碱性，过滤收集上清液1；再调节上清液1至酸性，离心收集沉淀和上清液2，干燥沉淀得竹笋蛋白；2)将所述竹笋蛋白配制成竹笋蛋白水溶液，并向其中加入复合蛋白酶进行酶解反应；反应结束后，进行灭酶处理，离心收集上清液，得到所述竹笋提取物；其中，所述复合蛋白酶由Protamex蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其酶活力比为1∶1-3。经测定，本发明所提供的竹笋提取物的得率≥60％，纯度≥80％，分子量小于5000Da的氨基酸肽含量≥80％。

Description

一种竹笋提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种竹笋提取物及其制备方法。 

背景技术

竹笋是竹子膨大的芽或幼嫩的茎，是一种高蛋白低脂肪的森林蔬菜。我国竹笋产量居世界首位，竹笋加工业发展迅速，预计2010年笋制品产量将达到80万吨。但是，传统竹笋加工过程伴随着大量废弃物和笋煮水的产生，造成严重的浪费和环境污染问题，而且初加工产品产值较低，要将竹笋资源优势转化为经济优势，实现对竹笋加工剩余物的综合利用，就必须重视产品创新，研制具有功能活性的竹笋深加工产品。 

竹笋蛋白质含量较高，100g鲜笋平均含有蛋白质2.65g，必需氨基酸占总氨基酸的32.0～37.2％，生物活性肽是当前国际药学和食品界热门的研究课题和极具发展前景的功能因子，研究开发竹笋短肽具有重要实际意义。目前，提取竹笋蛋白一般用酸沉法，500g鲜笋脚料可获得1.4mg蛋白，国内有研究报道利用超滤和反渗透技术从竹笋加工废液中制备出竹笋氨基酸肽类提取物，氨基酸总量(以干基计)10～50％，游离氨基酸含量占5～40％；从毛竹春笋(或笋加工废液)中利用等电点沉淀法分离、精制得酪氨酸，制取得率为3.8～4.2％，精制纯度大于98.5％。 

发明内容

本发明的目的是提供一种竹笋提取物(竹笋氨基酸肽)及其制备方法。 

本发明所提供的竹笋提取物为竹笋提取物A或竹笋提取物A+B。 

本发明所提供的竹笋提取物A是按照包括下述步骤的方法制备得到的： 

1)提取竹笋蛋白：将竹笋粉碎，加水打浆，调节浆液至碱性以增溶，过滤收集上清液，记为上清液1；再调节上清液1至酸性，离心收集沉淀和上清液2，所述沉淀即为竹笋蛋白； 

2)酶处理及酶灭活：将竹笋蛋白以水溶解，配制成竹笋蛋白溶液，并向其中加入复合蛋白酶进行酶解反应；反应结束后，对酶处理后的蛋白溶液进行灭酶处理，离心收集上清液3，得到所述竹笋提取物A(竹笋氨基酸肽原液)；其中，所述复合蛋白酶由Protamex蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其酶活力比为1∶1-3。 

所述Protamex蛋白酶可购于丹麦诺维信公司(128-027-01)；木瓜蛋白酶可购于南宁庞博公司(450000-000105)。 

其中，步骤1)中竹笋与水的配比可为1kg∶(3-5)L；调节浆液至碱性时，pH值优选为8-9；对所述浆液可采用100-200目纱布进行过滤。步骤1)中调节上清液1至酸性时，pH值优选为4-5；对酸性上清液进行离心时，离心的条件为：转速为 4000-5000r/min，时间20-30min。 

步骤2)中所述酶解反应的条件为：竹笋蛋白底物浓度为2-4％(g/100ml)，反应温度为55-60℃，反应时间为150-180min，pH值为6.5-7.0，所述复合酶的用量为7500-9000U/g竹笋蛋白。 

步骤2)中所述灭酶的方法为：将酶处理后的蛋白溶液升温至90-95℃，保持10-20min。 

为了进一步得到固态的竹笋提取物，所述方法还包括将步骤2)得到的竹笋提取物A浓缩并干燥的步骤。 

具体方法如下：将竹笋提取物A(竹笋氨基酸肽原液)通过真空浓缩至固形物含量为35-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成竹笋提取物干粉A。 

步骤1)中，对上清液进行酸沉时，由于部分小分子蛋白和氨基酸的等电点不在pH4附近，因此不能从上清液沉降出来，为了尽量提取出竹笋中的全部氨基酸肽，本发明可将步骤1)中酸沉后得到的上清液2浓缩，依次经过微滤膜(0.45μm)和超滤膜(5K Da)过滤，除去大分子纤维和多糖，得到竹笋氨基酸肽产品B(即竹笋提取物B)。 

将本发明得到的竹笋提取物干粉A以及竹笋氨基酸肽产品B混合，即得到竹笋完全提取物(竹笋提取物A+B)。 

本发明的竹笋完全提取物也可由下述a)-c)中任意一中方法得到： 

a)将步骤1)中上清液2过滤得滤液a，将步骤2)中上清液3与滤液a混合，得到所述竹笋全提取物溶液； 

b)将步骤1)中上清液2先过滤再浓缩或先浓缩再过滤得浓缩液1，将所述上清液3浓缩得浓缩液2，将所述浓缩液1和浓缩液2混合、干燥，得到所述竹笋全提取物； 

c)将所述上清液2依次过滤、浓缩、干燥，或依次浓缩、过滤、干燥，得到竹笋提取物A，将所述上清液3浓缩、干燥得到竹笋提取物B，将所述竹笋提取物A和B混合，得到所述竹笋全提取物； 

所述a)-c)中对所述上清液2过滤的方法为：依次经过0.45μm微孔滤膜、5K Da超滤膜过滤。 

经测定，本发明所提供的竹笋完全提取物得率≥60％(以竹笋中总蛋白含量计)，纯度≥80％，分子量小于5000Da的氨基酸肽含量≥80％。 

与目前已有方法相比，本发明获得了高提取率和高纯度的竹笋氨基酸肽。 

试验证明，本发明的竹笋提取物具有较强的抗氧化活性。氨基酸肽浓度为20mg/ml时，清除羟基自由基的能力可达到89％；氨基酸肽浓度为25mg/ml时，超氧阴离子自 由基清除率可达为50.83％；氨基酸肽浓度为10mg/ml，DPPH自由基清除能力率可达73.60％。 

附图说明

图1为实施例1-3中制备竹笋提取物的流程图。 

图2为实施例4中制备竹笋提取物的流程图。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。 

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 

下述实施例中所用的Protamex蛋白酶购于丹麦诺维信公司(128-027-01)；木瓜蛋白酶购于南宁庞博公司(450000-000105)。 

实施例1、制备竹笋提取物(竹笋氨基酸肽) 

制备流程见图1。 

具体过程为： 

①提取竹笋蛋白：竹笋粉碎→打浆(料水质量体积比1kg∶4L)→碱提(用NaOH调节pH＝9，50℃，60min)→过滤(先用100目纱布，再用200目纱布过滤)→上层清液→酸沉(以盐酸调节pH＝4.0)→离心(4800r/min，20min)→收集沉淀→冷冻干燥，得到竹笋蛋白。 

②酶处理：将竹笋蛋白配制成底物浓度为4％的竹笋蛋白溶液，以Protamex蛋白酶与木瓜蛋白酶按酶活力比为1∶2的比例进行酶解，条件为：水解温度60℃，水解时间150min，pH7.0，蛋白酶总用量为7500U/g蛋白。 

③酶灭活：将酶处理后的蛋白溶液快速升温至95℃，保持15min使酶灭活，之后4200g离心20min，固液分离，得上清液即为竹笋氨基酸肽原液。 

④浓缩、干燥：通过真空浓缩至固形物含量为35-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成竹笋提取物(竹笋氨基酸肽)干粉，产品得率为67.74％(以竹笋中总蛋白含量计)。竹笋蛋白含量采用国标GB/T 5009，5.2003方法测定。 

所得竹笋氨基酸肽干粉是一种淡黄色粉末，氨基酸肽含量为82％，氨基酸肽含量的测定采用三氯乙酸(TCA)可溶性氮法(参考文献：JANG A，LEE M.Purification and identification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates[J].Meat Sci，2005，69：653-661.)。将所得氨基酸肽产品通过超滤膜(5K Da和1K Da)超滤，测定超滤后得到的产品氨基酸肽含量，计算出所得产品的分子量小于5000Da的含量≥80％，其中分子量小于1000Da的含量≥60％。 

实施例2、制备竹笋提取物(竹笋氨基酸肽) 

制备流程见图1。 

具体过程为： 

①提取竹笋蛋白：竹笋粉碎→打浆(料水质量体积比1kg∶3L)→碱提(用NaOH调节pH＝8.0，50℃，60min)→过滤(先用100目纱布，再用200目纱布过滤)→上层清液→酸沉(以盐酸调节pH＝4.5)→离心(4500r/min，30min)→收集沉淀→冷冻干燥，得到竹笋蛋白。 

②酶处理：将竹笋蛋白配制成底物浓度为4％的竹笋蛋白溶液，以Protamex蛋白酶与木瓜蛋白酶按酶活力比为1∶1的比例进行酶解，条件为：水解温度55℃，水解时间180min，pH6.5，蛋白酶总用量为9000U/g蛋白； 

③酶灭活：将酶处理后的蛋白溶液快速升温至90℃，保持20min使酶灭活，之后4200g离心20min，固液分离，得上清液即为竹笋氨基酸肽原液。 

④浓缩、干燥：通过真空浓缩至固形物含量为35-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成竹笋提取物(竹笋氨基酸肽)干粉，产品得率65.37％(以蛋白量计)，氨基酸肽含量为81％。 

实施例3、制备竹笋提取物(竹笋氨基酸肽) 

制备流程见图1。 

具体过程为： 

①提取竹笋蛋白：竹笋粉碎→打浆(料水质量体积比1kg∶5L)→碱提(用NaOH调节pH＝8.5，50℃，60min)→过滤(先用100目纱布，再用200目纱布过滤)→上层清液→酸沉(以盐酸调节pH＝4.2)→离心(4200r/min，25min)→收集沉淀→冷冻干燥，得到竹笋蛋白。 

②酶处理：将竹笋蛋白配制成底物浓度为2％的竹笋蛋白溶液，以Protamex蛋白酶与木瓜蛋白酶按酶活力比为1∶3的比例进行酶解，条件为：水解温度58℃，水解时间170min，pH7.5，蛋白酶总用量为8000U/g蛋白； 

③酶灭活：将酶处理后的蛋白溶液快速升温至92℃，保持15min使酶灭活，之后4200g离心20min，固液分离，得上清液即为竹笋氨基酸肽原液。 

④浓缩、干燥：通过真空浓缩至固形物含量为35-40％，经喷雾干燥或冷冻干燥制成竹笋提取物(竹笋氨基酸肽)干粉，产品得率66.93％(以蛋白量计)，氨基酸肽含量为80.7％。 

实施例4、制备竹笋提取物(竹笋氨基酸肽) 

制备流程见图2 

具体过程为： 

①提取竹笋蛋白：竹笋粉碎→打浆(料水质量体积比1kg∶5L)→碱提(用NaOH调节pH＝9.0，55℃，60min)→过滤(先用100目纱布，再用200目纱布过滤)→上层清液1→酸沉(以盐酸调节pH＝4.1)→离心(4500r/min，20min)→收集沉淀→冷冻干燥，得到竹笋蛋白。 

②将酸沉离心后得到的上清液2，先后通过微滤膜(0.45μm)和超滤膜(5K Da)过滤，除去大分子纤维和多糖，再进行真空浓缩，干燥得到竹笋氨基酸肽产品B。 

③酶处理：将竹笋蛋白配制成底物浓度为3％的竹笋蛋白溶液，以Protamex蛋白酶与木瓜蛋白酶按酶活力比为1∶3的比例进行酶解，条件为：水解温度58℃，水解时间160min，pH7.5，蛋白酶总用量为8500U/g蛋白。 

④酶灭活：将酶处理后的蛋白溶液快速升温至92℃，保持17min使酶灭活，之后4800g离心20min，固液分离，得上清液即为竹笋氨基酸肽原液。 

⑤浓缩、干燥：经喷雾干燥或冷冻干燥制成竹笋氨基酸肽干粉A。将竹笋氨基酸肽干粉A和步骤2得到的竹笋氨基酸肽产品B混合得竹笋提取物，产品得率为68.98％(以蛋白量计)，氨基酸肽含量为82.1％。 

实施例5、竹笋提取物抗氧化活性试验 

实验方法如下 

1.超氧阴离子自由基的清除 

在一系列的试管中加入离子强度为0.05M，pH为8.2的Tris-Hcl缓冲液9ml，再分别加入实施例4制备的竹笋提取物的溶液(氨基酸肽浓度为20mg/ml)100μl，空白组加入同体积的蒸馏水，再加入0.045M邻苯三酚(以0.01MHCL配制)100μl，震荡计时三分钟，加入10％抗坏血酸100μl终止反应，立即在325nm处测吸光值，实验设三次重复。 

$\mathrm{SA}=\frac{A_0-A_S}{A_0}\×100\%$

式中SA-清除自由基的能力，％；A₀-空白样测定值；A_S-样品测定值。 

2.羟自由基的清除 

在试管中依次加入9.1mM水杨酸-乙醇溶液0.5ml，竹笋提取物溶液(氨基酸肽浓度为25mg/ml)0.5ml，9.1mM Fe²⁺溶液0.5ml，蒸馏水3.5ml，最后加入88mMH₂O₂5ml，显色摇匀后，在510nm下测定清除活性，实验设三次重复。 

$\mathrm{SA}=\frac{A_0-\mathrm{As}}{A_0}\×100\%$

式中SA-清除自由基的能力，％；A₀-为空白样测定值；A_S-为样品测定值。 

3.DPPH自由基 

依次添加，0.1mM的DPPH 95％乙醇溶液1.5ml，竹笋提取物溶液(氨基酸肽浓度为10mg/ml)1.5ml，震荡后在室温下放置30min，517nm测定吸光度，实验重复三次。 

$\mathrm{SA}=(1-\frac{\mathrm{As}-\mathrm{Ae}}{A_0})\×100\%$

式中SA-清除自由基的能力，％；A_s-DPPH+样品；A_e-95％乙醇+样品；A₀-DPPH+蒸馏水。 

竹笋氨基酸肽抗氧化活性测定结果为： 

竹笋氨基酸肽羟自由基清除率为89.15±1.06％(氨基酸肽浓度为20mg/ml)，超氧阴离子自由基清除率为50.83±3.31％(氨基酸肽浓度为25mg/ml)，DPPH自由基清除能力率73.60±1.95％(氨基酸肽浓度为10mg/ml)。 

Claims (9)

1.一种制备竹笋提取物的方法，包括下述步骤：

1)将竹笋粉碎，加水打浆，调节浆液至碱性，过滤收集上清液，记为上清液1；再调节上清液1至酸性，离心收集沉淀，所述沉淀即为竹笋蛋白；

2)将所述竹笋蛋白配制成竹笋蛋白水溶液，并向其中加入复合蛋白酶进行酶解反应；反应结束后，进行灭酶处理，离心收集上清液，得到所述竹笋提取物；其中，所述复合蛋白酶由Protamex蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其酶活力比为1∶1-3；其中，酶解反应的条件为：竹笋蛋白底物浓度为2-4％，反应温度为55-60℃，反应时间为150-180min，pH值为6.5-7.0，所述复合酶的用量为7500-9000U/g竹笋蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述竹笋与水的配比为1kg∶(3-5)L；所述调节浆液至碱性时，浆液的pH值为8-9；所述过滤的方法为采用100-200目纱布进行过滤；

步骤1)中所述调节上清液1至酸性时，上清液1的pH值为4-5；所述离心的条件为：转速为4000-5000r/min，离心时间为20-30min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述灭酶的方法为：将酶处理后的竹笋蛋白水溶液升温至90-95℃，保持10-20min。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将步骤2)得到的竹笋提取物浓缩并干燥的步骤；所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。

5.一种制备竹笋提取物的方法，包括下述步骤：

1)将竹笋粉碎，加水打浆，调节浆液至碱性，过滤收集上清液，记为上清液1；再调节上清液1至酸性，离心收集沉淀和上清液2，所述沉淀即为竹笋蛋白；

2)将所述竹笋蛋白配制成竹笋蛋白水溶液，并向其中加入复合蛋白酶进行酶解反应；反应结束后，进行灭酶处理，离心收集上清液3；其中，所述复合蛋白酶由Protamex蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其酶活力比为1∶1-3；其中，酶解反应的条件为：竹笋蛋白底物浓度为2-4％，反应温度为55-60℃，反应时间为150-180min，pH值为6.5-7.0，所述复合酶的用量为7500-9000U/g竹笋蛋白；

3)选自下述a)-c)中任意一步：

a)将所述上清液2过滤得滤液，记为滤液a，将所述上清液3与滤液a混合，得到所述竹笋提取物；

b)将所述上清液2先过滤再浓缩或先浓缩再过滤得浓缩液，记为浓缩液1，将所述上清液3浓缩得浓缩液2，将所述浓缩液1和浓缩液2混合、干燥，得到所述竹笋提取物；

c)将所述上清液2依次过滤、浓缩、干燥，或依次浓缩、过滤、干燥，得到竹笋提取物A，将所述上清液3浓缩、干燥得到竹笋提取物B，将所述竹笋提取物A和B混合，得到所述竹笋提取物；

所述a)-c)中对所述上清液2过滤的方法为：依次经过0.45μm微孔滤膜、5K Da超滤膜过滤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述竹笋与水的配比为1kg∶(3-5)L；所述调节浆液至碱性时，浆液的pH值为8-9；所述过滤的方法为采用100-200目纱布进行过滤；步骤1)中所述调节上清液1至酸性时，上清液1的pH值为4-5；所述离心的条件为：转速为4000-5000r/min，离心时间为20-30min。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述灭酶的方法为：将酶处理后的竹笋蛋白水溶液升温至90-95℃，保持10-20min。

8.权利要求1-7中任一所述方法制备得到的竹笋提取物。

9.根据权利要求8所述的竹笋提取物在制备抗氧化产品中的应用。