CN102297914B - 同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法。目前还没有一种能够同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法。本发明所用试剂包括色谱纯的乙睛、水、分析纯的无水硫酸钠、正丙醇、氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷、分析纯的氨水和色谱纯的甲醇，该方法包括标准储备溶液配制工序、混合标准中间液配制工序、标准液配制工序、标准曲线制备工序、样品处理工序和样品检测工序。本发明操作简单，检测效率高，检测精度高，以信噪比S/N=3对应浓度确定方法的检出限分别为：三唑醇1.6μg/kg、蝇毒磷2.1μg/kg、氟胺氰菊酯2.0μg/kg，能同时检蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量。

Description

同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法

技术领域

本发明涉及一种检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，尤其是涉及一种同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，属于一种蜂王浆的检测方法。

背景技术

在蜂王浆的生产过程中，需要对蜂王浆中的氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的残留量进行检测，现有的检测蜂王浆中的氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的残留量的方法通常较为复杂，检测效率较低，检测的精确度较差，难以符合进口国对蜂产品残留限量的要求，阻碍了蜂产品的出口。如公开日为2009年02月04日，公开号为CN101358953的中国专利中，公开了一种蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，该检测方法的样品中加入提取液三氯乙酸或高氯酸和提取液醋酸盐、磷酸盐或硼酸盐溶液，控制PH值4.5-9.0；离心，滤液入固相萃取柱中萃取，洗脱并吹干萃取柱，用草酸-甲醇溶液洗柱，洗脱液用甲醇水溶液定容，入液相色谱-串联质谱分析测试，所得的色谱峰与各已知药物的标准色谱峰对照，根据保留时间和质谱离子的丰度确定所检出药物的具体名称；该方法对样品进行一次前处理后，能够同时提取磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、Β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒和三唑醇等11大类60多种兽药的药物残留，能够降低检测成本，但是，由于该方法检测的残留量的组分过多，导致检测的精确度大大降低，难以有效的达到检测三唑醇残留量的目的。

目前还没有一种能够同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，这就大大降低了检测效率，增加了检测成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种操作简单，检测效率高，检测精度高，有利于降低检测成本的能够同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法的特点在于：所述方法用到的试剂包括色谱纯的乙睛、水、分析纯的无水硫酸钠、正丙醇、氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷、分析纯的氨水和色谱纯的甲醇，该方法包括标准储备溶液配制工序、混合标准中间液配制工序、标准液配制工序、标准曲线制备工序、样品处理工序和样品检测工序；

所述标准储备溶液配制工序中，称取10mg氟胺氰菊酯、10mg三唑醇和10mg蝇毒磷分别置于一号10mL容量瓶、二号10mL容量瓶和三号10mL容量瓶中，向一号10mL容量瓶、二号10mL容量瓶和三号10mL容量瓶中加入乙腈并均定容至10ml分别制得浓度均为1000mg/L的氟胺氰菊酯标准储备溶液、三唑醇标准储备溶液和蝇毒磷标准储备溶液；

所述混合标准中间液配制工序中，分别取100μl氟胺氰菊酯标准储备溶液、100μl三唑醇标准储备溶液和100μl蝇毒磷标准储备溶液置于四号10mL容量瓶中，向四号10mL容量瓶中加入乙腈并定容至10ml制得浓度为10mg/L的混合标准中间液；

所述标准液配制工序中，取两份浓度为10mg/L的混合标准中间液100μl，分别用乙腈配至浓度为100μg/L的一号混合液和浓度为1000μg/L的二号混合液；称取五份阴性基质样品，每份阴性基质样品的重量均为2g，将五份阴性基质样品分别置于一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中；再向一号瓶、二号瓶和三号瓶中分别加入浓度为100μg/L的一号混合液100μl、200μl和500μl，向四号瓶和五号瓶中分别加入浓度为1000μg/L的二号混合液100μl和200μl；所述一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中的液体先各自混合3-5分钟，再各自静置15分钟后待用，该一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中分别得到浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液；

所述标准曲线制备工序中，将浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液均通过标准液处理步骤得到工作标准曲线制备样液，该工作标准曲线制备样液均通过标准液检测步骤得到工作标准曲线方程；所述标准液处理步骤中，称取2g±0.02g标准液置于50ml塑料离心管中，向50ml塑料离心管中加入5ml水混合均匀，再向50ml塑料离心管中加入300μl氨水混合均匀，然后向50ml塑料离心管中加人10mL乙腈并用力振摇3-5min，使标准液完全溶解，再向50ml塑料离心管中加入8g无水硫酸钠并用力振摇3-5min，然后在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为标准一次上清液和标准一次残渣，吸取50ml塑料离心管中的标准一次上清液后，再向50ml塑料离心管中加入5ml乙腈并用力振摇提取1-3min，在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为标准二次上清液和标准二次残渣，吸取50ml塑料离心管中的标准二次上清液，将标准一次上清液和标准二次上清液合并成为标准总上清液；向标准总上清液中加入5ml正丙醇，在40℃的条件下减压浓缩至干得到标准上清液残渣；向标准上清液残渣中加入10ml体积百分比为50%的乙腈溶液后进行超声波溶解，得标准溶解液；取HLB小柱，并用5ml甲醇和5ml水对HLB小柱进行活化，将上述标准溶解液用0.22μm的滤膜过滤至10ml注射器中作为标准样液，该注射器接HLB小柱，使标准样液自然速度过HLB小柱，再用3ml水对HLB小柱进行洗柱，然后真空抽干HLB小柱10min；用10ml乙腈对HLB小柱进行洗脱并收集标准洗脱液，该标准洗脱液在40℃的条件下减压浓缩至干得到标准洗脱液残渣，向标准洗脱液残渣中加入1ml体积百分比为80%的乙腈溶液，待标准洗脱液残渣完全溶解后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤得到标准洗脱样液，用标准洗脱样液进行上机检测，在LC/MS/MS中标准洗脱样液的进样量为20μl；所述标准液检测步骤中，检测仪器的条件为：液相色谱采用的色谱柱为intersil ODS C8-3 150mm×2.1mm×3μm或相当者，进样量为20μl，流动相采用含体积百分比为0.1%甲酸的甲醇为有机相，以含体积百分比为0.1%的甲酸水溶液（含0.5mmoL/L乙酸铵）为水相；质谱条件中的TEM为200.00℃，辅助加热气GS1为60.00，干燥气GS2为50.00，气帘气CUR为10.00，碰撞气CAD为5.00，电喷雾电压IS为4500.00V，ihe为ON；将制备好的各标准样液进样，得到工作标准曲线方程y=kx+b，其中，y表示峰面积，x表示浓度，k和b表示回归方程中的系数，该工作标准曲线方程中的r>0.99，r表示回归方程中的相关系数；

所述样品处理工序中，称取2g±0.02g蜂王浆样品置于50ml塑料离心管中，向50ml塑料离心管中加入5ml水混合均匀，再向50ml塑料离心管中加入300μl氨水混合均匀，然后向50ml塑料离心管中加人10mL乙腈并用力振摇3-5min，使蜂王浆样品完全溶解，再向50ml塑料离心管中加入8g无水硫酸钠并用力振摇3-5min，然后在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为一次上清液和一次残渣，吸取50ml塑料离心管中的一次上清液后，再向50ml塑料离心管中加入5ml乙腈并用力振摇提取1-3min，在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为二次上清液和二次残渣，吸取50ml塑料离心管中的二次上清液，将一次上清液和二次上清液合并成为总上清液；向总上清液中加入5ml正丙醇，在40℃的条件下减压浓缩至干得到上清液残渣；向上清液残渣中加入10ml体积百分比为50%的乙腈溶液后进行超声波溶解，得溶解液；取HLB小柱，并用5ml甲醇和5ml水对HLB小柱进行活化，将上述溶解液用0.22μm的滤膜过滤至10ml注射器中作为样液，该注射器接HLB小柱，使样液自然速度过HLB小柱，再用3ml水对HLB小柱进行洗柱，然后真空抽干HLB小柱10min；用10ml乙腈对HLB小柱进行洗脱并收集洗脱液，该洗脱液在40℃的条件下减压浓缩至干得到洗脱液残渣，向洗脱液残渣中加入1ml体积百分比为80%的乙腈溶液，待洗脱液残渣完全溶解后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤得到洗脱样液，用洗脱样液进行上机检测，在LC/MS/MS中洗脱样液的进样量为20μl；

所述样品检测工序中，检测仪器的条件为：液相色谱采用的色谱柱为intersil ODS C8-3 150mm×2.1mm×3μm或相当者，进样量为20μl，流动相采用含体积百分比为0.1%甲酸的甲醇为有机相，以含体积百分比为0.1%的甲酸水溶液（含0.5mmoL/L乙酸铵）为水相；质谱条件中的TEM为200.00℃，辅助加热气GS1为60.00，干燥气GS2为50.00，气帘气CUR为10.00，碰撞气CAD为5.00，电喷雾电压IS为4500.00V，ihe为ON；将制备好的样液进样，通过计算式X=C（V/m）分别计算得到蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的残留量，计算式中的X表示样液中被测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)，C表示从工作标准曲线方程上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每千克(μg/kg)，V表示样品进样液定容体积，单位为毫升(mL)，m表示蜂王浆样品的质量，单位为克(g)。

本发明所述氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的重量百分比均大于99%，所述标准储备溶液配制工序中称取的10mg氟胺氰菊酯、10mg三唑醇和10mg蝇毒磷折算成100%纯度后的重量。

本发明所述标准储备溶液配制工序中制得的浓度均为1000mg/L的氟胺氰菊酯标准储备溶液、三唑醇标准储备溶液和蝇毒磷标准储备溶液置于-18℃下保存，且在24个月内使用。

本发明所述混合标准中间液配制工序中制得的浓度为10mg/L的混合标准中间液置于-18℃下保存，且在6个月内使用。

本发明所述水为GB/T 6682中规定的一级水。

本发明所述固相萃取小柱为HLB固相萃取小柱，200mg/6ml。

本发明所述固相萃取小柱为Supelco-C₁₈小柱，500mg/3ml。

本发明所述方法中包括做质控样及质控添加工序，该做质控样及质控添加工序采用LC/MS/MS方法，向2g样品中添加以乙腈为溶剂且浓度为100μg/L的混合标准中间液200μl，则添加浓度为10μg/kg，回收率要求在70%-120%之间，在添加混合标准中间液后充分混合后静置15min，再按样品处理进行。

本发明所述方法中包括做质控样及质控添加工序，该做质控样及质控添加工序采用HPLC方法，向2g样品中添加以乙腈为溶剂，浓度为100μg/L的混合标准中间液200μl，则添加浓度为10μg/kg，回收率要求在80%-120%之间，在添加混合标准中间液后充分混合后静置15min，再按样品处理进行。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：能够同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量，操作简单，检测效率高，检测精度高，有利于降低检测成本，有效监控蜂产品的质量。

本发明在标准曲线制备工序的标准液处理步骤中以及样品处理工序中均使用到了氨水，将氨水添加到蜂王浆中，有利于提高蜂王浆的净化效果，通常情况下，蜂王浆的pH=3.5-4.5，呈酸性，蜂王浆中含有大量的花粉，色素含量较高，脂肪酸含量约为3-8%，蜂王浆能够完全溶解于碱性溶液，故本发明选择碱性条件下用乙腈提取农药残留，使蜂王浆中的酸性物质与碱反应成盐，提高其极性，而不被乙腈所提取，提高净化效果。但是，由于乙腈的沸点高，蒸干慢，所以本发明中加入正丙醇降低沸点，以提高浓缩效率。本发明中使用氨水的效果理想，氨水与其他碱性物质相比，如氨水与氢氧化钠相比，氨水具有不易乳化、易分层、提取方便、且浓缩时更容易干燥等性能，氨水与其他碱性溶解剂相比，发现用氨水的效果比较理想，原因是提取时部分水相溶于乙腈，而氨水更容易挥发。提取后浓缩至干，用50%乙腈溶解时样液呈无色，样品的净化程度大为改善。

本发明的检测精度高，以信噪比S/N=3对应浓度确定方法的检出限分别为：三唑醇1.6μg/kg、蝇毒磷2.1μg/kg、氟胺氰菊酯2.0μg/kg。

附图说明

图1是本发明实施例中样品预处理的工艺流程示意图。

图2是本发明实施例在阴性蜂王浆中添加氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷后的总离子流图。

图3是本发明实施例在阴性蜂王浆中添加三唑醇的提取离子流图。

图4是本发明实施例中在阴性蜂王浆中添加氟胺氰菊酯提取离子流图。

图5是本发明实施例中在阴性蜂王浆中添加蝇毒磷的提取离子流图。

具体实施方式

下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例。

参见图1至图5，本实施例中同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法所用到的试剂包括色谱纯的乙睛、水、分析纯的无水硫酸钠、正丙醇、氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷、分析纯的氨水和色谱纯的甲醇，其中，水为GB/T 6682中规定的一级水。

本实施例中同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法包括标准储备溶液配制工序、混合标准中间液配制工序、标准液配制工序、标准曲线制备工序、样品处理工序和样品检测工序。

本实施例的标准储备溶液配制工序中，称取10mg氟胺氰菊酯、10mg三唑醇和10mg蝇毒磷分别置于一号10mL容量瓶、二号10mL容量瓶和三号10mL容量瓶中，向一号10mL容量瓶、二号10mL容量瓶和三号10mL容量瓶中加入乙腈并均定容至10ml分别制得浓度均为1000mg/L的氟胺氰菊酯标准储备溶液、三唑醇标准储备溶液和蝇毒磷标准储备溶液。本发明中的氟胺氰菊酯标准储备溶液、三唑醇标准储备溶液和蝇毒磷标准储备溶液通常置于-18℃下保存，且需要在24个月内使用。本发明中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的重量百分比通常均大于99%，标准储备溶液配制工序中称取的10mg氟胺氰菊酯、10mg三唑醇和10mg蝇毒磷是折算成100%纯度后的重量。

本实施例的混合标准中间液配制工序中，分别取100μl氟胺氰菊酯标准储备溶液、100μl三唑醇标准储备溶液和100μl蝇毒磷标准储备溶液置于四号10mL容量瓶中，向四号10mL容量瓶中加入乙腈并定容至10ml制得浓度为10mg/L的混合标准中间液，该混合标准中间液可以分装成每袋0.2ml，每袋1次性使用。本发明在混合标准中间液配制工序中制得的浓度为10mg/L的混合标准中间液通常置于-18℃下保存，且需要在6个月内使用。

本实施例的标准液配制工序中，取两份浓度为10mg/L的混合标准中间液100μl，分别用乙腈配至浓度为100μg/L的一号混合液和浓度为1000μg/L的二号混合液；称取五份阴性基质样品，每份阴性基质样品的重量均为2g，将五份阴性基质样品分别置于一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中；再向一号瓶、二号瓶和三号瓶中分别加入浓度为100μg/L的一号混合液100μl、200μl和500μl，向四号瓶和五号瓶中分别加入浓度为1000μg/L的二号混合液100μl和200μl；一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中的液体先各自混合3-5分钟，再各自静置15分钟后待用，如将一号瓶中的液体先混合3-5分钟，然后再静置15分钟后待用。本实施例的一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中分别得到浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液。本发明中所用的阴性基质样品是指不含有氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷三种残留物的蜂王浆样品，阴性基质样品对本领域的技术人员来说为公知常识。

本实施例的标准曲线制备工序中，将浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液均通过标准液处理步骤得到工作标准曲线制备样液，该工作标准曲线制备样液均通过标准液检测步骤得到工作标准曲线方程。

在标准液处理步骤中，称取2g±0.02g标准液置于50ml塑料离心管中，向50ml塑料离心管中加入5ml水混合均匀，再向50ml塑料离心管中加入300μl氨水混合均匀，然后向50ml塑料离心管中加人10mL乙腈并用力振摇3-5min，使标准液完全溶解，再向50ml塑料离心管中加入8g无水硫酸钠并用力振摇3-5min，然后在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为标准一次上清液和标准一次残渣，吸取50ml塑料离心管中的标准一次上清液后，再向50ml塑料离心管中加入5ml乙腈并用力振摇提取1-3min，在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为标准二次上清液和标准二次残渣，吸取50ml塑料离心管中的标准二次上清液，将标准一次上清液和标准二次上清液合并成为标准总上清液；向标准总上清液中加入5ml正丙醇，在40℃的条件下减压浓缩至干得到标准上清液残渣；向标准上清液残渣中加入10ml体积百分比为50%的乙腈溶液后进行超声波溶解，得标准溶解液；取HLB小柱，并用5ml甲醇和5ml水对HLB小柱进行活化，将上述标准溶解液用0.22μm的滤膜过滤至10ml注射器中作为标准样液，该注射器接HLB小柱，使标准样液自然速度过HLB小柱，再用3ml水对HLB小柱进行洗柱，然后真空抽干HLB小柱10min；用10ml乙腈对HLB小柱进行洗脱并收集标准洗脱液，该标准洗脱液在40℃的条件下减压浓缩至干得到标准洗脱液残渣，向标准洗脱液残渣中加入1ml体积百分比为80%的乙腈溶液，待标准洗脱液残渣完全溶解后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤得到标准洗脱样液，用标准洗脱样液进行上机检测，在LC/MS/MS中标准洗脱样液的进样量为20μl。在标准液处理步骤中，分别用浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液作为标准液进行操作，从而得到工作标准曲线制备样液。

在标准液检测步骤中，检测仪器的条件为：液相色谱采用的色谱柱为intersil ODS C8-3 150mm×2.1mm×3μm或相当者，进样量为20μl，流动相采用含体积百分比为0.1%甲酸的甲醇为有机相，以含体积百分比为0.1%的甲酸水溶液（含0.5mmoL/L乙酸铵）为水相；质谱条件中的TEM为200.00℃，辅助加热气GS1为60.00，干燥气GS2为50.00，气帘气CUR为10.00，碰撞气CAD为5.00，电喷雾电压IS为4500.00V，ihe为ON；其中，TEM表示离子源温度，ihe为ON表示Interface Heater，接口加热器为开。将制备好的各标准样液进样，得到工作标准曲线方程y=kx+b，其中，y表示峰面积，x表示浓度，k和b表示回归方程中的系数，该工作标准曲线方程中的r>0.99，r表示回归方程中的相关系数。本实施例中的液相色谱条件具体见表1，质谱条件具体见表2。

本发明中可以包括做质控样及质控添加工序，该做质控样及质控添加工序可以采用LC/MS/MS方法，向2g样品中添加以乙腈为溶剂且浓度为100μg/L的混合标准中间液200μl，则添加浓度为10μg/kg，回收率要求在70%-120%之间，在添加混合标准中间液后充分混合后静置15min，再按样品处理进行，以验证检测结果的准确性。本发明中包括做质控样及质控添加工序也可以采用HPLC方法，向2g样品中添加以乙腈为溶剂，浓度为100μg/L的混合标准中间液200μl，则添加浓度为10μg/kg，回收率要求在80%-120%之间，在添加混合标准中间液后充分混合后静置15min，再按样品处理进行。

本实施例在标准液检测步骤中，将制备好的各标准样液进样得到工作标准曲线方程y=kx+b，其中，y表示峰面积，x表示浓度，k和b表示回归方程中的系数，该工作标准曲线方程中的r>0.99，r表示回归方程中的相关系数。本发明通过一系列浓度的标准液进样，得到标准物质的峰，y表示峰面积，x表示浓度，k、b表示回归方程中的系数，r表示回归方程的相关系数，可以反映此方程线性的好坏。本发明中的固相萃取小柱可以为HLB小柱，规格为 200mg/6ml，也可以为Supelco-C₁₈小柱，规格为500mg/3ml。

本实施例的样品处理工序中，称取2g±0.02g蜂王浆样品置于50ml塑料离心管中，向50ml塑料离心管中加入5ml水混合均匀，再向50ml塑料离心管中加入300μl氨水混合均匀，然后向50ml塑料离心管中加人10mL乙腈并用力振摇3-5min，使蜂王浆样品完全溶解，再向50ml塑料离心管中加入8g无水硫酸钠并用力振摇3-5min，然后在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为一次上清液和一次残渣，吸取50ml塑料离心管中的一次上清液后，再向50ml塑料离心管中加入5ml乙腈并用力振摇提取1-3min，在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为二次上清液和二次残渣，吸取50ml塑料离心管中的二次上清液，将一次上清液和二次上清液合并成为总上清液；向总上清液中加入5ml正丙醇，在40℃的条件下减压浓缩至干得到上清液残渣；向上清液残渣中加入10ml体积百分比为50%的乙腈溶液后进行超声波溶解，得溶解液。取HLB小柱，并用5ml甲醇和5ml水对HLB小柱进行活化，将上述溶解液用0.22μm的滤膜过滤至10ml注射器中作为样液，该注射器接HLB小柱，使样液自然速度过HLB小柱，再用3ml水对HLB小柱进行洗柱，然后真空抽干HLB小柱10min；用10ml乙腈对HLB小柱进行洗脱并收集洗脱液，该洗脱液在40℃的条件下减压浓缩至干得到洗脱液残渣，向洗脱液残渣中加入1ml体积百分比为80%的乙腈溶液，待洗脱液残渣完全溶解后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤得到洗脱样液，用洗脱样液进行上机检测，在LC/MS/MS中洗脱样液的进样量为20μl。

本实施例的样品检测工序中，将制备好的样液按标准曲线制备工序中的条件进样，检测仪器的条件为：液相色谱采用的色谱柱为intersil ODS C8-3 150mm×2.1mm×3μm或相当者，进样量为20μl，流动相采用含体积百分比为0.1%甲酸的甲醇为有机相，以含体积百分比为0.1%的甲酸水溶液（含0.5mmoL/L乙酸铵）为水相；质谱条件中的TEM为200.00℃，辅助加热气GS1为60.00，干燥气GS2为50.00，气帘气CUR为10.00，碰撞气CAD为5.00，电喷雾电压IS为4500.00V，ihe为ON。将制备好的样液进样，通过计算式X=C（V/m）分别计算得到蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的残留量，计算式中的X表示样液中被测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)，通过分别计算得到各自不同的曲线方程，C表示从标准曲线方程上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每千克(μg/kg)，将样品的峰面积代入标准曲线方程后得到，若空白试验中有检测到，则实际该物质的峰面积为样品峰面积减去空白样品的峰面积，V表示样品进样液定容体积，单位为毫升(mL)，m表示蜂王浆样品的质量，单位为克(g)。

通过本实施例中的方法能够得到如图2-图5中所示的离子流图，图2表示的是在阴性蜂王浆中添加氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷后的总离子流图，图3表示的是在阴性蜂王浆中添加三唑醇的提取离子流图，图4表示的是在阴性蜂王浆中添加氟胺氰菊酯提取离子流图，图5表示的是在阴性蜂王浆中添加蝇毒磷的提取离子流图，图2-图5中的横坐标均表示出峰时间，纵坐标均表示峰信号强度。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，其特征在于：所述方法用到的试剂包括色谱纯的乙睛、水、分析纯的无水硫酸钠、正丙醇、氟胺氰菊酯、三唑醇、蝇毒磷、分析纯的氨水和色谱纯的甲醇，该方法包括标准储备溶液配制工序、混合标准中间液配制工序、标准液配制工序、标准曲线制备工序、样品处理工序和样品检测工序；

所述标准储备溶液配制工序中，称取10mg氟胺氰菊酯、10mg三唑醇和10mg蝇毒磷分别置于一号10mL容量瓶、二号10mL容量瓶和三号10mL容量瓶中，向一号10mL容量瓶、二号10mL容量瓶和三号10mL容量瓶中加入乙腈并均定容至10ml分别制得浓度均为1000mg/L的氟胺氰菊酯标准储备溶液、三唑醇标准储备溶液和蝇毒磷标准储备溶液；

所述混合标准中间液配制工序中，分别取100μl氟胺氰菊酯标准储备溶液、100μl三唑醇标准储备溶液和100μl蝇毒磷标准储备溶液置于四号10mL容量瓶中，向四号10mL容量瓶中加入乙腈并定容至10ml制得浓度为10mg/L的混合标准中间液；

所述标准液配制工序中，取两份浓度为10mg/L的混合标准中间液100μl，分别用乙腈配至浓度为100μg/kg的一号混合液和浓度为1000μg/kg的二号混合液；称取五份阴性基质样品，每份阴性基质样品的重量均为2g，将五份阴性基质样品分别置于一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中；再向一号瓶、二号瓶和三号瓶中分别加入浓度为100μg/kg的一号混合液100μl、200μl和500μl，向四号瓶和五号瓶中分别加入浓度为1000μg/kg的二号混合液100μl和200μl；所述一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中的液体先各自混合3-5分钟，再各自静置15分钟后待用，该一号瓶、二号瓶、三号瓶、四号瓶和五号瓶中分别得到浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液；

所述标准曲线制备工序中，将浓度为5μg/kg的一号标准液、浓度为10μg/kg的二号标准液、浓度为25μg/kg的三号标准液、浓度为50μg/kg的四号标准液和浓度为100μg/kg的五号标准液均通过标准液处理步骤得到工作标准曲线制备样液，该工作标准曲线制备样液均通过标准液检测步骤得到工作标准曲线方程；所述标准液处理步骤中，称取2g±0.02g标准液置于50ml塑料离心管中，向50ml塑料离心管中加入5ml水混合均匀，再向50ml塑料离心管中加入300μl氨水混合均匀，然后向50ml塑料离心管中加人10mL乙腈并用力振摇3-5min，使标准液完全溶解，再向50ml塑料离心管中加入8g无水硫酸钠并用力振摇3-5min，然后在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为标准一次上清液和标准一次残渣，吸取50ml塑料离心管中的标准一次上清液后，再向50ml塑料离心管中加入5ml乙腈并用力振摇提取1-3min，在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为标准二次上清液和标准二次残渣，吸取50ml塑料离心管中的标准二次上清液，将标准一次上清液和标准二次上清液合并成为标准总上清液；向标准总上清液中加入5ml正丙醇，在40℃的条件下减压浓缩至干得到标准上清液残渣；向标准上清液残渣中加入10ml体积百分比为50%的乙腈溶液后进行超声波溶解，得标准溶解液；取HLB小柱，并用5ml甲醇和5ml水对HLB小柱进行活化，将上述标准溶解液用0.22μm的滤膜过滤至10ml注射器中作为标准样液，该注射器接HLB小柱，使标准样液自然速度过HLB小柱，再用3ml水对HLB小柱进行洗柱，然后真空抽干HLB小柱10min；用10ml乙腈对HLB小柱进行洗脱并收集标准洗脱液，该标准洗脱液在40℃的条件下减压浓缩至干得到标准洗脱液残渣，向标准洗脱液残渣中加入1ml体积百分比为80%的乙腈溶液，待标准洗脱液残渣完全溶解后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤得到标准洗脱样液，用标准洗脱样液进行上机检测，在LC/MS/MS中标准洗脱样液的进样量为20μl；所述标准液检测步骤中，检测仪器的条件为：液相色谱采用的色谱柱为intersil ODS C8-3 150mm×2.1mm×3μm，进样量为20μl，流动相采用含体积百分比为0.1%甲酸的甲醇为有机相，以含体积百分比为0.1%的甲酸水溶液含0.5mmoL/L乙酸铵为水相；质谱条件中的TEM为200.00℃，辅助加热气GS1为60.00，干燥气GS2为50.00，气帘气CUR为10.00，碰撞气CAD为5.00，电喷雾电压IS为4500.00V，ihe为ON；将制备好的各标准样液进样，得到工作标准曲线方程y=kx+b，其中，y表示峰面积，x表示浓度，k和b表示回归方程中的系数，该工作标准曲线方程中的r>0.99，r表示回归方程中的相关系数；

所述样品处理工序中，称取2g±0.02g蜂王浆样品置于50ml塑料离心管中，向50ml塑料离心管中加入5ml水混合均匀，再向50ml塑料离心管中加入300μl氨水混合均匀，然后向50ml塑料离心管中加人10mL乙腈并用力振摇3-5min，使蜂王浆样品完全溶解，再向50ml塑料离心管中加入8g无水硫酸钠并用力振摇3-5min，然后在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为一次上清液和一次残渣，吸取50ml塑料离心管中的一次上清液后，再向50ml塑料离心管中加入5ml乙腈并用力振摇提取1-3min，在转速为6000rpm的条件下离心5min后，50ml塑料离心管中分为二次上清液和二次残渣，吸取50ml塑料离心管中的二次上清液，将一次上清液和二次上清液合并成为总上清液；向总上清液中加入5ml正丙醇，在40℃的条件下减压浓缩至干得到上清液残渣；向上清液残渣中加入10ml体积百分比为50%的乙腈溶液后进行超声波溶解，得溶解液；取HLB小柱，并用5ml甲醇和5ml水对HLB小柱进行活化，将上述溶解液用0.22μm的滤膜过滤至10ml注射器中作为样液，该注射器接HLB小柱，使样液自然速度过HLB小柱，再用3ml水对HLB小柱进行洗柱，然后真空抽干HLB小柱10min；用10ml乙腈对HLB小柱进行洗脱并收集洗脱液，该洗脱液在40℃的条件下减压浓缩至干得到洗脱液残渣，向洗脱液残渣中加入1ml体积百分比为80%的乙腈溶液，待洗脱液残渣完全溶解后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤得到洗脱样液，用洗脱样液进行上机检测，在LC/MS/MS中洗脱样液的进样量为20μl；

所述样品检测工序中，检测仪器的条件为：液相色谱采用的色谱柱为intersil ODS C8-3 150mm×2.1mm×3μm，进样量为20μl，流动相采用含体积百分比为0.1%甲酸的甲醇为有机相，以含体积百分比为0.1%的甲酸水溶液含0.5mmoL/L乙酸铵为水相；质谱条件中的TEM为200.00℃，辅助加热气GS1为60.00，干燥气GS2为50.00，气帘气CUR为10.00，碰撞气CAD为5.00，电喷雾电压IS为4500.00V，ihe为ON；将制备好的样液进样，通过计算式X=CV/m分别计算得到蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的残留量，计算式中的X表示样液中被测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)，C表示从工作标准曲线方程上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每千克(μg/kg)，V表示样品进样液定容体积，单位为毫升(mL)，m表示蜂王浆样品的质量，单位为克(g)。

2.根据权利要求1所述的同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，其特征在于：所述氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷的重量百分比均大于99%，所述标准储备溶液配制工序中称取的10mg氟胺氰菊酯、10mg三唑醇和10mg蝇毒磷折算成100%纯度后的重量。

3.根据权利要求1所述的同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，其特征在于：所述标准储备溶液配制工序中制得的浓度均为1000mg/L的氟胺氰菊酯标准储备溶液、三唑醇标准储备溶液和蝇毒磷标准储备溶液置于-18℃下保存，且在24个月内使用。

4.根据权利要求1所述的同时检测蜂王浆中氟胺氰菊酯、三唑醇和蝇毒磷残留量的方法，其特征在于：所述混合标准中间液配制工序中制得的浓度为10mg/L的混合标准中间液置于-18℃下保存，且在6个月内使用。

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