CN102283893A - 一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术 - Google Patents
一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102283893A CN102283893A CN 201010213317 CN201010213317A CN102283893A CN 102283893 A CN102283893 A CN 102283893A CN 201010213317 CN201010213317 CN 201010213317 CN 201010213317 A CN201010213317 A CN 201010213317A CN 102283893 A CN102283893 A CN 102283893A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- module
- decoction
- enzyme
- biosimulation
- intestinal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明公开了一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术,其特征在于包括下述模块中的至少2种:模块1、模拟胃部消化作用的胃酶转化模块;模块2、模拟十二指肠消化作用的胰酶转化模块;模块3、模拟小肠的肠内菌转化模块;模块4、模拟肠壁吸收作用的膜滤纯化模块。本发明制备的提取物具有更明显的药效。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离、纯化中药效应成分的方法,特别涉及一种利用酶解、微生物转化、超滤等若干生物模拟技术的集成,用于分离、纯化中药整体效应分子组的方法。
背景技术
中药是在中医理论指导下,以辨证论治为依据,针对证候确定的治则治法,依据那些经过特殊方法炮制加工而成的各种不同药材的性味、归经、功效等,按照君、臣、佐、使原则配伍,主要用于对“证”治疗的药物。因此,中药是特指的,它与天然药物、动植物及矿物药等有着本质上的不同。中药现代化必须植根于中医现代化的土壤才能有生命力。
应当在遵循中医药基本理论和传统用药原则的前提下,合理采用恰当的现代科技手段,较传统分离方法更合理、有效地分离、纯化中药,达到提高药效,创建具有自主知识产权的新型中药复方制剂的目的。
整体调节是几千年来中医辨证论治的精髓,坚持标本兼治原则,追求的是机体的阴阳平衡和协调。中药的“君、臣、佐、使”配伍就是以实现此种整体平衡的调节效应为目标,这里我们将这种中药方剂的整体调节效应简称为中药的整体效应。
本发明认为在目前尚难对中药化学成分及其药性等准确定位的情况下,方剂的整体效应只能依靠尽可能多的保持其中能被吸收的化学物质来实现,尤其不能忽视的是其中大量低丰度的化学物质及微量元素,他们很可能是方剂整体效应中具有四两拨千斤的重要效应成分或减毒增效成分。
胃肠道的消化、吸收作用对中药方剂疗效有着重要影响,对于这一关键环节必须充分重视。本发明认为除部分胃肠道药物外,中药方剂中真正的药物分子或前体即效应分子应是存在于通过消化道吸收后进入血液循环前(即进入门静脉)的那些物质之中,它们才是中药方剂整体效应的物质基础或方剂的效应物质。在此将某一中药或中药方剂中能被吸收的全部效应分子称之为该中药或中药方剂的整体效应分子组。
基于以上思考,本研究从中药传统用药习惯和整体效应理论出发,通过体外模拟中药汤剂经酶及菌群作用并吸收入血的整个过程,将酶解、微生物转化及超滤等若干生物工程技术模块进行集成,建立一套以纯化中药、提高药效、改变传统给药方式为主要目的的标准化分离纯化中药整体效应分子组的技术模块集成,为建立中药制剂原料生产、制备药效研究样品的通用技术平台提供基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更加有效、合理的分离、纯化中药的方法,该方法较传统分离方法有更的药效。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
本发明提供一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术(一种提取中药有效成分的方法),包括下述至少2种模块:
1、模拟胃部消化作用的胃酶转化模块;
2、模拟十二指肠消化作用的胰酶转化模块;
3、模拟小肠的肠内菌转化模块;
4、模拟肠壁吸收作用的膜滤纯化模块;
所述模块1的方法为:将中药提取物或提取液加入水,调节水溶液pH值为1.7±0.5后加入适量胃酶,在35-50℃常压状态搅拌反应0.5-4小时;
所述模块2的方法为:模块1完成后,调节药液pH值为7.5±0.5后加入适量胰酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时;
所述模块3的方法为:模块2完成后,调节药液pH值为7.5±0.5后加入适量肠内菌酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-36小时;
所述模块4的方法为:模块3完成后,过滤,滤液摄氏4度存放过夜,吸取上层清液进一步采用超滤分离纯化,收集超滤液,即得中药整体效应分子组;
上述4个模块可以根据中药的组成及胃肠道对其的作用特点进行灵活组合。
上述模块1中的胃酶可以由其他酶代替,如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶、组织蛋白酶等。
上述模块2中的胰酶可以由其他酶代替,如糜蛋白酶、羧肽酶、肠激酶、麦芽糖酶、乳糖酶、淀粉酶、脂酶等。
上述模块3中肠内菌酶可由人肠道中混合菌群或其他具有转化中药成份功能的细菌中的一种或几种细菌的混合物替换,包括但不限于普通拟杆菌、青春双歧杆菌、单形拟杆菌、颊拟杆菌、消化拟杆菌、两歧双歧杆菌、双歧杆菌、消化球菌。
上述模块3中分离(制备)肠内菌酶所用的肠内菌为人肠道中混合菌群或其他具有转化中药成份功能的细菌中的一种或几种细菌的混合物,包括但不限于普通拟杆菌、青春双歧杆菌、单形拟杆菌、颊拟杆菌、消化拟杆菌、两歧双歧杆菌、双歧杆菌、消化球菌等。
上述模块3中分离肠内菌酶所用的肠内菌培养基根据细菌生长需要选择合适的培养基,包括但不限于胰蛋白胨2-15g、消化血清粉5-20g、酵母浸膏1-10g、牛肉膏1一5g、牛肝浸出粉0.1-2g、葡萄糖1-5g、磷酸二氢钾1-5g、氯化钠1-5g、可溶性淀粉1-10g、L-2半胱氨酸盐酸盐0.1-1g或硫代乙醇酸钠0.1-1g,加蒸馏水至1L,调PH至7.2±0.5配方中的一种或几种。
上述模块3中肠内菌酶的分离方法为:菌液在3000-15000rpm、0-25℃条件下离心5-20min,倾去上清液,即得肠内菌酶。
上述模块4中过滤优选常规过滤,包括但不限于离心除杂或常压过滤中的板框过滤器或纱布过滤;离心除杂优选500-7000r/min。
上述模块4中超滤技术包括超滤或反渗透,利用其不同孔径或截流分子量的各种材料和装置对药液进行纯化;超滤膜孔径优选5,000-500,000分子量。
上述模块4中中药整体效应分子组为超滤液,也可将其经常规浓缩、干燥处理后的浓缩液或浸膏,也可以将浓缩液或浸膏加入常规辅料,按照常规工艺进一步制成临床可接受的制剂,包括但不限于口服液、片剂、胶囊、注射剂等。
上述模块1中优选:加入5-50倍浸膏重量的水,调节水溶液pH值为1.7±0.5(或所用酶的最适pH)后加入0.005-0.02倍浸膏重量份的胃酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时;
上述模块2中优选:调节药液pH值优选为7.5±0.5(或所用酶的最适pH)后加入0.005-0.02倍浸膏重量的胰酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时;
上述模块3中优选:加水至25-250倍浸膏重量,调节药液pH值为7.5±0.5后加入0.02-0.10倍浸膏重量份的肠内菌酶,在35-50℃搅拌0.5-36小时;
上述模块4中优选:用5,000-500,000分子量孔径的超滤膜柱纯化转化产物。
本发明具体提供一种桂枝汤生物提取方法,该方法包括如下步骤:
步骤1:桂枝汤用常规方法提取,得浸膏。
步骤2:取1g浸膏,加入10mL水,调pH值至1.7,加入胃酶10mg,36-45℃水浴,振摇反应1-2h;
步骤3:反应完成后,调pH值至7.5,加入胰酶10mg,36-45℃水浴,时时振摇反应1-2h;
步骤4:反应完成后,加水至50mL,调pH值至7.5,加入蛋白质含量为65mg的肠内菌酶,42℃水浴,振摇反应12-24h;
步骤5:反应完成后,3000rpm离心或者滤纸过滤,将滤液用分子量为100,000的中空纤维超滤柱超滤,超滤产物即所得桂枝汤汤剂整体效应分子组。
本发明从传统中药汤剂口服方式出发,按照中医药整体效应理论,模拟胃肠道消化吸收过程,综合利用酶解、微生物转化、超滤等若干生物工程技术模块进行集成,建立了一套系统的分离、纯化中药整体效应分子组的技术集成平台。
本发明充分体现了中医辨证施治及中药复方配伍的科学内涵,可基本上改变现有绝大部分传统中药制剂技术的落后状态,也为实现大规模筛选中药方剂配伍的药效物质提供标准化制备技术。原则上适合全部口服中药制剂的分离纯化,可预先去除传统的中药汤剂及丸、散、膏、丹中那些不能被吸收的大部分物质,有利于提高药物制剂的吸收和利用,产物可直接用于药物研究的体外实验及药物分析等,克服了血清药物采血时间和血清的非药物性以及药物分子代谢产物的干扰和动物个体差异造成的巨大误差。
本发明在分离过程中加入消化酶、肠道微生物或其酶类,使得药物在体外分离、纯化的过程就发生了与体内相似的变化过程,尽可能地保留了原方的效应物质,提高了药效。药效学实验证明:较传统分离、纯化中药的方法,本发明分离、纯化方法获得的产品药效显著增强。
本发明利用超滤技术,除去大量的杂质,降低了药物的服用量,方便制剂,一般中药分离物重量为药材的10--20%,服用量较大,而经超滤纯化后,在药效提高的同时,固形物含量为药材水提液的5--10%,便于制剂。
下述实验例与实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明。
实验例1 桂枝汤生物模拟转化方法与传统分离、纯化方法的比较
1、药效学比较实验:
采用IL-1刺激rCMEC的细胞发热模型,比较桂枝汤汤剂生物转化模拟产物、桂枝汤汤剂生物转化模拟产物血清药、桂枝汤汤剂血清药对IL-1β介导rCMEC表达cPLA2、PGES、15-PGDH、sPLA2的影响。
1.1 实验方法:
1.1.1 动物与细胞:
雄性SD大鼠30只,体重250±10g,大鼠脑微血管内皮细胞株(rCMEC)
1.1.2 药物:
桂枝汤汤剂生物模拟产物(实施例1方法制备):减压浓缩至1.0g生药/mL。桂枝汤汤剂生物转化模拟产物血清药、桂枝汤汤剂血清药的制备:大鼠随机分为3组,每组各10只,桂枝汤汤剂生物转化模拟产物、桂枝汤汤剂按桂枝汤临床等效剂量的10倍(47g生药/kg BW)进行灌胃,按常规方法制备桂枝汤汤剂生物转化模拟产物血清药及桂枝汤汤剂血清药。
1.1.3 实验分组:
空白对照组、桂枝汤汤剂生物模拟产物组(10%、20%、50%)、桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药组(5%、10%、20%)、桂枝汤汤剂血清药组(5%、10%、20%)
1.1.4: 细胞处理:
以胰酶将rCMEC消化成2x106浓度,接种于24孔培养板内,每孔0.5ml。培养箱中继续培养24h,待细胞长至融合状态后,换液以无血清DMEM液继续培养24h。分别给予不同组药物孵育24h,再以30ng/ml IL-1β刺激rCMEC 10h。吸取细胞外液用于检测。
1.1.5 检测指标及方法:
以双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中15-PGDH、PGES、cPLA2水平。1.1.6分析方法:
组间两两比较采用方差分析。
1.2 实验结果:
1.2.1 桂枝汤汤剂生物模拟产物对IL-1β介导rCMEC表达cPLA2、PGES、15-PGDH、sPLA2的影响
表1 不同浓度桂枝汤汤剂生物模拟产物对IL-1β介导rCMEC表达cPLA2、PGES、15-PGDH、sPLA2的影响
与IL-1β组(模型组)比较,*P<0.05,**P<0.01
实验结果表明桂枝汤汤剂生物模拟产物可显著降低IL-1β介导的rCMEC15-PGDH、PGES、cPLA2的表达,与模型组比较均有显著性差异,P<0.01。
1.2.2 桂枝汤原药血清药与桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药组对IL-1β介导rCMEC表达cPLA2、PGES、15-PGDH、sPLA2的影响
表2 不同浓度桂枝汤汤剂生物模拟产物对IL-1β介导rCMEC表达cPLA2、PGES、15-PGDH、sPLA2的影响
与IL-1β组(模型组)比较,*P<0.05,**P<0.01;与桂枝汤原药血清药组相应浓度比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;
实验结果表明桂枝汤汤剂血清药低剂量下可显著降低IL-1β介导的PGES的表达,P<0.01;低、中、高剂量下可显著降低IL-1β介导的15-PGDH的表达,P<0.01。
桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药高剂量下可显著降低IL-1β介导的cPLA2的表达,P<0.01;低、中剂量下可显著降低IL-1β介导的PGES的表达,P<0.01;低、中、高剂量下可显著降低IL-1β介导的15-PGDH的表达,P<0.01;中、高剂量下可显著降低IL-1β介导的sPLA2的表达,P<0.01。
桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药高剂量下较桂枝汤汤剂血清药高剂量显著降低IL-1β介导的cPLA2的表达,P<0.01;桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药低剂量下较桂枝汤汤剂血清药低剂量显著降低IL-1β介导的PGES的表达,P<0.01;桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药低剂量下较桂枝汤汤剂血清药低剂量显著降低IL-1β介导的15-PGDH的表达,P<0.05;桂枝汤汤剂生物模拟产物血清药低、中、高剂量下较桂枝汤汤剂血清药低、中、高剂量显著降低IL-1β介导的sPLA2的表达,P<0.05。
研究结果表明:桂枝汤汤剂经本发明建立的生物模拟集成技术获得的产物,可以直接用于体外药效学试验,在等效剂量下比其汤剂具有更明显的药效作用。
2、吸收利用率比较:
桂枝汤汤剂中固形物含量为0.035g/mL,利用本发明方法制得的相同生药浓度的产物中固形物含量为0.009g/mL,相比前者减少约75%左右。说明中药汤剂经本发明分离、纯化后杂质含量显著降低,可大幅度提高药物吸收利用率,便于缩小后续制剂重量。
3、肠道吸收率比较实验
利用大鼠肠外翻模型比较桂枝汤汤剂中部分成分转化后的透过率。
3.1 实验方法
3.1.1 药物
桂枝汤汤剂:按原方比例配齐药物,水煎2次合并药液,过滤浓缩,给药时以蒸馏水稀释至0.25g生药/mL。桂枝汤汤剂生物模拟产物(实施例1方法制备)减压浓缩至0.25g生药/mL。
3.1.2 肠外翻模型实验
取SD大鼠10只分为2组,实验前12h禁食,自由饮水。2%戊巴比妥腹腔麻醉,腹主动脉取血后,小心将大鼠肠管同肠系膜剥离,分别切取小肠上端10cm。用37℃台氏液冲洗至无内容物,将肠腔面向外翻出,用台氏液冲洗后将一端结扎,使之形成囊状肠管。向肠囊内注入2mL空白台氏液,将其放入已有台氏液的麦氏浴槽中,保持37℃恒温,并向浴槽中通入95%O2/5%CO2,向麦氏浴槽中注入配制好的37℃恒温的桂枝汤汤剂药液或其转化产物(0.25g生药/mL)10mL,3h后从肠囊内取样200μL,进入HPLC测定各成分的透过率。
3.2 实验结果:
以各肠段透析液中峰面积除以实验药液中各成分峰面积,得各成分在肠段中的透过率,比较桂枝汤汤剂中成分转化前后透过率的变化,结果见表4。
**与该成分原形化合物相比,P<0.01
实验结果表明:桂枝汤汤剂经本发明分离、纯化后各成分在肠道中的吸收率均显著提高。
实验例2 工艺筛选实验
本发明对桂枝汤汤剂利用此方法进行分离、纯化,但本发明要求保护的方法并不局限于此,还包括利用此方法分离、纯化其他药材、中药复方。
1、 桂枝汤汤剂的制备及分析方法的建立
1.1 桂枝汤汤剂的制备
取40g桂枝、40g芍药、26g炙甘草、生姜40g、50g大枣药材,加8倍量水浸泡1小时,煎煮30分钟,滤去药液,加6倍量水,再煎煮30min,过滤,合并两次滤液,减压干燥,每g干膏合药材10g。
1.2 桂枝汤汤剂指纹图谱分析方法的建立
1.2.1 实验仪器及试剂
Agilent 1200高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器);MILLIPORE Simplicity超纯水器。乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
1.2.2 色谱条件:
色谱柱:Kromasil C18色谱柱(5μm,4.6×250mm);流速1.0mL·min-1;检测波长:250nm;流动相条件见表5。
表5 桂枝汤汤剂指纹图谱流动相条件
stop time:64.00min;post time:8.00mm
1.3 桂枝汤汤剂中4个有效成分含量测定方法的建立
1.3.1 色谱条件
色谱柱为Diamond C18(4.6mm×250mm,5μm),柱温25℃;流动相0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱程序依次为A-B[85∶15(0~34min),62∶38(35~54min)];流速1.0mL.min-1;检测波长:230nm(检测芍药苷)、250nm(检测甘草酸)和280nm(检测肉桂酸和甘草苷);进样量10μμL。
1.3.2 对照品溶液配制
称取对照品芍药苷35.0mg、甘草苷10.0mg、肉桂酸15.0mg和甘草酸7.5mg,精密称定,置于同一50mL量瓶中,用甲醇定容,配成混合对照品储备液。将储备液用乙腈-0.1%磷酸(50∶50)溶液稀释成含芍药苷0.14mg·mL-1、甘草苷0.04mg·mL-1、肉桂酸0.06mg·mL-1和甘草酸0.03mg·mL-1的混合对照品溶液。
1.3.3 供试品溶液配制
取桂枝汤汤剂浸膏1.0g,甲醇超声溶解,定容至10mL量瓶中,摇匀后过0.45μm微孔滤膜,即得。
1.3.4 样品测定
分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪测定,采用外标两点法计算桂枝汤汤剂中的芍药苷、甘草苷、肉桂酸和甘草酸的含量。
2、分析桂枝汤汤剂在大鼠体内消化、吸收过程:
2.1 桂枝汤汤剂在大鼠体内的消化特征
取实验前禁食12h(自由饮水)的SD大鼠处死后立即打开腹腔,将胃肠道各部分(胃,十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)于一端结扎,迅速剪下胃、小肠上端、小肠下端并收集其肠液,加入K-R液至20mL,分别加入2mL桂枝汤汤剂,37℃厌氧培养24h后取出,加入3倍体积的甲醇溶液停止反应,取各样品10ml减压回收至干,甲醇溶解,定容于10ml量瓶,吸取10μL,进液相分析。
分别吸取以上溶液10μL注入液相色谱仪,观察色谱峰。将色谱文件导入药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版,计算各时间点胃肠道内容物与桂枝汤汤剂指纹图谱的相似度,以此评价胃肠道各部位对桂枝汤汤剂的消化、吸收特点。相似度计算结果见表6。
表6 桂枝汤汤剂在肠道不同部位肠液培养前后指纹图谱相似度的变化
由相似度比较结果可见,胃、小肠上端肠液对桂枝汤汤剂消化作用不大,而小肠下端肠液对桂枝汤汤剂有较强的消化作用。
通过对比桂枝汤汤剂在小肠下端肠液中培养前后指纹图谱,可以看出桂枝汤汤剂中芍药苷、甘草苷、肉桂酸、甘草酸培养24h后均消失,而新产生芍药苷代谢物、甘草素、甘草次酸等相应代谢产物。
2.2 桂枝汤汤剂在大鼠体内的吸收特征
取250g SD大鼠禁食不禁水12h,灌胃桂枝汤汤剂(1.0g生药·mL-1)5mL后1.5h,2%戊巴比妥腹腔麻醉,门静脉取血。全血3000rpm离心15min,吸取上层血浆。取血浆0.5mL加入甲醇1.0mL,旋涡混匀,15000rpm离心15min,取上清液,空气吹干,加入0.2mL甲醇,旋涡溶解,15000rpm离心15min,吸取上清液10μL,进液相分析。
通过分析门静脉血指纹图谱发现,大鼠口服桂枝汤汤剂后门静脉血中含有肉桂酸、芍药苷代谢物、甘草次酸、葡萄糖醛酸甘草素、葡萄糖醛酸异甘草素等非原形成份。
研究结果表明:桂枝汤汤剂经大鼠口服吸收入血的许多成分是经胃肠道酶转化后的产物。
3、桂枝汤汤剂体外模拟部分:
3.1 胃酶对桂枝汤汤剂的影响:
取1g桂枝汤浸膏,加入10mL水,配制成浓度为1.0g生药/mL的药液,调节pH至1.7,加入10mg胃酶,45℃水浴,于0、0.25、0.5、1、2、4、8小时后取出,计算各时间点转化后药液与桂枝汤汤剂指纹图谱的相似度,相似度结果见表7。
表7 胃酶对桂枝汤汤剂的影响
实验结果表明:胃酶对桂枝汤汤剂转化作用不大,与胃部肠液对桂枝汤汤剂的影响相一致。
3.2 胰酶对桂枝汤汤剂的影响:
取胃酶转化2小时后药液,调节pH至7.5,加入10mg胰酶,45℃空气浴,于0、0.25、0.5、1、2、4、8小时后取出,计算各时间点转化后药液与桂枝汤汤剂指纹图谱的相似度,相似度结果见表8。
表8 胰酶对桂枝汤汤剂的影响
实验结果表明:胰酶对桂枝汤汤剂转化作用不大,与小肠上端肠液对桂枝汤汤剂的影响相一致。
虽然利用指纹图谱未观察到胃酶、胰酶对桂枝汤汤剂有明显作用,但桂枝汤汤剂中含有大量物质HPLC指纹图谱无法分析。为了保证体外转化条件和体内消化过程一致,参考人工胃液、人工肠液的组成,确定桂枝汤汤剂胃内、肠内模拟条件为:取桂枝汤汤剂浸膏1.0g加入10mL水,调pH至1.7,加入胃酶10mg,45℃水浴,时时振摇反应2h。反应完成后,调pH值至7.5,加入胰酶10mg,45℃水浴,时时振摇反应2h。
3.3 肠内菌酶对桂枝汤汤剂的影响
桂枝汤汤剂利用胃酶、胰酶按照3.2、3.3条件转化2小时后,减压浓缩至1.0g生药/mL。
利用单因素实验优化肠内菌酶转化桂枝汤汤剂各影响因素:菌酶浓度、底物浓度、pH、温度和转化时间。以各主要成分的转化率和各转化产物的生成量为指标,选择各因素参数,以转化率和生成量高者为优。
3.3.1 菌酶浓度的考察
精密吸取桂枝汤汤剂2.0mL 4份,分别加入蛋白质浓度为325、650、1300、1950μg·mL-1pH=7.0的10mL肠内菌酶溶液中,37℃空气浴摇床中培养12小时后取出,检测。实验结果见表9、表10。
表9 不同浓度菌酶对桂枝汤汤剂各成分转化率(%)的影响
表10 不同浓度菌酶对桂枝汤汤剂各成分转化产物生成量的影响
由实验结果可以看出酶浓度大于1300μg·mL-1时各化合物转化率和代谢物生成量增加不明显,故选择酶浓度1300μg·mL-1为合适的酶浓度。
3.3.2 底物浓度的考察
取菌酶溶液(蛋白质浓度650ug·mL-1)10mL4份,7000rpm离心15min,弃去上清液,分别加入2、5、10、15mL pH=7.0磷酸缓冲液,各样品中加入2mL桂枝汤汤剂,37℃空气浴摇床中培养12小时后取出,检测。实验结果见表11、表12。
表11 不同底物浓度对桂枝汤汤剂各成分转化率(%)的影响
表12 不同底物浓度对桂枝汤汤剂各成分转化产物生成量的影响
由实验结果可以看出2mL药液稀释至12mL时各化合物转化率和代谢物生成量较其他组高,故选择2mL药液稀释至12mL为合适的底物浓度。
3.3.3 pH的考察
取菌酶溶液(蛋白质浓度650ug·mL-1)10mL4份,7000rpm离心15min,弃去上清液,分别加入pH=6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸缓冲液各10mL,各样品中加入2mL桂枝汤汤剂,37℃空气浴摇床中培养12小时后取出,检测。实验结果见表13、表14。
表13 不同pH对桂枝汤汤剂各成分转化率(%)的影响
表14 不同pH对桂枝汤汤剂各成分转化产物生成量的影响
由实验结果可以看出pH=7.5时各化合物转化率和代谢物较其他组高。
3.3.4 温度的考察
精密吸取桂枝汤汤剂2.0mL 4份,加入10mL菌酶溶液(蛋白质浓度650ug·mL-1)(pH=7.0)中,分别于32、37、42、47℃空气浴摇床中培养12小时后取出,检测。实验结果见表13、表14。
表13 不同温度对桂枝汤汤剂各成分转化率(%)的影响
表14 不同温度对桂枝汤汤剂各成分转化产物生成量的影响
由实验结果可以看出为42℃时各化合物转化率和代谢物生成量较其他组高。3.3.5转化时间的考察
精密吸取桂枝汤汤剂2.0mL,加入10mL菌酶溶液(蛋白质浓度650ug·mL-1)(pH=7.0)中,37℃空气浴摇床中培养,于6、12、24、36小时后取样1mL,检测。实验结果见表15、表16。
表15 不同时间对桂枝汤汤剂各成分转化率(%)的影响
表16 不同时间对桂枝汤汤剂各成分转化产物生成量的影响
确定肠内菌酶转化桂枝汤汤剂的条件为:1.0g桂枝汤汤剂浸膏,经胃酶、胰酶反应完成后,加水至50mL,调pH值至7.5,加入蛋白质含量为65mg的肠内菌酶,42℃水浴,时时振摇反应24h。
3.4 超滤膜孔径的选择
3.4.1 利用大鼠肠外翻模型研究桂枝汤汤剂转化物在胃肠道的吸收特征
取SD大鼠3只,实验前12h禁食,自由饮水。2%戊巴比妥腹腔麻醉,腹主动脉取血后,小心将大鼠肠管同肠系膜剥离,分别切取小肠上端10cm。用37℃台氏液冲洗至无内容物,将肠腔面向外翻出,用台氏液冲洗后将一端结扎,使之形成囊状肠管。向肠囊内注入2mL空白台氏液,将其放入已有台氏液的麦氏浴槽中,保持37℃恒温,并向浴槽中通入95%O2/5%CO2,向麦氏浴槽中注入配制好的37℃恒温的桂枝汤汤剂药液转化产物(0.25g生药/mL)10mL,3h后从肠囊内取样200μL,进入液相分析透析液中成分。
3.4.2 不同膜孔径超滤液指纹图谱与肠外翻透析液指纹图谱相似度的比较
分别利用膜孔径为0.45μm、0.2μm、50万、10万、3万、1万、3千的超滤柱纯化桂枝汤转化液,得样品1、2、3、4、5、6、7,比较各膜孔径超滤样品指纹图谱与肠外翻透析液指纹图谱相似度,以相似度高者为优。相似度结果见表17。
表17 各超滤样品与肠外翻透析液指纹图谱相似度
各样品与空肠透析液指纹图谱的相似度大小依次为:样品4>样品5>样品2、样品3>样品1>样品6>样品7。
3.4.3 各超滤液中各主要成分透过率的比较
以各膜孔径超滤样品中各主要成份的峰面积除以转化液中该成分的峰面积,计算该成份的透过率(%),以透过率高者为优。各超滤液中各主要成分的透过率结果见表18。
表18 各膜孔径超滤液中各主要成份的透过率(%)
实验结果表明随着超滤膜孔径的下降,超滤液中各主要成份的透过率也随之下降,样品5~样品7中各成分的透过率不到50%。
综合以上研究结果,确定选择膜孔径为10万的超滤膜纯化桂枝汤汤剂体外模拟转化产物。最终确定桂枝汤汤剂的分离、纯化条件为实施例1的方法。
具体实施方式
实施例1
步骤1:取40g桂枝、40g芍药、26g炙甘草、生姜40g、50g大枣药材,加8倍量水浸泡1小时,煎煮30分钟,滤去药液,加6倍量水,再煎煮30min,过滤,合并两次滤液,减压干燥,得浸膏。
步骤2:取1g浸膏,加入10mL水,调pH至1.7,加入胃酶10mg,45℃水浴,振摇反应2h;
步骤3:反应完成后,调pH值至7.5,加入胰酶10mg,45℃水浴,时时振摇反应2h;
步骤4:反应完成后,加水至50mL,调pH值至7.5,加入蛋白质含量为65mg的肠内菌酶,42℃水浴,振摇反应24h;
步骤5:反应完成后,3000rpm离心或者滤纸过滤,将滤液用分子量为100,000的中空纤维超滤柱超滤,超滤产物即所得桂枝汤汤剂整体效应分子组。
实施例2
步骤1:取丹参药材,加8倍量水浸泡1小时,煎煮30分钟,滤去药液,加6倍量水,再煎煮30min,过滤,合并两次滤液,浓缩至每ml折合为1.0g生药。
步骤2:取10mL药液,调pH至1.7,加入胃酶10mg,45℃水浴,时时振摇反应2h;
步骤3:反应完成后,调pH值至7.5,加入胰酶10mg,45℃水浴,时时振摇反应2h;
步骤4:反应完成后,加水至50mL,调pH值至7.5,加入蛋白质含量为65mg的肠内菌酶,42℃水浴,振摇反应24h;
步骤5:反应完成后,3000rpm离心或者滤纸过滤,将滤液用分子量为100,000的中空纤维超滤柱超滤,超滤产物即所得产品。
Claims (10)
1.一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术,其特征在于包括下述模块中的至少2种:
模块1、模拟胃部消化作用的胃酶转化模块;
模块2、模拟十二指肠消化作用的胰酶转化模块;
模块3、模拟小肠的肠内菌转化模块;
模块4、模拟肠壁吸收作用的膜滤纯化模块;
所述模块1的方法为:调节药液pH值为1.7±0.5后加入适量胃酶,在35-50℃常压状态搅拌反应0.5-4小时;
所述模块2的方法为:调节药液pH值为7.5±0.5后加入适量胰酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时。
所述模块3的方法为:调节药液pH值为7.5±0.5后加入适量肠内菌酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-36小时。
所述模块4的方法为:转化药液过滤,滤液摄氏4℃存放,吸取上层清液采用超滤分离纯化,收集超滤液。
2.如权利要求1所述的生物模拟集成技术,其特征在于包括下述模块:
模块1:将中药提取物或提取液用水配制成合适浓度,调节溶液pH值为1.7±0.5后加入适量胃酶,在35-50℃常压状态搅拌反应0.5-4小时;
模块2为:模块1完成后,调节药液pH值为7.5±0.5后加入适量胰酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时;
模块3为:模块2完成后,调节药液pH值为7.5±0.5后加入适量肠内菌酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-36小时;
模块4为:模块3完成后,过滤,滤液摄氏4度存放过夜,吸取上层清液进一步采用超滤分离,收集超滤液,即得中药整体效应分子组。
3.如权利要求2所述的生物模拟集成技术,其特征在于模块1的方法为:加入5-50倍浸膏重量的水,调节水溶液pH值为所用酶的最适pH后加入0.005-0.02倍浸膏重量份的胃酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时。
4.如权利要求2所述的生物模拟集成技术,其特征在于模块2的方法为:调节药液pH值为所用酶的最适pH后加入0.005-0.02倍浸膏重量的胰酶,在35-50℃常压状态搅拌0.5-4小时;
5.如权利要求2所述的生物模拟集成技术,其特征在于模块3的方法为:加水至25-250倍浸膏重量,调节药液pH值为7.5±0.5后加入0.02-0.10倍浸膏重量份的肠内菌酶,在35-50℃搅拌0.5-36小时;
6.如权利要求2所述的生物模拟集成技术,其特征在于模块4的方法为:用5,000-500,000分子量孔径的超滤膜柱纯化转化产物。
7.如权利要求2所述的生物模拟集成技术,其特征在于所述中药为复方中药或单味中药。
8.如权利要求7所述的生物模拟集成技术,其特征在于所述中药为桂枝汤或丹参。
9.如权利要求1或2所述的生物模拟集成技术,其特征在于:
胃酶可由胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶、组织蛋白酶任意一种或几种酶的混合物替换;
胰酶可由糜蛋白酶、羧肽酶、肠激酶、麦芽糖酶、乳糖酶、淀粉酶、脂酶任意一种或几种酶的混合物替换;
肠内菌酶由人肠道中混合菌群或其他具有转化中药成份功能的细菌中的一种或几种细菌的混合物替换,包括但不限于普通拟杆菌、青春双歧杆菌、单形拟杆菌、颊拟杆菌、消化拟杆菌、两歧双歧杆菌、双歧杆菌、消化球菌;
10.如权利要求1或2所述的生物模拟集成技术,其特征在于:
胃酶可由胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶、组织蛋白酶任意一种或几种酶的混合物替换;
胰酶可由糜蛋白酶、羧肽酶、肠激酶、麦芽糖酶、乳糖酶、淀粉酶、脂酶任意一种或几种酶的混合物替换;
分离肠内菌酶所用的肠内菌为人肠道中混合菌群或其他具有转化中药成份功能的细菌中的一种或几种细菌的混合物,包括但不限于普通拟杆菌、青春双歧杆菌、单形拟杆菌、颊拟杆菌、消化拟杆菌、两歧双歧杆菌、双歧杆菌、消化球菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010213317 CN102283893B (zh) | 2010-06-18 | 2010-06-18 | 一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010213317 CN102283893B (zh) | 2010-06-18 | 2010-06-18 | 一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102283893A true CN102283893A (zh) | 2011-12-21 |
CN102283893B CN102283893B (zh) | 2013-10-02 |
Family
ID=45330830
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201010213317 Active CN102283893B (zh) | 2010-06-18 | 2010-06-18 | 一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102283893B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106132427A (zh) * | 2014-03-21 | 2016-11-16 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 含有后发酵茶提取物的组合物 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1404860A (zh) * | 2002-11-02 | 2003-03-26 | 夏跃胜 | 中药多酶乳化方法 |
CN1546682A (zh) * | 2003-12-16 | 2004-11-17 | 天津大学 | 酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺 |
CN1568761A (zh) * | 2004-05-11 | 2005-01-26 | 浙江蜂之语蜂业集团有限公司 | 酶解蜂皇浆冰干粉及生产方法 |
CN1961751A (zh) * | 2006-11-29 | 2007-05-16 | 山东师范大学 | 鹿肉酶解口服液的制作方法 |
CN101647821A (zh) * | 2008-08-13 | 2010-02-17 | 北京凯瑞创新医药科技有限公司 | 一种动物药仿生酶解产物及其用途 |
-
2010
- 2010-06-18 CN CN 201010213317 patent/CN102283893B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1404860A (zh) * | 2002-11-02 | 2003-03-26 | 夏跃胜 | 中药多酶乳化方法 |
CN1546682A (zh) * | 2003-12-16 | 2004-11-17 | 天津大学 | 酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺 |
CN1568761A (zh) * | 2004-05-11 | 2005-01-26 | 浙江蜂之语蜂业集团有限公司 | 酶解蜂皇浆冰干粉及生产方法 |
CN1961751A (zh) * | 2006-11-29 | 2007-05-16 | 山东师范大学 | 鹿肉酶解口服液的制作方法 |
CN101647821A (zh) * | 2008-08-13 | 2010-02-17 | 北京凯瑞创新医药科技有限公司 | 一种动物药仿生酶解产物及其用途 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
《世界科学技术》 20060630 宋剑南 辨证论治的整体调节与中药整体效应分子组 54-56、61 1-10 第8卷, 第3期 * |
《中草药》 20090612 宋宏新等 半仿生酶法提取三七皂苷工艺研究 905-907 1-10 第40卷, 第6期 * |
《饲料博览》 20060110 杨再等 天然植物有效成分的提取新技术-生物酶解技术 40-42 1-10 , * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106132427A (zh) * | 2014-03-21 | 2016-11-16 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 含有后发酵茶提取物的组合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102283893B (zh) | 2013-10-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103037879B (zh) | 微量人参皂苷成分得到增加的新型加工人参或加工人参提取物的制备方法 | |
CN102600219B (zh) | 黄蜀葵花总黄酮提取物及其制备方法 | |
CN102319275B (zh) | 黄蜀葵花提取物、制剂及其制备方法 | |
CN101524389B (zh) | 芫根多糖用于制备抗缺氧的药物的用途 | |
CN101560268B (zh) | 一种Cs-4发酵菌丝体多糖及其制备方法与用途 | |
CN1723981A (zh) | 罗汉果提取物用于制备药物辅料的新用途 | |
CN101396445A (zh) | 黄连总碱在制备糖尿病并发症治疗药物中的应用 | |
CN108186731A (zh) | 一种提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 | |
CN106039050A (zh) | 一种益生菌发酵玉米须的组合物及其制备方法和应用 | |
CN101401829A (zh) | 一种野金柴活性提取物及其制备方法和应用 | |
CN101747307A (zh) | 去甘草酸甘草黄酮及其药物组合物 | |
CN101829224A (zh) | 一种中药组合物制剂及制备方法和质量控制方法 | |
CN101744844B (zh) | 具有降血糖作用的黄腐酸或黄腐酸钠物质 | |
CN102283893B (zh) | 一种分离、纯化中药整体效应分子组的生物模拟集成技术 | |
TWI441640B (zh) | 促進營養素被吸收的醫藥組合物及茯苓萃取物 | |
CN102100761A (zh) | 一种防治脂代谢紊乱的植物提取物组合物及其制备方法 | |
CN101732578A (zh) | 一种治疗原发性高血压的药物组合物及其制备方法和用途 | |
CN104435072B (zh) | 一种具有辅助降血糖、降血脂的提取物及其制备方法 | |
CN104127816B (zh) | 一种治疗糖尿病的药物组合物及其制备方法和用途 | |
CN104000896B (zh) | 一种变叶海棠提取物及其制备方法和其用途 | |
CN102430001B (zh) | 防治糖尿病的复方蔷薇果黄酮制剂及其制备方法 | |
CN102204946B (zh) | 从半边莲中提取的半边莲多糖及其应用 | |
CN103263467A (zh) | 强力脑心康药物及制备方法和含量测定 | |
CN100333771C (zh) | 一种参芪降糖滴丸及其制备和检测方法 | |
CN110483657A (zh) | 一种半边莲均一多糖及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |