发明内容
本发明的第一目的在于提供一种更有效的、安全的动物药仿生酶解产物,该仿生酶解产物是动物药经过仿生酶解而得到的。
第二目的是提供该仿生酶解产物在治疗各种眼科炎症、青光眼及干眼症等眼科疾病方面的应用。
具体的说:
本发明主要涉及一种动物药仿生酶解产物,该仿生酶解产物是按以下方法制备的:
取动物药,加水匀浆,调节pH至1.0~3.0,加入胃蛋白酶于35~45℃保温酶解0.5~4小时,调节pH至7.5~8.5,加入胰酶或胰蛋白酶于40~50℃保温酶解2~8小时。
进一步优选,该提取物按以下方法制备:
取动物药,加水匀浆,调节pH至1.5~2.5,加入动物药量0.5~5%的胃蛋白酶于35~45℃保温酶解1~3小时,再调节pH至7.5~8.5,加入动物药量0.5~5%的胰酶或胰蛋白酶于40~50℃保温酶解3~6小时,即得。
再优选,该酶解产物按以下方法制备:
取动物药,加水匀浆,调节pH至2.0,加入动物药量1~2%的胃蛋白酶于40℃保温酶解1~3小时,再调节pH至8.0,加入动物药量1~2%的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3~6小时,即得。
发明人经过试验筛选,动物药药材加水匀浆后,可预先加热至80~100℃,保温15~30分钟,再放冷至酶解所需温度,按以上操作酶解,其效果更强。按本发明技术方案进行酶解,当胃蛋白酶的酶活力达到1200U/g,胰蛋白酶的酶活力达到2500U/mg,胰酶的酪蛋白转化力达到25.0时,效果较为充分;酶活力越高,酶解速度越快、效果越好。按本发明的方法操作,动物药的抗凝血、活血、抗炎等活性大大增强,优于以往常用的动物药原粉、水提液、醇提液及水提醇沉液。
本发明中的动物药选自水蛭、地龙、土鳖虫、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、僵蚕等,其均具有活血化瘀功效,并具有坚实的临床应用基础。
本领域技术人员可以方便地将本发明的仿生酶解产物配合适当的药用辅料,制备成滴眼液、眼用凝胶、眼用即型凝胶、眼膏、眼用膜剂等各种眼用常规制剂,如:
a、将酶解液加热至85℃杀酶后,滤过,滤液以超滤膜超滤,分取截留分子量10kD以下的溶液,可加入等渗调节剂、pH调节剂、抑菌剂等制成滴眼液。
b、将酶解液滤过,滤液以超滤膜超滤,截留分子量10kD以下的溶液,或滤液直接加卡波姆、壳聚糖、羟丙基甲基纤维素等眼用制剂常规辅料,制成眼用凝胶剂。
c、将酶解液滤过,滤液以超滤膜超滤,截留分子量10kD以下的溶液,加入结冷胶、泊洛沙姆等眼用制剂常规辅料,制成眼用即型凝胶剂。
本发明提供的动物药仿生酶解产物可以单独使用,也可以与其他药物成分联合使用,即:在药物活性成分中,可以只有该产物,还可以是其与其他药物的混合物,达到配合治疗、辅助治疗的目的。
本发明中的动物药仿生酶解产物,针对其活血化瘀的作用可以用于治疗各种眼科炎症,如结膜炎、角膜炎、沙眼、眼睑炎、睑缘炎、巩膜炎、角膜溃疡等,也可以用于治疗青光眼及干眼症等眼科疾病。
有益效果
为进一步验证本发明产物相对于现有技术的进步效果,发明人进行了动物药效学的对比实验,实验中的“仿生酶解组”即为按本发明技术方案制得的动物药酶解产物。
试验一、体外抗凝血活性试验(全蝎)
试验材料
胃蛋白酶,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:F20070914;胰蛋白酶,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:F20071228;胰酶,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:F20071025;牛纤维蛋白原,供凝血酶效价测定用,购自中检所,批号:140626-200608;凝血酶,购自珠海经济开发区生物化学制药厂,批号:20071101。
试验动物
Wister大鼠,购自北京大学实验动物科学部。
供试样品的制备
未酶解组:取全蝎药材细粉(80目)50g,加入10倍量生理盐水,匀浆30分钟,搅匀,取1/4量,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
胃蛋白酶酶解组:取1/4匀浆液,加入1%胃蛋白酶(酶活力为1200U/g),同时调节pH至2,温度为40℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
胰蛋白酶酶解组:取1/4匀浆液,加入1%胰蛋白酶(酶活力为2500U/mg),同时调节pH至8,温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
仿生酶解组:取1/4匀浆液,加入1%胃蛋白酶(酶活力为1200U/g),同时调节pH至2,温度为40℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,然后调pH至8,加入1%胰蛋白酶(酶活力为2500U/mg),温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
空白组:即生理盐水组。
试验方法
大鼠腹腔静脉取血,3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝,混合后,以3000r/min离心15分钟,取上清液,得到贫血小板血浆(PPP)。取血浆0.1ml,加入动物药不同酶解液0.1ml,混匀,37℃保温3min,再加入已预温的凝血酶(10U/ml)0.2ml,混匀,记录出现絮状沉淀所需时间,即为凝血酶原时间(PT)。结果见表1。
表1 凝血酶原时间(PT)测定结果(n=5)
编号 |
凝血酶原时间(秒) |
未酶解样品组 |
32±4.16 |
胃蛋白酶酶解样品组 |
57±2.12 |
胰蛋白酶酶解样品组 |
61±1.56* |
仿生酶解样品组 |
289±2.48** |
生理盐水组 |
18±2.01 |
注:与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
上述试验结果表明,仿生酶解工艺大大增加了全蝎的抗凝血活性,均比其余酶解工艺理想,较未酶解样品具有极显著性差异(P<0.01)。
试验二、纤溶活性试验(水蛭)
1、材料
1.1供试样品
未酶解组:取水蛭药材细粉(80目)40g,加入10倍量生理盐水,匀浆30分钟,搅匀,取1/4量,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
胃蛋白酶酶解组:取1/4匀浆液,加入1%胃蛋白酶(酶活力为1200U/g),同时调节pH至2,温度为40℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
胰蛋白酶酶解组:取1/4匀浆液,加入1%胰蛋白酶(酶活力为2500U/mg),同时调节pH至8,温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
仿生酶解组:取1/4匀浆液,加入1%胃蛋白酶(酶活力为1200U/g),同时调节pH至2,温度为40℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,然后调pH至8,加入1%胰蛋白酶(酶活力为2500U/mg),温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得;
空白组:即生理盐水组。
1.2试剂琼脂糖,购自北京奥博星生物技术有限责任公司,批号:20080204;考马斯亮蓝R-250,购自上海展云化工有限公司,批号:0708019;胃蛋白酶,购自国药基团化学试剂有限公司,批号:F20070914;胰蛋白酶,购自国药基团化学试剂有限公司,批号:F20071228;胰酶,购自国药基团化学试剂有限公司,批号:F20071130;牛纤维蛋白原,供凝血酶效价测定用,购自中检所,批号:140626-200608;凝血酶,购自珠海经济开发区生物化学制药厂,批号:20071101。
2、方法与结果
2.1试验方法 取0.08g琼脂糖,加入磷酸盐缓冲液(PH7.6)10ml,加热使溶解,冷却至55℃,加入纤维蛋白原溶液(7mg/ml)0.8ml及凝血酶溶液(5U/ml)0.5ml,混匀,立即倒入已预热的培养皿中,待基本冷却后转移至7℃冰箱中放置20min,用直径0.5厘米打孔器打孔,即得。每个孔中均加入20μl对应样品液,以生理盐水做对照。于37℃培养箱中培养22h。取出,用考马斯亮蓝R-250染色20~30min,脱色液脱色,观察纤维蛋白溶圈,记录溶圈直径。
2.2试验结果 水蛭不同酶解工艺对应的纤溶活性测定结果见表2。
表2 水蛭纤维蛋白溶圈测定结果(n=5)
编号 |
溶圈直径(mm) |
溶圈面积(mm2) |
未酶解样品组 |
18±3.12 |
234.72±25.46** |
胃蛋白酶酶解样品组 |
22±2.86 |
360.32±33.53*** |
胰蛋白酶酶解样品组 |
24±2.67 |
432.54±28.21*** |
仿生酶解样品组 |
28±3.18* |
595.82±36.07*** |
空白对照组 |
6.5±3.26 |
13.54±30.52 |
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
上述试验结果表明,仿生酶解工艺大大增加了水蛭的纤溶活性,均比其余酶解工艺理想,较未酶解样品具有显著性差异。
试验三、对家兔细菌性角膜炎的药效学试验研究(土鳖虫)
试验材料
绿脓杆菌(ACTT27853),浓度1×106CFU·ml-1;
金黄色葡萄球菌(ACTT25923),浓度2.5×109CFU·ml-1;
大肠杆菌(ACTT25922),浓度1.8×109CFU·ml-1;均由北京市中医院检验科细菌室临床分离而得。
供试样品的制备
土鳖虫滴眼液I(未酶解组):取土鳖虫50g,加8倍量水匀浆,粗滤,再以10kD的超滤膜截取分子量小于10kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
土鳖虫滴眼液II(胃蛋白酶酶解组):取土鳖虫50g,加8倍量注射用水匀浆,调节pH至2.0,加入1g胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时,粗滤,再以10kD的超滤膜截取分子量小于10kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
土鳖虫滴眼液III(胰酶酶解组):取土鳖虫50g,加8倍量注射用水匀浆,调节pH至8.0,加入1g胰酶(酪蛋白转化力25.4)于50℃保温酶解5小时,粗滤,再以10kD的超滤膜截取分子量小于10kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
土鳖虫滴眼液IV(仿生酶解组):取土鳖虫50g,加8倍量注射用水匀浆,调节pH至2.0,加入1g胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时,再调节pH至8.0,加入1g胰酶(酪蛋白转化力25.4)于50℃保温酶解5小时,粗滤,再以10kD的超滤膜截取分子量小于10kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
试验动物
新西兰兔,雌雄兼用,2.2~2.5kg,共50只,购自北京大学实验动物科学部。
试验方法
1、细菌性角膜炎模型建立:用兔座夹固定家兔,以0.5%丁卡因2~3滴滴眼,待其失去知觉后用1ml注射器抽取0.1ml含菌培养液(含绿脓杆菌1×106CFU,金黄色葡萄球菌2.5×109CFU或大肠杆菌1.8×109CFU)自眼角膜近中央部位注人角膜实质层内,使造成直径约2~3min的白色菌斑,分别放入单笼饲养治疗。
2、动物分组治疗与给药方法:模型家兔50只,分为土鳖虫未酶解组、土鳖虫胃蛋白酶酶解组、土鳖虫胰酶酶解组、土鳖虫仿生酶解组和空白对照组(给予注射用水)。给药4次/d,1~2滴/次,以造模后12h开始用药,为期5d,每天进行相关观测工作。
3、观察指标:角膜炎病变治愈程度(肉眼观察)于角膜接种细菌6h后开始,每天观察记录一般情况和积脓、红肿、角膜浑浊、溃疡等角膜炎症表现,并予以分级评分:
0分(正常):无积脓、无红肿、无角膜浑浊、无溃疡;
1分(轻度):眼球角膜、无积脓、有红肿、无角膜浑浊、无溃疡;
2分(中度):眼角膜有积脓、有红肿、无角膜浑浊、轻度溃疡;
3分(重度):眼角膜积脓红肿、角膜浑浊、溃疡。
于接种治疗后第6天处死动物,取一侧10只眼角膜作切片HE染色于显微镜观察角膜厚度、溃疡、炎细胞浸润、成纤维细胞增生等炎症表现评分。另一侧10只眼角膜作24h细菌培养分离检测、金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌和大肠杆菌计数对比统计。并与下述病原体转阴率检测数据一起统计处理。
试验结果
家兔用绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌接种后分组照上述治疗后第5天借助眼科反光镜肉眼观察角膜炎症评分及治疗后第6天处死家兔,取一侧10眼角膜切片HE染色显微镜观察角膜炎症评分,两组20眼综合统计见表3。计算公式如下。
治愈率(%)=(空白炎症分值-各组炎症分值)/空白炎症分值×100%
表3 土鳖虫滴眼液治疗兔眼角膜炎试验结果表
组别 |
正常(0分) |
轻度(1分) |
中度(2分) |
重度(3分) |
总分 |
治愈率(%) |
未酶解滴眼液 |
2 |
5 |
8 |
5 |
36 |
37.9 |
胃蛋白酶酶解滴眼液 |
3 |
7 |
6 |
4 |
31 |
46.6 |
胰酶酶解滴眼液 |
8 |
5 |
5 |
2 |
21 |
63.8 |
仿生酶解滴眼液 |
15 |
4 |
1 |
0 |
6 |
89.7* |
空白组滴眼液 |
0 |
0 |
2 |
18 |
58 |
-- |
注:与空白对照组比较*P<0.05
结果表明,经仿生酶解工艺制备的土鳖虫滴眼液对兔细菌性角膜炎具有较好的治疗效果,均优于未酶解、胃蛋白酶酶解、胰酶酶解的土鳖虫滴眼液。与空白对照组比较具有显著性差异。
试验四、对家兔病毒性结膜炎的药效学试验研究(地龙)
试验材料
病毒株:单纯疱疹病毒I型(HSV-I),TCID50为10-9,由北京药品生物制品检定所提供。
供试样品的制备
地龙滴眼液I(未酶解组):取地龙30g,加8倍量水匀浆,粗滤,再以5kD的超滤膜截取分子量小于5kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
地龙滴眼液II(胃蛋白酶酶解组):取地龙30g,加8倍量注射用水匀浆,调节pH至2.0,加入1g胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时,粗滤,再以5kD的超滤膜截取分子量小于5kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
地龙滴眼液III(胰酶酶解组):取地龙30g,加8倍量注射用水匀浆,调节pH至8.0,加入1g胰酶(酪蛋白转化力25.4)于50℃保温酶解5小时,粗滤,再以5kD的超滤膜截取分子量小于5kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
地龙滴眼液IV(仿生酶解组):取地龙30g,加8倍量注射用水匀浆,调节pH至2.0,加入1g胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时,再调节pH至8.0,加入1g胰酶(酪蛋白转化力25.4)于50℃保温酶解5小时,粗滤,再以5kD的超滤膜截取分子量小于5kD的部分,加入2g尼泊金乙酯,加热使溶解,再加入硼酸12g、硼砂0.6g,加注射用水至1000ml,搅匀,加入0.5g透明质酸钠,充分润胀24h,无菌条件下以微孔滤膜(0.22μm)滤过,罐装,即得。
试验动物
新西兰兔,雌雄兼用,2.2~2.5kg,共40只,购自北京大学实验动物科学部。
试验方法
(1)结膜炎模型的复制方法:对家兔两只眼的下眼脸与球结膜交界处注射单纯疱疹病毒I型的混悬液(TCID50为10-9)0.1mL/眼,造成感染性单纯疱疹病毒I型结膜炎模型。
(2)分组与药物剂量:在注射单纯疱疹病毒I型造成结膜炎模型24小时后(第2天)根据病情轻重程度将家兔50只按性别均匀搭配分成5组,分为地龙未酶解组、地龙胃蛋白酶酶解组、地龙胰酶酶解组、地龙仿生酶解组和空白对照组(给予注射用水)。给药4次/d,1~2滴/次,以造模后12h开始用药,为期7d,每天上午第1次滴眼药水之前,先按综合评分方法观察和记录结膜炎症程度分值后再分别滴眼药液。结果见表4。
(3)观察指标:结膜炎病变治愈程度(肉眼观察)于角膜接种细菌6h后开始,每天观察记录一般情况和积脓、红肿、角膜浑浊、溃疡等角膜炎症表现,并予以分级评分。
0分(正常):血管正常,无水肿,无分泌物;
1分(轻度):血管充血呈鲜红色,轻微水肿,少量分泌物;
2分(中度):血管充血呈深红色,血管不易分辨,明显水肿,伴有部分眼睑外翻,分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着;
3分(重度):弥漫性充血呈紫红色,水肿至眼睑近半闭合,分泌物使整个眼区和睫毛潮湿或粘着。
4分(极重度):水肿至眼睑超过半闭合。
表4 地龙滴眼液治疗兔眼结膜炎试验结果表
组别 |
正常(0分) |
轻度(1分) |
中度(2分) |
重度(3分) |
极重度(4分) |
总分 |
治愈率(%) |
未酶解滴眼液 |
2 |
3 |
8 |
7 |
0 |
40 |
32.2 |
胃蛋白酶酶解滴眼液 |
3 |
6 |
5 |
6 |
0 |
34 |
42.4 |
胰酶酶解滴眼液 |
8 |
5 |
5 |
2 |
0 |
21 |
64.4 |
仿生酶解滴眼液 |
13 |
5 |
2 |
0 |
0 |
9 |
84.7* |
空白组滴眼液 |
0 |
0 |
3 |
15 |
2 |
59 |
-- |
注:与空白对照组比较*P<0.05
结果表明,经仿生酶解工艺制备的地龙滴眼液兔病毒性结膜炎具有较好的治疗效果,均优于未酶解、胃蛋白酶酶解、胰酶酶解的地龙滴眼液。与空白对照组比较具有显著性差异。