CN102218056A - 白术内酯i在防治免疫性肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白术内酯I用于制备抗免疫性肝损伤药物的应用。白术内酯I能降低免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α、NO，白术内酯I可降低免疫性肝损伤小鼠升高的肝匀浆NO、iNOS水平，减少NO对肝脏的损害；白术内酯I对TNF-α的过强表达有抑制作用，减少TNF-α直接或间接引起的肝脏损害。而且，白术内酯I作为抗免疫性肝损伤的药物具有制备方便、来源广泛，价格低廉、安全性高的优点，具有良好的开发应用前景。

Description

白术内酯I在防治免疫性肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及内酯类化合物白术内酯I新的应用，特别涉及白术内酯I在防治免疫性肝损伤药物中的应用。

背景技术

白术为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎等功效，主要用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安等症(中国药典委员会.中国药典一部.北京：中国医药科技出版社，2010，[S]：95-96.)。现代药理学研究表明，白术有利尿、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、抗衰老等多种作用。

白术内酯I是白术的主要活性成分，是一种倍半萜类化合物，极性很小，在水中的溶解度较低。其化学结构式如下：

白术内酯I是白术抗炎、抗癌的有效成分，同时具有调节胃肠道功能和促进营养物质吸收的作用[汤得芳，贺玉巧，刘佐雅，等.平江白术根茎挥发油的成分及其抑瘤作用研究.药学通报，1984，19(9)：43.奕强，徐实波，林永成.白术内酯系列物的胃肠抑制作用.中药材.1999，22(12)：636-40.]。王嫦鹤等的研究结果表明[Changhe Wang，Haijie Duan，Langchong He. Inhibitory effect of Atractylenolide I on the angiogenesis in chronic inflammation in vivo and in vi

我国是病毒性乙型肝炎发病率最高的国家之一，据统计我国乙肝病毒携带者约有9300万人，其中1/3出现肝损害的临床表现，而对免疫性肝损伤的临床治疗还缺乏特效的药物。

免疫性肝损伤通常由生物性因素等引起，常见的原因为病毒感染，如临床上乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的感染，其重要的特征是肝组织内大量的炎症细胞浸润，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤。病毒侵入肝细胞后，可与肝细胞DNA整合在一起，免疫细胞或抗病毒药物在杀灭病毒的同时，也会清除受感染的肝细胞，从而造成免疫性肝损伤。长期反复的肝损伤会导致疤痕状增生、肝纤维化、肝硬化、肝腹水、甚至肝癌等。免疫性肝损伤是肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终末病变发生发展的重要因素之一，从正常、免疫性肝损伤到肝纤维化、肝硬化甚至到肝脏肿瘤的发生发展过程中，免疫性肝损伤是疾病发生的重要步骤，它决定了疾病的转归或发生发展。

BCG联合LPS诱导免疫性肝损伤模型，其肝损伤动物模型类似于人类肝炎发生的病理生理过程，是筛选保肝药物较为理想的模型之一[王华，魏伟，岳莉，等.白芍总苷对卡介苗加脂多糖引起的小鼠免疫性肝损伤的保护作用.中国药理学通报，2004，20(8)：875-8.]。BCG联合LPS所致肝损伤的机制主要为肝巨噬细胞介导的免疫性肝损伤。NO和TNF-α在其发病过程中起到重要作用。

NO是体内重要的生物活性分子和信号分子，它作为血管扩张因子、神经递质和免疫调节剂具有多种生理和病理功能[陈卫刚，李睿，周婷，等.NO和iNOS在肝硬化患者肝组织中的表达及与门静脉压力的关系.天津医药，2006，34(4)：238-40.]。NO具有细胞保护和细胞毒性双重作用：在生理浓度起保护作用，过量引起细胞毒性损害。诱导型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOS)是体内催化NO合成的酶，主要分布在肝细胞和肝巨噬细胞中，在生理情况下不表达，在内毒素、细胞因子的刺激下，iNOS被激活时会持续、大量地产生过量NO。高水平的NO可损伤线粒体、直接损伤DNA，导致细胞死亡[Connelly L，Jacobs AT，Palacios-Callender M，et al.Macrophage endothelial nitric-oxide synthase autoregulates cellular activation and pro-inflammatory protein expression.J Biol Chem，2003，278(29)：26480-7.Laroux FS，Lefer DJ，Kawachi S，et al.Role of nitric oxide in the regulation of acute and chronic inflammation.Antioxid Redox Signal，2000，2(3)：391-6.]。

TNF-α是引起急、慢性肝损伤的重要因素之一，TNF-α本身具有细胞毒作用，能激活T、B淋巴细胞，增加自然杀伤细胞的杀伤能力，直接或间接引起肝细胞的免疫损伤。还可诱导TNF-α本身、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子的大量分泌，介导肝细胞功能受损，加重肝损害[Liu DF，Wei W，Song LH，et al.Upregulation of TNF-alpha and IL-6mRNA in mouse liver induced by bacille Calmette-Guerin plus lipopolysaccharide.Acta Pharmacol Sin，2006，27(4)：460-8.Tukov FF，Luyendyk JP，Ganey PE，et al.The role of tumor necrosis factor alpha in lipopolysaccharide/ranitidine-induced inflammatory liver injury.Toxicol Sci，2007，100(1)：267-80.]。

发明内容

本发明解决的问题在于提供白术内酯I在防治免疫性肝损伤药物中的应用，为白术内酯I提供了一种新用途，也为防治免疫性肝损伤提供了一种新的药物来源。

本发明是通过以下技术方案来实现：

白术内酯I用于制备抗免疫性肝损伤药物的应用。

所述的抗免疫性肝损伤药物为减少NO和TNF-α对肝伤害的药物。

所述的抗免疫性肝损伤药物所包含的白术内酯I的给药量至少为120mg/kg。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明为白术内酯I提供了一种新用途，也为防治免疫性肝损伤提供了一种新的药物来源。而且，白术内酯I作为抗免疫性肝损伤的药物具有制备方便、来源广泛，价格低廉、安全性高的优点，具有良好的开发用用前景。

白术内酯I能降低免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α、NO：白术内酯I可降低免疫性肝损伤小鼠升高的肝匀浆NO、iNOS水平，减少NO对肝脏的损害；白术内酯I对TNF-α的过强表达有抑制作用，减少TNF-α直接或间接引起的肝脏损害。

而且与模型组比较，白术内酯I可降低免疫性肝损伤小鼠增加的肝脏指数、脾脏指数，改善肝脏组织病理学变化和肝脏组织病理学分级，减轻BCG联合LPS所致肝损伤的炎症反应；对免疫性肝损伤中肝匀浆MDA产生和GSH-px水平有明显改善作用，证实白术内酯I有保护肝氧化性损伤的作用。

白术内酯I对肝脏的保护呈现出剂量依赖性；中(120mg/kg)、高剂量(240mg/kg)组的保护与防治要明显好与低剂量组(60mg/kg)；从降低免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α、NO、iNOS含量，从而保护肝损伤来看，中剂量的防治效果基本与作为对照的联苯双酯(100mg/kg)，高剂量组的防治效果要好与作为对照的联苯双酯组。

具体实施方式

下面结合白术内酯I对BCG联合LPS所致免疫性肝损伤小鼠的肝脏指数、脾脏指数、肝脏组织病理学变化，对免疫性肝损伤中肝匀浆MDA产生和GSH-px水平及TNF-α、NO、iNOS水平对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、BCG联合LPS所致免疫性肝损伤小鼠模型的建立与分组

1.1小鼠来源

昆明种小鼠，雄性，体重为22～24g，西安交通大学大学实验动物中心供应。在恒温、光照周期12h:12h环境中，饲养1wk后建立免疫性肝损伤模型，之前24h禁食，任意饮水。

1.2试剂和药品来源

白术内酯I提取自白术，纯度为99.9％；脂多糖(LPS)购自Sigma公司。卡介苗(BCG)由兰州生物制品研究所提供；谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。联苯双酯滴丸(Biphenyldicarboxylate)，北京协和药厂产品，批号：20091024。

1.3模型建立与分组

昆明种雄性小鼠，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照药联苯双脂组和白术内酯I三个剂量组(60、120、240mg/kg)，每组12只。第一天，除正常组外，其余小鼠经尾静脉注射2.5mg BCG，灌胃给予白术内酯I(60、120、240mg/kg)或联苯双酯(100mg/kg)，连续给药10d，正常组和模型组给予等量溶媒(含有0.5％羧甲基纤维素钠的生理盐水)；10d后，除正常组外，其余小鼠经尾静脉注射7.5μg LPS。

2、对照组及白术内酯I剂量组的免疫性肝损伤小鼠模型相关检测

2.1肝脏和脾脏器指数

LPS注射激发肝损伤后禁食10h，称量各个分组当中小鼠的个体体重，摘眼球采血后拉颈处死小鼠，迅速解剖，称取脾脏和肝脏重量，以小鼠脾重/体重(mg/10g)和肝重/体重(mg/10g)作为肝脏和脾脏指数。

2.2肝脏组织学检查

在各个分组小鼠的肝右叶相同部位，取约1cm×1cm×0.5cm的肝组织，10％甲醛固定，HE染色，光镜下观察肝组织损伤程度，并进行病理组织学损伤程度分级：“-”未见明显病理损伤；“+”肝组织浊肿伴有散在的点状坏死，汇管区少许炎性细胞浸润；“++”肝细胞浊肿有点状坏死及小灶性坏死。可见散在的肉芽肿形成，汇管区有大量炎性细胞浸润；“+++”肝细胞浊肿并伴有片状坏死，肉芽肿形成，汇管区及周围有大量炎性细胞浸润。

2.3血浆ALT和AST测定

摘眼球法取血1.5mL，1500r/min离心分离血清，置-20℃保存、备用，然后用ALT和AST检测试剂盒进行含量检测，测定时按照检测试剂盒说明进行操作。

2.5肝匀浆丙二醛(MDA)和谷脱甘肽过氧化物酶(GSH-px)测定

取小鼠肝脏同一部位组织，准确称量(0.3g)，制备肝匀浆液，然后用MDA和GSH-px检测试剂盒进行MDA含量和GSH-px活力的检测，测定时按试剂盒操作说明分别进行。

2.6血浆和肝组织中TNF-α、NO、iNOS含量测定

摘眼球法取血1.5mL，1500r/min离心分离血清，置-20℃保存、备用。在肝脏同一部位准确称取0.3g，用冰生理盐水制成10％的肝匀浆。然后分别去血浆和肝组织匀浆液，利用TNF-α、NO、iNOS含量测定试剂盒进行TNF-α、NO、iNOS含量的测定，测定时按试剂盒操作说明分别进行。

2.7统计学分析

应用统计软件SPSS10.0版进行统计，结果以Mean±SD表示，组间比较采用ANOVA分析。

3、白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠模型的影响

3.1白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠脏器指数的影响

免疫性肝损伤小鼠用药10d，白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠器官重量的影响的结果如表1所示，与正常组比较，模型组小鼠肝脏、脾脏明显肿大；白术内酯I中、高剂量组均能显著降低免疫性肝损伤小鼠升高的肝脏指数、脾脏指数水平，且呈一定的剂量依赖性趋势，高剂量降低肝脏指数、脾脏指数的效果好与100mg的联苯双酯处理组。

表1白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠脏器指数的影响(Mean+SD，n＝9)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01。

3.2白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠肝脏组织病理学变化的影响

肝脏组织学检查表现为：光镜下正常小鼠肝组织结构清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状整齐排列，未见点状坏死和炎性细胞浸润，肝内未见纤维组织增生及假小叶形成；免疫性肝损伤模型组小鼠肝组织可见明显点状坏死及小灶性坏死，并伴有较多炎性细胞浸润；白术内酯I组小鼠肝组织切片见肝组织结构正常，肝细胞点状及灶性坏死较模型组明显减轻，肝细胞轻度浊肿。

炎症坏死程度，6组间比较，各组间炎症坏死程度比较有显著性差异，然后用多个样本两两比较的秩和检验统计，模型组与正常组，联苯双酯组，白术内酯I与模型组比较，均有显著性差异。说明白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠有很好的保护作用，具体结果如表2所示。

表2白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠肝组织病理学分级的影响(n＝9)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，⁺P＜0.1，⁺⁺P＜0.05。

3.3白术内酯I对血浆转氮酶水平的影响

血浆ALT和AST测定结果如表3所示，与正常组相比较，模型组血清ALT、AST水平升高，给予白术内酯I(60、120、240mg/kg)和联苯双酯(100mg/kg)组均能降低免疫性肝损伤小鼠血清中升高的ALT、AST水平(P＜0.01)。

表3白术内酯I对小鼠免疫性肝损伤血浆转氨酶活力的影响(Mean+SD，n＝10)

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，⁺⁺P＜0.01。

3.4白术内酯I对肝匀浆MDA和GSH-px的影响

MDA和GSH-px的测定结果如表4所示，不同剂量的白术内酯I组，其肝匀浆MDA含量明显降低，GSH-px活力明显升高；与模型对照组比较，差异有显著性(P＜0.05～0.01)。这表明白术内酯I可能通过抗脂质过氧化环节而保护肝脏。

表4白术内酯I对小鼠免疫性肝损伤肝匀浆MDA和GSH-px的影响(Mean+SD，n＝9)

注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5白术内酯I对血浆和肝组织中TNF-α、NO、iNOS生成的影响

TNF-α、NO、iNOS含量测定的结果如表5所示，与正常组比较，模型组小鼠肝匀浆TNF-α、NO、iNOS生成量显著升高；白术内酯I各剂量组均能降低免疫性肝损伤小鼠升高的肝匀浆TNF-α、NO、iNOS水平，且呈一定的剂量依赖性趋势。

表5白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠肝组织TNF-α生成的影响(Mean+SD，n＝9)

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01。

综合以上反映肝损伤灵敏指标ALT和AST的测定、抗脂质过氧化环节相关的MDA和GSH-px的测定、以及免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α、NO、iNOS含量测定果，与模型组比较，白术内酯I可降低免疫性肝损伤小鼠增加的肝脏指数、脾脏指数，改善肝脏组织病理学变化和肝脏组织病理学分级，减轻BCG联合LPS所致肝损伤的炎症反应；对免疫性肝损伤中肝匀浆MDA产生和GSH-px水平有明显改善作用，证实白术内酯I有保护肝氧化性损伤的作用；白术内酯I可降低免疫性肝损伤小鼠升高的肝匀浆NO、iNOS水平，减少NO对肝脏的损害；白术内酯I对TNF-α的过强表达有抑制作用，减少TNF-α直接或间接引起的肝脏损害。这表明白术内酯I对免疫性肝损伤小鼠具有保护作用，其保护作用可能与减少NO和TNF-α等炎症介质的释放有关；说明白术内酯I可用于抗免疫性肝损伤药物的制备。

以上对免疫性肝损伤各检测指标的呈现出剂量依赖性；中(120mg/kg)、高剂量(240mg/kg)组的保护与防治要明显好与低剂量组(60mg/kg)；从降低免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α、NO、iNOS含量，从而保护肝损伤来看，中剂量的防治效果基本与作为对照的联苯双酯(100mg/kg)，高剂量组的防治效果要好于作为对照的联苯双酯组。

Claims (3)

1.白术内酯I用于制备抗免疫性肝损伤药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗免疫性肝损伤药物为减少NO和TNF-α对肝伤害的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗免疫性肝损伤药物所包含的白术内酯I的给药量至少为120mg/kg。