CN102836168A

CN102836168A - 吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制药中的应用

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Publication number: CN102836168A
Application number: CN2012102654805A
Authority: CN
Inventors: 朱荃; 杨子峰; 李楚源; 钟南山; 郑兆广; 顾斐; 林青; 王玉涛; 段婷婷; 招穗珊; 何宝; 李莉; 汤丹; 关文达; 王德勤
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd; Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASES; Macao University of Science and Technology
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd; Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASES; Macao University of Science and Technology
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: CN102836168B

Abstract

本发明公开了一种吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法以及其在制备抗流感病毒药物中的应用，本发明还涉及了活性成份包括有吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是抗流感病毒的药物。本发明提供吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在抗流感药物中的应用，从而为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的天然药物。

Description

吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制药中的应用

技术领域

本发明涉及吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制药中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

流行性感冒（以下简称流感）是人类面临的主要公共健康问题之一。流感往往突然暴发，迅速扩散，造成不同程度的流行，具有季节性、传染性、传播迅速等特点。季节性流感一般可引起伴有发热的急性呼吸系统疾病，重症病例可因呼吸或多脏器衰竭而死亡。

疫苗是公认的预防流感有效方法，但流感病毒的抗原变异能力极强且相当频繁，导致疫苗的相对滞后性。抗病毒药物治疗是流感治疗最基本和最重要的环节，当前美国食品和药物管理局（FDA）批准用于防治流感的药物有多金刚烷胺、金刚乙胺和奥司他韦、扎那米韦，但甲型流感病毒对M2离子通道阻滞剂（金刚烷胺和金刚乙胺）早有耐药报道，2007～2008年流感季节期间，全球近90％的季节性甲型流感病毒（H1N1）对磷酸奥司他韦耐药，并且经典神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦存在服用后产生呕吐、恶心、失眠、头痛和腹痛等副作用。可见，耐药性和副作用始终困扰着现有抗流感病毒药物治疗。

传统中草药在我国长期应用于呼吸道感染的防治，取得了较好效果，形成了自身独特优势：（1）成分清晰的中药单体，作用明确，具备化学药物研究的基础；（2）中药复方具有成分复杂、作用环节多的特点，抗病毒机理也不尽相同，其中既有直接抗病毒的功效，也有调节机体免疫状态的功能，多个环节共同作用，具有综合防治功能，有些经典方剂历经千百年的中医临床实践而沉淀，拥有十分丰富研究线索和广泛的病人认同；（3）抗病毒中药具有疗效稳定、毒副作用较小以及不易产生耐药性、不促使病毒变异等，而且药源丰富，价格低廉。因此，近年来，国内外均开展了抗流感病毒中草药的研究，为抗流感药物提供了宝贵的资料和数据，也取得了一定的成果。

板蓝根Isatis infigotica Fort.异名，靛青根(《本草便读》)，蓝靛根(《分类草药性》)，为十字花科（Brassicaceae）菘蓝属（Isatis）植物菘蓝（Isatis indigotica）的根；药性苦、寒，为临床常用的抗病毒药物，对流感病毒、柯萨奇B₃病毒、肾综合征出血热病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒以及乙型肝炎病毒均有抑制作用。目前从板蓝根中分离得到化合物包括生物碱类（靛玉红、靛蓝）、芥子苷类（黑芥子苷）、糖类（糖蛋白、多糖）、含硫类、木脂素类（异落叶松树脂醇）、有机酸类（苯甲酸等）、黄酮类、醌类、甾醇类化合物及微量元素等，但是其具体的有文献报道的抗流感病毒成分仍不明确，为此有必要对其抗流感病毒的化学成分进行深入的研究。吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Indole-3-acetonitrile-6-O-β-D-glucopyranoside，)为从板蓝根中分得天然产物，而目前的文献中还没有其在抗流感病毒方面应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在抗流感药物中的应用，从而为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的天然药物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备抗流感病毒药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种抗流感病毒的药物。

实现上述目的的技术方案如下：

一种抗流感病毒的药物，其活性成份包括有吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可以制备抗流感病毒复方药物。吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷也可以单独制成抗流感病毒药物。

所述流感病毒为甲、乙型流感病毒。

本发明的另一目的是提供吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：

A、取板蓝根生药粉碎，加入8－12倍量水回流提取2－4次，每次1.5－2.5小时，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液；

B、浓缩液置D101大孔树脂中，分别用水、30%(v/v)乙醇洗脱，收集30%醇洗脱液，减压浓缩得浸膏1；

C、浸膏1以适量的水溶解后，置MCI凝胶柱中，分别以水、25%(v/v)的甲醇、35%(v/v)的甲醇洗脱，收集35%甲醇的洗脱液，浓缩至干浸膏2；

D、浸膏2置硅胶柱中，分别以体积比20:1和10:1的氯仿-甲醇洗脱，其中体积比10:1的氯仿-甲醇洗脱液中得棕黄色针状晶体，用氯仿-甲醇(优选体积比为10:1)中重结晶，即得吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明所述药物组合物的使用剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而相应调整。一般情况下，临床口服使用的参考剂量是20-400mg/d。

本发明对吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进行体内外抗流感病毒的研究：其中体外抗病毒利用直接、治疗及保护3种策略，以细胞病变抑制法和空斑减少试验，评价对不同流感病毒亚型的抑制作用，包括甲型H1N1流感病毒PR8株（A/PR/8/34，H1N1）、甲型H1N1流感病毒FM1株（A/FM1/47，H1N1)、甲型H3N2流感病毒Aichi株（A/Aichi/2/68，H3N2）、新甲型H1N1流感病毒株（A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1）、季节性甲型H1N1流感病毒株（A/Guangzhou/GIRD02/2009，H1N1）、乙型流感病毒（B/Guangzhou/GIRD08/09）、甲型H6N2流感病毒（A/Duck/Guangdong/2009，H6N2）、甲型H7N3流感病毒（A/Duck/Guangdong/1994，H7N3）、甲型H9N2流感病毒（A/Chicken/Guangdong/1996，H9N2）；体内抗病毒利用小鼠感染甲1型流感病毒FM1鼠肺适应株模型，评价了吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的体内抗病毒药效。结果表明在保护和治疗作用模式，对不同亚型流感病毒都显示了不同程度的抑制作用（半数有效浓度IC₅₀，0.4～3.2mg/ml）；体内抗流感病毒研究则表明吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷高剂量组的肺指数（LI）（1.12±0.35）显著低于病毒模型组（2.00±0.48），p<0.05。因此表明该药物具有开发成抗流感病毒的有效药物而用于临床，并且可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发的广阔前景。结合现代常用药物制剂手段，还可将吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂，从而采用比较方便的口服给药形式。

综上所述，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是一种纯天然药物，细胞毒性作用小，在10μg-10mg/ml范围内没有细胞毒性。

2、能够抑制多种甲型流感病毒，包括甲型H1N1（A/PR/8/34）、H1N1（A/FM1/47)、H1N1（A/Guangzhou/GIRD07/09）、A/Duck/Guangdong/2009，H6N2）、H7N3（A/Duck/Guangdong/1994）。

3、对甲型流感病毒感染具有保护和治疗作用。

4、可口服给药，服用方便。

5、纯天然产物，与西药比较不容易产生耐药性。

附图说明

图1为体外抗流感病毒治疗、保护和直接作用三种策略模式操作步骤。

图2为吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷体外抗甲1型流感病毒PR8株的空斑减少实验图。

图3为吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷体内抑制流感病毒引起的小鼠肺炎（肺指数）。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明的内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

实施例1：

制备吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

A、取板蓝根生药10kg，切碎，加入100L水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至一定的体积；

B、置D101大孔树脂中，先用水洗脱，再用30%（V/V）乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得浸膏1；

C、浸膏以适量的水溶解后，置MCI凝胶柱中，分别以水、25%（V/V）的甲醇、35%（V/V）的甲醇洗脱，收集35%（V/V）甲醇的洗脱液，浓缩至干，得浸膏2

D、浸膏2置硅胶柱中，分别以体积比为20:1和10:1的氯仿-甲醇洗脱，其中10:1的氯仿-甲醇洗脱部分得一棕黄色针状晶体，氯仿-甲醇(体积比10:1)中重结晶，经红外、紫外、核磁共振和质谱等分析确定其结构为吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Indole-3-acetonitrile-6-O-β-D-glucopyranoside)，HPLC检测其纯度为98%，分子式C₁₆H₁₈N₂O₆，分子量334，物理性质为棕黄色晶体，粉末状，其结构如下：

实施例2：

吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷体外抗流感病毒作用

1 实验材料

1.1药物受试样品：

吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为实验室自制（制备方法如实施例1所述），经红外、紫外、核磁共振和质谱等分析确定其结构为吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Indole-3-acetonitrile-6-O-β-D-glucopyranoside，经HPLC检测其纯度为98%)。也可购买吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷商品。

1.2 细胞

狗肾细胞（MDCK）引自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。人喉癌细胞（HEp-2）、猴肾细胞（LLC-MK2）、人胚肺成纤维细胞（MRC-5）分别引自美国经典培养物收藏中心（ATCC）及中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3 病毒株

甲型H1N1流感病毒PR8株（A/PR/8/34，H1N1）、甲型H1N1流感病毒FM1株（A/FM1/47，H1N1)、甲型H3N2流感病毒Aichi株（A/Aichi/2/68，H3N2）均购自美国经典培养物收藏中心（ATCC）；新甲型H1N1流感病毒株（A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1，Genebank No.HM014332.1）、季节性甲型H1N1流感病毒株（A/Guangzhou/GIRD02/2009，H1N1）、乙型流感病毒（B/Guangzhou/GIRD08/09）为本室临床分离株，甲型流感病毒H6N2（A/Duck/Guangdong/2009，H6N2）、H7N3（A/Duck/Guangdong/1994，H7N3）、H9N2（A/Chicken/Guangdong/1996，H9N2）由华南农业大学兽医学院陈建新教授惠赠。上述病毒均以9～11日龄鸡胚扩增，收获尿囊液，测定其相应血凝效价。以Reed-Muench法测定其半数感染量（TCID₅₀）作为病毒滴度，用于细胞病变抑制法；根据空斑形成法的滴度计算感染复数（Multiplicity Of Infection,M.O.I），用于空斑减少实验。

1.4 主要试剂

MEM(基础培养基) GIBCO Lot:699642

胎牛血清 GIBCO Lot:721229

MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2）Genebase Lot:0793

Agar（低熔点琼脂） OXOID Lot:1042795-02

DEAE（二乙氨乙基纤维素） MP Biomedicals Lot:3967J

结晶紫天津大茂

2 实验方法

2.1 药物细胞毒性试验(MTT法)

常规制备MDCK细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层，弃去培养液，加入不同稀释度的药物，空白对照和正常细胞对照孔加入MEM，37℃，5％CO₂继续培养36-48小时，每孔加MTT溶液（5mg/mL），置37℃，5％CO₂温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，加二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数毒性浓度(TC₅₀)。

(1)空白对照孔（培养基、MTT、DMSO）

(2)正常细胞对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO）

(3)抑制率＝[（正常－空白）－（给药－空白）]/（正常－空白）×100％

2.2.体外抗甲型流感病毒作用

2.2.1 对不同亚型的流感病毒抑制作用

以空斑减少实验（Plaque Reduction Assay）在治疗、保护和直接作用三种试验策略下进研究LBG对不同流感病毒亚型（H1/H3/H6/H7/H9）的抑制作用。

（1）治疗模式：12孔细胞培养板内的MDCK细胞吸附病毒2h，同时设定病毒对照和细胞对照，加入不同浓度药物（除病毒和细胞对照外）在37℃ 5%CO₂环境下培养。

（2）保护模式：12孔细胞培养板内的MDCK细胞孵育药物2h，加入病毒吸附2h后，换含TPCK胰酶的无血清培养基，在37℃、5%CO₂环境下培养。

（3）直接杀灭作用：病毒与不同浓度的药物37℃孵育1h后接种于细胞中，置于4℃孵育1h，吸弃上清，换含TPCK的无血清培养基37℃培养8h。

空斑减少试验：经过不同的模式处理的单层细胞上加入1.5mL/孔琼脂糖营养物，内含0.2%BSA，0.8%Aga r和0.3%DEAE-Dext ran，置34℃、5％CO₂条件下培养3天，以福尔马林缓冲结晶紫溶液(0.1％)固定和染色并计算空班形成单位（PFU/mL），按下列公式计算空斑形成单位：

用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)，并以选择指数TI表示，（TI=TC₅₀/IC₅₀）,TI>2表示低毒高效；TI：1～2表示高毒低效；TI<1表示无效。

3实验结果

3.1 药物细胞毒性实验

利用MTT法测得受试样品的药物半数有毒浓度（TC₅₀），见表1。本研究中的药效实验均在最大无毒浓度（T₀）下进行。

表1吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对MDCK细胞毒性试验结果

由表可以看出，吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在比较大的浓度范围对细胞没有毒性，表明药物的安全性较好。

3.2吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对不同亚型的流感病毒抑制作用

在保护、治疗和直接作用三种模式中，其主要作用在保护和治疗模式下，对不同亚型的流感病毒都显示了不同程度的体外抑制作用,结果见表2。

表2.吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷体外对不同流感病毒亚型的抑制作用

TC₅₀、IC₅₀单位为mg/mL；选择指数（SI），SI>2表示低毒有效；SI=1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。a：保护模式；b：治疗模式；c：直接模式；NC:Not Confirmed，未确定。

4.结果与分析

参见图1和图2。体外抗病毒作用实验结果表明：吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在保护作用模式下，对不同亚型流感病毒包括A/PR/8/34（H1N1）、A/FM1/47（H1N1)、A/Guangzhou/GIRD07/09（H1N1），治疗作用模式下对不同亚型流感病毒包括（A/Duck/Guangdong/2009，H6N2）、A/Chicken/Guangdong/1996（H9N2）都显示了不同程度的抑制作用（半数有效浓度IC₅₀，0.4～3.2mg/ml）；这表明吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作用的环节可能主要在于抑制病毒进入宿主细胞，具有保护宿主细胞的作用。

实施例3

吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对流感病毒体内抑制作用研究

1.实验材料

1.1 药物及其制备

阳性对照药物利巴韦林（病毒唑），购自广东肇庆星湖生物科技股份有限公司。

1.2 动物

6～8周龄,体重16-18g BALB/C小鼠(SPF级)，购自广东省实验动物中心（许可证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2008A023）。

1.3 病毒株

甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株（A/FM1/47，H1N1)。扩增时接种9日龄鸡胚尿囊腔，35℃培养2天，收集尿囊液备用。病毒滴度测定：血凝滴度为1024；按照Reed-Muench的方法^[1]测定半数致死量（LD₅₀）为10^-3.5737；空斑形成单位为2.25×10⁶PFU/mL。

2.实验方法

体内抑制流感病毒性肺炎作用（病毒性肺炎试验）

（1）将病毒冻融后，稀释至50μL含300个PFU（约为10个LD₅₀）。

（2）BALB/C小鼠随机分组，每组10只，全部雌性，设置正常对照组、病毒对照组及阳性药物组（病毒唑）。除正常组外，经乙醚轻度麻醉后，滴鼻感染病毒液，每只约50μL。

（3）3小时后，灌胃给药。阳性药物（病毒唑）浓度为0.07g/kg，LBG设置3个浓度，每只灌胃给药0.2mL，每天灌胃1次，正常对照组及病毒对照组同时每天灌胃1次0.2mL生理盐水，连续灌胃5天。

（4）每天称体重、观察小鼠反应及死亡情况并做记录，共观察7天。7天后，乙醚麻醉处死小鼠，解剖观察肺部病变，并称量体重及肺湿重，测定其肺指数（肺指数（Lung Consolidation Index，LI）=肺脏重量(g)/体质量(g)×100）。

（5）统计学处理实验数据以

表示，采用SPSS12.0软件包，进行单因素方差分析。

3.实验结果

3.1 体内抗流感病毒效果（病毒性肺炎试验）

参见图3。感染流感病毒的小鼠给药后，每日称体重观察给药后小鼠体重变化，结果显示正常组小鼠每日体重变化均匀，且呈递增趋势，病毒唑组小鼠体重有所下降，但第4日开始体重基本维持不变，而其他药物组小鼠体重均逐日下降，与病毒组状况无明显差别。

流感病毒感染鼠肺的大体病变观察：给药6天后解剖,肉眼观察各组鼠肺大体病变情况：（1）正常对照组小鼠肺部呈粉红色，无异常；（2）病毒对照组大部分小鼠肺部病变明显,肺组织充血、水肿、体积增大，病变主要发生于肺间质,病灶呈暗红色,局灶性分布,病灶多累及2个以上肺叶;（3）部分给药组小鼠肺部病变程度及病灶面积较病毒对照组有一定程度减轻。

主要依据肺指数，观察吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的治疗病毒性肺炎效果：首先在建模方面，正常组，阳性药物（病毒唑）组均与病毒模型组间存在显著差异(P<0.01)，而正常组与病毒唑组间无差异(P>0.05)，提示吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷药物的动物（小鼠）感染流感病毒模型均构建成功。

体内抗病毒实验结果显示，吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有显著的体内抗病毒作用，其高剂量组（0.9g/kg）肺病变程度改善明显，肺指数与病毒组比较有差异，P<0.05（表3）。

表3.吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的体内抑制病毒性肺炎作用

4.实验结果分析

本研究中，建立了小鼠体内流感病毒鼠肺适应株模型，以评价药物体内抗病毒效果，结果显示，吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（0.9g/kg）可显著抑制流感病毒引起的小鼠肺组织病变及肺炎（肺指数）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备抗流感病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1或2所述的抗流感病毒的药物，其特征在于，所述流感病毒为甲、乙型流感病毒。

3.一种抗流感病毒的药物，其特征在于，其活性成份包括有吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

4.根据权利要求3所述的抗流感病毒的药物，其特征在于，所述流感病毒为甲、乙型流感病毒。

5.一种吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

B、浓缩液置D101大孔树脂中，分别用水、30%（v/v）乙醇洗脱，收集30%醇洗脱液，减压浓缩得浸膏1；

C、浸膏1以适量的水溶解后，置MCI凝胶柱中，分别以水、25%（v/v）的甲醇、35%（v/v）的甲醇洗脱，收集35%甲醇的洗脱液，浓缩至干浸膏2；

D、浸膏2置硅胶柱中，分别以体积比20:1和10:1的氯仿-甲醇洗脱，其中体积比10:1的氯仿-甲醇洗脱液中得棕黄色针状晶体，用氯仿-甲醇重结晶，即得吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤D中，用于重结晶的氯仿-甲醇的体积比为10:1。