CN102196724A - 杯状病毒灭活方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供不具有次氯酸钠水溶液那样的危险性，并且即使在以蛋白质为主要成分的有机物的共存下，也能够有效地使被消毒物中所含的诺如病毒等杯状病毒失活或灭活的方法。一种使蛋白质共存下的杯状病毒灭活的方法，其中，包括：使疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质与包含含有乙醇和酸作为有效成分、pH在2.5～5.0的范围内的水溶液的组合物接触。所述杯状病毒例如为诺如病毒。

Description

杯状病毒灭活方法
相关申请的相互参照
本申请要求2008年10月24日提出的日本特愿2008-274103号和2009年7月13日提出的日本特愿2009-164896号的优先权，上述申请的全部记载特此作为公开援引于此。
技术领域
本发明涉及灭活猫杯状病毒、诺如病毒等属于杯状病毒科的病毒(以下称为杯状病毒)的方法。
背景技术
日本厚生劳动省指出，十分之一的冬季急性胃肠炎患者是由于感染了诺如病毒。诺如病毒的感染途径基本为经口感染，从防止来自食品处理者、烹调器具的二次污染的观点来看，诺如病毒的失活或灭活方法是很重要的。
日本厚生劳动省指出，消毒用乙醇、逆化皂对于使诺如病毒失活是无效的，次氯酸钠水溶液对于使诺如病毒失活是有效的(参照厚生劳动省“ノロウイルスに関するQ&A Q16”(关于诺如病毒的Q&A Q16)、http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/03.html#3-3)(非专利文献1)。
但是，次氯酸钠水溶液也存在如下问题：具有特有的强烈臭气、附着于皮肤而引起皮肤粗糙、使衣服和绒毯脱色，等。此外，与酸混合时会产生氯气，有时会引起中毒症状，有时还会出现危险的情况。
另一方面，对于乙醇而言，其为酒类等食品中所含的成分，因此安全性高，但如上所述单独使用时不具有使诺如病毒失活的效果。
与此相对，有文献报道了组合使用乙醇、天然提取物(葡萄柚种子提取液)和植酸的杯状病毒用除菌液(专利文献1)。
此外，已知为了抑制或消除常见的细菌而组合使用乙醇和有机酸作为食品用防腐剂(专利文献2)，但其对诺如病毒的效果是未知的。
与此相对，最近公开的专利文献3中公开了一种消毒剂，其含有以下的(a)、(b)、(c)和(d)，且不含其它的用于杀菌消毒的杀菌消毒剂。其中还记载了该消毒剂能够适用于手指、皮肤，并且用于杀病毒。
(a)相对于全部消毒剂为40～90％(w/w)的乙醇、异丙醇或它们的混合物
(b)相对于全部消毒剂为0.1～2％(w/w)的乳酸
(c)相对于全部消毒剂为0.01～2％(w/w)的柠檬酸
(d)相对于全部消毒剂为0.001～0.1％(w/w)的在溶液中游离出锌离子的含锌化合物
专利文献
专利文献1：日本特开2007-320924号公报
专利文献2：日本特公昭60-35106号公报
专利文献3：日本专利4163249号公报
非专利文献
非专利文献1：http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/03.html#3-3
上述专利文献和非专利文献的所有记载特此作为公开援引于此。
发明内容
如上所述，厚生劳动省所指出的对诺如病毒失活有效的次氯酸钠水溶液存在若干问题，此外，乙醇在单独使用时对诺如病毒失活无效，只不过是通过与特殊的天然提取物(葡萄柚种子提取液)和植酸组合使用才能作为杯状病毒用除菌液。
根据说明书的记载，专利文献3所记载的消毒剂对诺如病毒等无包被病毒具有较高的有效性。但是，该消毒剂的适用对象主要限于手指、皮肤。
与此相对，虽然手指、皮肤的消毒也是必要的，但与其同样重要的是在医疗、护理现场所必须的对含有诺如病毒等无包被病毒的吐泻物、粪尿等物质的病毒进行灭活的方法。在医疗、护理现场，感染或疑似感染无包被病毒的患者所排泄的吐泻物、粪尿等有时会散布在地板等上，迫切需要对其进行安全处理。迄今为止，均是使用一次性片或纸将这样的排泄物擦去，然后用次氯酸钠水溶液进行处理。但是，次氯酸钠水溶液除了存在上述那样的问题之外，还存在如下问题：在吐泻物、粪尿等中，除病毒外还含有以蛋白质为主要成分的有机物，在灭活病毒之前次氯酸已被消耗，灭活效果显著降低。
因此，本发明的目的在于提供不具有次氯酸钠水溶液那样的危险性，并且即使在以蛋白质为主要成分的有机物的共存下，也能够有效地使被消毒物中所含的诺如病毒等杯状病毒失活或灭活的方法。
本发明人发现，通过使用在乙醇水溶液中共存有酸以显示特定范围的pH的乙醇制剂(组合物)，能够将以蛋白质为主要成分的有机物共存下的杯状病毒灭活，从而完成了本发明。需要说明的是，本说明书中，杯状病毒的灭活和失活具有相同的含义，杯状病毒灭活或失活的状态是指病毒基本上失去感染力的无毒化的状态，具体而言，是指病毒的感染滴度与对照相比为10-4以下的情况。
用于解决上述课题的本发明如下所述。
[1]一种使蛋白质共存下的杯状病毒灭活的方法，其中，包括：使疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质与包含含有乙醇和酸作为有效成分、pH在2.5～5.0的范围内的水溶液的组合物接触。
[2]如[1]所述的方法，其中，所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质存在于设施或物品表面，
所述方法包括下述步骤：
在所述设施或物品表面的至少一部分或全部上覆盖透水性和/或保水性片的步骤；
将所述组合物供给到所述片上，使所述组合物与片下的所述表面接触的步骤；和
在接触后放置规定时间的步骤。
[3]如[2]所述的方法，其中，将所述表面上存在的所述物质的至少一部分擦去，在擦去所述物质后的设施或物品表面覆盖所述片。
[4]如[2]或[3]所述的方法，其中，所述片预先含有所述组合物。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质是吐泻物或粪尿。
[6]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质是杯状病毒感染者的吐泻物或粪尿。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述组合物中的乙醇的浓度为40～85％(w/w)的范围。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，所述酸为有机酸或无机酸。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，所述酸的浓度为1～10％的范围。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，所述酸是在1～10％的浓度下使所述水溶液显示2.5～5.0的范围的pH的酸。
[11]如[8]所述的方法，其中，所述酸为柠檬酸、乳酸或磷酸。
[12]如[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，所述组合物还含有聚甘油脂肪酸酯。
[13]如[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，所述杯状病毒为诺如病毒。
[14]如[1]～[13]中任一项所述的方法，其中，相对于1体积的所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质，以体积比计，所述组合物的供给量为0.5～100的范围。
发明效果
根据本发明，可以提供能够使用乙醇制剂(组合物)而使与蛋白质共存的杯状病毒灭活的方法，对抑制诺如病毒的蔓延特别有效。并且，根据本发明，可以提供在医疗、护理现场所必须的对含有诺如病毒等无包被病毒的吐泻物、粪尿等的病毒进行有效且安全的灭活的方法。
具体实施方式
本发明涉及一种使蛋白质共存下的杯状病毒灭活的方法，其中，包括：使疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质与包含含有乙醇和酸作为有效成分、pH在2.5～5.0的范围内的水溶液的组合物接触。
本发明中使用的组合物含有乙醇和酸作为有效成分。如上所述，据报道单独使用乙醇时对诺如病毒不具有失活或灭活效果。与此相对，本发明人发现，通过将酸与乙醇组合使用且使pH为2.5～5.0的范围，对使用次氯酸钠水溶液无法获得灭活效果的、蛋白质共存下的诺如病毒也显示出灭活效果。
本发明中使用的组合物中的乙醇浓度可根据组合物的使用方法(以原液状态直接使用、或适当稀释后使用等)而适当选择，例如从可靠地获得杯状病毒的灭活效果的观点来看，乙醇浓度为40～85％(w/w)的范围是合适的。乙醇浓度为该范围时，多可同时期待对细菌的效果，据称通常该浓度对杀灭细菌也具有很高的效果。此外，乙醇浓度低时，应用喷雾等后的干燥变慢，至开始下一作业为止需要较多时间，因此设定为一定程度以上的浓度是合适的。乙醇的更优选的浓度为40～59％(w/w)。这是由于，超过60％时，为消防法规定的危险物，在处理方面产生限制。此外，乙醇浓度变高时，作为酸和盐的柠檬酸、柠檬酸盐等的溶解性降低，因此有时在制造方面、制品的稳定性方面不易处理。
与乙醇组合使用的酸例如可以是有机酸或无机酸，有机酸可以举出醋酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、植酸，无机酸可以举出硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等。酸的浓度可考虑组合物的pH而适当决定，例如可为1～10％的范围。酸的浓度过低时，可能会由于吐泻物等使用对象中所含的蛋白质的缓冲能力而使灭活效果变差，另一方面酸的浓度过高时，在使用乙醇制剂后，水、乙醇挥发之后会残留固体成分，有时需要通过洗涤等将其除去，因而优选上述范围。此外，根据酸的种类的不同，有时还存在酸被浓缩而促进金属腐蚀的可能。酸的优选浓度为约1％～约5％。这是由于，比5％更浓的情况下，使用组合物后，水、乙醇挥发之后容易残留固体成分，有时外观上会很醒目。酸的更优选浓度为约1％～约3％。
上述组合物的pH设定为2.5～5.0的范围。pH过低而小于2.5时，金属腐蚀等不良影响会更为严重，因而pH优选为2.5以上。从可靠地获得杯状病毒的灭活效果的观点出发，pH的更优选范围为2.5～4.5的范围，进一步优选2.8～4.0的范围、更优选3.0～3.5的范围。如果为该范围则基本能够可靠地灭活病毒，但超过3.5时根据使用条件的不同有时灭活效果会变差。例如，在吐泻物等使用对象具有缓冲能力的情况下，存在灭活效果变差的倾向。但只要pH为4.0以下，则多数情况下能够发挥病毒灭活效果。
作为酸，在上述1～10％的浓度范围内使作为组合物的水溶液显示2.5～5.0的范围的pH的酸是合适的。作为这样的酸的具体例子，可以举出上述的柠檬酸、乳酸和磷酸。此外，酸既可以单独使用，也可以组合使用多种酸，只要组合物的pH范围在上述范围内即可。此外，上述酸的至少一部分也可以为盐，有时通过成盐还可以发挥缓冲作用，从而易于调节pH。作为盐，可以举出例如乳酸、柠檬酸等有机酸或磷酸等无机酸的碱金属(锂、钠、钾)盐。
上述组合物可通过将水溶性的酸、酸的金属盐溶解于水中后加入乙醇而制备。
上述组合物中，除上述乙醇和酸以外，通过混合例如甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯或甘氨酸、植物提取物或植物浸膏等抗菌成分，强化对细菌、真菌的杀菌效果，能够制备在卫生方面综合功能好的乙醇制剂。其中，聚甘油脂肪酸酯能够通过降低乙醇制剂的表面张力而增大接触面积，此外，还易于渗透到细小的间隙中，因此能够提高上述组合物对杯状病毒的灭活效果的有效性。作为聚甘油脂肪酸酯的优选例子，可以举出四甘油月桂酸酯、五甘油月桂酸酯、六甘油月桂酸酯等。
此外，本发明的上述组合物不含有含锌化合物。这是由于，添加较多有机酸、无机酸的情况下，会与锌离子形成盐，有溶解性变差的可能。
本发明的方法包括使上述组合物与疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质接触的步骤。疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质例如可以是吐泻物或粪尿，进而可以是杯状病毒感染者或疑似感染者的吐泻物或粪尿。吐泻物或粪尿中含有大量蛋白质，当其中存在杯状病毒的情况下，难以通过通常所使用的浓度的次氯酸钠水溶液使杯状病毒灭活。与此相对，即使是这样的吐泻物或粪尿，通过本发明中使用的上述组合物也能够使杯状病毒灭活。
如上所述，疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质为吐泻物或粪尿的情况下，有时这些物质被排泄在地板、床等上，需要在医疗现场、护理现场对其进行适当且安全的处理的方法。本发明的方法中，在吐泻物或粪尿被排泄而存在于地板、床等设施或物品表面的情况下，即，疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质存在于地板、床等设施或物品表面的情况下，在所述设施或物品表面的至少一部分或全部上覆盖透水性和/或保水性片。优选将存在于所述表面上的所述物质的至少一部分擦去，在擦去所述物质后的设施或物品表面覆盖所述片。接着，将所述组合物供给到所述片上，使所述组合物与片下的所述表面接触，接触后放置规定时间。规定时间例如可以为1～10分钟、优选3～5分钟。通过放置上述规定时间，在存在于设施或物品表面的物质中存在杯状病毒的情况下，不论是否有蛋白质共存均能灭活杯状病毒。所述组合物的供给量可根据存在于地板、床等设施或物品表面的、疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质的量而适当决定。如后述的实施例所示，所述组合物根据其组成，在组合物被供给于所述含有蛋白质的物质的状态(混杂存在状态)下，当蛋白质的量为40mg/ml以下时，能发挥杯状病毒灭活效果。因此，所述组合物的供给量可考虑该点而适当决定，当疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质的量较多时，可供给与其相应的量的所述组合物。相对于1体积的疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质，所述组合物的供给量(体积比)可为例如0.5～100的范围、优选1～20的范围。也可以不覆盖上述片而将上述组合物供给至存在于设施或物品表面的、疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质，并使二者接触。但是，由于疑似存在杯状病毒，为防止飞散，优选覆盖上述片。并且，通过覆盖片且进行上述接触，还具有能够抑制组合物中所含的乙醇蒸发从而使灭活效果持续较长时间的效果。从保持较多量的组合物以获得对杯状病毒的较高灭活效果的观点出发，优选覆盖用的片具有较高的液体保持力。作为这样的液体保持力高的片，可以举出吸水性片(内含吸水性树脂的片)、无纺布等。
擦去所述物质后的设施或物品表面上覆盖的所述片也可以预先含有所述组合物。此外，擦去所述表面上存在的所述物质的至少一部分时所使用的物品例如无纺布等中，可以预先含有所述组合物。使所述片等中含有(向所述片等供给)所述组合物，可以在即将使用前使其含有，也可以预先使片等中含有所述组合物并将其以密闭状态保存在密闭容器(例如袋)中。
接触时将上述组合物供给至上述片的方法没有特别限制，例如，可以注入组合物或进行喷雾。
本发明的方法中，还可以对上述方法处置后的设施或物品的表面进一步喷雾上述组合物，以彻底灭活杯状病毒。
本发明的组合物对杯状病毒中的诺如病毒的灭活有效。
本发明方法的具体方法的一个示例如下所述。
在处理飞散在地板等上的患者吐泻物、粪便时，适当的方式是穿戴一次性的罩衣(围裙)、口罩和手套，用纸巾等轻轻擦去粪便、吐泻物以避免污物中的病毒飞散。擦去后，用片覆盖地板，向覆盖后的片上供给所述组合物，对片下的地板进行消毒。另外，优选的是：为保险起见，对未用片覆盖的地板也喷雾所述组合物等，对可能飞散的飞沫也进行处理。或者也可以在擦去后不用片覆盖，而是进一步擦拭地板以使所述组合物浸入。不使用片的方法适合于飞散的吐泻物等量少的情况。进行上述处理后，也可以根据需要用水擦拭。
此外，上述组合物不仅能够用于含有蛋白质的疑似存在杯状病毒的物质，而且能够用于灭活例如餐具类、食品用机械、食品用设备、手套、手指等的皮肤、餐桌、菜板、抹布等上附着的病毒。为了灭活餐具类、食品用机械器具的病毒，将其浸渍后使用是有效的。无法浸渍的情况下，也可以对这些物品进行喷雾然后使用。无法浸渍、喷雾的情况下，也可以在擦尘器(ダスタ一)中渗入本发明的组合物，将对象表面进行擦拭后使用。这种情况下，优选酸、乙醇的浓度较高。
[实施例]
以下基于实施例进一步详细说明本发明。
例1(参考例)对猫杯状病毒的感染性灭活效果试验(乙醇浓度依赖性)
用M/100磷酸缓冲液pH7.2(以下简称PBS)将99.5％的特级乙醇试剂稀释成以W/W％计为80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％，从而制备样品，通过以下所示的试验方法测定样品的消毒效果(病毒灭活效果)。结果如表1所示。
试验方法
1)作为用于测定样品的消毒效果(病毒灭活效果)所使用的病毒，使用猫杯状病毒F9株。
2)使用样品1和样品2的原液以及2倍稀释液(用M/100磷酸盐缓冲液pH7.2即PBS稀释)。未获得消毒效果的终点时，将样品进一步进行稀释。
3)在各个样品液900μl中加入100μl病毒液，在室温下作用1分钟和30分钟。
反应后采集100μl，加入到含有大量蛋白质的日水制药公司制造的肉汤液(肉浸膏5mg、蛋白胨15mg/ml)900μl中。使用日水制药公司制造的肉汤是为了抑制作用后试验样品的消毒效果的持续。
4)对于所用病毒的病毒对照组，用肉汤液代替消毒剂样品进行稀释并测定感染滴度。
5)对于用肉汤液稀释至10倍的病毒液，用肉汤液进一步稀释至10-1～10-4(连续稀释液)。
6)用抽吸器除去在6孔板上培养了4天的CrFK细胞的细胞增殖用培养基(含10％胎牛血清的MEM培养基)，对于各连续稀释的病毒液，使用3孔细胞，在其中各接种100μl各连续稀释的病毒液。
7)在培养箱内进行1小时病毒吸附后，每孔中加入3ml不含胎牛血清的组织培养液(将MEM培养基(含Earle’s盐的改良MEMEAGLE)(MIP Biomedicals公司)用碳酸氢钠调节至pH7.1)，然后将培养基除去，从而洗涤细胞。(以除去检查样品对细胞的毒性)
8)在孔板的每个孔中加入3ml含有0.7％琼脂的MEM琼脂培养基(含有0.03％L-谷氨酰胺、0.22％碳酸氢钠)(40℃)，待琼脂培养基固化后将6孔板翻转并用5％CO2培养箱培养72小时。
9)培养结束后，在6孔板的每个孔中加入1.5ml的10％福尔马林PBS液，在室温下放置1小时将细胞固定，然后用流水除去琼脂培养基，并进行亚甲蓝染色。通过该方法，能够用空斑计数病毒数。
10)通过将未加入消毒剂样品的病毒的感染滴度与加入有消毒剂的病毒的感染滴度进行比较来评价消毒效果。
表1
试验结果1
Figure BPA00001350226700111
总结：由上述结果可知，单独使用乙醇时对于灭活猫杯状病毒是无效的。
例2(参考例)对猫杯状病毒的感染性灭活效果试验(含乙醇液的pH依赖性)1
制备具有表2所示的组成的样品，按照例1所述的试验方法测定样品的消毒效果(病毒灭活效果)。结果如表3所示。
表2
样品1和2的组成(％W/W)
  样品1   样品2
  乙醇   50.0   68.0
  甘油脂肪酸酯※   2.0   5.0
  乳酸   -   10.0
  聚赖氨酸   2.0   -
  水   46.0   17.0
※甘油脂肪酸酯：甘油(单)癸酸酯
表3
试验结果2
总结：可知，显示碱性的样品1未确认到对猫杯状病毒的消毒效果；显示酸性的样品2确认到消毒效果，作用时间为1分钟时即可达到检测限以下，即使在稀释至2倍的情况下，病毒的感染滴度也降低至万分之一。
例3(参考例)对猫杯状病毒的感染性灭活效果试验(含乙醇液的pH依赖性)2
在表4所述的样品中加入等量的猫杯状病毒原液，在室温下反应1分钟后，用5倍浓度的肉汤液(蛋白质的量80mg/ml)稀释至10倍，以使细胞毒性消失。进而在进行10倍连续稀释而稀释至10-6的样品的稀释系列中，使用MEM作为稀释液。将各稀释液各100μl接种在6孔板的3个孔中的已铺满的培养了3天的猫肝脏细胞(CrFK)中，进行90分钟病毒吸附后，覆盖含0.7％琼脂的MEM培养基。在34℃、5％CO2的培养箱中培养50小时。使用10％福尔马林固定数小时后，除去琼脂培养基，加入亚甲蓝染色液，对染色后的空斑数进行计数。结果如表5所示。
表4
Figure BPA00001350226700131
※组成中的％表示％(W/W)。
※次氯酸钠为纯正化学株式会社制造，有效氯浓度的测定值为5.6％。
※猫杯状病毒：F9株
※关于样品1～4的乙醇浓度、样品1～8的柠檬酸浓度和样品9～13的次氯酸钠浓度，由于与病毒等量混合后被稀释至2倍，因此浓度均变为1/2。
表5
试验结果3
Figure BPA00001350226700141
总结
1.关于柠檬酸和乙醇的混合制剂，柠檬酸从5％至1.25％均确认到对猫杯状病毒具有优良的病毒灭活效果，但0.625％的柠檬酸的情况下效果减小。
2.另一方面，在不含乙醇而仅为柠檬酸的组中，即使是5％也没有效果。
3.与例1的结果综合，可知：各物质单独使用时没有效果，但通过混合则发挥出效果。
4.为了完全灭活病毒，次氯酸钠的最终浓度需要为200ppm。
例4(实施例)对蛋白质共存下的猫杯状病毒的感染性灭活效果1
制备表6所示的样品，按照例3所述的方法测定消毒效果(病毒灭活效果)。其中，猫杯状病毒液使用了蛋白质的量不同的含有普通肉汤的病毒液和不含普通肉汤而仅含有MEM培养基的病毒液。作为比较，对次氯酸钠也进行了同样的试验。
肉汤使用的是5倍浓度的极东制药工业公司制造的普通肉汤(蛋白质的量85mg/ml)。由于肉汤与病毒等量混合，因此蛋白质的量为42.5mg/ml，由于又将样品和病毒液等量混合，因此最终蛋白质浓度为21.5mg/ml。反应时间为室温下1分钟。
表6
试验结果4
Figure BPA00001350226700151
样品( )内为与病毒液合并时的最终浓度
总结
1.通过在猫杯状病毒中加入肉汤蛋白质，确认到消毒效果减小。
2.柠檬酸5％+乙醇的情况下，即使在蛋白质共存下，消毒效果也不减小。
3.单独使用5％乳酸的情况下，未确认到病毒灭活效果，但通过加入乙醇确认到效果。
4.次氯酸钠即使为较高浓度(最终浓度800ppm)，在蛋白质共存下，消毒效果也消失。
5.自然界的病毒在任何情况下都是与蛋白质混杂存在的，因此，柠檬酸5％+乙醇所具有的使蛋白质混杂存在下的病毒灭活的效果是非常有用的。
例5(实施例)对蛋白质共存下的猫杯状病毒的感染性灭活效果2
研究猫杯状病毒中混杂存在的蛋白质的量与灭活效果的相关性。制备表7所示的样品，按照例3所述的方法测定消毒效果(病毒灭活效果)。其中，猫杯状病毒液使用了蛋白质的量不同的含有普通肉汤的病毒液和不含普通肉汤而仅含有MEM培养基的病毒液。作为比较，对次氯酸钠也进行了同样的试验。
其中，猫杯状病毒液使用加入5倍浓度的普通肉汤(85mg/ml)而使蛋白质的量为40mg/ml、10mg/ml、8mg/ml的病毒液。对于蛋白质的量为0mg/ml的病毒液，使用MEM(不含蛋白质的组织培养液)进行了替代。样品和病毒液等量混合后在室温下反应60秒钟。
表7
试验结果5
Figure BPA00001350226700171
※和( )内的数字表示与病毒液混合时的最终制剂浓度或蛋白质浓度。
总结
1.柠檬酸5％(2.5％)+乙醇使含有20mg/ml的蛋白质的病毒完全灭活。
2.柠檬酸2.5％(1.25％)+乙醇使含有10mg/ml的蛋白质的病毒完全灭活。
3.柠檬酸1.25％(0.625％)+乙醇虽然将含有4mg/ml的蛋白质的病毒灭活至103，但未能完全灭活。
4.次氯酸钠1600ppm(800ppm)使含有4mg/ml的蛋白质的病毒完全灭活，但未能灭活含有10mg/ml、20mg/ml的蛋白质的病毒。
5.次氯酸钠800ppm(400ppm)、次氯酸钠400ppm(200ppm)连含有4mg/ml的蛋白质的病毒也未能灭活。
例6(实施例)对蛋白质共存下的猫杯状病毒的感染性灭活效果3
制备表8所示的样品，按照例3所述的方法测定消毒效果(病毒灭活效果)。其中，猫杯状病毒液使用了蛋白质的量不同的含有普通肉汤的病毒液和不含普通肉汤而仅含有MEM培养基的病毒液。作为比较，对次氯酸钠也进行了同样的试验。其中，在猫杯状病毒中加入10倍浓度的普通肉汤(170mg/ml)而制备含有80mg/ml、40mg/ml、或20mg/ml蛋白质的病毒液，并使用这些病毒液。对于蛋白质的量为0mg/ml的病毒液，使用MEM(不含蛋白质的组织培养液)进行了替代。在浓度不同的柠檬酸、乙醇、次氯酸钠溶液中，加入等量的蛋白质的量不同的猫杯状病毒液，在室温下反应60秒钟。
表8
试验结果6
Figure BPA00001350226700181
NT表示Non Test(未试验)。
※和( )内的数字为与病毒液混合时的最终制剂浓度或蛋白质浓度
总结
1.柠檬酸5％(2.5％)+乙醇在最终浓度40mg/ml的蛋白质共存下使病毒完全灭活。
2.柠檬酸2.5％(1.25％)+乙醇在最终浓度10mg/ml的蛋白质共存下显示出减少了约106的感染性。
3.次氯酸钠3200ppm(1600ppm)在10mg/ml的蛋白质共存下使病毒完全灭活，但随着蛋白质浓度变高，病毒的灭活效果急剧减小。
4.可以判断：次氯酸钠为1600ppm(800ppm)以下的浓度时，在蛋白质共存下，病毒灭活作用消失。
例7(参考例)对诺如病毒的效果
通过RT-PCR法评价抗诺如病毒的灭活效果。试验样品的组成为乙醇68％、乳酸10％、水22％，试验材料使用粪便来源的诺如病毒(属于NV基因Ⅱ类)。
在诺如病毒悬浮液100μL中添加试验样品400μL，用涡流混合器搅拌，30分钟后抽提RNA。将RNA抽提物用DNA酶处理后，进行RT-PCR(逆转录+聚合酶链反应)，进而通过PCR法扩增。将扩增产物供于2.5％琼脂糖凝胶电泳，并拍摄电泳照片。对试验样品进行2次同样的操作。
作为比较，对下述样品也进行同样的操作：(1)诺如病毒悬浮液500μL、(2)在诺如病毒悬浮液100μL中添加消毒用乙醇400μL而得到的样品、(3)在诺如病毒悬浮液100μL中添加次氯酸钠溶液(200ppm)400μL而得到的样品。
其结果是，试验样品和使用次氯酸钠溶液的体系没有观测到诺如病毒的条带(344bp)，仅为诺如病毒悬浮液和使用消毒用乙醇的体系观测到诺如病毒的条带(344bp)。
例8(实施例)
材料
1.病毒：猫杯状病毒F9株
2.细胞：CrFK细胞
3.肉汤液：10倍浓度160mg/ml
4.病毒稀释液：MEM培养基(FCS-)
表9
  单位％(w/w)   样品1   样品2   样品3   样品4
  乙醇   57   70   55   55
  柠檬酸   2.5   0.65   1.5   1.5
  柠檬酸钠   0.35   0.05   0.05
  乳酸   -   1   1
  甘油脂肪酸酯   -   0.22   0.22
  五甘油单月桂酸酯   -   0.03   0.03
  十甘油单月桂酸酯   -   -   0.05
  甘油   1   -   -
  1，8-桉树脑   0.085   -   -
  水   余量   余量   余量   余量
  pH   3.2   5.0   3.2   3.2
样品5：次氯酸钠1600ppm水溶液
方法：
1.将100μl表9所示的样品分别与100μl含有80mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、0mg/ml的蛋白质的猫杯状病毒原液等量混合，在室温下反应60秒钟。
2.反应后立即将样品-病毒混合液100μl加入到80mg/ml浓度的肉汤液900μl中，终止反应。将其用MEM培养基从10-2至10-5进行10倍连续稀释。
3.在培养第3天的6孔板中，接种100μl进行了10倍连续稀释后的病毒-样品液，进行90分钟的病毒吸附操作后，用0.7％琼脂培养基覆盖，在5％CO2培养箱内于34℃下培养60小时。
4.培养结束后，用10％福尔马林固定，通过亚甲蓝染色对形成的空斑数进行计数，判断感染滴度。
5.对于病毒对照，使用MEM代替样品，并按照与样品相同的方法进行。
结果如表10所示。
表10
Figure BPA00001350226700211
总结
1.对于样品1，确认到病毒灭活效果，即使在10mg/ml的蛋白质共存下，也使病毒感染性完全灭活。
2.对于样品2，没有确认到病毒灭活。但是，如后述的例11所示，样品2的组成下，当相对于病毒液量增加使用量时，能够确认到病毒灭活。
3.对于样品3和4，确认到病毒灭活效果，但效果不及样品1。
例9(实施例)
材料
1.病毒：猫杯状病毒F9株
2.细胞：CrFK细胞
3.肉汤液：10倍浓度160mg/ml
4.病毒稀释液：MEM培养基(FCS-)
表11
  单位％(w/w)   样品1   样品2   样品3   样品4   样品5   样品6   样品7
  乙醇   55   55   55   55   55   55   55
  柠檬酸   2.5   2.5   2.5   2.5   2.5   2.5   -
  柠檬酸钠   0.08   0.08   0.09   0.1   0.11   0.11   -
  乳酸   -   -   0.5   1   1.5   1.5   2.5
  乳酸钠   -   -   -   -   -   -   0.015
  甘油单癸酸酯   0.22   -   0.22   0.22   0.22   -   0.22
  五甘油单月桂酸酯   0.03   -   0.03   0.03   0.03   -   0.03
  水   余量   余量   余量   余量   余量   余量   余量
  pH   3.2   3.2   3.2   3.2   3.2   3.2   3.2
方法：
1.将100μl表11所示的样品分别与100μl含有20mg/ml、10mg/ml、0mg/ml的蛋白质的猫杯状病毒原液等量混合，在室温下反应60秒钟。
2.反应后立即将样品-病毒混合液100μl加入到80mg/ml浓度的肉汤液900μl中，终止反应。将其用MEM培养基从10-2至10-5进行10倍连续稀释。
3.在培养第3天的6孔板中，接种100μl进行10倍连续稀释后的病毒-样品液，进行90分钟的病毒吸附操作后，用0.7％琼脂培养基覆盖，在5％CO2培养箱内于34℃下培养60小时。
4.培养结束后用10％福尔马林固定，通过亚甲蓝染色对形成的空斑数进行计数，判断感染滴度。
5.对于病毒对照，使用MEM代替样品，并按照与样品相同的方法进行。
表12
总结
1.对于样品1～6，确认到病毒灭活效果，即使在20mg/ml的蛋白质共存下，也使病毒感染性完全灭活。
2.对于样品7，虽然对于含有20mg/ml蛋白质的病毒液中的病毒灭活效果的结果差，但对于含有浓度低于10mg/ml的蛋白质的病毒液中的病毒确认到灭活效果。
例10(实施例)
材料
病毒：猫杯状病毒F9株
普通肉汤10倍浓度：160mg/ml
次氯酸钠：有效氯浓度4％
表13
  单位％(w/w)   1   2   3   4   5   6   7   8
  乙醇   55   55   55   55   55   55   70   70
  柠檬酸   2.5   2.5   2.5   2   2   1.5   2.5   2.5
  柠檬酸钠   0.08   0.1   0.11   0.065   0.1   0.11   0.06   0.25
  乳酸   -   1   1.5   1   1.5   1.5   -   -
  甘油单癸酸酯   0.22   0.22   0.22   0.22   0.22   0.22   -   -
  五甘油单月桂酸酯   0.03   0.03   0.03   0.03   0.03   0.03   -   -
  甘油   -   -   -   -   -   -   1   1
  药典桉树油   -   -   -   -   -   -   0.12   0.12
  水   余量   余量   余量   余量   余量   余量   余量   余量
  pH   3.2   3.2   3.2   3.2   3.2   3.2   3.5   4.0
方法
1.在加入到表13所示的样品中的猫杯状病毒中加入普通肉汤，从而准备最终蛋白质浓度调节为80mg/ml、40mg/ml、20mg/ml、0mg/ml的4种不同蛋白质浓度的病毒液。
2.对每个样品，均使用蛋白质浓度不同的病毒来测定病毒灭活活性。
3.将100μl样品与100μl病毒等量混合，用涡流混合器在室温25℃下搅拌60秒钟后，取100μl加入至900μl的蛋白质浓度80mg/ml的肉汤液中，稀释至10倍。使用这样的高浓度的肉汤液是为了终止样品的作用和使消毒剂对空斑形成中使用的CrFK细胞的细胞毒性消失。
4.使用MEM从10-2稀释至10-5；在6孔板中将各稀释液进行1倍稀释，在每2个孔中各接种100μl。
5.对于对照病毒组，在含各浓度的蛋白质的病毒中加入等量的MEM。
6.进行90分钟病毒对细胞的吸附，覆盖琼脂培养基，在34℃下培养60小时。
7.对于培养后的板上所形成的空斑，用福尔马林固定后，进行亚甲蓝染色，通过空斑数计算感染滴度。
表14
Figure BPA00001350226700241
※NT：未试验
总结
可以认为：关于在蛋白质共存下灭活病毒的作用，样品3最为优良。
例11(实施例)
材料
1.病毒：猫杯状病毒F9株
2.细胞：CrFK细胞
3.肉汤液：10倍浓度160mg/ml
4.病毒稀释液：MEM培养基(FCS-)
表15
  单位％(w/w)   A   B   C   D   E   F   G
  乙醇   55   55   55   55   55   57.2   57.2
  柠檬酸   1.5   -   -   1.5   1.5   2.5   2.5
  柠檬酸钠   0.11   -   -   0.5   0.7   0.08   0.08
  乳酸   1.5   -   -   1.5   1.5   -   -
  乳酸钠   -   -   -   -   0.7   -   -
  磷酸   -   2.13   -   -   -   -   -
  植酸   -   -   0.5   -   -   -   -
  磷酸钠   -   0.47   0.075   -   -   -   -
  甘油单癸酸酯   0.22   0.22   0.22   0.22   0.22   -   -
  五甘油单月桂酸酯   0.03   0.03   0.03   0.03   0.03   -   -
  水   余量   余量   余量   余量   余量   余量   余量
  pH   3.2   3.2   2.6   4.0   5.0   3.2   3.2
方法
1.将100μl表15所示的样品分别与100μl含有80mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、0mg/ml的蛋白质的猫杯状病毒原液等量混合，在室温下反应60秒钟。
2.反应后立即将样品-病毒混合液100μl加入到80mg/ml浓度的肉汤液900μl中，终止反应。将其用MEM培养基从10-2至10-5进行10倍连续稀释。
3.在培养第3天的6孔板中，接种100μl进行10倍连续稀释后的病毒-样品液，进行90分钟的病毒吸附操作后，用0.7％琼脂培养基覆盖，在5％CO2培养箱内于34℃下培养60小时。
4.培养结束后用10％福尔马林固定，通过亚甲蓝染色对形成的空斑数进行计数，判断感染滴度。
5.对于病毒对照，使用MEM代替样品，并按照与样品相同的方法进行。
表16
总结
1.在病毒∶药剂＝1∶1的体系中，样品B、F、G即使在最终存在10mg/ml蛋白质的情况下也确认到病毒灭活效果。
2.样品A、C虽然也确认到病毒灭活效果，但效果不及B、F、G。
3.在病毒∶药剂＝1∶9的体系中，样品A～D即使在最终存在16mg/ml浓度的蛋白质的情况下也确认到病毒灭活效果。
4.样品E也确认到病毒灭活效果，但效果不及A～D。
产业实用性
本发明在使杯状病毒、特别是诺如病毒失活的相关药品的制造和公共卫生领域中有用。

Claims (14)

1.一种使蛋白质共存下的杯状病毒灭活的方法，其中，包括：使疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质与包含含有乙醇和酸作为有效成分、pH在2.5～5.0的范围内的水溶液的组合物接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质存在于设施或物品表面，
所述方法包括下述步骤：
在所述设施或物品表面的至少一部分或全部上覆盖透水性和/或保水性片的步骤；
将所述组合物供给到所述片上，使所述组合物与片下的所述表面接触的步骤；和
在接触后放置规定时间的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其中，将所述表面上存在的所述物质的至少一部分擦去，在擦去所述物质后的设施或物品表面覆盖所述片。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中，所述片预先含有所述组合物。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质是吐泻物或粪尿。
6.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质是杯状病毒感染者的吐泻物或粪尿。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述组合物中的乙醇的浓度为40～85％(w/w)的范围。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述酸为有机酸或无机酸。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述酸的浓度为1～10％的范围。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述酸是在1～10％的浓度下使所述水溶液显示2.5～5.0的范围的pH的酸。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述酸为柠檬酸、乳酸或磷酸。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述组合物还含有聚甘油脂肪酸酯。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述杯状病毒为诺如病毒。
14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，相对于1体积的所述疑似存在杯状病毒且含有蛋白质的物质，以体积比计，所述组合物的供给量为0.5～100的范围。
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