JP6688597B2

JP6688597B2 - ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を消失させる方法

Info

Publication number: JP6688597B2
Application number: JP2015217969A
Authority: JP
Inventors: 絵美佐々木; 陽介浦賀
Original assignee: Mitsubishi Corp Life Sciences Ltd
Current assignee: Mitsubishi Corp Life Sciences Ltd
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2035-10-20
Also published as: JP2017077232A

Description

本発明は、ノンエンベロープウイルスの不活化に関する。

厚生労働省によると、冬の急性胃腸炎患者の１０分の１はノロウイルス感染によるとされている。ノロウイルスの感染経路はほとんどが経口であり、食品取扱者や調理器具からの二次汚染を防止するとの観点で、これらの表面に存在するノロウイルスの失活化または不活化が重要である。
厚生労働省によると、ノロウイルスの失活化には消毒用エタノールや逆性石鹸は効果がなく、次亜塩素酸ナトリウム水溶液がノロウイルス失活化に効果があるとされる。

しかし、次亜塩素酸ナトリウム水溶液は特有の臭気が強く、皮膚に付着して肌荒れを起こす、衣服や絨毯を脱色してしまう等の問題点が存在する。また、酸と混合すると塩素ガスを発生し、中毒症状を起こすこともあり、危険な場合もある。
一方、エタノールは酒類等の食品に含まれる成分のため安全性が高いが、上記のように単独ではノロウイルスをはじめとするエンベロープを持たないウイルス、すなわちノンエンベロープウイルスを不活化する効果は期待できない。

本発明者らはこれまでに、エタノール、リン酸、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステルを含み、かつｐＨが２．５〜５．０の範囲にある水溶液からなる組成物によるカリシウイルス不活化方法を開示している（特許文献１参照）。この発明は、エタノールを酸性に調整することで抗カリシウイルス活性が向上することを見出してなされたものであり、タンパク質存在下でもカリシウイルスを不活化できることに特長がある。
また、リン酸以外の成分を用いるものとして、エタノールまたはイソプロピルアルコール、乳酸、クエン酸および亜鉛含有化合物を含有する消毒剤が開示されている（特許文献２参照）。

しかし、このようなエタノール製剤では、効果の強化を狙って有効成分の濃度を高くしすぎると、器具等への使用後に有効成分による金属腐食、べたつき、白残り等が生じることがあり、抗ウイルス効果とこれらの好ましくない事象の発生可能性とのバランスをとることが難しくなる。
このため、バランスよくノンエンベロープウイルスを不活化できる方法が求められている。

特許第５５４２６８２号公報特許第４１６３２４９号公報

本発明の課題は、使用後に固形分の残存によるべたつき、白残り等の好ましくない事象が発生する可能性を抑えた条件で、ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡを消失させる方法、すなわちノンエンベロープウイルスを死滅させる方法、または該方法に用い得るエタノール製剤を提供することにある。

本発明者らは、エタノール製剤中の特定の有効成分の含有量および含有比率等を特定の条件とした場合、ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡが顕著なレベルで消失することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）または（２）に関する。

（１）各有効成分の含有量およびｐＨが以下（ａ）〜（ｅ）であるエタノール製剤をノンエンベロープウイルスと接触させることを特徴とする、ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を消失させる方法。
（ａ）乳酸またはその塩の含有量が、乳酸として１．０〜１．８重量％である
（ｂ）クエン酸またはその塩の含有量が、クエン酸として０．２〜０．５重量％である
（ｃ）乳酸またはその塩とクエン酸またはその塩の重量比が、乳酸とクエン酸として４：１である
（ｄ）ｐＨが、ｐＨ３〜４である
（ｅ）エタノール濃度が、６５重量％以上、７５重量％未満である

（２）エタノール製剤が、さらにポリグリセリン脂肪酸エステルを含有するエタノール製剤である、上記（１）の方法。

本発明により、使用後に固形分の残存によるべたつき、白残り等が発生しにくい条件で、ノンエンベロープウイルスの確実な不活化につながる遺伝情報の消失方法および該方法に用い得るエタノール製剤を提供することができる。係る方法は、糞便等の有機物（タンパク質を含む）存在下においても効果を奏するものである。

本発明に用いられるエタノール製剤（以下、本発明のエタノール製剤ともいう）は、各有効成分の含有量およびｐＨが以下の（ａ）〜（ｅ）であるエタノール含有組成物である。
（ａ）乳酸またはその塩の含有量が、乳酸として１．０〜１．８重量％である
（ｂ）クエン酸またはその塩の含有量が、クエン酸として０．２〜０．５重量％である
（ｃ）乳酸またはその塩とクエン酸またはその塩の重量比が、乳酸とクエン酸として４：１である
（ｄ）ｐＨが、ｐＨ３〜４である
（ｅ）エタノール濃度が、６５重量％以上、７５重量％未満である

本発明のエタノール製剤における乳酸またはその塩およびクエン酸またはその塩の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等があげられる。
本発明のエタノール製剤の調製において乳酸およびクエン酸は、その一部に塩を用いることにより、緩衝作用が働いてｐＨの調整が容易になる場合もある。
本発明のエタノール製剤における乳酸またはその塩およびクエン酸またはその塩の含有量は、それぞれ乳酸およびクエン酸として４：１であれば上記数値範囲のいずれの濃度でもよい。

本発明のエタノール製剤のｐＨはｐＨ３〜４のいずれでもよいが、金属への使用の際の腐食をできるだけ抑えることと薬効の強さとのバランスを考慮し、ｐＨ３．４〜３．７であることが好ましい。
本発明のエタノール製剤におけるエタノール濃度は６５重量％以上７５重量％未満のいずれでもよいが、薬効の強さから６８〜７２重量％であることが好ましく、６８〜７０重量％であることがより好ましい。

有効成分の含有量およびｐＨが上記条件を満たすエタノール製剤は、ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を消失させるに十分な活性を奏する。したがって、本発明のエタノール製剤は、有効成分との塩の形成により溶解性を悪くする恐れがある亜鉛含有化合物等の他の有効成分を含有する必要は特にない。しかし、本発明のエタノール製剤の薬効が妨げられない限り、必要に応じてポリグリセリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ヒアルロン酸、グリセリン等の保湿剤や色素、香料等を含有してもよい。特にポリグリセリン脂肪酸エステルは、これを含有することにより、エタノール製剤の表面張力が低下し、接触面積が広くなる。また、細かい隙間にも浸透しやすくなるため、本発明のエタノール製剤の薬効が高まることが期待できる。

ポリグリセリン脂肪酸エステルの好適な例としては、ラウリン酸テトラグリセリル、ラウリン酸ペンタグリセリル、ラウリン酸ヘキサグリセリル等を挙げることができる。
ポリグリセリン脂肪酸エステルの含有量は本発明のエタノール製剤の薬効を妨げない限り限定されないが、通常０．０１〜０．１重量％である。

本発明のエタノール製剤は、例えば乳酸またはその塩およびクエン酸またはその塩、および必要に応じてポリグリセリン脂肪酸エステル等を上記濃度となるようにエタノール水に溶解させ、エタノール濃度およびｐＨを上記濃度となるように、酸やアルカリにより調整することにより調製することができるが、各工程の順はこれに限られない。

本発明のエタノール製剤によりノンエンベロープウイルスの遺伝情報を消失させる方法としては、該エタノール製剤とノンエンベロープウイルスとを１分間以上、好ましくは３分間以上、より好ましくは５分間以上接触させる方法があげられる。これらを接触させる方法は、該エタノール製剤をノンエンベロープウイルスの存在が疑われる物に噴霧、塗布、混合させる等、いずれの方法であってもよい。ノンエンベロープウイルスの存在が疑われる物は、固体、液体、気体のいずれであってもよいが、固体である場合、通常の製剤では使用後に固形分の残存によるべたつき、白残り等の好ましくない事象の発生する可能性があるため、本エタノール製剤がその長所を発揮でき、好ましい。固体としては、食器類や食品用機械器具等が好ましくあげられる。

ノンエンベロープウイルスの存在が疑われる物が食器類や食品用機械器具である場合は、これらを本発明のエタノール製剤に浸漬することが有効である。浸漬できない場合はこれらの物へ噴霧して使用することもできる。浸漬も噴霧もできない場合は、ダスター等に本発明の組成物を染み込ませて、対象表面を拭き取って使用することもできる。
本発明の方法を実施した後にノンエンベロープウイルスの遺伝情報が消失していることは、ＰＣＲ法等のＤＮＡまたはＲＮＡの存在を検出できる方法により確認することができる。

上記のとおり、本発明のエタノール製剤は、抗ノンエンベロープウイルス用のエタノール製剤として好適に用いることができる。
本発明におけるノンエンベロープウイルスとしては、ＲＮＡを遺伝情報の担体とするノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）等のカリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）等のレオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）等のピコナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科等に属するＲＮＡウイルス、およびＤＮＡを遺伝情報の担体とするアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属するＤＮＡウイルスがあげられるが、ＲＮＡウイルスが好ましくあげられる。
以下に本発明の実施例をあげるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

ＧＩＩ／４型ノロウイルスに感染した患者の便（Ａ〜Ｃ）を採取した。
便Ａよりタンパク質等を除去し、ウイルス液Ａ（ＰＥＧ濃縮液）を調製した。
また、便ＢおよびＣを、それぞれ蒸留水で１０倍希釈し、ウイルス液Ｂ−１、Ｂ−２、およびＣを調製した。なお、ウイルス液Ｂ−１およびＢ−２は、同一の便材料の異なる箇所から採集したものであるため、このような表記としている。
各ウイルス液中のウイルス粒子数は、いずれも約１０^７個／ｍｌである。
一方、表１記載の組成のエタノール製剤（実施例１〜３および比較例１〜３）を調製した。

調製したウイルス液２０μｌとエタノール製剤１８０μｌとを混合し１０分間室温で静置後、２００μｌの普通ブイヨンを加えてエタノール製剤の作用を停止させた。
この溶液をウイルスのエタノール製剤による処理液として、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＶｉｒａｌＲＮＡキット（東洋紡社製）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡと逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ：東洋紡社製）とを４２℃で６０分間反応させてｃＤＮＡを調製した（変性温度９９℃ ５分間）。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ヒトノロウイルス検出用のプライマーとして周知であるＧ２−ＳＫＦプライマーおよびＧ２−ＳＫＲプライマーを用い、リアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）でリアルタイムＰＣＲを行ってウイルスのエタノール製剤による処理液中のＲＮＡのコピー数を算出した。

また、ウイルス液をエタノール製剤で処理する代わりに、次亜塩素酸ナトリウム溶液を終濃度５４，０００ｐｐｍとなるようにウイルス液（Ａ〜Ｃ）に添加して処理する以外は同様の操作を行い、ウイルスの次亜塩素酸ナトリウムによる処理液中のＲＮＡのコピー数を算出した。
予め測定しておいた薬剤処理する前のウイルス液中のＲＮＡのコピー数と、薬剤処理した後のウイルス液中のＲＮＡのコピー数とから、ウイルス液中のＲＮＡの減少率を算出した。結果を表２に示す。

表２に示すとおり、本発明のエタノール製剤に該当する実施例１〜３のエタノール製剤は、タンパク等を除去したウイルス液（ウイルス液Ａ）のみならず、有機物を含有するウイルス液（ウイルス液Ｂ−１、Ｂ−２およびＣ）においても優れたＲＮＡ消失効果を示した。これに対し、本発明のエタノール製剤の条件を満たさない比較例１〜３のエタノール製剤および次亜塩素酸ナトリウムを用いて処理したウイルス液では効果にバラつきが認められた。ちなみに、エタノール製剤の代わりに、エタノール系消毒薬として広く用いられている７０重量％のエタノール水溶液で同様な処理を行ったところ、残存率は約５０％であって高い効果は得られなかった。

表３記載の組成のエタノール製剤を調製した。ｐＨはいずれもｐＨ３．２に統一した。エタノール濃度（５５％）は本発明のエタノール製剤のエタノール濃度の範囲外であるが、これはエタノール蒸散による影響を統一するためである。また、総酸量は製剤２を除きほぼ同一である。

（１）それぞれのステンレス板に各製剤を１ｍｌ噴霧し、３０℃で５日間放置した。５日間経過後、ステンレス板の腐食度合い、および薬剤中の成分による白残り、液残りの度合いを表４に示した。

表４に示したとおり、乳酸とクエン酸とを４：１で含有するエタノール製剤１では、エタノールは完全に蒸散し、成分の白残りも認められなかった。これに対して、製剤１と総酸量がほぼ同一であるが成分の量比が異なる製剤３〜６では成分の白残りや液残りが認められた。また、リン酸を含有する製剤２ではステンレス版の腐食がかなり認められた。
（２）それぞれのステンレス板に各製剤を１ｍｌ噴霧し、３０℃で６時間放置した。その後、噴霧部を紙で拭き取り、再度３０℃で２日間放置した。２日後、ステンレス板の腐食、白残り、べたつきの度合いを評価した。結果を表５に示す。

表５に示すとおり、乳酸とクエン酸とを４：１で含有するエタノール製剤１では、成分の白残りやべたつきが認められなかった。これに対して、製剤１と総酸量がほぼ同一であるが成分の量比が異なる製剤３〜６では成分の白残りやべたつきが認められた。また、リン酸を含有する製剤２ではステンレス版の腐食がかなり認められた。

本発明により、使用後に固形分の残存によるべたつき、白残り等が発生しにくい条件で、ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を消失させる方法および該方法に用い得るエタノール製剤を提供することができる。ノンエンベロープウイルスの遺伝情報の消失は該ウイルスの確実な不活化にとって重要である。係る方法は、糞便等の有機物（タンパク質を含む）存在下においても効果を奏するものであり、実用性が高い。

Claims

各有効成分の含有量およびｐＨが以下（ａ）〜（ｅ）であるエタノール製剤をノンエンベロープウイルスと接触させることを特徴とする、ノンエンベロープウイルスの遺伝情報を消失させる方法。
（ａ）乳酸またはその塩の含有量が、乳酸として１．０〜１．８重量％である
（ｂ）クエン酸またはその塩の含有量が、クエン酸として０．２〜０．５重量％である
（ｃ）乳酸またはその塩とクエン酸またはその塩の重量比が、乳酸とクエン酸として４：１である
（ｄ）ｐＨが、ｐＨ３〜４である
（ｅ）エタノール濃度が、６５重量％以上、７５重量％未満である
エタノール製剤が、さらにポリグリセリン脂肪酸エステルを含有するエタノール製剤である、請求項１記載の方法。