CN102124028A - 对甲型流感病毒h1亚型具有同亚型交叉中和性能的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
描述了针对甲型流感病毒的单克隆抗体,其能够结合表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒的人类分离株和动物分离株。优选的实施方案是命名为Fab49的抗体,其显示出针对多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株(包括动物源性分离株)的中和活性。还介绍了针对本发明单克隆抗体的抗独特型抗体、包含本发明单克隆抗体的免疫原性或疫苗组合物、以及本发明单克隆抗体在治疗、预防和诊断方面的应用。本发明的单克隆抗体也可以被用于测试用作疫苗的抗体制剂。
Description
总的来说,本发明涉及免疫学领域。
更具体地说,本发明涉及针对甲型流感病毒(influenza virus A)H1亚型HA(血凝素)抗原的单克隆抗体,其对来自人的分离株和来自动物的分离株两者都能够识别并中和。
流感病毒能感染不同物种的动物,其中特别是若干鸟类、猪科和马科的物种。这些病毒中只有少数已经成功地适应人类,即感染人类,特别是其自身可以从人到人进行传播。允许这种适应性的主要因素与该病毒最重要的表面蛋白(血凝素)的特性相关联。尤其是,依据这种蛋白的抗原特性已鉴别出16个亚型(H1-H16),只有其中三个(H1、H2和H3)已成功地完全适应人类,是造成过去一个世纪三次流感大流行的原因。目前在人类中流通并导致季节性流感流行的有两种亚型-H1亚型和H3亚型。H1亚型(本发明的抗体所识别的目标)出现于1918年,导致了被命名为“西班牙流感”(根据报导第一个病例的欧洲国家而命名)的可怕大流行。最近的研究表明,负责“西班牙流感”的这种病毒是感染鸟类的禽流感病毒,作为少数突变的结果,该病毒发展出了能够感染人并且其自身可以从人到人进行传播的能力。1918年的分离株是在人类与其他动物(如猪)中发现的所有H1亚型病毒的共同祖先。直至1957年,每年度人类流感的流行都是由H1亚型病毒引起的,在该年,它们被具H2亚型血凝素的病毒所取代,后者造成了所谓的“亚洲”大流行。直到1977年,再也没有由H1亚型引起的病例报告,在该年,由于仍然不完全明白的原因,在俄罗斯重新出现了少量的H1分离株。因此,现在,H1亚型病毒仍在流通,并与自1967年以来在人类出现的H3亚型病毒发生关联。例如,欧洲2007-08流感季节(包括从2007年第40周至2008年第16周期间)的通告证明,30%的有效分离株与H1亚型血凝素相关(European Influenza Surveillance Scheme-Weekly Electronic Bulletin-April 28,2008)。
每年的流感病毒流行对公共健康服务和与此相关的费用造成相当大的影响。仅在美利坚合众国,据估计,每年有超过200,000人因流感病毒的症状住院,有约40,000人的死亡或多或少与此直接相关(Thompson等,JAMA,2003,289:179-186)。我们必须以指数更大的数字向这些数据添加在或长或短时期不能去工作的感染者的所有病例,以及因工作日减少而导致的不可避免的经济损失。最近的一项工作(Molinari等,Vaccine,2007,25:5086-5096)估计,与每年流感流行直接相关的医疗费用为每年10.4亿美元,对此,还必须加入另外的16.3亿美元,这是由于缺勤而导致的收入损失。如果在计算中我们再考虑其他项目,如将与感染者的死亡相联系的经济损失货币化,数量会上升到每年871亿美元的惊人数字。
目前,面对年度流感流行,在某种程度来说唯一可用的工具是含H1亚型和H3亚型病毒分离株抗原(还有乙型分离株)的灭活三价疫苗,它们可能就成为引起下一个流感季节的流行病因。基于与一些标志地理区域的早期分离相联系的流行病学数据的这种类型的预测并不总是成为正确。因此,存在不是微不足道的风险,这种风险一年又一年存在,即为某一流感季节研制的三价疫苗相反地可能是实质上无效的。
在那种情况下,以及在新的大流行的情况下,唯一可用的预防/治疗手段是求助于两类可用的抗病毒药物:M2蛋白抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(奥赛米韦和扎那米韦)。但是,在这种情况下也一样,已经可以预期一系列的问题,既涉及到需要在感染的非常早期就给予抗病毒药物,同时涉及到抗药性病毒分离株的迅速呈现(这种情况已经发生)。
另一种有效的策略可以是依赖中和抗体制剂,它们直接针对关键的病毒蛋白质并能够识别此类蛋白质在不同的流感病毒分离株中共亭的部分。
为了更好地理解基于被动给予抗体的方案的潜能,有必要简单地提及流感病毒的主要结构特征。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),其特征是具有源自受感染细胞细胞膜的包膜,在包膜上有约500个突起。这些突起由来自两种重要的病毒表面蛋白即上述的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的三聚体和四聚体组成,其也被用作甲型流感病毒的分型。在包膜表面还发现了膜内在蛋白(M2),与血凝素和神经氨酸酶相比,该蛋白的数量低得多,也以四聚体构成。
流感病毒的进一步特征是,在其核心存在由8条单链RNA片段组成的节段基因组。基于其病毒粒子中某些蛋白质(NP和M1)的特性,可识别三种已知类型的流感病毒:甲型(A型)、乙型(B型)和丙型(C型)。造成每年流行的病毒型是甲型病毒和乙型病毒。相反,丙型病毒造成不太严重的症状。
表面蛋白的作用在病毒复制周期是至关重要。具体而言,血凝素是使病毒能够识别存在于一些细胞表面的唾液酸并感染这些细胞的蛋白。相反,神经氨酸酶在病毒复制周期的末期,即在新病毒颗粒从被感染细胞释放的期间发挥作用。它的功能是促进新形成的病毒粒子的血凝素从产生病毒粒子的细胞表面存在的唾液酸上释放。这两种蛋白质发挥的关键作用以及它们在病毒表面的呈现,解释了为什么它们代表免疫应答的主要靶标,以及为什么它们易于高速率突变。事实上,引起每年流行的病毒都是或多或少与往年有所不同,因此,都能够或多或少有效地逃逸由它们刺激所产生的免疫应答。换句话说,血凝素(主要的)和神经氨酸酶(次要的)上点突变的逐步积累使由先前流行过程中产生的保护性抗体基本上逐步无效。
体液组分在抗流感免疫应答中发挥了主要的保护作用。抗体发挥其保护作用主要是通过干扰血凝素与唾液酸的结合,从而阻止病毒对细胞的感染。这样的选择压力决定了血凝素的高突变率。然而,在如此高的变异性中发现了一些不变化的氨基酸残基,预示它们在该蛋白质的功能中有重要作用。这些血凝素部分代表了交叉中和应答的潜在靶标。但是,可以预见,这些区域将无法在大多数患者中诱导有效的抗体应答,因为此类靶标在免疫沉默区域的藏匿肯定代表了对病毒非常有利的进化环节。
从预防和治疗角度考虑,提供能识别一种亚型中此类共同区域的抗体分子将是极其有用的。对有风险受治疗者给予此类抗体可能事实上代表了有用的预防手段,因为它们能够识别广谱的在进化上彼此远离的同一亚型病毒,从而能够潜在地阻止属于此种亚型的大部分病毒,包括可能出现的获得了从动物传播给人类的能力的新病毒。这种免疫类型(其在流行株表现出比前几年有很高突变率时会失效),被称为同亚型抗流感免疫(HOMOSUBTYPE ANTI-INFLUENZAIMMUNITY)。
本发明现已成功地获得具上述希望特性的单克隆抗体。
因此,本发明的第一个方面是针对甲型流感病毒的单克隆抗体,其能够结合多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒的分离株,包括人类的分离株和动物的分离株两者。
本发明的第二方面是针对甲型流感病毒的单克隆抗体,其特征是对H1亚型甲型流感病毒人类和动物分离株有中和活性。优选地,所述中和单克隆抗体识别H1亚型甲型流感病毒的血凝素(HA)抗原。
本发明的单克隆抗体优选是人抗体或人源化抗体。
当给予有风险患者时此类抗体代表了有价值的预防工具。
此外,对人类患者使用人或人源化单克隆抗体有进一步的优势,因为人抗体或人源化抗体肯定有很好的耐受性。
此外,作为对这种病毒的人类抗体应答的组份的代表,本发明的单克隆抗体构成了用于设计创新型疫苗的关键因素,与目前使用的疫苗所引起的免疫力比较,所述新疫苗能诱导对H1亚型病毒的更加有效、更具保护和更广范围的免疫力。
在下述的实验章节详细介绍了获得本发明单克隆抗体的步骤,还例证了其结合和中和性能。借助实验章节中具体描述的程序可获得的单克隆抗体是人抗体。
人源化抗体的制备可以通过任何本身已知的方法来进行,如下述文献中描述的方法:Baca等,1997,J.Biol.Chem,272:10678-84;或Carter等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci,89:4285。这些目录文献是专供说明而非限制性的。事实上,在现有技术中已知的其它制备人源化抗体的方法都可以用于本发明中。
在实验章节具体介绍了命名为INF49的一个克隆的获得,所述克隆能产生Fab片段形式的单克隆抗体,该抗体在体外能结合多种人类和动物的H1亚型甲型流感病毒分离株。
由克隆INF49生产的单克隆抗体(命名为Fab49)代表了本发明的一个优选实施方案,因为本发明人经实验证明,这些抗体显示出对多种人类和动物的H1亚型流感病毒株A分离株的中和活性。为简便起见,这种与中和人类和动物的H1亚型流感病毒株A分离株的能力相关的免疫学特性在本文下述中有时会被称为“对H1亚型的同亚型交叉中和活性”。
序列表显示了本发明的Fab49的重链可变区氨基酸序列(SEQ IDNO:1)和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。还进一步显示了它们各自的编码核苷酸序列,分别命名为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
具体而言,实验章节介绍了Fab片段形式的单克隆抗体Fab49的制备。然而,应该明白,所述单克隆抗体也可以其它形式来制备和使用,例如整个免疫球蛋白,或其它类型的抗体片段,比如F(ab′)2片段或比Fab小的抗体片段(例如,单链抗体、单域抗体),以及与Fab具有相同免疫学特性的至少有8个氨基酸长度的多肽。
可以根据Ladner等人在美国专利4,946,778中描述的方法去构建单链抗体,该专利在此引作参考。单链抗体包含由柔性接头相连的轻链和重链可变区。命名为单域抗体的抗体片段甚至比单链抗体更小,因为它仅包括一个分离的重链可变区。获得具有(至少部分)与整个抗体同样结合能力的单域抗体的技术,在现有技术中已有描述。Ward等在“ Binding Activities of a Repertoire of Single ImmunoglobulinVariable Domains Secreted from Escheria c
在后面的描述中,术语“抗体”将被用来指代上述所有实施方案,包括全免疫球蛋白、Fab片段或其它类型的抗体片段、单链抗体、单域抗体等。
本发明的单克隆抗体可以以游离的形式或与载体缀合的形式被生产和使用。载体可以是能够与抗体缀合并赋予其免疫原性或增加其免疫原性的任何分子或化学的或生物学的实体。载体的非限制性例子有:蛋白质[如KLH(匙孔血蓝蛋白)、麻仁球蛋白、甲状腺球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)]、红细胞如绵羊红细胞(SRBC)、破伤风类毒素、霍乱类毒素、多聚氨基酸如多聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)等等。为了促进抗体与载体的结合,抗体的C末端或N末端可被修饰,例如,插入额外的氨基酸残基,比如:一个或多个能形成二硫键的半胱氨酸残基。
鉴于其性质(将在随后的实验章节中参考Fab49详细显示),本发明的单克隆抗体特别适合于医疗应用,尤其是用于生产针对H1亚型甲型流感病毒感染的广谱预防性或治疗性药物。
因此,应用本发明的单克隆抗体制备预防或治疗由H1亚型甲型流感病毒感染引起的疾病(比如流感症状)的药物,属于本发明的范畴。
同样,在本文,表述“Fab49抗体”不仅包括Fab片段,还包括可制备出抗体的任何其他形式,例如整个免疫球蛋白、其他种类的抗体片段、单链抗体等。
正如在实验章节中详细介绍的,本发明的单克隆抗体是借助分子生物学技术从能产生人类交叉反应单克隆抗体的EB病毒转化人淋巴细胞为起始所获得,因此,其能够识别用用几种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒人参照分离株感染的MDCK(Madin-Darby狗肾)(ATCCn°CCL-34TM)细胞裂解液,所述分离株在下文被称为:A/Puerto Rico/8/34(ATCCn°VR-1469TM);A/Wilson-Smith/33(ATCCn°VR-1520);A/Malaya/302/54(ATCCn°VR-98)。还可使所述的抗体能够识别用动物源性“现场(field)”分离株(特别是猪源分离株(SW1))感染的NSK(新生猪肾)(Istituto Zooprofilattico di Brescia)细胞裂解液,这借助所表达的H1亚型血凝素HA2片段的序列(SEQ IDNO:5)得到证实。
本发明的单克隆抗体的另一个特别有优势的特性是其结合源自A/California/04/2009流感病毒分离株的重组HA蛋白的能力,该分离株最近被确定为引起所谓的“猪流感”的分离株之一,由世卫组织(WHO)官方命名为“新流感”。
在后面的实验章节介绍了采用源自A/California/04/2009分离株的重组HA蛋白和源自A/PR/08/1934分离株的重组HA(作为阳性对照)进行的结合实验。该实验证明,本发明的单克隆抗体Fab49对这两种重组HA蛋白都能结合。
所进行的实验还表明,单克隆抗体Fab49能中和源自上述两种流感病毒分离株的HA蛋白伪颗粒。
在后面的实验章节描述了从患者外周血制备转化B细胞系的具体程序。
还介绍了克隆编码本发明的Fab49抗体的重链和轻链的Fd部分的基因的程序及其重组制备(无论是单一的肽还是Fab片段)的程序。
借助ELISA和免疫荧光证实了本发明单克隆抗体与不同的人类和动物的H1亚型甲型流感病毒分离株感染的细胞发生反应的能力。此外,进行了中和实验以验证所述抗体在体外的生物活性。在该实验中,Fab49抗体显示出对如上文所述的人类和动物的甲型和H1亚型病毒分离株的同亚型交叉中和活性。
所获得的数据表明,本发明的抗体在赋予给予了上述形式之一的受治疗者对H1亚型甲型流感病毒产生被动免疫方面潜在有效,以及其在广谱的预防和治疗由H1亚型甲型流感病毒感染引起的疾病(如流感综合征)方面的有用性。
因此,本发明的另一方面是药物组合物,其包含作为活性成分的有效量的本发明单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或稀释剂。有效量是指在给予了所述组合物的受治疗者体内能够引起有利效果(例如中和H1亚型甲型流感病毒)的量。
在本文,术语“受治疗者”被定义为可以给予本发明组合物的任何动物宿主,包括人类。
在本发明的药物组合物中可用的药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性例子包括:稳定剂如SPGA、碳水化合物(例如,山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质如白蛋白或酪蛋白、含蛋白试剂如牛血清或脱脂乳,以及缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液)。
本发明的单克隆抗体还可有益地用作体外方法中的诊断试剂,用于检测先前从患者获得的生物样品中具有相同或相似中和特性的抗H1亚型甲型流感病毒抗体,其中该生物样品可以是血清、血浆、血液样本或任何其它合适的生物学材料。
“具有相同或相似中和特性的抗甲型流感病毒抗体”是指呈现与人类或动物的H1亚型甲型流感病毒有同亚型交叉中和活性的抗体。这些抗体可出现在下述患者(或动物)的生物样品中:其先前曾接触到甲型流感病毒,或者是因为治疗或预防疾病或研究目的该患者先前已经被给予本发明的单克隆抗体。
因此,本发明的范畴也包括用于检测先前从患者或动物宿主获取的生物样本中对H1亚型有同亚型交叉中和活性的抗甲型流感病毒抗体存在情况的分析方法,包括用本发明的单克隆抗体作为特异性检测试剂接触所述生物样品。
该方法可以是定性或定量的。可通过例如竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测或定量有同亚型交叉中和活性的抗H1亚型甲型流感病毒抗体。因此,包含本发明的单克隆抗体作为特异性试剂的诊断试剂盒也属于本发明的范畴,所述试剂盒特别设计用于检测或定量生物样本(先前从患者或动物宿主获取的)中对H1亚型甲型流感病毒有同亚型交叉中和活性的抗甲型流感病毒抗体的存在情况。
同样,本发明的单克隆抗体可作为特异性试剂用于检测方法中,所述方法用于检测或定量在以前制备的免疫原性或疫苗组合物中、具有诱发能力的抗原表位中、在已经给予了这种组合物的受治疗者中的、具有与本发明的单克隆抗体相同或相似的中和性质(即对H1亚型甲型流感病毒的同亚型交叉中和活性)的抗H1亚型甲型流感病毒抗体。
预测这种方法可用于对用作疫苗或免疫原制剂的任何制剂的评估,因为能被本发明的单克隆抗体所识别可以指示免疫原制剂和/或疫苗中存在能刺激抗体克隆产生的一种或多种表位,其中所述抗体克隆能够识别有益的表位,例如能诱发抗H1亚型甲型流感病毒的同亚型免疫的表位。
最后,本发明的单克隆抗体可用于根据本身已知的方法来制备抗独特型抗体。抗独特型抗体是特异性针对用于制备它们的独特型广谱中和抗体的抗体,因此能够模仿它们识别的关键表位。
针对本发明单克隆抗体的抗独特型抗体也因此包括在本发明的范畴内。
提供下述实验章节纯粹为了说明而非限制。
实验章节
患者的选择
挑选进入本研究的患者,以增加从中克隆交叉反应性抗流感抗体的机会,所述抗体即能够识别、潜在地能够中和不同的流感病毒分离株的抗体。尤其是,据介绍,有些个体,尽管连续暴露于流感病毒(有时是由于职业原因,如医生、儿科医生、在幼儿园和学校工作的人们),并不会患上这种疾病。由此,他们被认为是用于制备人类单克隆抗体的最佳人选。具体地讲,遵循下述入选标准:
-年龄在25至55岁之间;
-最近的病理医疗史在本研究前十年内是临床流感综合征阴性;
-对引起本研究前五年期间年度流行的H1N1亚型病毒分离株的抗体效价高于1∶1000;
-抗两种人类参照H1N1亚型甲型病毒分离株(A/PuertoRico/8/34;A/Malaya/302/54)的中和效价(IC50>=1∶20)能被检测到;
-没有事先接种抗流感疫苗;
-应允接种抗流感疫苗。
接种疫苗时和在接种后约3周,从每个患者抽取约20ml血液到肝素处理试管中。
参照病毒分离株的培养
以在改良Eagle培养基(MEM)(购自GIBCO)中传种的MDCK细胞(Madin-Darby狗肾)细胞(ATCCno.CCL-34TM)作为所述细胞系,所述培养基中添加10%灭活(在56℃处理30分钟)的胎牛血清(FBS)(购自EuroClone)、50μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素(购自GIBCO)和2mML-谷氨酰胺(购自EuroClone)。关于现场猪分离株SW1(以附在本专利申请的HA2区序列明确表征),用NSK(新生猪肾)细胞(IstitutoZooprofilattico di Brescia)来代替,对其进行相似的处理。这些细胞置于37℃、5%CO2氛围下培养,并每周两次以1∶3比率传代。对于本专利申请中描述的实验,采用以下H1N1亚型流感病毒分离株:A/Puerto Rico/8/34分离株(ATCCno.VR-1469TM)、A/Wilson-Smith/33分离株(ATCCno.VR-1520)和A/Malaya/302/54分离株(ATCCno.VR-98)。对于H1N1亚型,也使用猪源分离株(SW1),根据血凝素HA2部分的序列(SEQ ID NO:5)进行表征。还使用了其他三种参照病毒分离株,两种属于甲型H3N2亚型(A/PortChalmers/1/73-ATCCno.VR-810和A/Aichi/2/68-ATCCno.VR-547),一种属于乙型(B/Lee/40-ATCCno.VR-101)。作为培养病毒的培养基,使用添加了1μg/ml无血清胰蛋白酶(购自SIGMA)的MEM。病毒原液以胞外病毒形式从培养液上清获得。简言之,在感染细胞后,每天观察单层以监测是否出现细胞病变效应。通常在感染后4天,收集上清液,以1000RCF(相对离心力)离心10分钟以消除细胞碎片,并用0.22μm过滤器(购自MILLIPORE)过滤。然后,分装上清并保存于-80℃,作为无细胞病毒。
从外周血B淋巴细胞筛选单克隆抗流感病毒抗体
来自患者的单克隆抗体的生产是通过借助EB病毒(EBV)感染的转化方法来进行的,该方法先前由Cole等介绍(1984Cancer Research22:2750-2753)。用ELISA评估从不同克隆得到的上清中抗体的存在情况。选择能够在上清中产生下述IgG抗体的克隆以供随后的表征,所述抗体在针对用上述三种人分离株和H1N1亚型猪源分离株SW1感染的细胞裂解液的ELISA中能反应,但在针对用所述两种H3N2亚型分离株和所述B分离株感染的细胞裂解液的ELISA中不能反应。具体而言,用上述分离株以高感染复数感染MDCK细胞。感染后大约48小时,将细胞从烧瓶中移出,并在PBS中漂洗两次。然后,将细胞沉淀悬浮于300μl裂解溶液(100mM NaCl,100mM Tris pH 8和0.5%Triton-X)中,并在冰中放置20分钟。在10000g离心5分钟去除细胞碎片,将上清保存于-20℃作为蛋白提取物。关于对照抗原的制备,以同样的方式处理非感染细胞。使用BCATM蛋白检测试剂盒(购自Pierce)以复份测定上清液蛋白浓度。简单地说,样品中蛋白质含量参照标准曲线来确定,所述标准曲线通过一系列已知稀释浓度的牛血清白蛋白(BSA)获得。用分光光度计在540nm波长处测量每个样品的吸光度。然后用这样得到的裂解液(每孔300ng)包被ELISA板(COSTAR),将板在4℃过夜孵育。次日,用蒸馏水洗涤该板,并用PBS/1%BSA(购自Sigma)在37℃封闭45分钟。然后,从每个克隆取40μl上清液加到每一孔中,在37℃孵育1小时。用PBS/0.5%吐温-20(Sigma)进行5次洗板(WASHER ETI-SYSTEM,DiaSorin)后,在每一孔中加入40μl过氧化物酶缀合的抗人Fc(以1∶4000于PBS/1%牛血清白蛋白中,购自Sigma),将板置于37℃孵育1小时。用PBS/0.5%吐温-20再进行5次洗板后,在每一孔中加入40μl过氧化物酶底物TMB(Pierce)。大约15分钟后,加入40μl H2SO4阻断酶的活性,用分光光度计在450nm处测量信号。具体地讲,一个克隆(命名为cINF49)被证明能够产生下述抗体,该抗体能以特异性方式识别从不同H1N1亚型分离株(包括所述动物分离株)感染的细胞获得的所有裂解液。相反,在用所述两种H3N2亚型病毒和所述B分离株感染的培养物中没有检测到信号。
从克隆cINF49制备Fab片段
将Fab49链编码基因克隆到原核表达载体。这可以避免由于抗体生产细胞克隆的不稳定性所引起的问题,更好地从分子观点表征编码基因,以便可自由获得确实是单克隆的分子以及增加该抗体本身的数量。
从培养的cINF49克隆中提取信使RNA(mRNA),按本身已知的方法用寡聚dT进行反转录。然后按已描述方法扩增编码轻链和Fd片段(即重链可变区和Fab片段内恒定区的部分)的cDNA(CSH Press,Phage display manual,D.R.Burton编辑,p.A1.6)。然后将这样得到的cDNA克隆到本身已知的表达载体中,所述表达载体名为RBCaf(Burioni等,J.Imm.Meth,1988)。简而言之,在37℃用限制性酶XhoI和SpeI(Roche)消化编码重链Fd部分的基因(扩增的DNA)1.5小时,随后插入到载体上用于重链的克隆位点(也用同样的酶进行消化)。相反,用酶SacI和XbaI(Roche)消化轻链(扩增的DNA),并克隆到经同样消化的载体中。
用这样得到的重组构建体电转化大肠杆菌菌株XL1Blue (在甘油中用冷洗涤制备感受态),使用0.2cm转化池(cuvette)按照标准化方案操作(电压:2500V;电容:25μF;电阻:200Ω)。对轻链可变区部分和重链可变区部分的DNA序列进行平行分析。所述序列提供在序列表中。突变模式的分子分析显示了起因于抗原诱导的体细胞突变过程的图片。
ELISA评估通过克隆到RBCaf中获得的Fab49
使用对培养物进行热休克而获得的裂解液,通过ELISA分析了40个用Fab49构建体转化的重组细菌克隆。具体地讲,将用所述构建体转化的细菌克隆接种于10ml SB培养基(含有氨苄青霉素和四环素,其浓度分别为50μg/ml和10μg/ml),在37℃振荡培养直至达到O.D.600=1。随后,加入特异性诱导剂(IPTG,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM,培养物在30℃振荡培养过夜。利用热休克(3次冷冻/解冻循环,分别在-80℃和37℃)溶解这些细胞,然后离心以从含Fab上清中分离细胞碎片。用ELISA法检测所获得的可溶性Fab。用从上述病毒分离株感染的细胞获得的裂解液包被96孔微孔板(购自Nunc)。用从未感染细胞获得的裂解液作为阴性对照。然后,让包被了300ng所得裂解液的ELISA板在4℃过夜。第二天,去除未结合的抗原后,用PBS洗板5次,用含3%白蛋白的PBS封闭非特异性结合位点,在37℃封闭1小时。去除封闭液后,向其中加入经如上所述处理、含有所述可溶性Fab的细胞培养物的上清液。紧接是在37℃2小时的孵育步骤。用PBS/0.5%吐温-20进行10次洗板循环后,向其中加入40μl(1∶700稀释度,于PBS/1%BSA中)辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人Fab免疫球蛋白多克隆制剂(Sigma)。在37℃孵育1小时和再进行10次清洗系列后,向各孔中加入底物(OPD-邻苯二胺)。然后,将板在黑暗中于室温下孵育30分钟。用1N硫酸淬灭反应,用分光光度计在450nm处读数评估光密度。所有检测的克隆都显示对从用所述H1N1亚型病毒感染的细胞获得的每一裂解液有特异性反应。于是,筛选出一个用含Fab49的轻链和重链Fd片段基因的表达载体转化的细菌克隆。所筛选出的细菌克隆被命名为INF49。
纯化Fab49和用ELISA评估感染细胞裂解液的Fab49
用含蛋白G(~2mg/ml)的琼脂糖凝胶树脂柱免疫亲和纯化由克隆INF49产生的Fab(从此处开始无差别地称为“克隆”或“Fab”),在所述蛋白G上共价连接了能够结合人Fab的山羊抗体多克隆制剂(PIERCE,Illinois)。简言之,将克隆INF49的一个菌落接种于10ml SB培养基(含有氨苄青霉素和四环素,浓度分别为50μg/ml和10μg/ml)。将在37℃生长过夜的培养物继代接种到装有500ml SB(加有与之前相同浓度的抗生素)的烧瓶中。细胞随后用1mM IPTG诱导,然后让细胞在30℃振荡过夜。将培养物在5000rpm离心25分钟,重新悬浮在PBS中的沉淀用超声波处理。有必要在18000rpm再次离心25分钟以去除细胞碎片。过滤上清液,然后慢慢地通过上述琼脂糖柱。此后,用10倍体积量的PBS洗涤树脂,最后用酸性溶液将结合的Fab洗脱出来(洗脱缓冲液-H2O/HCl pH 2.2)。用适当的溶液(1M Tris pH 9)中和所收集的各组分,通过超滤(Centricon,Millipore)进行浓缩。取一等分的纯化Fab在12%聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠凝胶(SDS-PAGE)上电泳以评估其纯度。最后,如所述用ELISA法测定系列稀释的纯化Fab。在每块板中,用针对HCV E2糖蛋白的单克隆Fab作为阴性对照。本实验结果证实了先前用细菌裂解液所得的结果,确证所述克隆对H1N1亚型病毒感染细胞具有特异性反应。
通过克隆到RBCaf对获得的Fab49进行免疫荧光评估
为了证实用ELISA法取得的数据,还采用免疫荧光检测分析了Fab49。简单地说,将来自用所有上述参照病毒感染的培养物的细胞用胰蛋白酶消化,用PBS洗两次后,用血细胞计数器在显微镜下计数。因此,通过在细胞离心机(Cytospin4,购自Shandon Southern Products)于90g离心3分钟后,将细胞悬液用于制片。如此制备的载玻片,每一片载有细胞总数为2×105。用未受感染的细胞按同样方法制备对照载玻片。然后,细胞于室温下用甲醇-丙酮溶液(在-20℃的温度下使用)固定和透化10分钟。用PBS洗涤3次后,在潮湿箱于37℃用Fab49(100μg/ml)孵育细胞30分钟,随后用PBS洗涤三次。然后,细胞在潮湿箱于黑暗中37℃与荧光异硫氰酸缀合的山羊Fab(Sigma)(以1∶200稀释于Evans Blue中)孵育30分钟。在荧光显微镜(Olympus)下检查该载玻片。特异性针对流感病毒M1蛋白的市售小鼠单克隆抗体(Argene)被用作阳性对照。针对丙型肝炎病毒E2糖蛋白的抗体(e509;Burioni等,Hepatology,1998)被用作阴性对照。通过免疫荧光法,Fab49显示对人类H1N1亚型分离株感染的所有细胞呈特异性反应,所述分离株是A/Puerto Rico/8/34分离株、A/Wilson-Smith/33分离株和A/Malaya/302/54分离株。使用被本研究所用的猪分离株SW1感染的细胞也得到类似的结果。所显示的荧光模式显然是细胞质型模式。相反,在未受感染的细胞、用H3N2亚型病毒感染的细胞和用乙型分离株或用阴性对照抗体感染的细胞中未观察到荧光。
中和试验
为了表征所选择克隆的体外生物学活性,为本研究中使用的一些参考病毒分离株设计了中和试验。简言之,将MDCK细胞(在猪分离株SW1的情况下用NSK)接种于96孔板中的MEM-10%FBS(2x104细胞/孔)。在维持培养液(含2%FBS的MEM)中制备病毒原液(如上所述获得)的系列稀释液(从10-1到10-8)。每个稀释度重复6次。当培养的细胞发生融合时,移除生长培养基,向每孔分别加入100μl每一病毒稀释液。经过37℃1小时,除去接种物,向每孔加入200μl含有1ug/ml胰蛋白酶的MEM培养基。病毒滴度,用TCID50(感染50%细胞培养物的剂量)表示,采用Reed-Muench公式计算:
基于所获得的数据,对病毒悬液进行稀释,使得在中和实验中使用约为0.01的感染复数(M.O.I.)(每100个细胞1个病毒粒子)。在实际的中和试验中,细胞接种于24孔板,每孔含有灭菌载玻片。中和实验是在80%-90%融合细胞时进行,即向其中接种后约48小时。然后制备纯化Fab49的稀释液,以达到最终浓度为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml。制备相应稀释度的e509抗-HCV抗体,作为阴性对照。将不同浓度的Fab与等体积的稀释病毒悬液(M.O.I.:0.01)于37℃共孵育1小时。随后,将250μl病毒Fab混合液加入到含有细胞的孔中。在病毒原液中只加入培养液,得到该感染的阳性对照。将该板在37℃孵育1小时,以使未经中和的病毒吸附。然后,移除接种物,并用PBS洗细胞两次。向每孔分别加入含1μg/ml胰蛋白酶的无血清培养基1.5ml。在37℃孵育6小时后,用PBS洗涤细胞单层,用冷甲醇-丙酮溶液(1∶2比率,在-20℃存储)在室温下固定10分钟。洗涤固定的细胞,与250μl市售单克隆抗M1抗体(Argene)于潮湿箱中在37℃孵育30分钟。用PBS洗涤细胞,最后与荧光缀合的山羊抗小鼠抗体(稀释于Evansblue中)于潮湿箱中黑暗下37℃孵育30分钟。经过三次PBS洗涤后,最后在荧光显微镜下检查载玻片。通过计数单阳性细胞,并计算与仅感染了病毒的阳性对照比较受感染细胞数下降的百分比,确定Fab49的中和活性。对用于本中和试验的每一分离株在三个独立时段进行了中和实验(见图1-3)。在每个实验中,不同稀释度的Fab49被重复三次,所述感染的阴性对照((Fab e509抗E2/HCV)和阳性对照(病毒和无Fab的培养基)也是同样进行的。
由克隆INF49产生的Fab表现出对人类和动物H1N1亚型甲型流感病毒分离株的同型交叉中和活性。相反,没有检测到本研究中使用的两个H3N2亚型病毒和乙型病毒的感染能力的降低,证实了所观察到的对H1N1亚型的同亚型中和活性的特异性。尤其是,由克隆INF49产生的Fab(称为Fab49)表现出对所试验的每一H1N1亚型分离株的IC50(对试验病毒分离株的感染抑制50%时的Fab浓度)都低于5μg/ml,即通过体外给药所述分子很容易获得的浓度,即使在不考虑将Fab转换为整个免疫球蛋白形式(包括在本发明范畴内的可能药物制剂中的一种)时观察到的中和生物学活性的通常大大提高的情况下也是如此。
图1至3总结了由克隆INF49产生的Fab 49在不同中和时段对本研究中使用的各种H1N1亚型病毒流感分离株获得的结果。
具体地讲,图1图示说明了不同浓度Fab 49对病毒A/PuertoRico/8/34的中和百分比。用人类e509抗-HCV Fab获得的结果作为阴性对照报告。
图2图示说明了不同浓度Fab 49对病毒A/Wilson-Smith/33分离株的中和百分比。用人类e509抗-HCV Fab获得的结果作为阴性对照报告。
图3说明了不同浓度Fab 49对用于本文的现场猪分离株SW1的中和百分比。用人类e509抗-HCV Fab获得结果作为阴性对照报告。
被Fab49识别的抗原的表征:来自感染细胞的裂解液的蛋白质印迹
将如前描述所制备的用A/Puerto Rico/8/34分离株感染的细胞裂解液10μg,在自然条件下于10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。为此,样品在适当的冷藏箱(BIORAD)中于100V电泳1小时。此后,将凝胶从电泳装置中移出,在转移缓冲液(Tris碱3g,甘氨酸14.41g,dH2O 800ml,甲醇200ml)中孵育10分钟以消除任何去垢剂残留物。然后,于30V和90mA过夜转移到硝酸纤维素膜(Hybond-ECL;AmershamBiosciences)上。用溶解在1X PBS的5%奶粉封闭膜1小时,其后,用1X PBS-0.1%吐温洗膜三次。在每次洗膜时,将膜留在摆动平台上摇晃10分钟。此后,以5μg/ml的浓度加入不同的Fab(稀释在含5%奶粉的PBS中)。除Fab49外,加入以下对照:作为阴性对照的e509、市售小鼠抗-HA整体IgG1(COVANCE)、市售小鼠抗-M1整体IgG1(ARGENE)、小鼠抗-M2整体IgG1(ABCAM)、人血清(1∶200稀释)。每一抗体在室温振摇1小时。此后,再次如前所述用PBS洗膜。然后,加入与ELISA试验中所描述的相同的二级小鼠抗体(1∶1000)或人抗体(1∶2000),这取决于待检测抗体的来源。为了检测信号,以1∶1的比例混合两种底物(SuperSignalWest Pico ChemiluminescentSubstrate Pierce)来制备工作液,需特别小心地不要将其暴露于光源。用工作液孵育硝酸纤维素膜5分钟,然后取出膜,并安装在HyperCassette(AMERSHAM)。其在暗房经必要的曝光时间后就显影在柯达胶卷上。所描述的实验在两个不同时段进行,在每一阶段,与Fab49孵育的膜部分都显示出存在一条分子量略小于80kDa的带,与病毒血凝素(HA0)的未成熟形式的分子量一致。同一条带也显示在用抗血凝素对照抗体孵育的条上,证实了这一点。在与人血清孵育的膜部分也检测到类似条带,比其它带更强烈。本实验结果表明,该抗体针对流感病毒的血凝素,完全与中和数据相一致,因为已知血凝素是体液中和应答的主要靶标。
来自甲型流感亚型(H1N1)(猪流感)的HA的结合和中和实验
从受感染的MDCK细胞的上清分别扩增流感病毒A/PR/08/1934和A/California/04/2009的HA蛋白质,或在体外合成(GenART,Ragensburg,Germany)所述HA蛋白质,并克隆到pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)中,从而获得一种H1HA(A/PR/08/1934)构建体和一种H1HA(A/California/04/2009)构建体。
上述两个分离株的HA蛋白的cDNA序列和氨基酸序列显示在序列表中,分别为:SEQ ID NO:6(来自A/PR/08/1934的HA蛋白的cDNA序列),SEQ ID NO:7(来自A/PR/08/1934的HA蛋白的氨基酸序列),SEQ ID NO:8(来自A/California/04/2009的HA蛋白的cDNA序列)和SEQ ID NO:9(来自A/California/04/2009的HA蛋白的氨基酸序列)。
用3μg含H1HA(A/PR/08/1934)构建体或H1HA(A/California/04/2009)构建体的重组载体pcDNA3.1转染人类肾上皮(HEK)293T细胞。离心和固定后,转染细胞与Fab49(10μg/ml)共孵育。进一步洗涤后,细胞与FITC缀合的人抗-Fab单克隆抗体共孵育,用FACS分析。根据Perotti等(J Virology,2008Jan;82(2):1047-52)的描述对数据进行分析。实验表明,Fab49能识别用两种重组载体的任一种所转染的293T细胞。
对于中和试验,由293T细胞产生逆转录病毒载体,所述293T细胞被FuGene 6(Roche)和以下质粒共转染:加有3μg H1 HA(A/PR/08/1934)构建体或H1HA(A/California/04/2009)构建体的Luc系统(5μg pCMVΔR8.2和5.5μg pHR’CMV-Luc),所述逆转录病毒载体经过修饰以便在其衣壳周(pericapsid)表达流感HA蛋白(伪-类型),包括报告基因Luc。转染后48小时收集上清,使用0.45μm低蛋白结合滤器过滤,立即使用或冷冻在-80℃。在293T和MDCK细胞上测量所述HA伪类型的滴度。简要地讲,在用100μl不同稀释度的慢病毒LucHA伪类型载体(HA-Luc)感染细胞48小时后,根据生产商的指示,用Luc试验细胞裂解缓冲液(荧光素酶分析试剂,Promega)裂解96孔板中的细胞。伪类型的滴度已表示为相对发光单位(RLU/ml)。
用基于流感伪粒子的中和试验来测试Fab49的中和活性。该方案显示,Fab49对用这两种H1N1亚型分离株(A/PR/08/1934和H1HA(A/Califomia/04/2009)产生的所有流感病毒伪颗粒皆具有强中和活性,其[IC50]为大约2μg/ml。
Claims (25)
1.针对甲型流感病毒的单克隆抗体,其特征在于它能结合多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株。
2.权利要求1的单克隆抗体,其特征在于它对多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株有中和活性。
3.权利要求1或2的单克隆抗体,其能够识别作为抗原的、来自多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株的血凝素。
4.权利要求1至3中任一项的单克隆抗体,其中,所述多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株包括至少一种人源分离株和一种动物源分离株。
5.权利要求1至4中任一项的单克隆抗体,其中,所述多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株至少包括下述分离株:A/PuertoRico/8/34、A/Wilson-Smith/33和A/Malaya/302/54。
6.权利要求1至4中任一项的单克隆抗体,其中,所述多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株至少包括下述分离株:A/PuertoRico/8/34、A/Wilson-Smith/33、A/Malaya/302/54和A/California/04/2009。
7.权利要求1至6中任一项的单克隆抗体,其包括至少一个重链可变区和一个轻链可变区,所述重链可变区具有氨基酸序列SEQ IDNO:1,所述轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。
8.权利要求7的单克隆抗体,其包括至少一个重链可变区和一个轻链可变区,所述重链可变区由核苷酸序列SEQ ID NO:3所编码,所述轻链可变区由核苷酸序列SEQ ID NO:4所编码。
9.权利要求1至8中任一项的单克隆抗体,其选自:整个免疫球蛋白和免疫球蛋白片段,后者包括至少一个重链可变区和一个轻链可变区。
10.权利要求9的单克隆抗体,其中,所述免疫球蛋白片段选自:Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、单链抗体(scFv)。
11.权利要求1至10中任一项的单克隆抗体,其是人抗体或人源化抗体。
12.多肽,其选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
13.权利要求12的分离的多肽,其对多种表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒分离株有中和活性。
14.抗独特型抗体,其特异性地针对权利要求1至11中任一项的单克隆抗体的独特型。
15.分离的核苷酸序列,其选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
16.表达载体,其包含:核苷酸序列SEQ ID NO:3,或核苷酸序列SEQ ID NO:4,或核苷酸序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4两者。
17.宿主细胞,其已被权利要求16的表达载体所转化。
18.药物组合物,其包括有效量的权利要求1至14中任一项的至少一种抗体或一种多肽,以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
19.权利要求1至14中任一项的抗体或多肽,其用作针对由表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒感染所直接或间接引起的病理的预防或治疗药物。
20.权利要求1至14中任一项的抗体或多肽在制备针对由表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒感染所引起的病理的预防或治疗药物中的应用。
21.权利要求20的应用,其中,由表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒的感染引起的所述病理是流感综合症。
22.权利要求21的应用,其中,所述病理由也称为猪流感病毒或新流感病毒的H1N1甲型流感病毒的感染引起。
23.分析方法,其用于在取自患者的生物样本中检测抗流感病毒抗体的存在情况,其中所述抗流感病毒抗体对表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒有同亚型交叉中和特性,所述方法包括用权利要求1至11中任一项的单克隆抗体作为特异性检测试剂去接触所述生物样品。
24.分析方法,其用于在免疫原性或疫苗组合物中检测表位的存在情况,其中所述表位来自表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒,其能够在给予了所述组合物的受治疗者中,诱发对表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒有同亚型交叉中和特性的抗甲型流感病毒抗体,所述方法包括用权利要求1至11中任一项的单克隆抗体作为特异性检测试剂去接触所述组合物。
25.试剂盒,其包括权利要求1至11中任一项的单克隆抗体作为特异性试剂,用于在取自患者的生物样本中或免疫原性或疫苗组合物中检测或定量对表达H1亚型血凝素的甲型流感病毒有同亚型交叉中和特性的抗甲型流感病毒抗体。
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