CN102037013B - 能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体 - Google Patents

能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102037013B
CN102037013B CN200980117842.2A CN200980117842A CN102037013B CN 102037013 B CN102037013 B CN 102037013B CN 200980117842 A CN200980117842 A CN 200980117842A CN 102037013 B CN102037013 B CN 102037013B
Authority
CN
China
Prior art keywords
influenza
antibody
virus
fab
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980117842.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102037013A (zh
Inventor
R·布里奥尼
M·克莱门蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BAIT BIOTECNOLOGIE APPLICATE I
Original Assignee
BAIT BIOTECNOLOGIE APPLICATE I
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40293277&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102037013(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by BAIT BIOTECNOLOGIE APPLICATE I filed Critical BAIT BIOTECNOLOGIE APPLICATE I
Publication of CN102037013A publication Critical patent/CN102037013A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102037013B publication Critical patent/CN102037013B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A61K47/6841—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses the antibody targeting a RNA virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4216—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-viral Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

描述了针对甲型流感病毒的单克隆抗体，其具有能结合甲型流感病毒复数个亚型的性质。一个优选实施方案是命名为Fab28的抗体，它表现出针对甲型流感病毒复数个亚型的中和活性。也描述了针对本发明的单克隆抗体的抗-独特型抗体，包含本发明的单克隆抗体的免疫原或疫苗组合物，以及本发明的单克隆抗体的治疗性、预防性和诊断应用。本发明的单克隆抗体也可以用于测试要用作疫苗的抗体制品。

Description

能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体
技术领域
本发明总体上属于免疫学领域。更具体地，本发明涉及针对甲型流感病毒的HA (血凝素)抗原的单克隆抗体。
发明背景
在世界范围内每年的流感病毒流行病代表着发病和死亡的一个重要原因。在美国，据估计每年超过200,000人因为与流感病毒有关的综合征而住院，其中约40,000例死亡或多或少地与之直接有关(Thompson 等人, JAMA, 2003, 289:179-186)。除了这些数字以外，我们还必须考虑下述情况，即成指数增加的更多数量的受感染的患者待在家中或长或短的时间段，由于工作日的减少导致不可避免的经济损失。一项近期的工作(Molinari 等人, Vaccine, 2007, 25: 5086-5096)已经估计，与每年的流行病直接有关的医疗成本是每年104亿美元，由于不能工作造成收入减少，必须再增加163亿美元。如果在计算中也考虑其它项目，例如与受感染的患者的死亡有关的经济损失的货币化，该总额升高至难以置信的871亿美元的数字。这些与每年流行病有关的经济数据，以及由于人类新流感病毒的出现在不远的将来的任意时刻可能发生的可怕大流行病，解释了搜寻有效的策略来控制这些病毒的传播的重大意义。
目前，以某种方式对抗每年流感流行病的唯一可利用的工具是含有病毒的分离抗原的灭活三价疫苗，所述抗原被假定为下一个流感季的流行病的成因。基于与一些监测的地理区域的早期分离有关的流行病学数据，这类预测不总是被证实是正确的。因而，年复一年总是存在一项根本不可忽视的任务，即为特定流感季开发的三价疫苗可能被证实基本上是无效的。
在该情况下，以及在新的大流行病的情况下，唯一可利用的预防/治疗手段将是求助于两类可利用的抗病毒药物：M2蛋白抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂 (奥塞米韦和扎那米韦)。但是，在这样的情形下，也已经预见到一系列问题，其不仅与需要在感染的非常早期施用抗病毒药有关，而且与抗性病毒分离物的快速出现（但是这已经发生）有关。
一种替代性的有效策略是基于中和抗体制品，其针对关键的病毒蛋白，且能识别不同的流感病毒分离物之间共有的这类蛋白。
为了更好地理解基于抗体的被动给药的方案的潜力，有用地简单地提及流感病毒的主要结构特征。流感病毒属于正粘病毒科家族，其特征是存在源自受感染的细胞膜的被膜，在这上面存在约500个刺突，也称作突出物。这样的突出物由来自两种重要的病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的三聚体和四聚体组成。完整的膜蛋白(M2)也存在于被膜表面上，该蛋白以比血凝素和神经氨酸酶低得多的数量存在，且也组织成四聚体。
流感病毒的其它特征是，在核心中存在分段的基因组，其包含8个单链RNA片段。基于病毒体内的一些蛋白(NP和M1)的特征，可识别出3种流感病毒类型: 甲型, 乙型,和丙型。
甲型和乙型病毒会引起每年的流行病。相反，丙型病毒会引起严重性更低的综合征。
在甲型病毒(引起大流行病且甚至能在每年流行病中造成最严重的综合征的唯一原因)中，基于血凝素和神经氨酸酶的抗原特征，还可识别出不同的亚型。在近期的历史进程中已经侵袭人类的亚型是H1N1和H3N2亚型(目前仍然在循环，且包含在疫苗制品中)以及H2N2亚型（从1968以来不再循环，且造成1957年的所谓“亚洲”流感）。其它亚型已经偶发地侵袭人类(H9N2, H7N7，和令人恐惧的近期的H5N1亚型)，但是它们尚未成功地有效传播和替代循环亚型。
表面蛋白的作用在病毒复制周期中是必需的。更具体地，血凝素是使病毒识别在某些细胞的表面上存在的唾液酸并感染它们的蛋白。相反，神经氨酸酶在病毒复制周期的末端（也就是新病毒颗粒从受感染的细胞释放的过程中）起作用。它的功能是，辅助新形成的病毒体的血凝素从生成它们的细胞的表面上存在的唾液酸释放出来。这两种蛋白所起的关键作用，以及它们在病毒表面上的展示，解释了它们代表免疫应答的主要靶物的原因，和它们易于高突变率的原因。实际上，每年的流行病的成因病毒或多或少地不同于前些年的成因病毒，因此能有效性或高或低地逃过它们刺激的免疫应答。换而言之，血凝素(主要地)和神经氨酸酶(次要地)中的点突变的逐渐累积，使得在以前的流行病过程中生成的保护性抗体总体上逐渐失效。
体液组分起抗流感免疫应答中的主要保护作用。抗体主要通过干扰血凝素结合唾液酸、从而阻止细胞的感染来发挥它们的保护作用。这样的选择压力决定了血凝素中的高突变率。从1968年至1999年对H3 血凝素亚型进行的序列研究已经揭示了共101个氨基酸突变(在共约560个氨基酸上)，平均每年约3.5个突变。在该研究阶段发生的60%突变也保留在第二年的循环病毒中，这指示免疫介导的选择压力的持续性。95%的这类突变发生于HA1血凝素亚基，它是直接参与结合唾液酸的亚基。但是，在这样的高变异性中，已经发现了一些不变的氨基酸残基，这指示它们在蛋白的功能中的必需作用。这些血凝素部分代表针对流感病毒不同亚型的交叉中和应答的潜在靶物。但是，可以预测这样的区域不能在大多数患者中诱导有效的抗体应答，因为下述事实，即这样的靶物隐藏在无免疫刺激区域，已经确定地代表非常有利的病毒进化步骤。
实际上，当提及抗流感免疫时，必须考虑3种不同类型的免疫，参考上面报道的数据，可以较好地理解它们：
同源免疫（HOMOLOGOUS IMMUNITY）: 与单个分离物有关。这类免疫总是在感染或疫苗接种后发现，但是它会提供非常有限的抗其它分离物的保护。
同亚型免疫（HOMOSUBTYPE IMMUNITY）: 与属于相同亚型的分离物有关。这类免疫经常在感染或疫苗接种后发现，但是在血凝素和/或神经氨酸酶的突变率显著增加时丧失。
异亚型免疫（HETEROSUBTYPE IMMUNITY）: 与属于不同亚型的分离物有关。这类免疫在天然感染和疫苗接种的情况下都非常罕见。从战略观点看，它是最重要的免疫，因为它的存在和刺激相当于对每种甲型流感病毒感染的抗性。
直到几年前，一直认为仅仅通过有效地刺激针对较少突变的病毒蛋白（例如构成它的核心的NP蛋白）的细胞免疫组分，可以实现异亚型免疫。但是，近年的研究已经证实，消除了CD8 淋巴细胞的小鼠仍然能显示出异亚型免疫，这不同于消除了B型淋巴细胞组分的小鼠 (Nguyen HH, J Inf. Dis. 2001, 183: 368-376)。一项更近的研究已经证实了该数据，突出了抗体的关键作用，即使不中和，也精确地针对不同亚型之间保守的表位(Rangel-Moreno 等人 The J of Immunol, 2008, 180: 454-463)。
发明目的
在上面报道的数据的基础上，本发明的一个目的是，提供能与甲型流感病毒的不同亚型反应的单克隆抗体，优选人或人化的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是，提供具有针对甲型流感病毒多个亚型的中和活性的单克隆抗体，优选人或人化的单克隆抗体。
当施用给处于危险中的患者时，这样的抗体会成为有效的预防措施。此外，用于人患者的人或人化的单克隆抗体的应用，会提供进一步的优点，因为所述抗体当然会被较好地耐受。
其次，通过构建响应于该病毒的人抗体的组分，具有上述特征的单克隆抗体会代表设计创新性疫苗的一项关键因素，与目前使用的疫苗相比，所述创新性疫苗能诱导极端更加有效的、保护性的和广范围的免疫。
但是，到目前为止已经证实非常难以获得具有这些性质的单克隆抗体。
于2007年11月22日授权的国际专利申请WO2007/134327描述了能在ELISA测定中结合来自甲型流感病毒H5亚型的不同分离物的HA抗原的Fab片段。但是，该专利申请没有提供能识别属于甲型流感病毒不同亚型的分离物的抗体的实现性描述，也没有以实现性方式描述具有针对属于不同亚型的甲型流感病毒的实际中和能力的抗体的获取。
因此，尽管实际上已经长期寻求能够识别和中和甲型流感病毒不同亚型的单克隆抗体，这样的需求到目前为止仍然未获成功。
发明内容
发明人已经令人惊奇地成功地提供了具有上述希望的特征的单克隆抗体。
因而，本发明的第一个目的是针对甲型流感病毒的血凝素抗原的单克隆抗体，其特征在于能结合甲型流感病毒的多个亚型。
本发明的第二个目的是针对甲型流感病毒的单克隆抗体，其特征在于具有针对甲型流感病毒多个亚型的中和活性。优选地，这样的中和单克隆抗体识别作为抗原的甲型流感病毒血凝素(HA)。
本发明的单克隆抗体优选是人或人化的抗体。
在下面的实验部分，详细描述了根据本发明的人单克隆抗体的获得和它们的结合性质。
通过任意本身已知的方法，例如描述在Baca等人, 1997 J. Biol. Chem 272:10678-84或Carter等人, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci 89:4285中，制备人化的抗体。这样的参考文献仅用于解释，而不是限制。实际上，现有技术已知制备人化抗体的其它方法，且可以用于本发明中。
在下面的实验部分中具体描述了能生产单克隆抗体的6个克隆(命名为INF4, INF16, INF28, INF39, INF43和INF47)的获得，所述单克隆抗体是具有结合甲型流感病毒多个亚型的体外能力的Fab片段的形式。
由克隆INF28生产的单克隆抗体(命名为Fab28)代表本发明的一个优选实施方案，如发明人已经实验证实的，该抗体表现出针对甲型流感病毒多个亚型的中和活性。为了简洁，这样的免疫性质有时在下文中称作“异亚型交叉中和活性”。
Fab28抗体的特征在于具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变结构域。编码该重链可变结构域的核苷酸序列是SEQ ID NO:3，编码该轻链可变结构域的核苷酸序列是SEQ ID NO:4。
更具体地，实验部分描述了作为Fab片段的本发明单克隆抗体的生产。但是，其它抗体形式、及其生产和应用也意在构成本发明范围的一部分。非限制性实例是完整免疫球蛋白或其它类型的抗体片段，例如F(ab’)2片段或比Fab更小的抗体片段，或具有与本发明的Fab实验证实的那些相同的免疫学性质的肽。
根据Ladner 等人在美国专利4,946,778中所述的方法，可以构建单链抗体，其在此引作参考。单链抗体包含通过柔性连接物连接的轻链和重链可变区。命名为单结构域抗体的抗体片段甚至比单链抗体更小，因为它仅包含一个分离的VH结构域。在现有技术中描述了获得单结构域抗体的技术，所述单结构域抗体至少部分地具有与完整抗体相同的结合能力。Ward等人在"Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escheria coli," Nature 341:644-646中描述了用于获得抗体重链可变区(VH单结构域抗体)的筛选方法，所述抗体重链可变区对于目标表位具有足够的亲和力，以便以分离的形式与之结合。
在下面的描述中，术语“抗体”则用于指上述的所有实施方案，包括完整免疫球蛋白、Fab片段或其它抗体片段类型、单链抗体、单结构域抗体等。
可以以游离形式或以载体缀合的形式，生产和使用本发明的单克隆抗体。载体是能与抗体缀合并使它成为免疫原或增加它的免疫原性的任意分子或化学物质或生物物质。载体的非限制性实例是蛋白例如KLH (钥孔戚血蓝素)、麻仁球蛋白、甲状腺球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)、红细胞例如绵羊红细胞(SRBC)、破伤风去毒毒素、霍乱去毒毒素、聚氨基酸例如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)等。为了促进抗体与载体的结合，可以修饰抗体C-末端或N-末端，例如，通过插入额外的氨基酸残基，例如一个或更多个能形成二硫键的半胱氨酸残基。
由于它们的将在下面的实验部分中详细证实的性质，本发明的单克隆抗体(具体地，抗体Fab28)特别适用于医学用途，特别是用于甲型流感病毒感染的广范围预防性或治疗性处理的药剂的生产。
因而，本发明的单克隆抗体、优选抗体Fab28用于药剂的生产的用途，所述药剂用于由甲型流感病毒感染造成的病理学（例如流感综合征）的预防性或治疗性处理，是在本发明的范围内。
也在该背景下，表述“Fab28抗体”不仅包括Fab片段，而且包括抗体可以制成的任意其它形式，例如完整免疫球蛋白、其它类型的抗体片段、单链抗体等。
如在实验部分中详细描述的，已经通过分子生物学技术，从能生产交叉反应性的单克隆抗体的EBV-转化的淋巴细胞开始获得单克隆抗体，因而能识别被下文提及的2种参照分离物感染的MDCK细胞裂解物，所述2种参照分离物属于不同的甲型流感病毒亚型：H1N1, 菌株A/PR/8/34和H3N2, 菌株A/PC/1/73。在实验部分中描述了用于从患者的外周血制备转化的B细胞系的具体程序。
另外，在实验部分中描述了用于克隆编码本发明的Fab28抗体的重链和轻链可变部分的基因的程序，以及重组地生产它们（作为单个肽和Fab片段）的程序。
通过ELISA和免疫荧光，验证了本发明的单克隆抗体的与被不同甲型流感病毒亚型感染的细胞裂解物反应的能力。另外，为了验证抗体的体外生物学活性，进行了中和测定。在该测定中，Fab28抗体表现出针对如上所示的参照甲型病毒分离物的异亚型交叉中和活性。
得到的数据表明，本发明的抗体、尤其是抗体Fab28，可以非常有效地赋予施用它们的受试者针对甲型流感病毒的被动免疫，因此，它们特别适用于甲型流感病毒感染或由甲型流感病毒感染直接或间接造成的病理学的广范围预防性或治疗性处理。这样的病理学的一个实例是流感综合征。
另外，在实验部分中描述了Fab28结合的血凝素构象表位的鉴别。这样的构象表位位于血凝素HA1区域和HA2区域之间，且包括在HA2区域上的W357和T358 残基以及在HA1区域上的N336、I337和P338 残基。残基的编号是基于来自数据库BLAST中的H1N1/A/PR/8/34分离物的血凝素序列(SEQ ID NO: 5)。
因而，本发明的另一个目的是药物组合物，其包含有效量的作为活性成分的本发明的单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或稀释剂。有效量是能在施用该组合物的受试者中诱导有利效应（例如中和甲型流感病毒或干扰病毒复制）的量。
在该上下文中，术语“受试者”指示可以施用该组合物的任意动物宿主，包括人。
适用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性实例包括：稳定剂例如SPGA, 碳水化合物 (例如，山梨醇, 甘露醇, 淀粉, 蔗糖, 葡萄糖, 葡聚糖), 蛋白例如白蛋白或酪蛋白，含有蛋白的试剂例如牛血清或脱脂乳，和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂)。
本发明的单克隆抗体也可以有利地用作体外方法中的诊断剂，用于检测以前从患者得到的生物样品(例如血清、血浆、血液样品或任意其它合适的生物材料)中具有相同的或类似的中和性质的抗-甲型流感病毒抗体。
“具有相同的或类似的中和性质的抗-甲型流感病毒抗体”是表现出针对甲型流感病毒的异亚型交叉中和活性的抗体。这些抗体可能存在于来自患者的生物样品中，这是因为以前暴露于甲型流感病毒，或因为患者以前已经施用用于治疗性或预防性或研究目的的本发明的单克隆抗体。
因而在本发明的范围内包括用于检测具有异亚型交叉中和活性的抗-甲型流感病毒抗体在患者的生物样品中的存在的测定方法，其包含，使所述生物样品接触作为特异性测定试剂的本发明的单克隆抗体。
测定可以是定性或定量测定。通过例如竞争ELISA测定法，可以检测或定量具有异亚型交叉中和活性的抗-甲型流感病毒抗体。因而，包含根据本发明的单克隆抗体作为特异性试剂的诊断试剂盒也在本发明的范围内，所述试剂盒为源自患者的生物样品中具有针对甲型流感病毒的异亚型交叉中和活性的抗-甲型流感病毒抗体的检测或定量而特别设计。
类似地，本发明的单克隆抗体(具体地抗体Fab28)可以用作测定方法中的特异性试剂，所述测定方法用于检测或定量以前制备的免疫原性的或疫苗组合物中能在已经施用这样的组合物的受试者中引起抗-甲型流感病毒抗体的表位，所述抗-甲型流感病毒抗体具有与本发明的单克隆抗体相同或类似的中和性质，即针对甲型流感病毒的异亚型交叉中和活性。
预期这样的方法可以用于评估要用作疫苗或免疫原制品的任意制品，因为本发明的单克隆抗体的识别可以指示一种或更多种能刺激抗体克隆的生产的表位在免疫原制品和/或疫苗中的存在，所述抗体克隆能识别有益的表位，例如能引起针对甲型流感病毒的异亚型免疫的表位。
最后，根据本身已知的方法，本发明的单克隆抗体可以用于生产抗-独特型抗体。抗-独特型抗体是特异性地针对用于制备它们的广范围中和抗体的独特型的抗体，因而能模仿它们识别的关键表位。
因此，针对本发明的单克隆抗体的抗-独特型抗体也包括在本发明的范围内。
下面的实验部分仅用于解释，而不是限制，无意限制由所附权利要求书确定的本发明的范围。权利要求书是说明书的组成部分。
实验部分
1. 患者的选择
选择在研究中登记的患者，从而增加克隆交叉反应性抗-流感抗体的机会，所述抗体是能识别和潜在地中和属于不同亚型的流感病毒分离物的抗体。更具体地，据称有些个体，尽管连续暴露于流感病毒(有时出于职业原因，如医师，儿科医生，在幼儿园和学校工作的人员)，不会感染该病。认为这些罕见的个体对于流感病毒感染的易感性更低，这是由于不明原因导致的有效异亚型免疫的形成。为此原因，认为他们是生产人单克隆抗体的最佳候选人。更具体地，服从下面的选择标准：
● 年龄为25至55岁；
● 在研究之前10年的近年病理学医疗史是临床流感综合征阴性的；
● 在研究之前5年期间，对引起每年流行病的病毒分离物H1N1和H3N2亚型的抗体效价高于1:1000；
● 在研究之前5年期间，对引起每年流行病的病毒分离物H1N1和H3N2亚型的高中和效价(IC50 >=1:400)；
● 可检测的针对2种参照甲亚型病毒分离物(A/PR/8/34亚型H1N1; A/PC/1/73亚型H3N2)的中和效价(IC50 >=1:20)；
● 以前没有抗流感疫苗接种；
● 服从接受抗流感疫苗接种。
在疫苗接种时和在疫苗接种后约3周，从每位患者抽约20 ml 血到肝素化的实验试管中。
2. 参照病毒分离物的培养
在添加了10%灭活胎牛血清(FBS) (在56℃处理30分钟) (EuroClone)、50μg/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素(GIBCO)和2 mM L-谷氨酰胺 (EuroClone)的改进的Eagle培养基(MEM) (GIBCO)中繁殖的MDCK (Madin-Darby犬肾)细胞 (ATCC注册号CCL-34TM) 用作细胞系。在37℃、在5% CO2气氛中培养细胞，每周以1:3比例传代2次。对于在该专利申请中所述的实验，使用下面的流感病毒分离物：H1N1, 菌株A/PR/8/34 (ATCC注册号VR-1469TM); H3N2, 菌株A/PC/1/73 (ATCC注册号VR-810),和菌株B/Lee/40 (ATCC注册号VR-101)。使用添加了1μg/ml无血清的胰蛋白酶(SIGMA)的MEM作为培养病毒的培养基。从培养物上清液得到病毒母液，为胞外病毒。简而言之，在感染细胞后，每天观察单层，以监视细胞病变效应的出现。通常，在感染后4天，收集上清液，在1000 RCF (相对离心力)离心10分钟，以消除细胞碎片，并用0.22μm过滤器(MILLIPORE)过滤。然后将上清液等分，并在-80℃保藏，作为无细胞的病毒。
3. 来自外周血 B 淋巴细胞的单克隆抗 - 流感病毒抗体的选择
使用Cole等人, 1984 Cancer Research 22:2750-2753以前所述的通过用EB病毒(EBV) 感染B淋巴细胞的转化方法，生产来自患者的单克隆抗体。通过ELISA，评估得到的来自不同克隆的上清液中抗体的存在。然后为后续表征选择能在上清液中生产IgG抗体的克隆，所述IgG抗体能在ELISA中与被2种参照分离物亚型H1N1和H3N2感染的细胞裂解物反应。更具体地，以高感染复数，用前述分离物感染MDCK细胞。感染后约48小时，使细胞脱离烧瓶，并在PBS中洗涤2次。然后将细胞沉淀悬浮于300μl裂解溶液(100mM NaCl, 100mM Tris pH 8和0.5% Triton-X)中，并在冰中保藏20分钟。在10000g离心掉细胞碎片5分钟，在-20℃保藏上清液，作为蛋白提取物。关于对照抗原的制备，以相同方式处理未感染的细胞。使用BCATM 蛋白测定试剂盒(Pierce)，一式两份地测定上清液蛋白浓度。简而言之，通过参照用一系列已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)稀释液得到的标准曲线，测定样品蛋白剂量。用分光光度计，在540nm的波长，测量每个样品的吸光度。然后将这样得到的裂解物用于包被(300 ng/孔) ELISA平板(COSTAR)，将其在4℃ 温育过夜。次日，用蒸馏水洗涤平板，并在37℃用PBS/1% BSA (Sigma)封闭45分钟。然后，将40 μl来自每个克隆的上清液加入每个孔中，将其在37℃温育1小时。用PBS/0.5%吐温-20 (Sigma)洗涤(WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin)5次后，向每个孔中加入40 μl过氧化物酶缀合的抗-人Fc (1:4000，在PBS/1% BSA中, Sigma)，在37℃温育平板1小时。用PBS/0.5%吐温-20再洗涤5次后，向每个孔中加入40 μl TMB过氧化物酶底物(Pierce)。约15分钟后，通过加入40 μl H2SO4，阻断酶活性，用设定在450nm的分光光度计测量信号。对6个推定克隆的上清液特别注意，所述推定克隆能生产交叉反应性抗体(分别命名为cINF4, cINF16, cINF28, cINF39, cINF43和cINF47)，即能识别被属于H1N1亚型的菌株感染的细胞裂解物和被属于H3N2亚型的菌株感染的细胞裂解物。
4. 来自交叉反应性克隆的 Fab 片段的制备
将编码能与流感病毒反应的单价Fab链的基因克隆进原核表达载体。这可以避免由于生产抗体的细胞克隆的不稳定性造成的问题，以从分子角度更好地表征编码基因，从而具有可任意支配的确定单克隆的分子以及增加量的每种单个的抗体。
根据本身已知的方法，从培养的克隆提取信使RNA (mRNA)，并使用寡-dT进行逆转录。然后通过(CSH press, Phage display manual, ed. D.R.Burton, p. A1.6) 所述的方法，扩增编码轻链和Fd片段(即存在于Fab片段中的重链部分)的cDNA。然后将这样得到的cDNA克隆进命名为pCb3/CAF (Burioni等人, J. Imm. Meth, 1988)的本身已知的表达载体中。简而言之，在37℃用限制酶XhoI和SpeI (Roche)消化编码每个Fab的重链 Fd部分的基因(扩增的DNA) 1.5小时，随后插入也用相同酶消化的载体的重链克隆位点。相反，用酶SacI和XbaI (Roche)消化轻链(扩增的DNA)，并克隆进同样消化的载体。
根据标准化的使用0.2 cm小池的方法(电压: 2500 V; 电容: 25μF; 电阻: 200 Ω)，将这样得到的每个克隆的重组构建体用于电转化大肠杆菌菌株XL1Blue (通过在甘油中冷洗涤处于感受态)。平行地，分析选择的克隆的轻链可变部分和重链可变部分的DNA序列。所述序列提供在序列表中。突变图谱的分子分析显示出每个克隆的归因于抗原诱导的体细胞突变过程的图片。
5. 通过克隆进 PCb3/CAF 得到的单克隆 Fab 的 ELISA 评估
在克隆结束时，使用通过热休克得到的细菌培养物的粗裂解物，通过ELISA，对于每个单克隆抗体分析40个重组的细菌克隆。更具体地，将用构建体PCb3/CAF转化的细菌的克隆接种进10 ml SB培养基，其含有分别在50μg/ml和10μg/ml的氨苄西林和四环素，并在37℃在摇动下培养，直到达到O.D.600 = 1。随后，以1mM的终浓度，加入特异性的诱导物(IPTG - 异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)，将培养物在30℃摇动过夜。通过热休克(3个冷冻/融化循环，分别在-80℃和37℃)裂解细胞，然后离心，从含有Fab的上清液分离细胞碎片。通过ELISA测定得到的可溶Fab。用来自被上述参照病毒分离物感染的细胞的裂解物包被96-孔微量滴定板(Nunc)。将从未感染的细胞得到的裂解物用作阴性对照。然后将用按照所述得到的300 ng裂解物包被ELISA平板在4℃放置过夜。次日，去除未结合的抗原后，用PBS洗涤平板5次，在37℃用在PBS中的3%白蛋白封闭非特异性的结合位点1小时。去除封闭溶液后，加入含有可溶Fab的如上所述处理过的细胞培养物的上清液，随后在37℃温育2小时。用PBS/0.05%吐温 20洗涤10个循环后，加入40μl辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-人Fab免疫球蛋白多克隆制品(Sigma)在PBS/1% BSA中的1:700稀释液。在37℃温育1小时并另外洗涤10次后，向孔中加入底物(OPD-邻苯二胺)。然后在室温在黑暗中温育平板30分钟。用1N硫酸猝灭反应，通过在450nm分光光度计读数，评估光密度。所有测定的克隆表现出针对从感染的细胞得到的裂解物的反应性。因而为每个交叉反应性单克隆选择一个用表达载体转化的细菌克隆，所述表达载体含有编码人抗体轻链和重链Fd片段的基因对。
这样的细菌克隆能生产能结合分离物A/PR/8/34 (H1N1)和分离物A/PC/1/73 (H3N2)的人Fab。这些克隆(含有关的基因对)命名为INF4, INF16, INF28, INF39, INF43和INF47。
6. Fab 的纯化
从而通过用所述表达载体转化的细菌，生产由上面列出的交叉反应性克隆 (从现在开始，统一称作“克隆”或“Fab”)生产的Fab，然后用由含有蛋白G (~ 2 mg/ml)的琼脂糖树脂组成的柱，能结合人Fab (PIERCE, Illinois)的山羊抗体的多克隆制品与所述蛋白G共价连接，进行免疫亲和纯化。简而言之，将每个克隆的单个菌落接种进10 ml SB培养基，其含有分别在50μg/ml和10μg/ml的氨苄西林和四环素。培养物在37℃生长过夜，然后继代接种进装有500 ml SB的烧瓶中，所述SB中加入了与前面相同浓度的抗生素。用1mM IPTG诱导后，在30℃摇动细胞过夜。在5000 rpm离心培养物25分钟，然后对重新悬浮于PBS中的沉淀进行声处理。为了去除细胞碎片，在18,000 rpm另外离心25分钟是必要的。过滤上清液，然后使它缓慢地穿过上述琼脂糖柱。此后，用10体积的PBS洗涤树脂，最后用酸性溶液(洗脱缓冲液 - H2O/HCl pH 2,2)洗脱结合的Fab。用适当溶液(1M Tris pH 9)中和收集的不同级分，并通过超滤(Centricon, Millipore)进行浓缩。通过将一份等分试样跑12%聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠凝胶(SDS-PAGE)，评估纯化的Fab的纯度。最后，通过上述的ELISA，测定纯化的Fab的连续稀释液。在每个平板中，包含针对HCV E2糖蛋白的单克隆Fab制品作为阴性对照。该实验的结果证实了以前用细菌裂解物得到的结果。
7. 通过克隆进 PCb3/CAF 得到的单克隆 Fab 的免疫荧光评估
为了确认通过ELISA得到的数据，还通过免疫荧光测定法分析交叉反应性抗流感Fab。简而言之，用胰蛋白酶处理来自受感染的培养物的细胞，在PBS中洗涤2次后，在显微镜下用血细胞计数器计数。通过在细胞离心机 (Cytospin4, Shandon Southern Products)中在90 g离心3分钟，将细胞悬浮液这样用于制备载玻片。这样制备的载玻片每片含有共2 x 105细胞。用未感染的细胞同样制备对照载玻片。然后固定细胞，并在室温用甲醇-丙酮溶液(在 -20℃的温度使用)透化10分钟。在PBS中洗涤3次后，在控湿室中在37℃与不同克隆 (100 µg/ml)一起温育细胞30分钟，随后在PBS中洗涤3次。在控湿室中、在黑暗中、在37℃，用在伊文思蓝中1:200稀释的荧光素异硫氰酸酯缀合的山羊Fab (Sigma)，温育细胞30分钟。在荧光显微镜(Olympus)下检查载玻片。对M1 流感病毒蛋白特异性的商业化的小鼠单克隆(Argene)用作阳性对照。针对丙型肝炎病毒的E2糖蛋白的抗体(e509; Burioni等人, Hepatology, 1998)用作阴性对照。通过免疫荧光，所有重组的Fab都表现出反应性，其对菌株A/PR/8/34 (H1N1)感染的细胞和菌株A/PC/1/73 (H3N2) 感染的细胞都是特异性的。相反，在未感染的细胞、乙型菌株感染的细胞或阴性对照抗体感染的细胞中没有看到荧光。
8. 中和测定法
为了表征选择的克隆的体外生物活性，为在该研究中使用的3种参照病毒分离物设计了中和测定法。简而言之，将MDCK细胞接种进96-孔平板中的MEM-10% FBS中(2x104细胞/孔)。在维持培养基(含有2% FBS的MEM)中制备如上所述得到的病毒母液的系列稀释液(从10-1至10-8)。每个稀释重复6次。当培养的细胞汇合时，取出生长培养基，向每个孔中加入100μl每种病毒稀释液。在37℃ 1小时后，取出接种物，将加入了1μg/ml 胰蛋白酶的200μl MEM培养基放入每个孔中。使用Reed-Muench的公式，计算病毒滴度，表达为TCID50 (感染50%细胞培养物的剂量)：
参考得到的数据，稀释病毒母液，以便在中和实验中使用约0.01 (1病毒颗粒/100细胞)的感染复数 (M.O.I.)。在实际的中和测定法中，将MDCK细胞接种进24-孔平板，每个孔含有无菌载玻片。在80%-90%汇合的细胞上（即在接种后约48小时）进行中和实验。然后制备纯化的Fab片段的稀释液，从而得到每种抗体的2.5 μg/ml、5 μg/ml、10μg/ml和20 μg/ml终浓度。制备e509 抗-HCV抗体的对应稀释液作为阴性对照。然后在37℃，用相同体积的稀释的病毒母液 (M.O.I.: 0.01)温育不同的Fab浓度1小时。随后将250μl病毒-Fab混合物加入含有细胞的孔中。通过只将培养基加入病毒母液中，制备感染的阳性对照。在37℃温育平板1小时，以允许未中和的病毒吸附。然后取出接种物，用PBS洗涤细胞2次。将1.5 ml含有1 μg/ml胰蛋白酶的无血清培养基加入每个孔中。在37℃温育6小时后，用PBS洗涤细胞单层，并用冷的甲醇-丙酮溶液(1:2比例，保藏在-20℃)在室温固定10分钟。洗涤固定的细胞，并在控湿室中在37℃与250μl 商业化的单克隆抗-M1抗体(Argene)一起温育30分钟。用PBS洗涤细胞，最后在控湿室中在黑暗中在37℃用在伊文思蓝中稀释的荧光素缀合的山羊抗-小鼠抗体温育30分钟。在PBS中洗涤3次后，在荧光显微镜下最后检查载玻片。如下测定Fab的中和活性：计数单个阳性的细胞，并计算受感染细胞的数目相对于被单独的病毒感染的阳性对照的百分比降低。对于每种Fab，在3个分开的期间，进行中和测定法。具体地，针对前面提及的2种不同的参照甲型流感菌株和参照乙型菌株，测定每个克隆。在每个实验中，一式三份地重复不同的Fab稀释液，对于感染的阴性(Fab e509 抗-E2/HCV)和阳性(病毒和没有Fab的培养基)对照进行同样的操作。
在6种测定的交叉反应性的Fab中，由克隆INF28生产的Fab表现出抗甲型病毒分离物的异型交叉中和活性。相反，关于在研究中使用的乙型病毒的感染能力，没有检测到降低，这证实了观察到的中和活性的特异性。更具体地，由克隆INF28生产的Fab (称作Fab 28)表现出低于5 µg/ml（在H1N1亚型的情况下）和约10 µg/ml（在H3N2亚型的情况下）的IC50 (使测定的病毒分离物的感染抑制50%的Fab浓度)，即通过体内施用目标分子可容易地得到的浓度，甚至不考虑当Fab转化成整个免疫球蛋白形式（在本发明的范围内包括的可能的药物制剂之一）时通常观察到的中和生物活性的显著增加。
图1-3总结了由克隆INF28生产的Fab 28在对研究用的不同流感病毒分离物上进行的不同中和期间中得到的结果。具体地，图1是解释不同Fab 28浓度对病毒A/PR/8/34 (H1N1)的中和百分比的图。将用人e509 抗-HCV Fab得到的结果报告为阴性对照。图2是解释不同Fab 28浓度对病毒A/PC/1/73 (H3N2)的中和百分比的图。将用人e509 抗-HCV Fab得到的结果报告为阴性对照。图3是解释不同Fab 28浓度对病毒B/Lee/40的中和百分比的图。将用人e509 抗-HCV Fab得到的结果报告为阴性对照。
9. 被 Fab 28 识别的抗原的表征 : 对来自受感染的细胞的裂解物的蛋白质印迹
将10 µg如前所述制备的用菌株A/PR/8/34 (H1N1)感染的细胞裂解物在天然条件下跑10%聚丙烯酰胺凝胶。为此目的，在适当的冷冻罐 (BIORAD)中在100V跑样品1小时。此后，从电泳仪取出凝胶，在转移缓冲液(Tris碱3g; 甘氨酸 14.41 g, dH2O 800 ml, 甲醇 200 ml)中温育10分钟，以便消除任何去污剂残留。然后转移到在30V和90mA的硝酸纤维素膜(Hybond-ECL; Amersham Biosciences)上过夜。然后用溶解在1X PBS中的5%奶粉封闭膜1小时，然后在1X PBS – 0.1%吐温中洗涤3次。在每次洗涤过程中，在摇摆平台上摇动膜10分钟。此后，以5 µg/ml的浓度，加入在含有5%奶粉的PBS中稀释的不同Fab。除了Fab 28以外，加入下面的对照: e509作为阴性对照; 商业化的小鼠抗-HA完整IgG1 (COVANCE); 商业化的小鼠抗-M1完整IgG1 (ARGENE);小鼠抗-M2完整IgG1 (ABCAM); 1:200稀释的人血清。在室温摇动每种抗体1小时。此后，如前所述在PBS中再次洗涤膜。然后根据要检测的抗体的来源，加入关于ELISA测定法所述的相同第二小鼠(1:1000)或人(1:2000)抗体。为了检测信号，如下制备工作溶液：以1:1比例混合2种底物 (SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce)，特别小心地不使它暴露于光源。用工作溶液温育硝酸纤维素膜5分钟，然后取出，并在HyperCassette (AMERSHAM)中固定。暴露必要的时间后，在暗室中在Kodak X-射线胶片上将其显影。在2个不同的期间进行所述测定法，在其中的每一个中，用Fab 28温育的膜部分证实分子量略小于80 KDa的带的存在，这与病毒血凝素的不成熟形式(HA0)的分子量相一致。也显示在用抗-血凝素对照抗体温育的条上的相同带，对此予以确认。在用人血清温育的膜部分中也检测到类似的带，它比其它带更强。该实验的结果证实，抗体针对流感病毒血凝素，与中和数据完全一致，因为已知血凝素是免疫中和抗体应答的靶物。
10. 通过噬斑减少测定法进行的中和测定法
通过使用噬斑测定技术来更精确地评估Fab 28的中和活性，进行中和测定法。首先，用下面的方法，通过噬斑测定法，定量病毒分离物亚型H1N1和H3N2的制品。在6孔平板 (Costar)中，在添加了青霉素和链霉素(pen/strep)且富含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养基中，培养MDCK细胞。细胞单层已经达到100%汇合后，用PBS和添加了相同抗生素(pen/strep)的新鲜MEM 培养基洗涤孔，并加入胰蛋白酶 (1 µg/ml)。在相同孔中制备病毒母液的系列稀释液，在34℃、在5% CO2气氛下，使病毒吸附1小时。然后抽吸培养基，用PBS洗涤2次。在不超过42℃的温度，轻轻加入更多的添加了抗生素、胰蛋白酶 (1 µg/ml)和0.8%琼脂糖的MEM。感染后，在相差光学显微镜下检查细胞单层的健康状况，在34℃、在5% CO2气氛下温育平板。感染后48小时，取出琼脂糖层，非常小心地不破坏细胞单层。此后，向孔中加入添加了结晶紫 (1% w/v)的70%甲醇水溶液。在室温用透化剂/染料温育平板5分钟。温育后，在室温用蒸馏水洗涤平板，在层流下干燥5分钟。最后，在相差显微镜下在4X放大率评估PFU(噬斑形成单位)数。一旦已经将病毒滴度计算为PFU，计算对应的TCID50，并通过终点有限稀释技术，将该相同的滴度与类似的病毒母液的滴度相对比。
上述滴定允许定量病毒，以精确评估Fab 28的活性。类似于上面关于噬斑测定法所述的滴定操作，建立几个平板。从而制备中和混合物，其包含病毒(100 TCID50/孔)和不同浓度的使用的Fab (Fab 28和对照Fab)。更具体地，通过针对100 TCID50的不同流感病毒菌株测试不同浓度的Fab(20, 10, 5和2.5 µg/ml)，进行测定。然后在34℃、在5% CO2气氛下温育病毒/Fab混合物1小时。用PBS洗涤MDCK细胞后，将预温育的制品转移进具有100%汇合的细胞单层的孔中，然后在34℃、在5% CO2气氛下温育1小时。如前所述进行测定和解释，其中将在有Fab 28存在下得到的噬斑数与在有相同浓度的对照Fab存在下得到的噬斑数进行对比。
使用下面的属于亚型H1N1和H3N2的流感分离物，进行测定:
H1N1:
A/Malaya/302/54
A/PR/8/34
H3N2:
A/Aichi/68
A/Victoria/3/75
A/Port Chalmers/1/73
结果证实了Fab 28针对流感病毒H1N1 A/Malaya/302/54和A/PR/8/34的中和活性，也证实了低于2.5 µg/ml的IC50值。也证实了抗流感病毒H3N2 A/Aichi/68、A/Victoria/3/75和A/Port Chalmers/1/73的异亚型中和活性(IC50 约20 µg/ml)。
11. 被 Fab 28 识别的表位的鉴别
遵循几个方案来鉴别被Fab 28识别的血凝素区域，它们识别表位的能力，尽管构象性的，已被以前的实验证实了。实际上，得到的Fab 28仅在半天然条件下(0.1% SDS)进行的蛋白质印迹测定法中能识别蛋白。相同的实验也已经证实了Fab的仅识别蛋白的不成熟形式(HA0)、但是不识别单个亚基(HA1和HA2)的能力。已经用鸡红细胞和人红细胞平行地进行了血凝抑制测定法(HAI)。尽管有显著的中和活性，Fab 28被证实不具有HAI活性，表明它不结合参与血凝素和唾液酸之间的结合的残基。
为了更好地表征表位，遵循2个互补的策略：选择在噬菌体呈现文库中包含的随机肽序列，其能结合Fab 28单克隆抗体；和通过Fab 28的选择压力，体外诱导能逃脱抗体的中和活性的病毒变体(逃脱突变体)。
通过淘选技术从肽文库进行选择，允许鉴别许多能特异性地结合Fab 28 独特型的肽。分析所有鉴别出的肽，以便建立共有序列。这样的共有序列然后用于属于H1N1亚型的血凝素晶体的计算机分析。通过该分析，可以揭示可能被Fab 28识别的区域。考虑到它与以前得到的结果的相容性，以及与用逃脱突变体方案平行地产生的结果的相容性，对一个表位特别地进行进一步分析。该表位位于血凝素的茎区域，它是在区域HA1和HA2之间的部分中(数据与在蛋白质印迹和HAI测定法中得到的结果非常一致)。鉴别出的对于结合而言至关重要的残基如下: 在区域 HA2上的W357和T358; 在区域 HA1上的N336; I337; P338 (残基的编号是指来自BLAST数据库中的分离物H1N1/A/PR/8/34的血凝素序列) (SEQ ID NO:5)。
通过在有10 µg/ml Fab 28（即相当于它抗目标分离物的IC90的Fab浓度）存在下，用100 TCID50 的H1N1/A/PR/8/34病毒对MDCK细胞进行系列感染，进行逃脱突变体测定。仅在几次传代后，可以检测在有Fab存在下细胞的感染，这指示在病毒基因组中发生的突变。实际上，选择出在区域 HA2、I361和D362的2个残基中突变的逃脱突变体，所述区域邻近通过计算机方案鉴别出的区域，证实了这是被Fab 28识别的区域的假设。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表
<110> POMONA BIOTECHNOLOGIES LLC
<120> 能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体
<130> E072218-EC
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Val
35 40 45
Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro
85 90 95
Ser Ala Ile Phe Gly Ile Tyr Ile Ile Leu Asn Gly Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Gly
35 40 45
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
65 70 75 80
Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala His Ser Phe Pro Leu Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
ctcgaggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca 60
gcctctggat tccccttcag tagttatggc atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag 120
gggctggagt gggtggcagg tgtttcatat gatggaagtt ataaatacta tgcggactcc 180
gtcaagggcc gattcaccat ctccagagac agttccaaga gcactctata tctgcaaatg 240
aacagcctga gacctgagga cacggctgtg tattactgtg cgagaccttc cgcgattttt 300
ggaatataca ttattctaaa cggtttggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcttca 366
<210> 4
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gagctcacgc agtctccatc ttccgtgtct gcatctgtag gagacagagt cactatcact 60
tgtcgggcga ctcagggtat tagtagttgg ttagcctggt atcagcagaa accagggaaa 120
ccacctaaac tcctgatttt tggtgcatct agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc 180
agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagtctaca gcctgaagat 240
tttgcaactt acttttgtca acaggctcac agtttcccgc tcactttcgg cggcgggacc 300
aaggtggaga tcaaa 315
<210> 5
<211> 565
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Lys Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Asp Pro Leu Leu Pro Val Arg Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn
130 135 140
Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Glu Gly Lys Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Glu Gly Ser Tyr Pro Lys
165 170 175
Leu Lys Asn Ser Tyr Val Asn Lys Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Ile His His Pro Pro Asn Ser Lys Glu Gln Gln Asn Leu Tyr
195 200 205
Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Thr Ser Asn Tyr Asn Arg
210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Glu Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Ala
225 230 235 240
Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile
245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Met Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met
275 280 285
His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Tyr Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
Asn Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
340 345 350
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln
515 520 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg Ile Cys Ile
565

Claims (14)

1.针对甲型流感病毒血凝素抗原的单克隆抗体，其能结合且中和甲型流感病毒亚型H1N1和H3N2，其中所述单克隆抗体至少包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成，且所述轻链可变结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成。
2.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述重链可变结构域由核苷酸序列SEQ ID NO:3编码，且所述轻链可变结构域由核苷酸序列SEQ ID NO:4编码。
3.根据权利要求1的单克隆抗体，其选自完整免疫球蛋白和至少包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的免疫球蛋白片段。
4.根据权利要求3的单克隆抗体，其中所述免疫球蛋白片段选自包含下列的组：Fab片段, Fab’片段, F(ab’)2片段, Fv片段, 单链抗体(scFv)。
5.根据权利要求1的单克隆抗体，它是人或人化的抗体。
6.抗-独特型抗体，其特异性地针对根据权利要求1 - 5中任一项的单克隆抗体的独特型。
7.选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的分离的核苷酸序列。
8.表达载体，其包含核苷酸序列 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4二者。
9.用根据权利要求8的表达载体转化的宿主细胞。
10.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1 – 6中任一项的至少一种抗体和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
11.根据权利要求1 – 6中任一项的抗体用于生产预防性或治疗性药剂的应用，所述药剂用于甲型流感病毒感染或由甲型流感病毒感染直接或间接造成的病理学。
12.根据权利要求11的应用，其中所述由甲型流感病毒感染造成的病理学是流感综合征。
13.根据权利要求1 - 5中任一项的单克隆抗体在制备用于检测具有异亚型交叉中和性质的抗-流感病毒抗体在患者的生物样品中的存在的测定方法中的试剂盒中的用途。
14.用于检测免疫原或疫苗组合物中甲型流感病毒表位的存在的测定方法，所述甲型流感病毒表位能在施用它的受试者中引出具有针对甲型流感病毒的异亚型交叉中和性质的抗-甲型流感病毒抗体，所述方法包含，使所述组合物接触作为特异性测定试剂的根据权利要求1 - 5中任一项的单克隆抗体。
CN200980117842.2A 2008-03-17 2009-03-16 能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体 Active CN102037013B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000204A ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2008-03-17 Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO2008A000204 2008-03-17
PCT/IB2009/051068 WO2009115972A1 (en) 2008-03-17 2009-03-16 Monoclonal antibodies capable of reacting with a plurality of influenza virus a subtypes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102037013A CN102037013A (zh) 2011-04-27
CN102037013B true CN102037013B (zh) 2015-01-28

Family

ID=40293277

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980117842.2A Active CN102037013B (zh) 2008-03-17 2009-03-16 能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体

Country Status (22)

Country Link
US (3) US9200063B2 (zh)
EP (1) EP2274335B2 (zh)
JP (1) JP5542118B2 (zh)
KR (1) KR101605573B1 (zh)
CN (1) CN102037013B (zh)
AU (1) AU2009227567B2 (zh)
BR (1) BRPI0909123B8 (zh)
CA (1) CA2718923C (zh)
DK (1) DK2274335T3 (zh)
EA (1) EA027069B1 (zh)
ES (1) ES2544968T5 (zh)
HU (1) HUE025329T2 (zh)
IL (1) IL208210A0 (zh)
IT (1) ITTO20080204A1 (zh)
MX (1) MX2010010120A (zh)
MY (1) MY157359A (zh)
NZ (1) NZ588238A (zh)
PL (1) PL2274335T3 (zh)
PT (1) PT2274335E (zh)
SG (1) SG188890A1 (zh)
WO (1) WO2009115972A1 (zh)
ZA (1) ZA201006934B (zh)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITTO20070066A1 (it) 2007-01-30 2008-07-31 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali anti-idiotipo mimotopi dell'antigene gp 120 di hiv
WO2009079259A2 (en) 2007-12-06 2009-06-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against influenza virus and methods of use thereof
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
US9340603B2 (en) 2008-07-25 2016-05-17 Institute For Research In Biomedicine Neutralizing anti-influenza A virus antibodies and uses thereof
ITTO20080964A1 (it) 2008-12-22 2010-06-23 Natimab Therapeutics S R L Anticorpo monoclonale anti-hcv come medicamento per il trattamento terapeutico e la prevenzione di infezioni da hcv
EP2413962A1 (en) 2009-03-30 2012-02-08 Mount Sinai School of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
MX2011011331A (es) 2009-05-11 2011-11-18 Crucell Holland Bv Moleculas de union humanas capaces de neutralizar el virus de la influenza h3n2 y usos de las mismas.
IT1395961B1 (it) 2009-06-01 2012-11-02 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali come medicamento per il trattamento terapeutico e/o profilattico delle infezioni da virus influenzale a (h1n1) di origine suina (s-oiv)
US9458226B2 (en) 2009-10-09 2016-10-04 Emory University Recombinant antibodies against H1N1 influenza
CA2790380A1 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Mount Sinai School Of Medicine Vaccines for use in the prophylaxis and treatment of influenza virus disease
ITTO20100237A1 (it) * 2010-03-26 2011-09-27 Pomona Biotechnologies Llc Immunoglobuline intere della classe delle igg per l'uso come medicamento antinfluenzale
SI2552485T1 (sl) * 2010-03-26 2017-05-31 Pomona Ricerca S.R.L. Imunoglobulini polne dolžine igg izotipa, sposobni prepoznave heteropodtipskega nevtralizacijskega epitopa na hemagglutininskem izvornem področju in njih uporaba kot zdravilo proti gripi
ITTO20110067A1 (it) * 2011-01-26 2012-07-27 Pomona Ricerca Srl Immunoglobuline intere di isotipo igg atte a riconoscere un epitopo di neutralizzazione eterosubtipica sulla regione stelo (stem region) dell'emoagglutinina e loro uso come medicamento antinfluenzale
CN102939103A (zh) 2010-03-30 2013-02-20 西奈山医学院 流感病毒疫苗及其应用
US9534042B2 (en) 2010-09-03 2017-01-03 Fujita Health University Influenza virus-neutralizing antibody and screening method therefor
EP3699286A1 (en) 2011-04-20 2020-08-26 The Trustees of the University of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
CN102775469B (zh) * 2011-05-12 2018-02-09 厦门大学 甲型流感病毒核衣壳蛋白的抗原表位及其用途
EP3418300B1 (en) 2011-07-18 2020-10-28 Institute for Research in Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
CN104185476A (zh) 2011-09-20 2014-12-03 西奈山医学院 流感病毒疫苗及其应用
US9321829B2 (en) 2011-10-18 2016-04-26 Emory University Antibodies directed against influenza
AU2012346669B2 (en) * 2011-12-02 2017-08-31 Kling Biotherapeutics B.V. Influenza A virus specific antibodies
US9969794B2 (en) 2012-05-10 2018-05-15 Visterra, Inc. HA binding agents
WO2014078268A2 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Genentech, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
CN108641002A (zh) 2012-12-18 2018-10-12 西奈山伊坎医学院 流感病毒疫苗及其用途
US9908930B2 (en) 2013-03-14 2018-03-06 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP3733244A1 (en) 2013-10-02 2020-11-04 Medlmmune, LLC Neutralizing anti-influenza a antibodies and uses thereof
PT3142750T (pt) 2014-05-13 2020-09-22 Univ Pennsylvania Composições que compreendem aav expressando construções de anticorpos duplos e suas utilizações
CN113563462A (zh) 2014-07-15 2021-10-29 免疫医疗有限责任公司 中和抗乙型流感抗体及其用途
TWI701258B (zh) 2014-12-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
WO2016118937A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
US11535665B2 (en) 2015-05-13 2022-12-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
RU2721706C2 (ru) 2015-06-01 2020-05-21 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Нейтрализующие связывающие молекулы, направленные против вируса гриппа, и пути их применения
WO2017083627A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
CN116271017A (zh) 2016-01-13 2023-06-23 免疫医疗有限责任公司 治疗甲型流感的方法
CN109641041A (zh) 2016-06-15 2019-04-16 西奈山伊坎医学院 流感病毒血细胞凝集素蛋白及其用途
SI3589730T1 (sl) 2017-02-28 2024-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-povezan virus (AAV) clade F vektor in njihova uporaba
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
KR20190135000A (ko) 2017-02-28 2019-12-05 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Aav 벡터를 기반으로 하는 인플루엔자 백신
CA3058652A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
US20210341475A1 (en) * 2018-06-11 2021-11-04 Glaxosmithkline Consumer Healthcare Holdings (Us) Llc Antibody pairs for use in a rapid influenza a diagnostic test
KR20200060969A (ko) * 2018-11-23 2020-06-02 (주)셀트리온 인플루엔자 바이러스 질환을 치료하기 위한 투여 요법
CN113924147A (zh) 2019-03-25 2022-01-11 威特拉公司 用于治疗和预防流感的组合物和方法
EP4256065A2 (en) 2020-12-01 2023-10-11 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel compositions with tissue-specific targeting motifs and compositions containing same
JP2024515788A (ja) 2021-04-27 2024-04-10 ジェネレーション バイオ カンパニー 治療抗体を発現する非ウイルスｄｎａベクター及びその使用
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
CN115724952B (zh) * 2022-07-13 2023-10-31 扬州大学 一种靶向甲型流感病毒保守线性b细胞表位的广谱单克隆抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0675199A2 (en) * 1994-03-30 1995-10-04 Takara Shuzo Co. Ltd. A DNA which codes for the variable region of the anti-human influenza A type virus antibody recognizing the H,N, and H2N2 subtypes of haemagglutinin

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA836080B (en) 1982-08-23 1984-04-25 Scripps Clinic Res Broad spectrum influenza antisera
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US6812024B2 (en) 1987-03-16 2004-11-02 Mcgready Roland Keith Anti-paratopic antibody as an immunogen
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
WO1992015885A1 (en) 1991-03-11 1992-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods for selecting antibody reagents; anti-idiotype antibodies; and aids vaccine formulations
ATE255902T1 (de) 1992-03-09 2003-12-15 San Diego Regional Cancer Ct Ein anti-idiotypischer antikörper und seine verwendung in der diagnose und therapie von hiv- verwandten krankheiten
EP0621339B1 (en) 1992-09-17 2001-10-24 Takara Shuzo Co. Ltd. Immunogenic human influenza A virus haemagglutinin polypeptides
GB9221654D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant human anti-cytomegalovirus antibodies
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
WO2000005266A1 (en) 1998-07-21 2000-02-03 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Anti hepatitis c virus antibody and uses thereof
WO2002055560A2 (en) 2000-12-01 2002-07-18 The Gouvernment Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies specific for the e2 glycoprotein of hepatitis c virus and their use in the diagnosis, treatment, and prevention of hepatitis c
FR2817869B1 (fr) * 2000-12-07 2005-01-14 Technopharm Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci
US6768004B2 (en) 2001-01-11 2004-07-27 Mueller Sybille Nucleotide sequences encoding variable regions of heavy and light chains of monoclonal antibody 1F7, an anti-idiotypic antibody reactive with anti-HIV antibodies
US6964199B2 (en) 2001-11-02 2005-11-15 Cantocor, Inc. Methods and compositions for enhanced protein expression and/or growth of cultured cells using co-transcription of a Bcl2 encoding nucleic acid
WO2003059953A2 (en) 2002-01-17 2003-07-24 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Anti-idiotypic antibody inducing hiv-1 neutralizing antibodies
ITRM20020049A1 (it) 2002-01-30 2003-07-30 Biostrands S R L Frammenti fab di anticorpi monoclonali umani diretti contro la glicoproteina e2 di hcv e dotati di potere neutralizzante in vitro.
AU2007249160B2 (en) * 2006-05-15 2013-09-12 I2 Pharmaceuticals, Inc. Neutralizing antibodies to influenza viruses
MY170607A (en) 2006-09-07 2019-08-20 Crucell Holland Bv Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h5n1 and uses thereof
BRPI0707728A2 (pt) 2006-09-15 2011-05-10 Fraunhofer Usa Inc anticorpos de gripe, composiÇço compreendendo os mesmos e seus usos em diagnàsticos e anÁlises clÍnicas
ITTO20070066A1 (it) 2007-01-30 2008-07-31 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali anti-idiotipo mimotopi dell'antigene gp 120 di hiv
US20100316563A1 (en) 2007-09-20 2010-12-16 Bracco Imaging S.P.A. Method For The Preparation Of New Oligoclonal Antibodies
ITTO20080204A1 (it) * 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
ITTO20080964A1 (it) 2008-12-22 2010-06-23 Natimab Therapeutics S R L Anticorpo monoclonale anti-hcv come medicamento per il trattamento terapeutico e la prevenzione di infezioni da hcv
IT1395961B1 (it) 2009-06-01 2012-11-02 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali come medicamento per il trattamento terapeutico e/o profilattico delle infezioni da virus influenzale a (h1n1) di origine suina (s-oiv)
SI2552485T1 (sl) 2010-03-26 2017-05-31 Pomona Ricerca S.R.L. Imunoglobulini polne dolžine igg izotipa, sposobni prepoznave heteropodtipskega nevtralizacijskega epitopa na hemagglutininskem izvornem področju in njih uporaba kot zdravilo proti gripi

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0675199A2 (en) * 1994-03-30 1995-10-04 Takara Shuzo Co. Ltd. A DNA which codes for the variable region of the anti-human influenza A type virus antibody recognizing the H,N, and H2N2 subtypes of haemagglutinin

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Prevention and treatment of bronchopneumonia in mice caused by mouse-adapted variant of avian H5N2 influenza A virus using monoclonal antibody against conserved epitope in the HA stem region;Y. A. Smirnov et al.;《Archives of Virology》;20001231;第145卷(第8期);1733-1741 *
Type-and subtype-specific detection of influenza viruses in clinical specimens by rapid culture assay;T Ziegler et al.;《Journal of Clinical Microbiology》;19951231;第33卷(第2期);318-321 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5542118B2 (ja) 2014-07-09
BRPI0909123B8 (pt) 2021-06-01
HUE025329T2 (en) 2016-02-29
MY157359A (en) 2016-05-31
EA027069B1 (ru) 2017-06-30
EP2274335B2 (en) 2022-07-27
KR101605573B1 (ko) 2016-03-22
US9598482B2 (en) 2017-03-21
KR20100126810A (ko) 2010-12-02
NZ588238A (en) 2012-08-31
PT2274335E (pt) 2015-09-18
ES2544968T5 (es) 2022-11-22
BRPI0909123B1 (pt) 2020-12-01
AU2009227567B2 (en) 2014-06-26
WO2009115972A1 (en) 2009-09-24
US20160200801A1 (en) 2016-07-14
IL208210A0 (en) 2010-12-30
MX2010010120A (es) 2010-12-02
CA2718923A1 (en) 2009-09-24
EP2274335A1 (en) 2011-01-19
US9587011B2 (en) 2017-03-07
US20160060325A1 (en) 2016-03-03
ITTO20080204A1 (it) 2009-09-18
AU2009227567A1 (en) 2009-09-24
US20110014187A1 (en) 2011-01-20
ES2544968T3 (es) 2015-09-07
PL2274335T3 (pl) 2015-10-30
BRPI0909123A2 (pt) 2019-02-26
EP2274335B8 (en) 2015-06-17
EA201071087A1 (ru) 2011-04-29
CN102037013A (zh) 2011-04-27
ZA201006934B (en) 2011-12-28
US9200063B2 (en) 2015-12-01
DK2274335T3 (en) 2015-08-17
CA2718923C (en) 2020-07-07
SG188890A1 (en) 2013-04-30
EP2274335B1 (en) 2015-05-13
JP2011517403A (ja) 2011-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102037013B (zh) 能与复数个甲型流感病毒亚型反应的单克隆抗体
CN102124028B (zh) 对甲型流感病毒h1亚型具有同亚型交叉中和性能的单克隆抗体
Gilchuk et al. Influenza H7N9 virus neuraminidase-specific human monoclonal antibodies inhibit viral egress and protect from lethal influenza infection in mice
AU2008297594B2 (en) Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin and neuraminidase from influenza virus H5-subtype or N1-subtype and uses thereof
WO2012045001A2 (en) Influenza virus antibodies and immunogens and uses therefor
KR20140112495A (ko) 인플루엔자 a 바이러스 특이적 항체
JP6423550B2 (ja) 広域スペクトルモノクローナル抗ＦｌｕＢ抗体およびその使用
MX2014003745A (es) Molecula de union que tiene actividad neutralizadora del virus de la influenza a, producida a partir de celulas b humanas.
Hansen et al. Human anti-N1 monoclonal antibodies elicited by pandemic H1N1 virus infection broadly inhibit HxN1 viruses in vitro and in vivo
Cabral et al. Development and characterization of neutralizing monoclonal antibodies against the pandemic H1N1 virus (2009)
Yan et al. An epitope on the stem region of hemagglutinin of H1N1 influenza A virus recognized by neutralizing monoclonal antibody
Cabral et al. Development of neutralizing monoclonal antibodies against the pandemic H1N1 virus (2009) using plasmid DNA immunogen

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant