BRPI0909123B1 - Anticorpos monoclonais, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, uso do referido anticorpo, kit de diagnóstico e métodos de ensaio paradetectar a presença de epítopos de vírus de influenza a - Google Patents

Anticorpos monoclonais, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, uso do referido anticorpo, kit de diagnóstico e métodos de ensaio paradetectar a presença de epítopos de vírus de influenza a Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAIS, POLIPEPTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E ANTICORPO ANTI-IDIOTIPO RECOMBINANTES, USOS DESTES, KIT DE DIAGNÓSTICO E MÉTODOS DE ENSAIO PARA DETECTAR Anticorpos monoclonais dirigidos contra o vírus de influenza A são descritos, que têm a propriedade de ser capazes de ligar uma pluralidade de subtipos do vírus de influenza A. Uma modalidade preferida é o anticorpo designado como Fab 28, que exibe uma atividade de neutralização contra uma plurali-dade de subtipos do vírus de influenza A. Anticorpos anti-idiotipo dirigidos contra os anticorpos monoclonais da invenção, composições de vacina ou imunogênicas compreendendo os anticorpos monoclonais da invenção são também descritos bem como aplicações terapêuticas, profiláticas e de diag-nóstico para os anticorpos monoclonais da invenção. Os anticorpos mono-clonais da invenção também podem ser utilizados para testar preparados de anticorpo a serem utilizados como vacinas.

Description

ANTICORPOS MONOCLONAIS, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO REFERIDO ANTICORPO, KIT DE DIAGNÓSTICO E MÉTODOS DE ENSAIO PARADETECTAR A PRESENÇA DE EPÍTOPOS DE VÍRUS DE INFLUENZA A
[001] A presente invenção está compreendida em geral no campo de imunologia. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno de HA (hemaglutinina) do vírus de influenza A.
Antecedentes da invenção
[002] A epidemia anual de vírus de influenza representa uma causa importante de morbidez e mortalidade em todo o mundo. Nos Estados Unidos da América estima-se que mais de 200.000 pessoas sejam hospitalizadas anualmente por síndromes ligadas a vírus de influenza, com aproximadamente 40.000 mortes mais ou menos diretamente relacionadas ao mesmo (Thompson e outros, JAMA, 2003, 289:179-186). Além desses dados devemos considerar também os casos, em números exponencialmente mais elevados, de sujeitos infectados que permanecem em casa por períodos mais ou menos longos, com repercussões econômicas inevitáveis devido à perda de dias de trabalho. Um trabalho recente (Molinari e outros, Vaccine, 2007, 25:5086-5096) estimou os custos médicos diretamente relacionados à epidemia anual em 10.4 bilhões de dólares norte-americanos por ano, aos quais 16.3 bilhões de dólares norte-americanos devem ser acrescentados por ganhos perdidos devido à ausência do trabalho. Se no cálculo considerarmos outros itens também, como a monetização das perdas econômicas ligadas à morte dos sujeitos infectados, o valor se eleva ao número incrível de 87.1 bilhões de dólares norte-americanos. Esses dados econômicos ligados à epidemia anual, juntamente com uma pandemia temida que pudesse ocorrer a qualquer momento no futuro próximo devido ao surgimento de vírus de influenza novos para o homem, explicam o interesse considerável na busca por estratégias eficazes para conter a difusão desses vírus.
[003] Atualmente, a única ferramenta disponível para enfrentar a epidemia anual de influenza de algum modo é uma vacina trivalente inativada contendo antígenos isolados virais que presumivelmente serão responsáveis pela epidemia do próximo período de influenza. Esse tipo de predição, com base em dados epidemiológicos ligados a isolamentos prematuros em algumas áreas geográficas de sentinela, nem sempre se apresentou como correta. Desse modo, há um risco não totalmente desprezível que está presente ano após ano, de que a vacina trivalente desenvolvida para certo período de influenza poderia provar substancialmente ineficaz.
[004] Nesse caso, bem como no caso de uma nova pandemia, o único meio auxiliar profilático/terapêutico disponível seria recorrer a duas classes disponíveis de drogas antivirais: os inibidores de proteína M2 (amantadina e rimantadina) e os inibidores de neuraminidase (oseltamivir e zanamivir). Entretanto,nessa situação também, uma série de problemas já pode ser esperada, relacionada tanto à necessidade de administrar os antivirais em um estágio muito inicial da infecção, como ao aparecimento rápido, que já ocorreu entretanto, de isolados virais resistentes.
[005] Uma estratégia eficaz alternativa poderia ser baseada em neutralizar preparados de anticorpo dirigidos contra proteínas virais críticas e capazes de reconhecer porções de tais proteínas que são compartilhadas entre os diferentes isolados de vírus de influenza.
[006] Para melhor compreensão do potencial de uma abordagem com base na administração passiva de anticorpos, é útil mencionar brevemente as características estruturais principais dos vírus de influenza. Os vírus de influenza pertencem à família de Orthomyxoviridae e são caracterizados pela presença de um envelope derivado de membranas de células infectadas, nas quais aproximadamente 500 picos estão presentes, também mencionados como projeções. Tais projeções consistem em trímeros e tetrâmeros de duas proteínas de superfície viral importantes: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Uma proteína de membrana integral (M2) também é encontrada na superfície de envelope, cuja proteína está presente em números muito mais baixos em comparação com hemaglutinina e neuraminidase, e também organizada em tetrâmeros.
[007] O vírus de influenza é adicionalmente caracterizado pela presença, no núcleo de um genoma segmentado compreendido de 8 fragmentos de RNA de fita única. Com base nas características de algumas proteínas no vírion (NP e MI), três tipos de vírus de influenza são reconhecíveis: tipo A, tipo B e tipo C.
[008] Os vírus do tipo A e tipo B são responsáveis pela epidemia anual. Em vez disso, os vírus do tipo C são responsáveis por síndromes menos severas.
[009] Nos vírus do tipo A (os únicos responsáveis por pandemia e capazes de causar as síndromes mais severas mesmo durante epidemias anuais), subtipos diferentes são também reconhecíveis com base nas características antigênicas de hemaglutinina e neuraminidase. Os subtipos que afetaram seres humanos no curso da história recente são subtipos H1N1 e H3N2 (ainda circulando atualmente e contidos em preparados de vacinas), bem como o subtipo H2N2, não mais em circulação desde 1968 e responsável pela gripe denominada "Asiática" em 1957. Outros subtipos afetaram esporadicamente seres humanos (H9N2, H7N7, e o tão temido subtipo H5N1 recente), porém não tiveram sucesso em difundir eficazmente e deslocar os subtipos em circulação.
[0010] O papel das proteínas de superfície é essencial no ciclo de replicação viral. Em particular, hemaglutinina é a proteína que permite que o vírus reconheça o ácido siálico presente na superfície de algumas células, e infecte as mesmas. Em vez disso, neuraminidase opera no final do ciclo de replicação viral, isto é, durante a liberação de novas partículas de vírus a partir das células infectadas. Sua função é auxiliar a liberação de hemaglutinina dos vírions recentemente formados a partir do ácido siálico presente na superfície da célula que produziu os mesmos. O papel chave desempenhado por essas duas proteínas, bem como sua exibição na superfície de vírus, explica porque representam o alvo principal da resposta imune, e porque são suscetíveis a uma taxa elevada de mutação. Na realidade, a epidemia anual é causada por vírus que são mais ou menos diferentes daqueles dos anos anteriores, e, portanto, são mais ou menos eficazmente capazes de escapar da resposta imune que estimularam. Em outras palavras, o acúmulo progressivo de mutações de ponto em hemaglutinina (na maior parte) e neuraminidase (em segundo lugar) torna os anticorpos de proteção, produzidos no curso de epidemia anterior, no total progressivamente ineficazes.
[0011] O papel de proteção principal compreendido nas respostas imune anti-influenza é desempenhado pelo componente humoral. Anticorpos exercem seu papel de proteção principalmente interferindo na ligação de hemaglutinina a ácido siálico, desse modo evitando infecção das células. Tal pressão seletiva determina a taxa elevada de mutação em hemaglutinina. Estudos de seqüência executados em subtipo de hemaglutinina H3 de 1968 até 1999 revelaram um total de 101 mutações de aminoácidos (em um total de aproximadamente 560 aminoácidos) com uma média de aproximadamente 3,5 mutações por ano. 60% de mutações que ocorrem no período do estudo foram retidas nos vírus em circulação no ano seguinte também, indicativo da persistência de uma pressão seletiva mediada imune. 95% dessas mutações foram encontradas na subunidade de hemaglutinina HA1, isto é uma diretamente envolvida na ligação com o ácido siálico. Em tal variabilidade elevada, entretanto, alguns resíduos de aminoácidos inalterados foram encontrados, indicativos de seu papel essencial na função da proteína. Essas porções de hemaglutinina representam um alvo potencial para uma resposta de neutralização cruzada em direção a subtipos diferentes de vírus de influenza. Entretanto, é previsível que tais regiões não serão capazes de induzir uma resposta de anticorpo eficaz na maioria dos pacientes, uma vez que o fato de que tais alvos se escondem em áreas imunosilenciosas representou certamente uma etapa de evolução muito favorável para o vírus.
[0012] Na realidade, ao se referir à imunidade anti-influenza, três tipos diferentes de imunidade devem ser levados em consideração, que podem ser bem entendidos à luz dos dados relatados acima:
IMUNIDADE HOMÓLOGA: relacionada ao isolado individual. Esse tipo de imunidade é sempre visto após uma infecção ou uma vacinação, porém provê uma proteção muito limitada contra outros isolados.
IMUNIDADE HOMOSUBTIPO: relacionada a isolados que pertencem ao mesmo subtipo. Esse tipo de imunidade é freqüentemente visto após uma infecção ou uma vacinação, porém é perdida quando a taxa de mutação em hemaglutinina e/ou neuraminidases aumenta consideravelmente.
IMUNIDADE HETEROSUBTIPO: relacionada a isolados que pertencem a subtipos diferentes. Esse tipo de imunidade é extremamente raro tanto no caso de infecção natural como no caso de vacinação. A partir do ponto de vista estratégico, é a imunidade mais importante, visto que sua presença e estimulação seriam equivalentes à resistência à infecção por todo tipo de vírus de influenza A.
[0013] Até alguns anos atrás, pensava-se que a imunidade heterosubtipo poderia ser obtida simplesmente por estimular eficazmente componentes de imunidade celular dirigidos contra proteínas virais menos mudadas, como por exemplo, a proteína NP que constitui seu núcleo. Entretanto, estudos recentes mostraram que camundongos isentos de linfócitos CD8 são ainda capazes de exibir uma imunidade heterosubtipo, ao contrário de camundongos isentos do componente de linfócito tipo B (Nguyen HH, J Inf. Dis 2001, 183: 368-376). Um estudo ainda mais recente confirmou esses dados, destacando um papel crucial de anticorpos, mesmo se não neutralizando, dirigidos precisamente contra epítopos que são conservados entre os subtipos diferentes (Rangel-Moreno e outros, The J of Immunol., 2008, 180:454-463).
Objetivo da invenção
[0014] Com base nos dados relatados acima, um objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo monoclonal, preferivelmente humano ou humanizado, reativo contra os subtipos diferentes do vírus de influenza A.
[0015] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo monoclonal, preferivelmente humano ou humanizado, com atividade de neutralização em direção a múltiplos subtipos do vírus de influenza A.
[0016] Tal anticorpo seria um meio eficaz de prevenção quando administrado a pacientes em risco. Além disso, o uso de um anticorpo monoclonal humano ou humanizado para pacientes humanos daria uma vantagem adicional, visto que o anticorpo certamente seria bem tolerado.
[0017] Em segundo lugar, por constituir um componente da resposta de anticorpo humano a esse vírus, o anticorpo monoclonal com as características acima mencionadas poderia representar um fator chave para o desenho de vacinas inovadoras capazes de induzir uma imunidade de proteção e gama ampla, extremamente mais eficaz, em comparação com aquela induzida pelas vacinas atualmente utilizadas.
[0018] Entretanto, a obtenção de anticorpos monoclonais com tais propriedades provou até o presente ser extremamente difícil.
[0019] O pedido de patente internacional WO2007/134327, expedida em 22 de novembro de 2007, descreve fragmentos Fab capazes, em ensaios ELISA, de ligar-se ao antígeno HA a partir de vários isolados do vírus de influenza A, subtipo H5. Entretanto, esse pedido de patente não provê uma descrição capacitante de anticorpos capazes de reconhecer isolados que pertencem a diferentes subtipos do vírus de influenza A, nem descreve em um modo capacitante a obtenção de anticorpos com capacidades de neutralização efetivas em direção a vírus de influenza A que pertencem a subtipos diferentes.
[0020] Portanto, apesar do fato de que um anticorpo monoclonal com a capacidade de reconhecer e neutralizar os subtipos diferentes do vírus de influenza A tem sido procurado há muito tempo, tal necessidade permaneceu até o presente frustrada.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0021] Os presentes inventores tiveram sucesso surpreendentemente em fornecer anticorpos monoclonais com as características desejáveis acima mencionadas.
[0022] Desse modo, um primeiro objetivo da presente invenção é um anticorpo monoclonal dirigido contra o antígeno de hemaglutinina do vírus de influenza A, caracterizado por ser capaz de ligar múltiplos subtipos do vírus de influenza A.
[0023] Um segundo objetivo da presente invenção é um anticorpo monoclonal dirigido contra o vírus de influenza A, caracterizado por ter uma atividade de neutralização em direção a múltiplos subtipos do vírus de influenza A. Preferivelmente, tal anticorpo monoclonal de neutralização reconhece hemaglutinina de vírus de influenza A (HA) como o antígeno.
[0024] Os anticorpos monoclonais da invenção são preferivelmente anticorpos humanos ou humanizados.
[0025] A obtenção de anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção e suas propriedades de ligação são descritas em detalhe na seção experimental que se segue.
[0026] A preparação de anticorpos humanizados é executada por qualquer metodologia conhecida por si, como por exemplo descrito em Baca e outros, 1997 J. Biol. Chem. 272: 10678-84 ou Carter e outros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:4285. Tais referências bibliográficas são fornecidas, exclusivamente para ilustração e não limitação. Na realidade, outras metodologias para a preparação de anticorpos humanizados são conhecidas na técnica anterior e podem ser utilizadas na presente invenção.
[0027] A obtenção de 6 clones (designados como INF4, INF16, INF28, INF39, INF43 e INF47) capazes de produzir anticorpos monoclonais na forma de fragmentos Fab com a capacidade in vitro de ligar múltiplos subtipos do vírus de influenza A é especificamente descrita na seguinte seção experimental.
[0028] O anticorpo monoclonal produzido por clone INF28 (designado como Fab28) representa uma modalidade preferida da invenção, visto que os inventores experimentalmente comprovaram que esse anticorpo exibe uma atividade de neutralização em direção a múltiplos subtipos de vírus de influenza A. Para fins de brevidade, tal propriedade imunológica será às vezes mencionada abaixo como "atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo".
[0029] O anticorpo Fab28 é caracterizado por um domínio variável de cadeia pesada com a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e um domínio variável de cadeia leve com a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 2. A seqüência de nucleotídeo codificando para o domínio variável de cadeia pesada é SEQ ID NO: 3 e a seqüência de nucleotídeo codificando para o domínio variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 4.
[0030] Em particular, a seção experimental descreve a fabricação dos anticorpos monoclonais da invenção como fragmentos Fab. Entretanto, outras formas de anticorpo também, e a fabricação e uso das mesmas pretendem fazer parte do escopo da invenção. Exemplos não limitadores são imunoglobulinas inteiras, ou outros tipos de fragmentos de anticorpo, como por exemplo fragmentos F(ab')2 ou fragmentos de anticorpo menores do que Fabs, ou peptídeos que têm as mesmas propriedades imunológicas que aqueles experimentalmente demonstrados para o Fab da invenção.
[0031] Anticorpos de cadeia única podem ser construídos de acordo com o método descrito na patente US 4.946.778 de Ladner e outros, pelo presente incluído como referência. Anticorpos de cadeia única compreendem as regiões variáveis de cadeia leve e pesada ligadas por um ligador flexível. O fragmento de anticorpo designado como anticorpo de domínio único é até mesmo menor do que o anticorpo de cadeia única, visto que compreende somente um domínio VH isolado. Técnicas para obter anticorpos de domínio único tendo, pelo menos parcialmente a mesma capacidade de ligação que o anticorpo inteiro, são descritas na técnica anterior. Ward, e outros, em "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escheria coli," Nature 341:644-646, descreve um método de triagem para obter a região variável da cadeia pesada de um anticorpo (anticorpo de domínio único VH) com uma afinidade suficiente para o epítopo alvo ligar-se ao mesmo em uma forma isolada.
[0032] Na descrição que se segue, o termo "anticorpo" será então utilizado para se referir a todas as modalidades mencionadas acima, incluindo imunoglobulinas inteiras, fragmentos Fab ou outros tipos de fragmento de anticorpo, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único, etc.
[0033] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser gerados e utilizados em uma forma livre ou em uma forma conjugada com veículo. Um veículo é qualquer entidade química ou biológica capaz de conjugar com um anticorpo e tornar o mesmo imunogênico ou aumentar sua imunogenicidade. Exemplos não limitadores de veículos são proteínas como KLH (hemocianina de molusco de buraco de fechadura), edestina, tiroglobulina, albuminas como albumina de soro bovino (BSA) ou albumina de soro humano (HSA), eritrócitos como eritrócitos de carneiro (SRBC), anatoxina de tétano, anatoxina de cólera, poliamino ácidos como por exemplo poli(D-lisina: ácido D-glutâmico) e similares. Para facilitar a ligação do anticorpo ao veículo, a extremidade-C ou extremidade-N de anticorpo pode ser modificada, por exemplo, pela inserção de resíduos de aminoácido adicionais, por exemplo um ou mais resíduos de cisteína que são capazes de formar ligações de dissulfeto.
[0034] Devido a suas propriedades, que serão mostradas em detalhe na seção experimental que se segue, os anticorpos monoclonais da invenção (especialmente o anticorpo Fab28) são particularmente adequados para uso em aplicações médicas, particularmente na fabricação de um medicamento para o tratamento profilático ou terapêutico de gama ampla de infecções por vírus de influenza A.
[0035] Desse modo, o uso de um anticorpo monoclonal da invenção, preferivelmente o anticorpo Fab28, para a fabricação de um medicamento para o tratamento profilático ou terapêutico de patologias causadas por infecções de vírus de influenza A, como por exemplo a síndrome de influenza, está compreendido no escopo da invenção.
[0036] Nesse contexto também a expressão "anticorpo Fab28" inclui não somente os fragmentos Fab como também qualquer outra forma na qual o anticorpo possa ser preparado, por exemplo imunoglobulinas inteiras, outros tipos de fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia única, etc.
[0037] Como descrito em detalhe na seção experimental, os anticorpos monoclonais foram obtidos por técnicas de biologia molecular iniciando a partir de um linfócito transformado com EBV capaz de produzir anticorpos monoclonais reativos cruzados, desse modo, capazes de reconhecer lisados de células MDCK infectados com os dois isolados de referência como mencionado abaixo, que pertencem a subtipos diferentes do vírus de influenza A: H1N1, cepa A/PR/8/34 e H3N2, cepa A/PC/1/73. Os procedimentos específicos utilizados para gerar as linhagens de células B transformadas de sangue periférico de pacientes são descritos na seção experimental.
[0038] Além disso, os procedimentos utilizados para clonar os genes codificando as porções variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo Fab28 da invenção são descritos na seção experimental, bem como os procedimentos para produzir os mesmos de forma recombinante, tanto como peptídeos únicos como fragmentos Fab.
[0039] A capacidade dos anticorpos monoclonais da invenção reagir com lisados de células infectados com subtipos de vírus de influenza A diferentes foi verificada por ELISA e imunofluorescência. Além disso, um ensaio de neutralização foi realizado para verificar a atividade biológica in vitro dos anticorpos. Nesse ensaio, o anticorpo Fab28 mostrou uma atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo em direção a isolados virais do tipo A de referência como indicado acima.
[0040] Os dados obtidos sugerem que os anticorpos da invenção, especialmente anticorpo Fab28, são extremamente eficazes em conferir uma imunidade passiva em direção ao vírus de influenza A aos sujeitos a quem são administrados, e que, por conseguinte, são particularmente úteis no tratamento profilático ou terapêutico de gama ampla de infecções de vírus de influenza A ou patologias direta ou indiretamente causadas por infecção de vírus de influenza A. Um exemplo de tais patologias é a síndrome de influenza.
[0041] Além disso, a identificação do epítopo de conformação de hemaglutinina com o qual Fab2 se liga é descrita na seção experimental. Tal epítopo de conformação situa-se entre a região de hemaglutinina HA1 e região HA2 e inclui resíduos W357 e T358 na região HA2 e resíduos N336, I337 e P338 na região HA1. A numeração dos resíduos se baseia na seqüência de hemaglutinina de isolado de H1N1/A/PR/8/34 no banco de dados BLAST (SEQ ID NO: 5).
[0042] Desse modo, um objetivo adicional da invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal da invenção como o ingrediente ativo e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Uma quantidade eficaz é aquela que é capaz de induzir um efeito favorável no sujeito ao qual a composição é administrada, por exemplo, para neutralizar o vírus de influenza A ou interferir na replicação do vírus.
[0043] Nesse contexto, o termo "sujeito" designa qualquer animal hospedeiro ao qual a composição possa ser administrada, incluindo seres humanos.
[0044] Exemplos não limitadores de veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis para a composição farmacêutica da invenção incluem estabilizadores como SPGA, carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, amido, sacarose, glicose, dextrano), proteínas como albumina ou caseína, agentes contendo proteína como soro bovino ou leite desnatado, e tampões (por exemplo, tampão de fosfato).
[0045] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser também vantajosamente utilizados como reagentes de diagnóstico em um método in vitro para a detecção de anticorpos de vírus anti-influenza A com propriedades de neutralização idênticas ou similares em uma amostra biológica anteriormente obtida de um paciente (como, por exemplo, um soro, plasma, amostra de sangue ou qualquer outro material biológico apropriado).
[0046] "Anticorpos de vírus anti-influenza A com propriedades de neutralização idênticas ou similares" são anticorpos que exibem uma atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo versus o vírus de influenza A. Esses anticorpos podem ser encontrados na amostra biológica do paciente como resultado de uma exposição prévia a um vírus de influenza A, ou porque o paciente tinha recebido anteriormente um anticorpo monoclonal da invenção para fins terapêuticos ou profiláticos ou de pesquisa.
[0047] Um método de ensaio para detectar, na amostra biológica de um paciente, a presença de anticorpos de vírus anti-influenza A tendo uma atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo, compreendendo contatar a amostra biológica com um anticorpo monoclonal da invenção, como um reagente de ensaio específico, é desse modo incluído no escopo da invenção.
[0048] O ensaio pode ser qualitativo ou quantitativo. A detecção ou quantificação de anticorpos de vírus anti-influenza A tendo uma atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo pode ser realizada, por exemplo, por um ensaio ELISA competitivo. Desse modo, um kit de diagnóstico compreendendo um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção como um reagente específico também está compreendido no escopo da invenção, o kit sendo particularmente projetado para a detecção ou quantificação de anticorpos de vírus anti-influenza A tendo uma atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo em direção ao vírus de influenza A em uma amostra biológica derivada de um paciente.
[0049] Similarmente, os anticorpos monoclonais da invenção (especialmente anticorpo Fab28) podem ser utilizados como reagentes específicos em um método de ensaio para detectar ou quantificar, em uma composição de vacina ou imunogênica previamente preparada, epítopos capazes de evocar, no sujeito ao qual tal composição foi administrada, anticorpos de vírus anti-influenza A tendo propriedades de neutralização idênticas ou similares àquelas do anticorpo monoclonal da invenção, isto é uma atividade de neutralização cruzada de heterosubtipo em direção ao vírus de influenza A.
[0050] Tal método é predito como sendo útil para a avaliação de qualquer preparação a ser utilizada como uma vacina ou preparado imunogênico, como o reconhecimento pelo anticorpo monoclonal da invenção poderia ser indicativo da presença, no preparado imunogênico e/ou vacina, de um ou mais epítopos capazes de estimular a produção de clones de anticorpo capazes de reconhecer um epítopo vantajoso, como por exemplo um epítopo capaz de eliciar uma imunidade de heterosubtipo contra o vírus de influenza A.
[0051] Finalmente, os anticorpos monoclonais da invenção podem ser utilizados para a fabricação de anticorpos anti-idiotipo de acordo com métodos conhecidos por si. Anticorpos anti-idiotipo são anticorpos especificamente dirigidos em direção ao idiotipo dos anticorpos de neutralização de gama ampla utilizados para preparar os mesmos, e como tal são capazes de simular os epítopos chave que reconhecem.
[0052] Portanto, anticorpos anti-idiotipo dirigidos contra um anticorpo monoclonal da invenção são também incluídos no escopo da invenção.
[0053] A seguinte seção experimental é fornecida exclusivamente como ilustração e não limitação e não pretende limitar o escopo da invenção como definido nas reivindicações apensas. As reivindicações são uma parte integral da descrição.
SEÇÃO EXPERIMENTAL 1. Seleção dos pacientes
[0054] Os pacientes inscritos no estudo foram selecionados de modo a aumentar as chances de clonar anticorpos anti-influenza reativos-cruzados, isto é, anticorpos capazes de reconhecer e potencialmente neutralizar isolados de vírus de influenza que pertencem a subtipos diferentes. Em particular, é descrito que alguns indivíduos apesar de exposição contínua ao vírus de influenza (às vezes por motivos profissionais, como médicos, pediatras, pessoas que trabalham em jardins de infância e escolas), não contraem a doença. Achava-se que esses indivíduos raros eram os melhores candidatos para a geração de anticorpos monoclonais humanos. Em particular, os seguintes critérios de inclusão foram obedecidos:
  • - Entre 25 e 55 anos de idade;
  • - Histórico médico patológico recente, para os dez anos que precedem o estudo, negativo para síndromes de influenza clínica;
  • - Título de anticorpo mais elevado do que 1:1000 contra isolados de vírus, subtipos H1N1 e H3N2 responsáveis pela epidemia atual durante os cinco anos que precedem o estudo;
  • - Título de neutralização elevado (IC50>=1:400) contra isolados de vírus, subtipos H1N1 e H3N2 responsáveis pela epidemia anual durante os cinco anos que precedem o estudo;
  • - Título de neutralização detectável (IC50>=1:20) contra dois isolados de vírus do subtipo A de referência (A/PR/8/34 subtipo H1N1; A/PC/1/73 subtipo H3N2);
  • - Nenhuma vacinação anti-influenza prévia;
  • - Conformidade em receber vacinação anti-influenza.
[0055] Na vacinação, e aproximadamente 3 semanas após-vacinação, aproximadamente 20 ml de sangue foram tirados de cada paciente em tubos de teste heparinizados.
2. Cultura dos isolados de vírus de referência
[0056] Células MDCK (rim canino Madin-Darby) (ATCC ® no. CCL-34TM) propagadas em Meio Eagle Modificado (MEM) (GIBCO), suplementadas com soro bovino fetal inativado a 10% (FBS) (tratamento a 56°C por 30 minutos) (EuroClone), 50 μg/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina (GIBOC) e 2 mM L-glutamina (EuroClone) foram utilizados como a linhagem de células. As células foram incubadas a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5% e foram passadas em uma razão de 1:3 duas vezes por semana. Para os experimentos descritos nesse pedido de patente, os seguintes isolados de vírus de influenza foram utilizados: H1N1, cepa A/PR/8/34 (ATCC® no. VR-1469TM); H3N2, cepa A/PC/1/73 (ATCC® NO. VR-810) e cepa B/Lee/40 (ATCC® no. VR-101). Como o meio de cultura para crescer o vírus, MEM suplementado com 1 μg/ml de tripsina livre de soro (SIGMA) foi utilizado. Os estoques de vírus foram obtidos do sobrenadante de cultura como vírus extracelular. Em resumo, após infectar as células, a monocamada foi observada diariamente para monitorar a aparência de um efeito citopático. Genericamente 4 dias após a infecção o sobrenadante foi coletado, centrifugado a 1000 RCF (força centrífuga relativa) por 10 minutos para eliminar o resíduo de célula e filtrado como filtros de 0,22 μm (MILLIPORE). O sobrenadante foi então formado em alíquotas e armazenado a -80°C como vírus livres de células.
3. Seleção de anticorpos de vírus anti-influenza a partir de linfócitos de sangue periférico B
[0057] A produção de anticorpos monoclonais a partir de pacientes foi realizada utilizando um método de transformação através de infecção de linfócitos B com vírus Epstein-Barr (EBV), anteriormente descrito por Cole e outros, 19084 Cancer Research 22:2750-2753. O sobrenadante dos clones diferentes obtidos foi avaliado em relação à presença de anticorpos por ELISA. Clones capazes de produzir anticorpos IgG no sobrenadante que são capazes de reagir na ELISA contra os lisados de células infectados com os dois isolados de referência, subtipos H1N1 e H3N2, foram então selecionados para uma caracterização subseqüente. Em particular, células MDCK foram infectadas com os isolados acima mencionados em uma elevada multiplicidade de infecção. Aproximadamente 48 horas pós-infecção, as células foram desprendidas do frasco e lavadas duas vezes em PBS. As pelotas de células foram então suspensas em 300 μl de solução de lise (100 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8 e 0,5% Triton-X) e armazenadas em gelo por 20 minutos. Os resíduos de células foram centrifugados a 10000g por 5 minutos e o sobrenadante foi armazenado a -20°C como um extrato de proteína. Com relação ao preparado do antígeno de controle, células não infectadas foram tratadas do mesmo modo. A concentração de proteína sobrenadante foi determinada em duplicata utilizando o Kit de ensaio de proteína BCA™ (Pierce). Resumidamente, a dosagem de proteína de amostra foi determinada referindo a uma curva padrão obtida por uma série de diluições de concentração conhecida de albumina de soro bovino (BSA). A absorvência de cada amostra foi medida com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 540 nm. Os lisados assim obtidos foram então utilizados (30 ng por cavidade) para revestir uma placa ELISA (COSTAR) que foi incubada a 4°C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi lavada com água destilada e bloqueada com PBS/1% BSA (Sigma) por 45 minutos a 37°C. A seguir, 40 μl de sobrenadante de cada clone foram adicionados a cada cavidade, que foram incubados por 1 hora a 37°C. após 5 lavagens (WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin) com PBS/0,5% Tween-20 (Sigma), 40 μl de Fc anti-humano conjugado com peroxidase (1:4000 em PBS/1% BSA, Sigma) foram adicionados a cada cavidade e a placa foi incubada por 1 hora a 37°C. após mais 5 lavagens com PBS/0,5% de Tween-20, 40 μl de substrato de peroxidase TMB (Pierce) foram adicionados a cada cavidade. Aproximadamente 15 minutos após, a atividade enzimática foi bloqueada por adição de 40 μl de H 2SO4 e o sinal foi medido com um espectrofotômetro ajustado em 450 nm. Atenção especial foi dada ao sobrenadante de seis clones putativos capazes de produzir anticorpos reativos cruzados (designados como cINF4, cINF16, cINF28, cINF39, cINF43, e cINF47, respectivamente), isto é, capazes de reconhecer tanto lisados de células infectados com a cepa que pertencem ao subtipo H1N1 como aqueles infectados com a cepa que pertencem ao subtipo H3N2.
4. Preparação de fragmentos Fab a partir dos clones reativos cruzados
[0058] Os genes que codificam as cadeias Fab monovalentes capazes de reagir com o vírus de influenza foram clonados em um vetor de expressão procariótica. Isso permite evitar problemas devido à instabilidade de clones de células que produzem anticorpo, para caracterizar melhor os genes de codificação a partir do ponto de vista molecular, a fim de ter moléculas que são certamente monoclonais à disposição de uma pessoa, bem como quantidades aumentadas de cada anticorpo individual.
[0059] O RNA mensageiro (mRNA) foi extraído dos clones cultivados e transcritos de forma inversa utilizando um oligo-dT de acordo com métodos conhecidos por si. Os cDNAs que codificam a cadeia leve e o fragmento Fd (isto é, a porção de cadeia pesada presente no fragmento Fab foram então amplificados por métodos descritos (CSH press, Phage display manual, cd. D.R. Burton, p.A1.16). Os cDNAs assim obtidos foram então clonados em um vetor de expressão conhecido por si, designado como pCb3/CAF (Burioni e outros, J. Imm. Meth., 1988). Em resumo, o gene (DNA amplificado) codificando a porção Fd de cadeia pesada de cada Fab foi digerido com enzimas de restrição XhoI e SpeI (Roche) por 1,5 horas a 37°C, e subsequentemente inserido no sítio de clonagem do vetor para cadeias pesadas, por sua vez digeridos com as mesmas enzimas. Em vez disso, as cadeias leves (DNA amplificado) foram digeridas com enzimas SacI e XbaI (Roche) e clonadas no vetor similarmente digerido.
[0060] As construções recombinantes assim obtidas para cada clone foram utilizadas para eletro-transformar cepa de E. coli XL1Blue (tornada competente por lavagens frias em glicerol), de acordo com protocolos padronizados para o uso de cubetas de 0,2 cm (Voltagem: 2500 V; capacitância 25 μF,· resistência: 200 Ω). Em paralelo, as seqüências de DNA da parte variável de cadeia leve e a parte variável de cadeia pesada dos clones selecionados foram analisadas. As seqüências são aquelas fornecidas na Listagem de seqüências. A análise molecular do padrão mutacional mostrou uma imagem atribuível a processos de mutação somática induzida por antígeno para cada dos clones.
5. Avaliação de ELISA dos Fabs monoclonais obtidos por clonagem em PCb3/CAF
[0061] Ao término de clonagem, 40 clones bacterianos recombinantes para cada anticorpo monoclonal foram analisados por ELISA utilizando lisados brutos de culturas bacterianas obtidas por choque térmico. Em particular, clones de bactérias transformadas com a construção PCb3/CAF foram inoculados em 10 ml de meio SB contendo ampicilina e tetraciclina em 50 μg/ml e 10 μg/ml, respectivamente, e foram crescidos sob agitação a 37°C até atingir um O.D. 600 = 1. Subsequentemente, um indutor específico (IPTG - isopropilaB-D-tiogalactopiranoside) foi adicionado na concentração final de 1 mM e a cultura foi deixada agitada a 30°C durante a noite. As células foram lisadas por choque térmico (3 cursos de congelar/descongelar, a -80°C e 37°C, respectivamente) e então centrifugadas para separar os resíduos de célula do sobrenadante contendo Fab. O Fabs solúvel obtido foi ensaiado por ELISA. Placas de microtítulo de 96 cavidades (Nunc) foram revestidas com lisados de células infectadas com os isolados de vírus de referência acima mencionados. Lisados obtidos de células não infectadas foram utilizados como controle negativo. As placas de ELISA revestidas com 300 ng dos lisados obtidos como descrito foram então deixadas a 4°C durante a noite. No dia seguinte, após remoção do antígeno não ligado, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS, e os sítios de ligação não específicos foram bloqueados com albumina a 3% em PBS por 1 hora a 37°C. após remoção da solução de bloqueio, os sobrenadantes das culturas de células tratados como descrito acima e contendo o Fabs solúvel foram adicionados à mesma, seguido por uma etapa de incubação a 37°C por 2 horas. Após 10 ciclos de lavagem com PBS/0,05% Tween 20, 40 μ! de uma diluição 1:700 de um preparado policlonal de imonoglobulinas Fab anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rabanete (Sigma) em PBS/1% BSA foram adicionados ao mesmo. Após incubação de 1 hora a 37°C e uma série adicional de 10 lavagens, o substrato (OPD-o-fenilenodiamina) foi adicionado às cavidades. As placas foram então incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. A reação foi resfriada bruscamente com 1 N ácido sulfúrico e a densidade óptica foi avaliada por leitura espectrofotométrica a 450 nm. Todos os clones ensaiados exibiram reatividade em relação aos lisados obtidos das células infectadas. Um clone bacteriano transformado com um vetor de expressão contendo um par de genes codificando a cadeia leve de um anticorpo humano e o fragmento Fd de cadeia pesada foi desse modo selecionado para cada dos monoclonais reativos cruzados. Tais clones bacterianos são capazes de produzir Fabs humanos capazes de ligar-se tanto ao isolado A/PR/8/34 (H1N1) como ao isolado A/PC/1/73 (H3N2). Esses clones (com os pares de gene relativos) foram denominados INF4, INF16, INF28, INF39, INF43 e INF47.
6. Purificação do Fabs
[0062] O Fabs produzido dos clones reativos cruzados acima lisados (daqui em diante indiferentemente mencionados como "clones" ou "Fabs") foram desse modo produzidos através de bactérias transformadas com o vetor de expressão descrito e então purificados por imunoafinidade com colunas compostas de uma resina de sefarose contendo a proteína G (~2 mg/ml), ao qual um preparado policlonal de anticorpos de cabra capaz de ligar Fabs humano (Pierce, Illinois) foi covalentemente ligado. Em resumo, uma colônia única de cada clone foi inoculado em 10 ml de meio SB contendo ampicilina e tetraciclina a 50 μg/ml e 10 μg/ml, respectivamente. A cultura, que foi cultivada durante a noite a 37°C, foi sub-inoculada em um frasco com 500 ml de SB adicionado com a mesma concentração de antibióticos como anteriormente. As células, subsequentemente induzidas por 1mM IPTG, foram deixadas agitando durante a noite a 30°C. a cultura foi centrifugada a 5000 rpm por 25 minutos e a pelota ressuspensa em PBS foi submetida à sonicação. Uma centrifugação adicional a 18.000 rpm por 25 minutos foi necessária para remover os resíduos de células. O sobrenadante foi filtrado, e então foi lentamente passado através da coluna de sefarose acima descrita. Posteriormente, a resina foi lavada com 10 PBS volumes e finalmente os Fabs ligados foram eluídos com uma solução acídica (tampão de eluição - H2O/HC1 pH 2.2). As várias frações coletadas foram neutralizadas com uma solução apropriada (1M Tris pH 9) e concentradas por ultrafiltração (Centricon, Millipore). A pureza do Fabs purificado foi avaliada passando uma alíquota em um gel de sulfato de dodecil de sódio/poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE). Finalmente, diluições seqüenciais do Fabs purificado foram ensaiadas por ELISA como descrito. Em cada placa, preparados de Fabs monoclonais dirigidos contra glicoproteína E2 HCV foram incluídos como controles negativos. Os resultados desse experimento confirmaram anteriormente obtidos com os lisados bacterianos.
7. Avaliação de imunofluorescência do Fabs monoclonal obtido por clonagem em PCb3/CAF
[0063] Para confirmar os dados obtidos por ELISA, os Fabs anti-influenza reativos cruzados foram também analisados por um ensaio de imunofluorescência. Resumidamente, as células a partir das culturas infectadas foram tripsinizadas e, após duas lavagens em PBS, contadas sob um microscópio com um hematocitômetro. A suspensão de células foi desse modo utilizada para a preparação de lâminas por centrifugação em uma citocentrífuga (Cytospin4, Shandon Southern Products) a 90 g por 3 minutos. As lâminas assim preparadas continham cada um total de 2 x 105 células. Lâminas de controle foram preparadas similarmente com células não infectadas. As células foram então fixadas e permeabilizadas em temperatura ambiente com uma solução de metanol-acetona (utilizada na temperatura de -20°C) por 10 minutos. Após 3 lavagens em PBS, as células foram incubadas com os clones diferentes (100 μg/ml) por 30 minutos a 37°C em uma câmara úmida e subsequentemente lavadas três vezes em PBS. As células foram então incubadas por 30 minutos a 37°C na câmara úmida no escuro com um Fab de cabra conjugado com isotiocianato de fluoresceína (Sigma) diluído 1:200 em Evans Blue. As lâminas foram examinadas sob um microscópio de fluorescência (Olympus). Um monoclonal de camundongo comercial (Argene) específico para a proteína de vírus de influenza M1 foi utilizado como controle positivo. Um anticorpo dirigido contra a glicoproteína E2 do vírus de hepatite C (e509; Burioni e outros, Hepatology, 1998) foi utilizado como controle negativo. Todos os Fabs recombinantes mostraram, por imunofluorescência, uma reatividade que foi específica para as células infectadas com a cepa A/PR/8/34 (H1N1) e aquelas infectadas com a cepa A/PC/1/73 (H3N2). Em vez disso, nenhuma fluorescência foi vista em células não infectadas, células infectadas de cepa tipo B, ou células infectadas com o anticorpo de controle negativo.
8. Ensaio de neutralização
[0064] Para caracterizar a atividade biológica in vitro dos clones selecionados, ensaios de neutralização foram projetados para os três isolados de vírus de referência utilizados no estudo. Em resumo, células MDCK foram semeadas em FBS a 10%-MEM em uma placa de 96 cavidades (2x 104 células/cavidade). Diluições seriais (de 10-1 a 10-8) dos estoques de vírus, obtidas como descrito acima, foram preparadas em meio de manutenção (MEM com 2% FBS). Cada diluição foi repetida seis vezes. Quando as células cultivadas eram confluentes, o meio de crescimento foi removido e 100 μl de cada das diluições de vírus foram adicionados a cada cavidade. Após 1 hora a 37°C, os inóculos foram removidos e 200 μl de meio MEM adicionados com 1 μg/ml de tripsina foram colocados em cada cavidade. O título viral, expresso como TCID50 (a dose que infecta 50% da cultura de célula) foi calculado por aplicar a fórmula de Reed-Muench:
Figure img0001
[0065] À luz dos dados obtidos, o estoque de vírus foi diluído de modo a utilizar uma multiplicidade de infecção (M.O.I.) de aproximadamente 0,01 (1 partícula de vírus por 100 células) no experimento de neutralização. No ensaio de neutralização efetivo, células MDCK foram semeadas em uma placa de 24 cavidades, com cada cavidade contendo uma lâmina estéril. O experimento de neutralização foi executado em 80%-90% de células confluentes, isto é aproximadamente 48 horas após a semeadura das mesmas. Diluições dos fragmentos de Fab purificados foram então preparadas, de modo a obter 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml e 20 μg/ml de concentrações finais para cada anticorpo. Diluições correspondentes do anticorpo anti-HCV e509 foram preparadas como um controle negativo. As várias concentrações de Fab foram então incubadas com o mesmo volume de estoque de vírus diluído (M.O.I.: 0,01) por 1 hora a 37°C. 250 μl da mistura de Fab-vírus foram subsequentemente adicionados às cavidades contendo as células. Um controle positivo para a infecção foi obtido por adição do meio de cultura individualmente ao estoque de vírus. A placa foi incubada por 1 hora a 37°C para permitir a adsorção do vírus não neutralizado. O inóculo foi então removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS. 1,5 ml de meio livre de soro com 1 μg/ml de tripsina foram adicionados a cada cavidade. Após uma incubação de 6 horas a 37°C, a monocamada de célula foi lavada com PBS e fixada com uma solução de acetona-metanol frio (razão 1:2, armazenada a -20°C) por 10 minutos em temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas e incubadas com 250 μ! de um anticorpo anti-MI monoclonal comercial (Argene) por 30 minutos a 37°C em uma câmara úmida. As células foram lavadas com PBS e finalmente incubadas com um anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com fluoresceína, diluído em Evans blue, por 30 minutos a 37°C em uma câmara úmida no escuro. Após três lavagens em PBS, as lâminas foram finalmente examinadas sob um microscópio de fluorescência. A atividade de neutralização de Fabs foi determinada por contagem das células positivas únicas e calcular a percentagem de diminuição no número de células infectadas, em comparação com o controle positivo infectado com o vírus individualmente. Os ensaios de neutralização foram realizados em três sessões separadas para cada Fab. Particularmente, cada clone foi ensaiado contra as duas cepas de influenza tipo A de referência diferentes e a cepa de tipo B de referência mencionada anteriormente. Em cada experimento, as diluições de Fab diferentes foram repetidas em triplicata, similarmente ao que foi executado para os controles de infecção de meio negativo (Fab e509 anti-E2/HCV) e positivo (vírus e meio sem Fabs).
[0066] Entre os seis Fabs reativos cruzados ensaiados, o Fab produzido pelo clone INF28 mostrou uma atividade de neutralização cruzada de heterotipo contra os isolados de vírus tipo A. em vez disso, nenhuma redução foi detectada com relação à capacidade de infecção do vírus do tipo B utilizado no estudo, confirmando a especificidade da atividade de neutralização observada. Em particular, o Fab produzido pelo clone INF28 (denominado Fab 28) mostrou um IC50 (a concentração de Fab que inibe 50% de infecção pelo isolado de vírus ensaiado) abaixo de 5 μg/ml no caso do subtipo H1N1 e de aproximadamente 10 μg/ml no caso de subtipo H3N2, isto é, concentrações que são facilmente obteníveis por administração in vivo das moléculas em questão mesmo sem levar em conta o aumento considerável na atividade biológica de neutralização normalmente observada quando Fabs são convertidos na forma de imunoglobulina inteira, uma das formulações farmacêuticas possíveis incluídas no escopo da invenção.
[0067] As figuras 1 a 3 resumem os resultados obtidos com Fab 28, produzido por clone INF28, nas sessões de neutralização diferentes executadas nos vários isolados de vírus de influenza utilizados no estudo. Particularmente, a figura 1 é um gráfico que ilustra a percentagem de neutralização do vírus A/PR/8/34 (H1N1) por concentrações de Fab 28 diferentes. Os resultados obtidos com o Fab anti-HCV e509 humano são relatados como controle negativo. A figura 2 é um gráfico que ilustra a percentagem de neutralização do vírus A/PC/1/73 (H3N2) por concentrações de Fab 28 diferentes. Os resultados obtidos com o Fab anti-HCV e509 humano são relatados como controle negativo. A figura 3 é um gráfico que ilustra a percentagem de neutralização do vírus B/Lee/40 por concentrações de Fab 28 diferentes. Os resultados obtidos com o Fab anti-HCV e509 humano são relatados como controle negativo.
9. Caracterização do antígeno reconhecido por Fab 28: western blot em um lisado a partir de células infectadas
[0068] 10 μg de um lisado de célula infectado com cepa A/PR/834 (H1N1), preparado como descrito anteriormente, foram passados sob condições nativas em um gel de poliacrilamida a 10%. Para essa finalidade, as amostras foram passadas em 100V por 1 hora em um tanque refrigerado adequado (BIORAD). Posteriormente, o gel foi removido do aparelho de eletroforese e incubado por 10 minutos em tampão de transferência (Tris base 3g; glicina 14,41 g, dH2O 800 ml, metanol 200 ml) para eliminar qualquer resíduo de detergente. A transferência para sobre uma membrana de nitrocelulose (Hybond-ECL; Amersham Biosciences) foi então realizada durante a noite em 30V e 90mA. A membrana foi então bloqueada por 1 hora com leite seco a 5% dissolvido em 1X PBS e posteriormente lavado três vezes em 1X PBS - 0,1% Tween. Durante cada lavagem, a membrana foi deixada agitar em uma plataforma oscilante por 10 minutos. Após o que, os Fabs diferentes, diluídos em PBS com 5% de leite seco, foram adicionados na concentração de 5 μg/ml. Além de Fab 28, os seguintes controles foram adicionados; e509 como controle negativo; IgG1 inteiro anti-HA de camundongo comercial (COVANCE); IgG1 inteiro anti-M1 de camundongo comercial (ARGENE); IgG1 inteiro anti-M2 de camundongo (ABCAM); soro humano diluído 1:200. Cada anticorpo foi deixado agitar por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, a membrana foi lavada novamente em PBS como descrito anteriormente. Os mesmos anticorpos de camundongo (1:1000) ou humano (1:2000) secundários como descrito para o ensaio ELISA foram então adicionados, dependendo da fonte do anticorpo a ser detectado. Para a detecção do sinal, uma solução de trabalho foi preparada misturando dois substratos (SuperSignal® West Pico Chemiluminescente Substrate Pierce) em uma razão de 1:1, sendo particularmente cuidadoso não expor o mesmo a fontes de luz. A membrana de nitrocelulose foi incubada por 5 minutos com a solução de trabalho e então removida e montada em um HyperCassette (AMERSHAM). Isso foi revelado em um filme de raios-X Kodak na sala escura após o tempo de exposição necessário. O ensaio descrito foi executado em duas sessões diferentes, e em cada uma delas a porção de membrana incubada com Fab 28 mostrou a presença de uma faixa pesando levemente menos do que 80 KDa, compatível com o peso da forma imatura da hemaglutinina viral (HAO). Isso foi confirmado pela mesma faixa sendo também exibida na tira incubada com o anticorpo de controle anti-hemaglutinina. Uma faixa análoga, mais intensa do que as outras, foi também detectada na porção de membrana incubada com soro humano. O resultado desse experimento mostra que o anticorpo é dirigido contra a hemaglutinina de vírus de influenza, perfeitamente compatível com os dados de neutralização, uma vez que hemaglutinina é conhecida como sendo o alvo da resposta de anticorpo de neutralização imune.
10. Ensaio de neutralização por ensaio de redução de placa
[0069] Ensaios de neutralização foram realizados utilizando a técnica de ensaio de placa para avaliar mais precisamente a atividade de neutralização de Fab 28. Em primeiro lugar, os preparados de isolados de vírus, subtipos H1N1 e H3N2, foram quantificados por ensaio de placa com o seguinte protocolo. Células MDCK foram cultivadas em placas de seis cavidades (Costar) em meio MEM suplementado com penicilina e estreptomicina (pen/strep) e enriquecido com soro bovino fetal a 10% (FBS). Após a monocamada de células ter atingido 100% de confluência, as cavidades foram lavadas com PBS e meio de cultura MEM fresco suplementado com os mesmos antibióticos (pen/strep) e tripsina (1 μg/ml) foi adicionada ao mesmo. Diluições em série dos estoques de vírus foram feitas nas mesmas cavidades, e o vírus foi deixado adsorver por 1 hora a 34°C sob uma atmosfera de CO2 a 5%. O meio foi então aspirado e duas lavagens com PBS foram feitas. Mais MEM suplementado com antibióticos, tripsina (1 μg/ml) e agarose a 0,8% foi suavemente adicionado em uma temperatura não superior a 42°C. Após infecção, a condição de saúde da monocamada de célula foi checada sob um microscópio de luz de contraste de fase, e as placas foram incubadas a 34°C sob uma atmosfera de CO2 a 5%. 48 horas após infecção, a camada de agarose foi removida, tendo muito cuidado para não danificar a monocamada de células. Posteriormente, metanol a 70% em água, adicionado com violeta cristal (1% peso/v) foi adicionado às cavidades. A placa foi incubada com permeabilizante/corante em temperatura ambiente por 5 minutos. Após incubação, a placa foi lavada com água destilada em temperatura ambiente e deixada secar sob um fluxo laminar por 5 minutos. Finalmente, o número de PFU (unidades de formação de placa) foi avaliado sob o microscópio de contraste de fase em 4X de magnitude. Após o título de vírus ter sido calculado como PFU, o TCID50 correspondente foi calculado, e aquele mesmo título foi comparado com o título dos estoques de vírus análogos pela técnica de diluição de limitação de ponto final.
[0070] A titulação acima permitiu quantificação dos vírus para a avaliação precisa da atividade de Fab 28. Várias placas foram montadas analogamente ao procedimento acima mencionado para titulação por ensaio de placa. Uma mistura de neutralização foi desse modo preparada, que compreendia o vírus (100 TCID50 por cavidade) e concentrações diferentes dos Fabs que foram utilizados (Fab 28 e Fab de controle). Em particular, o ensaio foi executado por teste de concentrações diferentes de Fabs (20, 10, 5 e 2,5 μg/ml) contra 100 TCID50 das diversas cepas de vírus de influenza. As misturas de Fab/vírus foram então incubadas por 1 hora a 34°C sob uma atmosfera de CO2 a 5%. Após lavagem das células MDC com PBS, os preparados pré-incubados foram transferidos para as cavidades tendo uma monocamada de célula confluente a 100%, então foram incubados por 1 hora a 34°C sob uma atmosfera de CO2 a 5%. O ensaio foi realizado e interpretado como descrito anteriormente, por comparar o número de placas obtidas na presença de Fab 28 com aquelas obtidas na presença da mesma concentração do Fab de controle.
[0071] Os ensaios foram executados utilizando os seguintes isolados de influenza que pertencem a subtipos H1N1 e H3N2:
H1N1
A/Malaya/302/54
A/PR/8/34
H3N2:
A/Aichi/68
A/Victoria/3/75
A/Port Chalmers/1/73
[0072] Os resultados confirmaram a atividade de neutralização de Fab 28 em direção aos vírus de influenza H1N1 A/Malaya/302/54 e A/PR/8/34, confirmando também os valores IC50 abaixo de 2,5 μg/ml. Uma atividade de neutralização de heterosubtipo foi também confirmada contra os vírus de influenza H3N2 A/Aichi/68, A/Victoria/3/75 e A/Port Chalmers/1/73 (IC50 aproximadamente 20 μg/ml).
11. Identificação do epítopo reconhecido por Fab 28
[0073] Várias abordagens foram seguidas para identificar a região de hemaglutinina reconhecida por Fab 28, a capacidade do qual de reconhecer um epítopo, embora conformacional, já tinha sido mostrado por experimentos anteriores. Realmente, Fab 28 resultou capaz de reconhecer a proteína somente em ensaios de Western blot executados sob condições semi-nativas (0,1% SDS). Os mesmos experimentos tinham também indicado a capacidade de Fab no reconhecimento somente da forma imatura da proteína (HAO), porém não as subunidades individuais (HA1 e HA2) . Ensaios de inibição de hemaglutinação (HAI) tinham sido realizados em paralelo, tanto com eritrócitos de frango como eritrócitos humanos. Apesar da atividade de neutralização notável, Fab 28 provou não ter atividade HAI, sugerindo que não ligou resíduos envolvidos na ligação entre hemaglutinina e ácido siálico.
[0074] Para melhorar caracterização do epítopo, duas estratégias complementares foram seguidas: seleção de seqüências de peptídeo aleatórias, contidas em uma biblioteca de exibição de fago, que eram capazes de ligar o monoclonal Fab 28; e indução in vitro, por pressão seletiva através de Fab 28, de variantes virais (mutantes de escapar) capazes de escapar da atividade de neutralização de anticorpo.
[0075] A seleção da biblioteca de peptídeo pela técnica de coleta permitiu a identificação de um número de peptídeos capazes de ligar especificamente o idiotipo Fab 28. Todos os peptídeos identificados foram lisados para gerar uma seqüência de consenso. Tal seqüência de consenso foi então utilizada para análise in silico de um cristal de hemaglutinina que pertence ao subtipo H1N1. Por essa análise foi possível revelar as regiões potencialmente reconhecidas por Fab 28. Um epítopo específico foi submetido à análise adicional, em vista de sua compatibilidade com os resultados encontrados anteriormente, e com aqueles gerados em paralelo com a abordagem pelos mutantes de escapar. O epítopo é localizado na região de origem de hemaglutinina, que está em uma porção entre as regiões HA1 e HA2 (dados perfeitamente compatíveis com os resultados obtidos nos ensaios de HA1 e Western Blot). Os resíduos críticos para a ligação que foram identificados são os seguintes: W357 e T358 na região HA2; N336; I337; P338 na região HA1 (a numeração dos resíduos se refere à seqüência de hemaglutinina a partir do isolado H1N1/A/PR/8/34 presente no banco de dados BLAST) (SEQ ID NO: 5).
[0076] O ensaio pelos mutantes de escapar foi realizado por infecções seriais de células MDCK com 100 TCID50 de vírus H1N1/A/PR/8/34 na presença de 10 ug/ml de Fab 28, isto é, uma concentração de Fab equivalente a seu IC90 contra o isolado em questão. Somente após inúmeras passagens, foi possível detectar infecção das células na presença do Fab, indicativo de uma mutação ocorrida no genoma de vírus. Na realidade, mutantes de escapar mudados em dois resíduos da região HA2, I361 e D362, foram selecionados, que estão adjacentes à região identificada pela abordagem in silico, confirmando a hipótese de que essa é a região reconhecida por Fab 28.

Claims (12)

  1. Anticorpo monoclonal recombinante direcionado contra antígeno de hemaglutinina de vírus de influenza A, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar e neutralizar uma pluralidade de subtipos do vírus de influenza A, em que a referida pluralidade de subtipos compreende pelo menos um subtipo de vírus influenza A que contém hemaglutinina H1 e pelo menos um subtipo de vírus influenza A que contém hemaglutinina H3, em que o anticorpo monoclonal recombinante compreende pelo menos um domínio variável da cadeia pesada e pelo menos um domínio variável da cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e o domínio variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
  2. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada é codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve é codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4.
  3. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em imunoglobulinas inteiras e fragmentos de imunoglobulina compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada e pelo menos um domínio variável de cadeia leve.
  4. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os referidos fragmentos de imunoglobulina são selecionados do grupo que compreende fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, anticorpos de cadeia única (scFv).
  5. Vetor de expressão recombinante caracterizado por compreender a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.
  6. Célula hospedeira caracterizada por ser transformada por um vetor de expressão recombinante como definido na reivindicação 5.
  7. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  8. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento profilático ou terapêutico para uma infecção de vírus de influenza A ou uma patologia direta ou indiretamente causada por uma infecção por vírus de influenza A.
  9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a patologia causada por uma infecção de vírus de influenza A é a síndrome de influenza.
  10. Método de ensaio para detectar, em uma amostra biológica de um paciente, a presença de anticorpos antivírus influenza tendo uma propriedade de neutralização cruzada de heterosubtipo caracterizado por compreender colocar a referida amostra biológica em contato com um anticorpo monoclonal recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, como um reagente de ensaio específico.
  11. Kit de diagnóstico caracterizado por compreender um anticorpo monoclonal recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, como um reagente específico, o referido kit sendo particularmente projetado para uso em um método para detectar ou quantificar anticorpos de vírus anti-influenza A tendo uma propriedade de neutralização cruzada de heterosubtipo em uma amostra biológica obtida de um paciente.
  12. Método de ensaio para detectar, em uma composição de vacina ou imunogênica, a presença de epítopos de vírus de influenza A capazes de incitar anticorpos de vírus antiinfluenza A tendo uma propriedade de neutralização cruzada de heterosubtipo contra o vírus de influenza A, em um sujeito ao qual é administrado, caracterizado por compreender colocar a referida composição em contato com um anticorpo monoclonal recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, como um reagente de ensaio específico.
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