JP5792060B2 - A型インフルエンザウイルスサブタイプh1に対するホモサブタイプ交差中和特性を有するモノクローナル抗体 - Google Patents
A型インフルエンザウイルスサブタイプh1に対するホモサブタイプ交差中和特性を有するモノクローナル抗体 Download PDFInfo
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Description
患者の選択
研究に参加した患者を、異なるインフルエンザ分離株を認識し、潜在的に中和することができる抗体である交差反応性抗インフルエンザ抗体をそこからクローニングする機会を増やすために選んだ。特に、何人かの個人は、インフルエンザウイルスへの継続的な曝露にもかかわらず(時々、医者、小児科医、幼稚園および学校で働いている人々などの職業上の理由のため)、病気にかからないことを注記する。このため、かれらを、ヒトモノクローナル抗体を作成するのに最も適する候補者であると考えた。特に、以下の選定基準に従った:
−年齢25から55歳の間;
−臨床的インフルエンザ症候群に対して陰性である研究より前の最近10年間の病理学的な病歴;
−研究前5年間の毎年の流行に関するH1N1サブタイプウイルス分離株に対する1:1000より高い抗体力価;
−2種類のヒト対照H1N1サブタイプA型ウイルス分離株(A/Puerto Rico/8/34;A/Malaya/302/54)に対して検出できる中和力価(IC50>=1:20)
−過去に抗インフルエンザワクチン接種経験がないこと
−抗インフルエンザワクチン接種を受容するための適合性
MDCK(メイディン・ダービー・イヌ腎臓)(ATCC (登録商標) no.CCL-34TM)を、10%不活性化(56℃で30分間処理)ウシ胎児血清(FBS)(EuroClone)、50μg/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン(GIBCO)および2mM L−グルタミン(EuroClone)を補充した改変イーグル培地(MEM)(GIBCO)中で増殖させ、細胞株として用いた。(本願に関連するHA2領域配列により明確に特徴付けられる)フィールド(field)ブタ分離株SW1に関して、NSK(新生ブタ腎臓)細胞(Is-tituto Zooprofilattico di Brescia)を代わりに用いて、同様に処理した。前記細胞を5% CO2雰囲気にて37℃でインキュベートし、1週間に2回、1:3の割合で継代した。本願に記載される実験において、下記のH1N1サブタイプインフルエンザウイルス分離株を用いた:A/Puerto Rico/8/34株(ATCC (登録商標) no. VR-1469TM);A/Wilson-Smith/33株(ATCC (登録商標) no. VR-1520)、およびA/Malaya/302/54株(ATCC (登録商標) no. VR-98)。H1N1サブタイプに関して、血球凝集素HA2部分の配列(配列番号:5)に基づいて特徴付けられたブタ由来の分離株(SW1)も用いた。2種類はA型サブタイプH3N2(A/Port Chalmers/1/73-ATCC (登録商標) no. VR-810およびA/Aichi/2/68-ATCC (登録商標) no. VR-547)に属し、1種類はB型(B/Lee/40-ATCC (登録商標) no. VR-101)に属する3種類の他の対照分離株もまた用いた。ウイルスを増殖させるための培養用培地として、1μg/ml 血清を含まないトリプシン(SIGMA)で補充したMEMを用いた。ウイルスストックを、細胞外ウイルスとして培養上澄み液から得た。簡単に説明すると、細胞を感染させた後、単層を毎日観察して細胞変性効果の出現をモニターした。一般に、感染4日後、上澄み液を収集し、1000RCF(相対遠心力)で10分間遠心分離して細胞残屑を取り除き、次いで0.22μmフィルター(MILLIPORE)でろ過した。次に、上澄み液を、細胞を含まないウイルスとして一定分量にし、−80℃で保存した。
患者に由来するモノクローナル抗体の産生を、Cole et al, 1984 Cancer Research 22:2750-2753により記載される、エプスタイン・バーウイルス(EBV)による感染を介する形質転換法を用いることにより行った。取得した異なるクローンに由来する上澄み液を、ELISAにより抗体の存在について測定した。次いで、上記3種類のヒト分離株およびH1N1サブタイプブタ分離株SW1で感染させた細胞株に対してELISAにおいて反応できるが、2種類のH3N2サブタイプ分離株およびB分離株で感染させたものに対しては反応できない上澄み液でIgG抗体を産生できるクローンを、後の特徴付けについて選択した。特に、MDCK細胞を前記分離株にて高い感染多重度において感染させた。感染の約48時間後に、細胞をフラスコから剥離し、PBSで2回洗浄した。次いで、細胞沈殿物を、300μlの溶解水溶液(100mM NaCl、100mM Tris pH8および0.5% Triton−X)で懸濁させ、氷上で20分間保存した。細胞残屑を、10000gにて5分間遠心分離して取り除き、上澄み液を、タンパク質抽出物として20℃で保存した。コントロール抗原の調製物に関しては、非感染細胞を同じ方法で処理した。上澄みタンパク質濃縮物を、BCA(登録商標)タンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて2回調べた。簡単に説明すると、試料タンパク質用量を、ウシ血清アルブミン(BSA)の一連の公知の濃度希釈物により得られた検量線を参照することにより決定した。全ての試料の吸光度を、分光光度計にて540nmの波長で測定した。そうして得られた溶解物を、ELISAプレート(COSTAR)上に載せ(1ウェルあたり300ng)、4℃で一晩インキュベートした。次の日、プレートを蒸留水で洗浄し、PBS/BSA(Sigma)で37℃にて45分間ブロックした。次いで、各クローンからの上澄み液の40μlを、各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBS/0.5% Tween−20(Sigma)による5回より多い洗浄(WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin)後、TMBペルオキシダーゼ基質(Pierce)の40μlを各ウェルに添加した。約15分後、酵素活性を40μlのH2SO4を添加することにより阻害し、分光光度計セットで450nmにてシグナルを測定した。特に、(cINF49と名付けた)1つのクローンは、動物分離株を含む、異なるH1N1サブタイプ分離株で感染させた細胞から得られる全ての溶解物を特定の方法で認識できる抗体を産生することができることが証明された。一方、2種類のH3N2サブタイプウイルスおよびB分離株で感染させた培養物においてシグナルを検出できなかった。
Fab49鎖をコードする遺伝子を原核生物の発現ベクターにクローン化した。これにより、モノクローナル抗体である分子、ならびに抗体自体の量の増加を有するために、抗体産生細胞クローンの不安定性の問題を回避し、分子的観点からコードする遺伝子をより特徴付けることが可能となる。
クローンINF49から産生されたFab(以下、「クローン」と「Fab」を区別せずに記載する)を、ヒトFabに結合することができるヤギ抗体のポリクローナル調製物(PIERCE, Illinois)が共有結合したプロテインG(〜2mg/ml)を含むセファロース樹脂からなるカラムを用いて免疫アフィニティーにより精製した。簡潔には、クローンINF49の1つのコロニーを、アンピシリンとテトラサイクリンをそれぞれ50μg/mlと10μg/mlの濃度で含むSB培地の10mlに植菌した。37℃で一晩増殖させた培養物を、先ほどと同じ濃度の抗生物質を添加したSBの500mlのフラスコにサブ植菌(sub-inoculated)した。細胞を1mM IPTGにより誘導し、30℃で一晩振蘯した。培養物を5000rpmで25分間遠心分離し、PBSで再懸濁したペレットを超音波で分解した。18000rpmで25分間のさらなる遠心分離は、細胞残屑を取り除くために必要である。上澄み液をろ過し、次いで上記のセファロースカラムをゆっくり通した。その後、この樹脂を10PBS体積で洗浄し、結合したFabを酸性溶液(溶出緩衝液−H2O/HCl pH2.2)で溶出した。採取した様々なフラクションを適当な溶液(1M Tris pH9)で中和し、限外ろ過(Centricon, Millipore)により濃縮した。精製したFabの純度を、12%ポリアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル(SDS−PAGE)において1のアリコートを流すことにより評価した。最終的に、精製したFabの連続希釈を、記載されるごときELISAによりアッセイした。HCV E2糖タンパク質に対するモノクローナルFabの調製物を陰性コントロールとして含めた。この実験結果は、細菌溶解物で得られたものを確認し、H1N1サブタイプウイルスで感染させた細胞に対するクローンの特異的な反応性を立証した。
ELISAにより行われたデータを確認するために、Fab49を免疫蛍光測定によっても解析した。簡単に説明すると、全ての記載される対照ウイルスで感染させた培養物に由来する細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄した後、血球計数器を搭載する顕微鏡にてカウントした。それゆえ、細胞懸濁物を、細胞収集装置(Cytospin 4, Shandon Southern Products)における90gで3分間の遠心分離によるスライドの調製に用いた。調製したスライドは、それぞれ合計2x105個の細胞を含有した。コントロールのスライドを、感染していない細胞を用いて同様に調製した。次いで、細胞を、(−20℃の温度で使用した)メタノール−アセトン溶液を用いて室温で10分間固定し、透過処理した。PBSで3回洗浄後、細胞をFab49(100μg/ml)と一緒に湿度チャンバーにて37℃で30分間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。
選択したクローンのインビトロにおける生物学的活性を特徴付けるために、中和アッセイを、本研究で用いられるいくつかの対照ウイルス分離株について設計した。簡潔には、MDCK細胞(ブタ分離株SW1の場合にはNSK)を、96ウェルプレートにてMEM−10%FBSに撒いた(2x104細胞/ウェル)。上記のとおりに得られたウイルスストックの連続希釈物(10−1から10−8まで)を維持培地(2%FBSを含むMEM)で調製した。各希釈を6回繰り返した。培養した細胞がコンフルエントとなった時、増殖培地を取り除き、ウイルス希釈物の各々100μlを各ウェルに添加した。37℃で1時間後、接種菌物を取り除き、1μg/ml トリプシンを添加したMEM培地の200μlを各ウェルに置いた。ウイルス力価を、TCID50(細胞培養物の50%を感染させるための用量)で表し、リード−ミュンヒの(Reed−Muench’)式:
上述のごとく調製したA/Puerto Rico/8/34で感染させた細胞溶解物の10μgを、10% ポリアクリルアミドゲルにおいて元々の条件下で流した。このため、試料を、適当な冷蔵タンク(BIORAD)にて100Vで1時間流した。その後、ゲルを電気泳動装置から回収し、試薬残渣を取り除くために、トランスファー緩衝液(トリスベース(Tris base)3g;グリシン14.41g、dH2O 800ml、メタノール 200ml)中で10分間インキュベートした。次いで、ニトロセルロース膜(Hybond-ECL; Amersham Biosciences)上でトランスファーを、30Vと90mAで一晩行った。次いで、膜を、1XPBSに溶解させた5% 乾燥ミルクで1時間ブロックし、その後、1XPBS−0.1%Tweenで3回洗浄した。各洗浄中、膜をスイングプラットフォームにて10分間振蘯させた。その後、5%乾燥ミルクを含有するPBSで希釈した異なるFabを5μg/mlの濃度で添加した。Fab49以外に、下記のコントロールを添加した:陰性コントロールとしてe509;市販されているマウス抗HA全IgG1(COVANCE);市販されているマウス抗M1全IgG1(ARGENE);マウス抗M2全IgG1(ABCAM);1:200で希釈したヒト血清。各抗体を室温にて1時間振蘯させた。その後、膜を上述のごとくPBSで再度洗浄した。次いで、ELISAアッセイにて記載したものと同一の二次マウス(1:1000)またはヒト(1:2000)抗体を、検出される抗体の供給源に応じて添加した。シグナルを検出するために、ワーキング(working)溶液を、2つの基質(SuperSignal (登録商標) West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce)を1:1の割合で混合させることにより、特に光源に曝露しないように注意しながら調製した。ニトロセルロース膜をワーキング溶液で5分間インキュベートし、次いで取り除き、HyperCassette(AMERSHAM)にマウントした。これを、必要な露出時間後に暗室にてKodakフィルム上に現像した。記載のアッセイを2つの異なるセッションにて行い、それらの各々において、Fab49でインキュベートした膜の一部は、ウイルス血球凝集素の未成熟形態(HA0)の重さと一致する80kDよりわずかに低い重さを示すバンドの存在を示した。このことを、抗血球凝集素コントロール抗体とインキュベートした条片(strip)上に示された同一のバンドによっても確認した。他よりもより強い類似バンドを、ヒト血清でインキュベートした膜の一部においても検出した。この実験の結果より、この抗体は、血球凝集素がヒト中和反応の主な標的であることが知られていることから、中和データと完全に一致してインフルエンザウイルス血球凝集素に対して指向性を有することを示す。
インフルエンザウイルスA/PR/08/1934およびA/California/04/2009のHA部分を、それぞれ感染させたMDCK細胞の上澄み液から増幅するか、またはインビトロで合成し(ドイツ、レーゼンバーグのGenART)、pcDNA3.1発現ベクター(Invitrogen)にクローン化し、それにより1つの構築物H1 HA(A/RP/08/1934)および1つの構築物H1 HA(A/California/04/2009)を得た。
Claims (17)
- 血球凝集素を抗原として認識し、複数のH1サブタイプA型インフルエンザウイルス分離株に対する中和活性を有し、前記複数のH1サブタイプA型インフルエンザウイルス分離株が少なくとも以下の分離株:A/Puerto Rico/8/34、A/Wilson-Smith/33、A/Malaya/302/54およびA/California/04/2009を含むことを特徴とする、A型インフルエンザウイルスに対するヒトモノクローナル抗体であって、配列番号:1のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖可変ドメインおよび配列番号:2のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの軽鎖可変ドメインを含む、前記ヒトモノクローナル抗体。
- 配列番号:3のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも1つの重鎖可変ドメインおよび配列番号:4のヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも1つの軽鎖可変ドメインを含む、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体。
- 少なくとも1つの重鎖可変ドメインおよび少なくとも1つの軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン全体および免疫グロブリンのフラグメントからなる群から選択されるものである、請求項1または2に記載のヒトモノクローナル抗体。
- 前記免疫グロブリンのフラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖抗体(scFv)を含む群から選択されるものである、請求項3記載のヒトモノクローナル抗体。
- 配列番号:1および配列番号:2から選択される単離されたポリペプチド。
- 請求項1から4のいずれか記載のモノクローナル抗体のイディオタイプに対して特異的である、抗イディオタイプ抗体。
- 配列番号:3および配列番号:4から選択されるヌクレオチド配列からなる単離された核酸。
- 配列番号:3のヌクレオチド配列、または配列番号:4のヌクレオチド配列、あるいは配列番号:3のヌクレオチド配列および配列番号:4のヌクレオチド配列の両方を含む、発現ベクター。
- 請求項8記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 有効量の請求項1から4または6のいずれか記載の少なくとも1つの抗体、ならびに医薬上許容される担体および/または希釈剤を含む、医薬組成物。
- H1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスによる感染により直接または間接的に引き起こされる症状を処置するための予防用または治療用の医薬として使用するための、請求項1から4または6のいずれか記載の抗体。
- H1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる症状を処置するための予防用または治療用の医薬を製造するための、請求項1から4または6のいずれか記載の抗体の使用。
- H1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる症状が、インフルエンザ症候群である、請求項12記載の使用。
- 前記症状が、ブタインフルエンザウイルスまたは新型インフルエンザウイルスとも称されるH1N1 A型インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされるものである、請求項13記載の使用。
- 患者に由来する生物学的試料において、H1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和特性を有する抗インフルエンザウイルス抗体の存在を検出するためのアッセイ方法であって、前記生物学的試料と、特異的なアッセイ試薬としての請求項1から4のいずれか記載のモノクローナル抗体とを接触させることを含む方法。
- 免疫原性またはワクチン組成物において、H1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和特性を有する抗A型インフルエンザウイルス抗体を誘導することができるH1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスに由来するエピトープの存在を検出するためのインビトロアッセイ方法であって、該組成物が投与される対象において、前記組成物と、特異的なアッセイ試薬としての請求項1から4のいずれか記載のモノクローナル抗体とを接触させることを含む方法。
- 患者から得られた生物学的試料または免疫原性もしくはワクチン組成物において、H1サブタイプ血球凝集素を発現するA型インフルエンザウイルスに対するホモサブタイプ交差中和特性を有する抗A型インフルエンザウイルス抗体を検出または定量するためのキットであって、特異的な試薬として請求項1から4のいずれか記載のモノクローナル抗体を含むキット。
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