MX2010012974A - Anticuerpos monoclonales que tienen propiedades de neutralizacion cruzada de homosubtipo contra los virus de la influenza a del subtipo h1. - Google Patents

Abstract

Se describe un anticuerpo monoclonal dirigido contra el virus de la influenza A que es capaz de unirse a aislados de humano y animal de virus de la influenza A que expresan la hemaglutinina del subtipo H1; una modalidad preferida es el anticuerpo denominado Fab49 que muestra una actividad neutralizante contra una pluralidad de aislados de virus de la influenza A que expresan la hemaglutinina del subtipo H1, incluso aislados derivados de animales; también se describen anticuerpos antiidiotipo dirigidos contra el anticuerpo monoclonal de la invención, composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden el anticuerpo monoclonal de la invención, y también aplicaciones terapéuticas, profilácticas y diagnósticas del anticuerpo monoclonal de la invención; el anticuerpo monoclonal de la invención también se puede usar para probar preparados de anticuerpo para usarse como vacunas.

Description

NTICUERPOS MONOCLONALES QUE TIENEN PROPIEDADE TRALIZACIÓN CRUZADA DE HOMOSUBTIPO CONTRA LOS DE LA INFLUENZA A DEL SUBTIPO H1 MEMORIA DESCRIPTIVA En general, la presente invención se refiere al camp nología.

Más específicamente, la invención se refiere a un an clonal dirigido contra el antígeno HA (hemaglutinina) del subtipo de la influenza A, que es capaz de reconocer y neutralizar tant das del hombre como cepas aisladas de animales.

Los virus de la influenza son capaces de infectar a di cies de animales, entre las cuales se encuentran especialment cíes de aves, porcinos y equinos. Solo unos pocos de estos vi pos que circulan en el hombre que ocasionan epidemias de i ional, el subtipo H1 y el subtipo H3. El subtipo H1 , reconocid uerpo que es el objeto de la presente invención, apareció en el 918 causando la terrible pandemia llamada "gripe española", n el país europeo en donde se reportaron los primeros casos. ntes han demostrado que el virus responsable de la "gripe españ irus aviar que infectó a unas aves y, como resultado de ciones, desarrolló la capacidad de infectar al hombre y propag persona a otra. El aislado de 1918 es el progenitor común de t del subtipo H1 encontrados en el hombre y otros animales c s. Los virus del subtipo H1 fueron los responsables de las ep les de influenza humana hasta 1957, durante el cual fueron desp un virus que tiene una hemaglutinina del subtipo H2, que nsable de la denominada pandemia "asiática". No se reportar s causados por el subtipo H1 hasta el año 1977, durante el cual nal, 28 de abril de 2008).

Las epidemias anuales del virus de la influenza tie cto considerable sobre el servicio de salud pública y sobre los iados con el mismo. Tan solo en los Estados Unidos de Am a que más de 200,000 personas son hospitalizadas cada omes asociados con los virus de la influenza, y aproximadamente rtes están relacionadas directamente con la misma (Thompso 2003, 289:179-186). A estos datos se deben agregar todos lo úmeros exponencialmente más altos, de los sujetos infectados a trabajar durante periodos más o menos largos, con reperc lómicas inevitables debido a la pérdida de días de trabajo. Un inte (Molinari et al., Vacciné, 2007, 25: 5086-5096) ha calculado 3S médicos relacionados directamente con las epidemias anual snza son de 10.4 billones de dólares estadounidenses al año, a lo íeben agregar otros 16.3 billones de dólares estadounidenses epidemia de la siguiente estación de influenza. Este tipo de pred a en datos epidemiológicos vinculados con aislamientos tempra s zonas geográficas centinelas, no siempre resulta correcta, existe el riesgo considerable, que está presente cada año, de a trivalente desarrollada para una cierta estación de influenza stancialmente ineficaz.

En ese caso, así como también en el caso de una pa , la única ayuda profiláctica/terapéutica disponible sería recurri ases disponibles de fármacos antivirales: los inhibidores de la p amantadina y rimantadina), y los inhibidores de neurami amivir y zanamivir). Sin embargo, también en esta situación ar una serie de problemas relacionados tanto con la necesid istrar los antivirales en una etapa muy temprana de la infección, c aparición de aislados virales resistentes, que no obstante do. sencia de una envoltura derivada de membranas celulares infe la cual están presentes aproximadamente 500 púas, también lla cciones. Estas proyecciones consisten en trímeros y tetrámeros tantes proteínas de superficie viral, esto es, la hemaglutinin tormente mencionada y la neuraminidasa (NA), que también se u inar los subtipos del virus de tipo A. En la superficie de la en én se encuentra una proteína de membrana integral (M2), dicha p presente en cantidades mucho más bajas en comparación glutinina y la neuraminidasa, y también se organiza en tetrámeros.

El virus de la influenza también se caracteriza por la pre del núcleo, de un genoma segmentado comprendido de 8 frag N de una sola cadena. Basándose en las características de ínas dentro del virión (NP y M1), son distinguibles los tre idos del virus de la influenza: el tipo A, el tipo B y el tipo C. Los vi y del tipo B son responsables de las epidemias anuales. En cam que los produjo. La función clave desempeñada por est ínas, así como su despliegue sobre la superficie del virus, é representan el blanco principal de la respuesta inmune, y por ptibles de una tasa de mutación elevada. De hecho, las ep es son causadas por virus que son más o menos diferentes de l s años anteriores, y por lo tanto son capaces de escapar más o ntérnente de la respuesta inmune que estimulan. En otras pala ulación progresiva de mutaciones de punto en la hema ipalmente) y neuraminidasa (secundariamente) hace a los anti ctores, producidos durante las epidemias previas, en resivamente ineficaces.

La función protectora principal de la respuesta inmune c snza es desempeñada por el componente humoral. Los anti en su función protectora obstaculizando la unión de la hemaglu ) siálico, impidiendo con ello la infección de las células. Esta menté un paso evolutivo muy favorable para el virus.

En vista del aspecto profiláctico y terapéutico, sería er moléculas de anticuerpo capaces de reconocer tales r nes dentro de un subtipo. De hecho, tales anticuerpos sentar una herramienta de protección útil al administrarse a suj 0, puesto que también serían capaces de reconocer una amplia g del mismo subtipo pero evolutivamente distantes uno de otro, potencialmente serían capaces de proteger contra la mayoría que pertenecen a dicho subtipo, incluso los posibles virus nue ieran la capacidad de propagarse de animales a humanos. Este nidad, que se pierde cuando los aislados en circulación muest de mutación alta en comparación con los años anteriores, es c > inmunidad de homosubtipo contra la influenza.

Ahora, los presentes inventores han acertado al uerpos monoclonales con las características deseables anteri la influenza A del subtipo H1. Preferiblemente, dicho an oclonal neutralizante reconoce como antígeno a la hemaglutinina de la influenza A del subtipo H1.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal de la inven año o humanizado.

Tales anticuerpos representan una herramienta de pr sa cuando se administran a los pacientes en riesgo.

Además, el uso de un anticuerpo monoclonal hu anizado en pacientes humanos es una ventaja adicional amenté, el anticuerpo humano o humanizado es bien tolerado.

Además, como representa un componente de la respu ;uerpo humano a este virus, el anticuerpo monoclonal de la i itituye un factor clave para el diseño de vacunas innovadoras cap cir una inmunidad mucho más eficaz, protectora y de amplio ra los virus del subtipo H1 , en comparación con la inmunidad indu ante cualquier método conocido per se, por ejemplo el método aca et al, 1997, J. Biol. Chem 272:10678-84, o Cárter et al, 199 Acad. Sci 89:4285. Estas referencias bibliográficas se sivamente a manera de ilustración y no de limitación. De he cen otros métodos para la preparación de anticuerpos humanizad en usar en la presente invención.

En la sección experimental se describe especifícam ción de un clon (denominado INF49) capaz de producir anti clonales en forma de fragmentos Fab con la capacidad de unirse ltiples aislados humanos y animales del virus de la influenz po H1.

Los anticuerpos monoclonales producidos por el clon minados Fab49) representan una modalidad preferida de la in e los inventores comprobaron experimentalmente que estos anti ntan una actividad neutralizante contra múltiples aislados hu espectivas secuencias de nucleótidos codificadoras, designada ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

En particular, la sección experimental describe la fabrica ticuerpos monoclonales Fab49 como fragmentos Fab. Sin emba de que los anticuerpos monoclonales también se pueden fabrica ras formas, tales como por ejemplo inmunoglobulinas completa de otros tipos de fragmentos de anticuerpo, tales como por entos F(ab')2 o fragmentos de anticuerpo más pequeños que lo ejemplo, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de io), y también en forma de péptidos de por lo menos 8 aminoác ud que tienen las mismas propiedades inmunológicas que el Fab.

Se pueden construir anticuerpos de una sola cadena de \ método descrito en la patente de EE. UU. No. 4,946,778, de La cluida aquí como referencia. Los anticuerpos de una sola renden las regiones variables de cadena ligera y pesada unidas n variable de la cadena pesada de un anticuerpo (anticuerpo de io VH), con una afinidad suficiente por el epítope objetivo para u o en una forma aislada.

En la descripción que sigue, el término "anticuerpo" s referirse a todas las modalidades anteriormente mencionadas, oglobulinas completas, fragmentos Fab u otros tipos de fragme erpo, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de un solo d Los anticuerpos monoclonales de la invención se rar y usar en forma libre o en forma conjugada con vehículo. Un v alquier molécula u entidad química o biológica capaz de conjuga ticuerpo y hacerlo inmunogénico o aumentar su inmunoge plos no limitativos de vehículos son las proteínas tales co ocianina de lapa), edestina, tiroglobulina, albúminas como albú bovina (BSA) o albúmina de suero humana (HSA), eritrocito clonal de la invención es particularmente adecuado para us ciones médicas, particularmente en la fabricación de un medie el tratamiento profiláctico o terapéutico de amplio espectro de infe rus de la influenza A del subtipo H1.

De esta manera, está dentro del alcance de la invenció nticuerpo monoclonal de la invención para preparar un medicame tamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades causad ones del virus de la influenza A del subtipo H1 , tales como por drome de influenza.

En este contexto también, la expresión "anticuerpo Fa incluye los fragmentos Fab sino que también cualquier otra for se pueda preparar el anticuerpo, por ejemplo inmunogl ietas, otros tipos de fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de u na, etc.

Como se describe en detalle en la sección experim ); A/Malaya/302/54 (ATCC® No. VR-98). El anticuerpo en ién resultó capaz de reconocer lisados de células NSK (de riñon d nacido) (Istituto Zooprofilattico di Brescia) infectados con un aisl o" derivado de animal, y en particular derivado de cerdo rado por la secuencia del fragmento HA2 de hemaglutinina del su sado por la misma (SEQ ID NO: 5).

Una propiedad adicional particularmente ventajo uerpo monoclonal de la invención es su capacidad para unir ína HA recombinante del aislado del virus de i lifornia/04/2009, identificado recientemente como uno de los nsables de la denominada "influenza porcina" denominada ofici a influenza" por la OMS.

En la siguiente sección experimental se describen pru realizadas con la proteína HA recombinante del lifornia/04/2009, y la proteína HA recombinante del aislado A/PR/ formadas partiendo de sangre periférica de pacientes.

También se describen los procedimientos usados para el s que codifican la porción Fd de las cadenas pesadas y lig uerpo Fab49 de la invención, y también los procedi mbinantes usados para producirlo, como péptidos solos ientos Fab.

Las capacidades del anticuerpo monoclonal de la invenc cionar con células infectadas con diferentes aislados humanos y a de la influenza A del subtipo H1 , fueron verificadas por m >A e ¡nmunofluorescencia. Además, se hizo una prueba de neutr verificar la actividad biológica in vitro del anticuerpo. En esta pr ;uerpo Fab49 mostró una actividad de neutralización cruz osubtipo contra los aislados virales de humano y animal de t ipo H1 arriba indicados.

Los datos obtenidos indican que el anticuerpo de la inve nte farmacéuticamente aceptable. Una cantidad efectiva es aqu paz de inducir un efecto favorable en el sujeto al que se le admi osición, por ejemplo, para neutralizar el virus de la influenz po H1.

En este contexto, el término "sujeto" designa cualquier edero al que se le puede administrar la composición, incl nos.

Ejemplos no limitativos de vehículos o d acéuticamente aceptables útiles en la composición farmacéutic ición incluyen estabilizadores como SPGA, carbohidratos (por tol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteína nina o caseína, agentes que contienen proteína tales como suer che descremada, y amortiguadores (por ejemplo amortigua tos).

El anticuerpo monoclonal de la invención también se pue e la influenza A del subtipo H1 de humano o animal. Estos antic eden encontrar en la muestra biológica del paciente (o animal) ado de una exposición previa a un virus de la influenza A, o por te se le ha administrado previamente el anticuerpo monoclona ión para fines terapéuticos o profilácticos o de investigación.

De esta manera, dentro del alcance de la invención está i étodo de prueba para detectar en una muestra biológica o menté de un paciente o un animal hospedero, la presen erpos contra el virus de la influenza A que tienen una ac lizante cruzada de homosubtipo contra el subtipo H1 , que com en contacto dicha muestra biológica con el anticuerpo monoclon ión como un reactivo de prueba específico.

La prueba puede ser cualitativa o cuantitativa. La dete ificación de los anticuerpos contra el virus de la influenza A del e tienen una actividad neutralizante cruzada de homosubtipo se Similarmente, el anticuerpo monoclonal de la invención se como reactivo específico en un método de prueba para det ificar, en una composición inmunogénica o de vacuna previ rada, epítopes capaces de provocar en un sujeto, al que se le ad composición, anticuerpos contra el virus de la influenza A del sub tienen propiedades neutralizantes idénticas o similares a l erpo monoclonal de la invención, que es una actividad neutra da de homosubtipo contra el virus de la influenza A del subtipo H1.

Se prevé que dicho método será útil para la valora uier preparado que se vaya a utilizar como vacuna o pre ogénico, ya que el reconocimiento por parte del anticuerpo mon invención sería indicativo de la presencia, en el preparado inmuno una, de uno o más epítopes capaces de estimular la producc s de anticuerpo capaces de reconocer un epítope conveniente, ta emplo un epítope capaz de provocar inmunidad de homosubtipo erpo monoclonal de la invención también están incluidos en el a invención.

La siguiente sección experimental se provee únicam ra de ilustración y no de limitación.

Sección experimental Selección de pacientes Los pacientes incluidos en el estudio fueron seleccionad mentar la probabilidad de clonar anticuerpos de reactividad c la influenza, esto es, anticuerpos capaces de recono lemente de neutralizar, diferentes aislados del virus de la influen ular, se describe que algunos individuos, a pesar de una exp ua al virus de la influenza (algunas veces por razones profesi médicos, pediatras, personas que trabajan en guarderías y esc traen la enfermedad. Por esta razón se piensa que estos ind - título de neutralización detectable (CI5o > = 1 :20) con os humanos del virus A del subtipo H1 N1 de referencia (A 8/34; A/Malaya/302/54). - sin vacunación previa contra la influenza; - de acuerdo en recibir vacunación contra la influenza.

En el momento de la vacunación y aproximadamente 3 s ués de la vacunación se extrajeron aproximadamente 20 mi de sa paciente en tubos de ensayo heparinizados.

Cultivo de los aislados del virus de referencia Como línea celular se usaron células DCK (células d 0 de Madin-Darby) (ATCC® No. CCL-34TM), propagadas en m modificado (MEM) (GIBCO), suplementado con 10% de suero desactivado (FBS) (tratado a 56°C durante 30 minutos) (EuroClo 1 de penicilina, 100 de estreptomicina (GIBCO) y 2 m ® No. VR-1469TM); cepa A/W¡lson-Smith/33 (ATCC® No. VR-1 A/Malaya/302/54 (ATCC® No. VR-98). Con respecto al subtipo én se usó un aislado derivado de cerdo (SW1), caracterizado s de la secuencia de la porción HA2 de hemaglutinina (SEQ ID ién se usaron otros tres aislados de virus de referencia, d ecen al tipo A subtipo H3N2 (A/Port Chalmers/1/73 - ATCC® N A/Aichi/2/68 - ATCC® No. VR- 547), y uno que pertenece al su e/40 - ATCC® No. VR-101). Para el crecimiento del virus se de cultivo MEM suplementado con 1 µg/ml de tripsina libre d A). Las reservas de virus se obtuvieron del sobrenadante del virus extracelulares. Brevemente, después de infectar las cél capa se observó diariamente para monitorear la aparición de un tico. El sobrenadante se recogió generalmente 4 días despué ión; se centrifugó a 1000 RCF (fuerza centrífuga relativa) dur os para eliminar los desechos celulares, y el producto se filtró co rch 22:2750-2753. El sobrenadante de los diferentes clones ob alizó por medio de ELISA para determinar la presencia de antic , los clones capaces de producir anticuerpos de IgG en el sobreñ on capaces de reaccionar en la ELISA contra los lisados c ados con los tres aislados humanos anteriormente mencionad o porcino SW1 del subtipo H1 N1 , pero no contra los infectados islados del subtipo H3N2 y con el aislado B, fueron seleccionad caracterización subsiguiente. En particular, las células MD aron con los aislados anteriormente mencionados, a una multiplici ión alta. Aproximadamente 48 horas después de la infección, las pegaron del matraz y se lavaron dos veces en PBS. Despu celulares se suspendieron en 300 µ? de solución de lisis (100 100 mM de Tris, pH 8, y 0.5% de Triton-X), y se guardaron e ite 20 minutos. Los desechos celulares se centrifugaron a 1 ite 5 minutos y el sobrenadante se guardó a -20 °C como un extr g por pocilio) para cubrir una placa de ELISA (COSTAR) que se durante la noche. Al día siguiente, la placa se lavó con agua d bloqueó con PBS /BSA 1 % (Sigma) durante 45 minutos a és se agregaron a cada pocilio 40 µ? del sobrenadante de cada ubó 1 hora a 37 °C. Después de 5 lavados (WASHER ETI-SY rin) con PBS 10.5% de Tween 20 (Sigma), se agregaron a cada de anti-Fc humano conjugado con peroxidasa (1 :4000 en PBS Sigma), y la placa se incubó 1 hora a 37 °C. Después de 5 lavad BS /0.5% de Tween 20, se agregaron a cada pocilio 40 µ? del su roxidasa TMB (Pierce). Aproximadamente 15 minutos desp eó la actividad enzimática agregando 40 µ? de H2S04, y la señal s espectrofotómetro a 450 nm. En particular, se encontró que minado clNF49) es capaz de producir anticuerpos que ocer de manera específica todos los lisados obtenidos de las das con los diferentes aislados del subtipo H1 N1 , incluso el ener disponibles moléculas que son indudablemente monoclona también mayores cantidades del anticuerpo mismo.

El ARN mensajero (ARNm) se extrajo del clon clNF49 cult nscribió inversamente usando un oligo-dT de acuerdo con los idos per se. Los ADNc's que codifican la cadena ligera y el fra sto es, la porción variable de cadena pesada y la parte de la ante presente dentro del fragmento Fab), fueron entonces ampli nte los métodos descritos (CSH Press, "Phage display manual", n, p. A1.6). Luego, los ADNc's así obtenidos se clonaron en un v sión conocido per se denominado RBCaf (Burioni et al, J. Imm . Brevemente, el gen (ADN amplificado) que codifica la porció a pesada se digirió con las enzimas de restricción Xhol y Spel ( te 1.5 horas a 37 °C, y subsiguientemente se insertó en el ción del vector para cadenas pesadas, a su vez «digeridas as enzimas. En cambio, la cadena ligera (ADN amplificado) s a pesada. Las secuencias son las provistas en el listado de secu álisis molecular del patrón mutacional mostró una imagen atrib sos de mutación somática inducidos por antígeno.

Análisis de ELISA del Fab49 obtenido por clonación en R Se analizaron 40 clones bacterianos recomb ormados con la construcción Fab49 por medio de ELISA, usando S obtenidos sometiendo los cultivos a choque de calor. En pa S de bacterias transformadas con la construcción se inocularon e edio SB que contenía ampicilina y tetraciclina a concentracione I y 10 µg/ml, respectivamente, y se desarrollaron bajo agitación alcanzar una DO 600 = 1. Subsiguientemente se les agregó un i ífico (IPTG - isopropil- -D-tiogalactopiranósido) a una conce de 1 mM, y el cultivo se dejó agitando a 30 °C durante la noch s se lisaron por choque de calor (3 ronda nte día, después de quitar el antígeno no unido, las placas se la con PBS y los sitios de unión inespecífica se bloquearon con al en PBS durante 1 hora a 37 °C. Después de quitar la s eadora, se les agregaron los sobrenadantes de los cultivos c os como se describe arriba y que contienen los Fab's solubles. ido por un paso de incubación a 37 °C durante 2 horas. Despué de lavado con PBS /0.05% de Tween 20, se agregaron 40 µ? ón 1 :700 de un preparado policlonal de inmunoglobulinas no de cabra conjugadas con peroxidasa de rábano (Sigma) en P SA. Después de 1 hora de incubación a 37 °C y una serie adicion los, se agregó el substrato (OPD-o-fenilendiamina) a los iués, las placas se incubaron 30 minutos a temperatura ambient ridad. La reacción se desactivó con ácido sulfúrico 1 N y la d a se determinó por lectura espectrofotométrica a 450 nm. To is probados mostraron una reactividad específica contra cada intamente el "clon" o el Fab"), se purificó por inmunoafini nas compuestas de una resina de sepharose que contenía la pro g/ml), a la que se enlazó covalentemente un preparado policl erpos de cabra capaces de unirse a los Fab's humanos (PI ). Brevemente, una colonia del clon INF49 se inoculó en 10 SB que contenía ampicilina y tetraciclina a las concentracione y 10 µ9 ???, respectivamente. El cultivo, que se desarrolló dur a 37 °C, se sub-inoculó en un matraz con 500 mi de SB añadid a concentración de antibiótico que antes. Las células, in guientemente por IPTG 1 mM, se dejaron agitando durante la noc El cultivo se centrifugó a 5000 rpm durante 25 minutos y l pendida en PBS se sometió a sonicación. Fue necesar fugación adicional a 18,000 rpm durante 25 minutos para qu hos celulares. El sobrenadante se filtró y luego se pasó lentar s de la columna de sepharose anteriormente descrita. Posteriorm tivo preparados de Fab's monoclonales dirigidos contra la glicop e VHC. Los resultados de este experimento confirmaron los ob amenté con los lisados bacterianos, confirmando la reactividad es on hacia las células infectadas con los virus del subtipo H1 N1.

Determinación de inmunofluorescencia del Fab49 obten ción en RBCAF Para confirmar los datos obtenidos por ELISA, tam zó el Fab49 mediante una prueba de inmunofluorescencia. Brev élulas de los cultivos infectados con todos los virus de ref onados se tripsinizaron y, después de dos lavados en PBS, se c un microscopio con un hematocitómetro. De esta manera, la sus ar se usó para preparar portaobjetos por centrifugación entrífuga (Cytospin4, Shandon Southern Products) a 90 g du tos. Los portaobjetos así preparados contenían, cada uno, un tota sceína (Sigma), diluido 1 :200 en azul de Evans. Los portaobje inaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus). Como o se usó un anticuerpo monoclonal de ratón comercial (A ífico para la proteína M1 del virus de la influenza. Como ivo se usó un anticuerpo dirigido contra la glicoproteína E2 del viru itis C (e509; Burioni et al, Hepatology, 1998). El Fab mostr ofluorescencia, una reactividad específica para todas las das con los aislados humanos del subtipo H1 N1 , es, el aislado A/ /34, el aislado A/Wilson-Smith/33 y el aislado A/Malaya/302/5 un resultado similar con las células infectadas con el aislado usado en el estudio. E! patrón de fluorescencia mostrado fue clar trón de tipo citoplasma. En cambio, no se observó fluorescencia s no infectadas, ni en las células infectadas con el virus del , ni en las infectadas con el aislado de tipo B, ni con el anticue l negativo. idas como se describe arriba, en un medio de mantenimiento (M e FBS). Cada dilución se repitió seis veces. Cuando las das se hicieron confluentes, el medio de crecimiento se retir aron a cada pocilio 100 µ? de cada dilución del virus. Después de °C, los inóculos se retiraron y se pusieron en cada pocilio 20 MEM con 1 µ9/??? de tripsina. El título viral, expresado como TC que infecta el 50% del cultivo celular) se calculó aplicando la fór -Muench; Infectividad > 50% - 50% TCID50 = x factor de dilución Infectividad > 50% - infectividad < 50% A la luz de los datos obtenidos, la reserva del virus se dilu ar una multiplicidad de infección (M.O.I.) de aproximadamente ula de virus por 100 células) en el experimento de neutralización. a de neutralización real, las células se sembraron en una placa l mismo volumen de reserva de virus diluida (M.O.L 0.01), a te 1 hora. Subsiguientemente, a los pocilios que contenían las agregaron 250 µ? de la mezcla de virus-Fab. Se hizo un control fección agregando el medio de cultivo solo a la reserva del vir se incubó a 37 °C durante 1 hora para permitir la adsorción del alizado. Después, el inoculo se retiró y las células se lavaron do BS. A cada pocilio se le agregaron 1.5 mi de medio libre de suer l de tripsina. Después de 6 horas de incubación a 37 °C, la mo r se lavó con PBS y se fijó con una solución fría de metanol-orción 1 :2, almacenada a -20 °C), durante 10 minutos a temp nte. Las células fijas se lavaron y se incubaron con 250 µ? erpo monoclonal anti-M1 comercial (Argene) a 37 °C durante 30 a cámara húmeda. Las células se lavaron con PBS y finalm aron con un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con flúore o en azul de Evans, a 37 °C durante 30 minutos, en una cámara ado, de forma similar a la realizada para los controles de in ivos (Fab e509 anti-E2/VHC) y positivos (virus y libre de Fab).

El Fab producido por el clon INF49 mostró una activi lización cruzada de homotipo contra los aislados humanos y a irus A del subtipo H1 N1 , En cambio, no se detectó reducció idad de infectividad de los dos virus del subtipo H3N2 ni del virus ados en el estudio, confirmando la especificidad de la a alizante de homosubtipo observada para el subtipo H1 N1. En pa b producido por el clon INF49 (llamado Fab49) mostró u entración de Fab que inhibe el 50% de la infección del aislado do) menor de 5 pg/ml para cada aislado del subtipo H N1 proba una concentración que es fácilmente obtenible mediant istración in vivo de las moléculas en cuestión, incluso sin to a el aumento usualmente considerable de la actividad bi alizante observada cuando los Fabs son convertidos a la fo iraciones de Fab49. Los resultados obtenidos con el Fab e50 umano se reportan como un control negativo.

La figura 2 es una gráfica que ilustra el porcent lización del aislado A/Wilson-Smith/33 con diferentes concentra b49. Los resultados obtenidos con el Fab e509 anti-VHC hum an como un control negativo.

La figura 3 ilustra el porcentaje de neutralización del o de campo SW1 usado aquí con diferentes concentraciones de sultados obtenidos con el Fab e509 anti-VHC humano se reporta trol negativo.

Caracterización del antígeno reconocido por Fab49: West lisado de células infectadas En un gel de poliacrilamida al 10% se corrieron 10 µ9 celular infectado con el aislado A/Puerto Rico/8/34, preparado c lta al 5% en PBS 1X y se lavó tres veces en PBS 1X /0.1 % de te cada lavado, la membrana se dejó agitando en una píat iora durante 10 minutos. Después de esto los diferentes Fab's, S con 5% de leche en polvo, se agregaron a una concentració . Además del Fab49, se agregaron los siguientes controles: e50 l negativo; lgG1 completa de ratón anti-HA comercial (COVANCE leta de ratón anti-M1 comercial (ARGENE); lgG1 completa de rat BCAM); suero humano diluido 1 :200. Cada anticuerpo se dejó a a a temperatura ambiente. Después, la membrana se lavó nuev BS como se describió arriba. Entonces se agregaron los erpos secundarios de ratón (1 :1000) o humano (1 :2000) co ibe para la prueba de ELISA, dependiendo de la fuente del ant e va a detectar. Para la detección de la señal se preparó una s trabajo mezclando dos substratos (SuperSignal® West iluminescent Substrate Pierce) en una proporción 1 :1 , t mó porque la misma banda también se desplegó en la tira incuba icuerpo de control anti-hemaglutinina. También se detectó una ga más intensa que las otras en la porción de membrana incuba humano. El resultado de este experimento muestra que el anti rige contra la hemaglutinina del virus de la influenza, lo tamente consistente con los datos de neutralización, pues se sa aglutinina es el blanco principal de la respuesta neutralizante hu Pruebas de unión y neutralización para la HA del viru za A del subtipo H1 1 (influenza porcina) Las proteínas HA de los virus de influenza A/PR/08/ ifornia/04/2009 se amplificaron, respectivamente, del sobrenada s MDCK infectadas, o se sintetizaron in vitro (Ge-nART, Rage nia), y se clonaron en vectores de expresión pcDNA3.1 (Invit iendo así una construcción H1 HA (A/PR/08/1934) y una construc Células epiteliales de riñon humano (HEK) 293T se transf pg del vector recombinante pcDNA3.1 que contiene la construcc /PR/08/1934) o la construcción H1 HA (A/California/04/2009). D trifugación y fijación, las células transfectadas se incubaron con g/ml). Después de más lavados, las células se incubaron erpo monoclonal anti-Fab humano conjugado con FITC y se pr nte FACS. Los datos se analizaron como lo describen Perotti gry, enero de 2008; 82(2): 1047-52. El experimento demostró que ce las células 293T transfectadas con cualquiera de los v binantes.

Para la prueba de neutralización se hicieron vecto irus modificados a fin de expresar proteínas HA de influenza s pside (pseudo-tipificación), incluso el gen reportero Luc, partiendo s 293T cotransfectadas con FuGene 6 (Roche) y los sig idos: sistema Luc (5 pg de pCMVAR8.2 y 5.5 pg de pHR'CMV-Lu ueba de Luc (reactivo de prueba de luciferasa, Promega), de a as instrucciones del fabricante. Los títulos de los pseudo-ti saron como unidades de luminiscencia relativas (RLU/ml).

La actividad de neutralización de Fab49 se probó usan a de neutralización basada en pseudo-partículas de influenza, úe mostró que Fab49 tiene una fuerte actividad neutraiizadora las pseudo-partículas del virus de influenza generadas con I os del subtipo H1 N1 (A/PR/08/1934 y H1 HA (A California/04/200 \so de aproximadamente 2 pg/ml.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el v uenza A, que reconoce a la hemaglutinina como antígeno, caract e tiene una actividad neutralizante contra una pluralidad de aisla de la influenza A del subtipo H1. 2 - El anticuerpo monoclonal humano de conformidad dicación 1 , caracterizado además porque dicha pluralidad de aisla de la influenza A del subtipo H1 comprende por lo menos un do de humano y un aislado derivado de animal. 3.- El anticuerpo monoclonal humano de conformidad dicación 1 , caracterizado además porque dicha pluralidad de aisla de la influenza A del subtipo H1 comprende por lo menos los sig rende por lo menos un dominio variable de cadena pesada y un le de cadena ligera; y el dominio variable de cadena pesada ncía de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y el dominio variable de tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 6. - El anticuerpo monoclonal humano de conformidad dicación 5, caracterizado además porque comprende por lo m nio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena li nio variable de cadena pesada siendo codificado por la secue ótidos de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera cado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4. 7. - El anticuerpo monoclonal humano de conformid uiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además po ciona del grupo que consiste en inmunoglobulinas compl entos de inmunoglobulina que comprenden por lo menos un ble de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. terizado además porque tiene una actividad neutralizante cont idad de aislados del virus de la influenza A que expré glutinina del subtipo H 1. 11. - Un anticuerpo anti-idiotipo que está dirigido específic el idiotipo de un anticuerpo monoclonal como el que se recl uiera de las reivindicaciones 1 a 8. 12. - Una secuencia de nucleótidos aislada seleccionad ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4. 13. - Un vector de expresión que comprende la secue ótidos de SEQ ID NO: 3, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID dos secuencias de nucleótidos, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. 14. - Una célula hospedera transformada con un ve sión como el que se reclama en la reivindicación 13. 15. - Una composición farmacéutica que comprende una c iva de por lo menos un anticuerpo o un polipéptido como los mento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermed as por infección con el virus de la influenza A que expré utinina del subtipo H1. 18. - El uso que se reclama en la reivindicación 17, en don dad causada por infección con el virus de la influenza A que ex glutinina del subtipo H1 , es el síndrome de influenza. 19. - El uso que se reclama en la reivindicación 18, en d nfermedad es causada por infección con el virus de la influen denominado también virus de la influenza porcina o virus de la n a. 20. - Un método de prueba para detectar, en una mu a de un paciente, la presencia de anticuerpos contra el virus a que tienen propiedades de neutralización cruzada de homos virus de la influenza A que expresan la hemaglutinina del subtip prende poner en contacto dicha muestra biológica con un antic inistra la composición, que comprende poner en contacto sición con un anticuerpo monoclonal como el que se reclam era de las reivindicaciones 1 a 8 como un reactivo de p ico. 22.- Un kit que comprende un anticuerpo monoclonal co reclama en cualquiera de las reivindicaciones a 1 8 como re ico para detectar o cuantificar anticuerpos contra el virus za A, que tienen propiedades de neutralización cruzad ubtipo contra los virus de la influenza A que expresan la hemaglu btipo H1 , en una muestra biológica obtenida de un paciente sición inmunogénica o de vacuna. o