CN102060899B - 一种奈拉滨N-9位α型异构体、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种奈拉滨N-9位α型异构体、其制备方法及其作为参比对照品用于奈拉滨试样中N-9位α型异构体杂质定性分析和定量分析的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种奈拉滨N-9位α型异构体、其制备方法及其应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
奈拉滨(Nelarabine)化学名为2-氨基-9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤，结构式为：
奈拉滨由葛兰素(GlaxoSmithKline)公司研发，2005年10月获得美国FDA的快速批准，成为治疗至少对两种化疗方案无反应或治疗后复发的急性T细胞淋巴细胞性白血病(T-ALL)和T细胞淋巴细胞性淋巴瘤(T-LBL)新药，2006年在美国正式上市。奈拉滨是T-淋巴细胞选择核苷的类似物，是水溶性脱氧鸟苷的类似物ara-G的6-甲氧基衍生物。已证实核苷类似物作为治疗血液系统肿瘤的细胞毒药物疗效显著。ara-G的前体药物奈拉滨已被证明可有效治疗T-淋巴细胞急性白血病。
奈拉滨合成文献报道较少，欧洲专利EP 0294114、文献Tetrahedron Letters 46(2005)2961～2964及中国专利CN88103820.2公开的方法为：以2-氨基-6-甲氧基嘌呤和D-阿拉伯呋喃糖基嘧啶为原料，使用生化方法得到目标产物奈拉滨，该方案的难点在于菌种较难得到，反应时间较长，条件较苛刻，不利于工业化生产。反应式表示如下：
而中国专利CN200710119140.0公开的一种奈拉滨的合成方法，是以6-氯鸟苷为原料，经化学合成将呋喃核糖构型转换为呋喃阿拉伯糖制得奈拉滨。该方法合成路线长，反应过程中需经选择性脱保护、构型转换等反应要求高的操作，产物化学纯度及光学纯度均难以受控。
众所周知，对于人类用药，活性药物成分(API)产品上市前，安全性因素要求国内和国际管理机构对毒性未确证杂质限度规定非常低。通常，这些限度对于未确证的和/或毒性未定的杂质，其限度显然要更低，低于0.1％(重量)。因此，在活性成分制备过程中，产品如奈拉滨的纯度在上市之前是有要求的，该纯度也是药物制剂制备中活性剂的纯度。
在本领域同样已知的是，活性成分的杂质可能是由于自身的降解而产生的，也可能来源于制备方法，包括化学合成。方法杂质包括未反应的起始原料、起始原料中包含的杂质的化学衍生物、合成副产物、以及降解产物等。
稳定性是影响API保存期限的一种因素，除稳定性外，工业制备方法所产生的API纯度显然也是要成为商品的必要条件，工业制备过程中带入的杂质必须限制到极少量，最好基本不含。例如，ICH指导原则要求制备过程中详细说明原料、控制工艺参数(如投料比、温度、压力、反应时间、有机溶剂)，以及包括提纯步骤，来维持杂质的含量低于规定限度。
在制备API如奈拉滨过程中的某些阶段，必须分析纯度来确定它是否适合于继续加工以及最终在药品中的使用。药物活性成分不必绝对纯的，因为绝对纯度是一个理论概念，通常难以达到。相反，需要规定纯度标准，其目的是确保活性成分尽可能不含杂质，从而对于临床应用也尽可能是安全的。在美国，FDA的指导原则建议某些杂质含量要限制到0.1％以下。
一般来讲，副产品、副产物等杂质可采用光谱法或其他物理方法鉴别，它们随后与峰的位置(如在色谱图中)或TLC板上的斑点存在关联关系。可以根据例如在色谱图中的相对位置对杂质进行鉴别，其中色谱图中的相对位置称为“相对保留时间”。
保留时间依据仪器操作条件及其他多种因素围绕平均值变化。为减少这些变化对杂质精确鉴别的影响，业内人员使用“相对保留时间”(RRT)来鉴别杂质。杂质的RRT是保留时间除以参比对照品的保留时间。测定RRT使用的参比对照品，需选择含量足够高的化合物。
正如本领域技术人员所知，通过了解杂质的化学结构和合成途径，以通过鉴别影响终产物中杂质含量的参数，能够大大增强对相关杂质的控制。“参比对照品”在定性分析中用于鉴别混合物中的各组份，以它们在例如色谱图或薄层色谱板上的位置为基础。针对该目的，如果混合物中存在该化合物，则不一定向混合物中加入该参比对照品。
同任何化合物一样，奈拉滨包含多种外来化合物或多种来源的杂质或降解杂质。目前，奈拉滨N-9位α异构体从未独立制备并与奈拉滨分离。
发明内容
本发明的目的克服现有技术的不足之处，提供一种奈拉滨N-9位α型异构体、其制备方法及其应用。
本发明的奈拉滨N-9位α型异构体，化学名为2-氨基-9-α-D-阿拉伯呋喃糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤，其化学结构式如式(I)所示：
式(I)。
优选分离制备的奈拉滨N-9位α异构体包含小于1％面积的奈拉滨(根据HPLC判断)。或者分离制备的奈拉滨N-9位α异构体至少95％纯度(根据HPLC判断，面积归一化法)。
本发明的制备式(I)奈拉滨N-9位α型异构体的方法，包含以下步骤：
1)以2-氨基-6-氯嘌呤为原料，与六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷在80～130℃下进行硅烷化保护反应，反应时间为8～10小时；将所得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化反应产物在三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯催化下与2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖缩合得到中间体A：2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤；
2)将第1)步的中间体A经甲氧基化反应和柱层析纯化后得中间体B：2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤；
3)将第2)步的中间体B脱保护得到式(I)奈拉滨N-9位α型异构体。
优选地，
步骤1)中，2-氨基-6-氯嘌呤与六甲基二硅胺烷的重量比为1∶10～20；2-氨基-6-氯嘌呤与三甲基氯硅烷的摩尔比为1∶1～2；2-氨基-6-氯嘌呤与2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖的摩尔比为1∶0.8～1；2-氨基-6-氯嘌呤与三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯摩尔比为1∶0.6～1。
步骤2)中，甲氧基化试剂为甲醇钠，中间体A与甲醇钠的摩尔比为1∶2～4。
步骤3)中，脱保护剂为钯碳和甲酸铵，其中中间体B与甲酸铵的摩尔比为1∶1～30，中间体B与钯碳的重量比为1∶0.01～0.5。
制备奈拉滨N-9位α异构体(奈拉滨杂质)的方法，可用以下化学反应式表示：
其中HMDS为：六甲基二硅胺烷；TMSCl为：三甲基氯硅烷
TMSOTf为：三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯；Bn为苄基的缩写。
本发明的式(I)奈拉滨N-9位α型异构体，可作为参比对照品用于奈拉滨试样中N-9位α型异构体杂质定性分析和定量分析的用途。
本发明提供了定性分析奈拉滨试样中奈拉滨N-9位α异构体的方法，包括：
a)提供包含参比对照品奈拉滨N-9位α异构体和奈拉滨的参比试样；
b)将参比对照品奈拉滨N-9位α异构体试样通过HPLC或TLC以测定与奈拉滨比较相对保留时间；
c)将奈拉滨试样通过HPLC或TLC，以测定与奈拉滨相比奈拉滨N-9位α异构体的相对保留时间；
本发明还提供定性分析奈拉滨试样中奈拉滨N-9位α异构体的方法，包括：
a)提供含有未知浓度奈拉滨N-9位α异构体的奈拉滨试样；
b)提供已知浓度奈拉滨N-9位α异构体的试样；
c)将奈拉滨试样和奈拉滨N-9位α异构体试样通过HPLC；
d)测量由奈拉滨试样以及奈拉滨N-9位α异构体试样的峰面积；
e)根据步骤d)中的测量结果计算奈拉滨试样中奈拉滨N-9位α异构体的含量。
利用HPLC对混合物中各组份的检测且尤其是定量分析，均要求各组份的峰之间有充分的分离度。其可以按照下文所述方法通过施行测定分辨率的系统适用性检测检查。
附图说明
图1是奈拉滨N-9位α异构体标示物溶液的典型HPLC色谱图。
图2是含奈拉滨N-9位α异构体的奈拉滨试样的典型HPLC色谱图。
图3是奈拉滨试样的典型HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例来对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：奈拉滨中N-9位α异构体的定量分析
A.HPLC色谱法
色谱柱：Agilent Zorbax Bonus-Rp 4.6×150mm；
流动相：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(含0.6％三乙胺，用磷酸调节pH值至7.0)-乙腈(95∶5)；
检测波长：249nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃
进样量：20μl
B.制备鉴别奈拉滨N-9位α异构体用的标准溶液定位图：
制备奈拉滨N-9位α异构体标准物在流动相中的溶液，在相对保留时间RRT为0.9处鉴别出N-9位α异构体的峰，色谱图见图一。
C.制备鉴别奈拉滨N-9位α异构体用的标示物溶液：
制备含奈拉滨N-9位α异构体的奈拉滨标示物溶液，浓度为约0.5mg/mL稀释剂。注入含奈拉滨N-9位α异构体的标示物溶液以鉴别奈拉滨中奈拉滨N-9位α异构体杂质的峰。图二表明含奈拉滨N-9位α异构体的典型色谱图。
D.制备试样溶液：
制备供分析用的奈拉滨溶液，浓度为0.5mg/mL稀释剂。
E.方法：
将试样溶液注入色谱仪中，继续试样的色谱直至程序结束。
试样色谱图见图3。
实施例2 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤152.6g(0.9mol)和六甲基二硅胺烷2300g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷147g(1.35mol)，加热至120℃，保持反应9小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于20L反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖355g(0.81mol)与1，2-二氯乙烷9000g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)200g(0.9mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入5000mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物371g，收率72.1％。
实施例3 2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)的制备
将按实施例2制得的11.4g中间体A(0.02mol)置于反应瓶中，加入114mL甲醇，磁力搅拌下，加入甲醇钠3.6g(0.067mol)，升温至60℃保温反应30分钟，TLC检测原料点反应结束，将反应液浓缩蒸干，得油状物；加入200mL二氯甲烷和200mL纯化水溶解，分出水层，二氯甲烷100mL×2次萃取水层，合并有机层，饱和氯化钠溶液100mL×2次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得淡黄色油状物；
用二氯甲烷溶解样品上柱，先用二氯甲烷∶甲醇(100∶1，体积比)配成的溶液洗脱柱床，洗去杂质；然后以二氯甲烷∶甲醇(100∶5，体积比)比例配成的溶液洗脱柱床，待目标峰出现后，收集洗脱液，浓缩至干得油状物6.4g，收率56.4％。(TLC检测：产品Rf约0.3，展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1，紫外灯下254nm检识)
实施例4 奈拉滨N-9位α异构体的制备
将实施例3所制备的2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)3.2g(5.6mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇32mL、甲酸铵4.2g(66.7mmol)和10％钯碳0.6g，在氮气保护条件下60℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约0.7g，收率：42％。HPLC纯度99.2％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例5 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤17g(0.1mol)和六甲基二硅胺烷170g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷10.9g(0.1mol)，加热至130℃，保持反应10小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖43.9g(0.1mol)与二氯甲烷850g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)17.8g(0.08mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入500mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物35.2g，收率61.6％。
实施例6 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤17g(0.1mol)和六甲基二硅胺烷200g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷21.7g(0.2mol)，加热至80℃，保持反应8小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖37.3g(0.085mol)与二氯甲烷750g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)15.6g(0.07mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入500mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物38.9g，收率68.1％。
实施例7 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤33.9g(0.2mol)和六甲基二硅胺烷610g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷26.1g(0.24mol)，加热至90℃，保持反应8.5小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖70.2g(0.16mol)与二氯甲烷700g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)26.7g(0.12mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入600mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物73.4g，收率64.2％。
实施例8 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤33.9g(0.2mol)和六甲基二硅胺烷678g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷30.4g(0.28mol)，加热至110℃，保持反应9.5小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖83.3g(0.19mol)与二氯甲烷416g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)40g(0.18mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入300mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物75.1g，收率65.7％。
实施例9 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤17g(0.1mol)和六甲基二硅胺烷238g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷17.4g(0.16mol)，加热至100℃，保持反应9.1小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖38.1g(0.087mol)与1，2-二氯乙烷1145g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)16.7g(0.075mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入600mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物40g，收率70％。
实施例10 2-氨基-6-氯-9-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤(中间体A)的制备
向反应瓶中加入2-氨基-6-氯嘌呤17g(0.1mol)和六甲基二硅胺烷289g，搅拌10分钟后加入三甲基氯硅烷19.6g(0.18mol)，加热至95℃，保持反应8.3小时，固体基本溶解形成溶液，减压浓缩至干得2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物，直接用于下一步反应。
将上步制得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化保护产物置于反应瓶中，再加入2，3，5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖40.8g(0.093mol)与1，2-二氯乙烷1630g形成的溶液，控制内温在20～30℃条件下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)18.7g(0.084mol)，于室温反应12小时，TLC监测原料点消失后将反应液倾入600mL水中，搅拌，分取有机相，加10％碳酸氢钠溶液调节pH＝6～7，分层，水洗后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得油状物43.6g，收率76.3％。
实施例11 2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)的制备
将11.4g中间体A(0.02mol)置于反应瓶中，加入114mL甲醇，搅拌下，加入甲醇钠2.16g(0.04mol)，升温至65℃保温反应30分钟，TLC检测原料点反应结束，将反应液浓缩蒸干，得油状物；加入200mL二氯甲烷和200mL纯化水溶解，分出水层，二氯甲烷100mL×2次萃取水层，合并有机层，饱和氯化钠溶液100mL×2次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得淡黄色油状物；
用二氯甲烷溶解样品上柱，先用二氯甲烷∶甲醇(100∶0.1，体积比)配成的溶液洗脱柱床，洗去杂质；然后以二氯甲烷∶甲醇(100∶2.5，体积比)配成的溶液洗脱柱床，待目标峰出现后，收集洗脱液，浓缩至干得油状物5.3g，收率46.7％。(TLC检测同实施例3)
实施例12 2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)的制备
将622.7g中间体A(0.04mol)置于反应瓶中，加入230mL甲醇，搅拌下，加入甲醇钠6.5g(0.12mol)，升温至50℃保温反应30分钟，TLC检测原料点反应结束，将反应液浓缩蒸干，得油状物；加入400mL二氯甲烷和400mL纯化水溶解，分出水层，二氯甲烷200mL×2次萃取水层，合并有机层，饱和氯化钠溶液200mL×2次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得淡黄色油状物；
用二氯甲烷溶解样品上柱，先用二氯甲烷∶甲醇(100∶0.5，体积比)配成的溶液洗脱柱床，洗去杂质；然后以二氯甲烷∶甲醇(100∶10，体积比)配成的溶液洗脱柱床，待目标峰出现后，收集洗脱液，浓缩至干得油状物13.4g，收率59.1％。(TLC检测同实施例3)
实施例13：2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)的制备
将22.7g中间体A(0.04mol)置于反应瓶中，加入230mL甲醇，搅拌下，加入甲醇钠7.78g(0.144mol)，升温至45℃保温反应30分钟，TLC检测原料点反应结束，将反应液浓缩蒸干，得油状物；加入400mL二氯甲烷和400mL纯化水溶解，分出水层，二氯甲烷200mL×2次萃取水层，合并有机层，饱和氯化钠溶液200mL×2次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得淡黄色油状物；
用二氯甲烷溶解样品上柱，先用二氯甲烷∶甲醇(100∶2，体积比)配成的溶液洗脱柱床，洗去杂质；然后以二氯甲烷∶甲醇(100∶21，体积比)配成的溶液洗脱柱床，待目标峰出现后，收集洗脱液，浓缩至干得油状物12.1g，收率53.4％。(TLC检测同实施例3)
实施例14：2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)的制备
将11.4g中间体A(0.02mol)置于反应瓶中，加入114mL甲醇，搅拌下，加入甲醇钠4.32g(0.08mol)，升温至40℃保温反应30分钟，TLC检测原料点反应结束，将反应液浓缩蒸干，得油状物；加入200mL二氯甲烷和200mL纯化水溶解，分出水层，二氯甲烷100mL×2次萃取水层，合并有机层，饱和氯化钠溶液100mL×2次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得淡黄色油状物；
用二氯甲烷溶解样品上柱，先用二氯甲烷∶甲醇(100∶1.5，体积比)配成的溶液洗脱柱床，洗去杂质；然后以二氯甲烷∶甲醇(100∶25，体积比)配成的溶液洗脱柱床，待目标峰出现后，收集洗脱液，浓缩至干得油状物5.7g，收率50.3％。(TLC检测同实施例3)
实施例15 2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2，3，5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤(中间体B)的制备
将11.4g中间体A(0.02mol)置于反应瓶中，加入114mL甲醇，搅拌下，加入甲醇钠2.7g(0.05mol)，升温至55℃保温反应30分钟，TLC检测原料点反应结束，将反应液浓缩蒸干，得油状物；加入200mL二氯甲烷和200mL纯化水溶解，分出水层，二氯甲烷100mL×2次萃取水层，合并有机层，饱和氯化钠溶液100mL×2次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩蒸干，得淡黄色油状物；
用二氯甲烷溶解样品上柱，先用二氯甲烷∶甲醇(100∶1.3，体积比)配成的溶液洗脱柱床，洗去杂质；然后以二氯甲烷∶甲醇(100∶14，体积比)配成的溶液洗脱柱床，待目标峰出现后，收集洗脱液，浓缩至干得油状物5.9g，收率52％。(TLC检测同实施例3)
实施例16：奈拉滨N-9位α异构体的制备
将中间体B 1.7g(3mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇17mL、甲酸铵0.19g(3mmol)和10％钯碳0.017g，在氮气保护条件下40℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约0.2g，收率：22.4％。HPLC纯度99.62％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例17：奈拉滨N-9位α异构体的制备
将中间体B 3.4g(6mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇34mL、甲酸铵2.27g(36mmol)和10％钯碳0.24g，在氮气保护条件下46℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约0.7g，收率：39.2％。HPLC纯度99.56％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例18：奈拉滨N-9位α异构体的制备
将中间体B 3.4g(6mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇34mL、甲酸铵7.6g(0.12mol)和10％钯碳0.4g，在氮气保护条件下51℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约0.9g，收率：50.5％。HPLC纯度99.83％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例19：奈拉滨N-9位α异构体的制备
将中间体B 3.4g(6mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇34mL、甲酸铵6g(0.096mol)和10％钯碳0.9g，在氮气保护条件下55℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约1.0g，收率：56.1％。HPLC纯度99.51％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例20：奈拉滨N-9位α异构体的制备
将中间体B 1.7g(3mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇17mL、甲酸铵5.67g(0.09mol)和10％钯碳0.65g，在氮气保护条件下65℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约0.4g，收率：44.8％。HPLC纯度99.55％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例21：奈拉滨N-9位α异构体的制备
将中间体B 1.7g(3mmol)置于反应瓶中，加入无水甲醇17mL、甲酸铵4.73g(0.075mol)和10％钯碳0.85g，在氮气保护条件下43℃反应约4小时，TLC监测反应完全后用醋酸调节反应液pH＝7.0～7.5，过滤，浓缩滤液至有固体析出后冷却至10℃以下析晶6小时，过滤，得白色的奈拉滨N-9位α异构体约0.5g，收率：56.1％。HPLC纯度99.71％，HPLC检测条件同实施例1。
实施例22 奈拉滨N-9位α异构体的结构确证
奈拉滨为2-氨基-9-β-D-呋喃型阿拉伯糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤，奈拉滨N-9-α异构体为2-氨基-9-α-D-呋喃型阿拉伯糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤；二者可根据两者圆二色谱(CD)的差异进行区分。此外两者的H12、H13、H14和H15化学位移在核磁共振谱氢谱上有明显的差异。在ROESY谱中，H12与H13、H14和H15相关信号有本质的差别，故可通过H12是否与H13、H14和H15有相关信号，来判断呋喃型糖基与嘌呤环N-9位连接的构型差异。
(1)元素分析
测试单位：南京大学现代分析中心
仪器：Vario Micro元素分析仪
方法：样品经减压干燥，燃烧分解，定量转换，检测，再经数据处理得到C、H和N的百分含量。
元素分析测定数据
表1.奈拉滨N-9-α异构体的元素分析结果
(2)、红外吸收光谱(IR)
测试单位：南京大学现代分析中心
仪器：NEXUS 870FT型红外光谱4EEA
方法：KBr压片法
红外吸收光谱测试数据
表2.奈拉滨N-9-α异构体的红外吸收光谱测定结果
3、质谱(MS)
测试单位：南京大学现代分析中心
仪器：Finnigan LCQ ESI-MS
离子源：电喷雾
质量分析器：离子阱
溶剂：甲醇
质谱(MS)测试数据
表3奈拉滨N-9-α异构体的质谱测定结果
(4)核磁共振谱(NMR)
测试单位：南京大学现代分析中心
仪器：BRUKER DRX-500型核磁共振仪
溶剂：DMSO-d6
内标：TMS
温度：303K
1H NMR和ROESY谱测试数据
表4 奈拉滨N-9-α异构体的1H NMR谱测定结果
化学位移(ppm) 质子数 峰形 相关质子 归属 备注
8.08 1H s H13，H12，13-OH H8
6.46 2H brs / -NH2 重水交换后消失
5.76 1H d H8，H12，H13，H14 13-OH J＝5.0Hz，重水交换后消失
5.73 1H d H14，H13，16-OH，13-OH H12 J＝5.5Hz
5.55 1H d H15，H14，H13 14-OH J＝5.0Hz，重水交换后消失
4.88 1H t H16，H15，H12 16-OH J＝5.5Hz，重水交换后消失
4.53-4.56 1H m H14，H15，14-OH，13-OH H13
4.09-4.12 1H m H16，H14，H13，14-OH H15
3.98-4.00 1H m H13，H12，14-OH H14
3.97 3H s / H10
3.47-3.61 2H m H15，16-OH H16
13C NMR和HMBC谱测试数据
表5奈拉滨N-9-α异构体的碳谱测定结果
带*为碳氢HMBC谱中的相映质子
Claims (6)
1. 一种奈拉滨N-9位α型异构体，其特征在于，其化学结构式如式（Ⅰ）所示：
2.一种制备如权利要求1所述的式（Ⅰ）奈拉滨N-9位α型异构体的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）以2-氨基-6-氯嘌呤为原料，与六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷在80~130℃下进行硅烷化保护反应，反应时间为8~10小时；将所得的2-氨基-6-氯嘌呤硅烷化反应产物在三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯催化下与2,3,5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖缩合得到中间体A：2-氨基-6-氯-9-D-(2,3,5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃基)-9H-嘌呤；
2）将第1）步的中间体A经甲氧基化反应和柱层析纯化后得中间体B：2-氨基-6-甲氧基-9-α-D-(2,3,5-三-O-苄基-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤；
3）将第2）步的中间体B脱保护得到式（Ⅰ）的奈拉滨N-9位α型异构体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，2-氨基-6-氯嘌呤与六甲基二硅胺烷的重量比为1：10~20；2-氨基-6-氯嘌呤与三甲基氯硅烷的摩尔比为1：1~2； 2-氨基-6-氯嘌呤与2,3,5-三-O-苄基-1-氯-阿拉伯呋喃糖的摩尔比为1：0.8~1；2-氨基-6-氯嘌呤与三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯摩尔比为1：0.6~1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，甲氧基化试剂为甲醇钠，中间体A与甲醇钠的摩尔比为1:2~4。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）中，脱保护剂为钯碳和甲酸铵，其中中间体B与甲酸铵的摩尔比为1：1～30，中间体B与钯碳的重量比为1：0.01～0.5。
6.如权利要求1所述的式（Ⅰ）奈拉滨N-9位α型异构体作为参比对照品用于奈拉滨试样中N-9位α型异构体杂质定性分析和定量分析的用途。
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| ROBERT BARKER 等.2,3,5-Tri-O-benzyl-D-nbosyl and-L-arabinosyl Bromides.《J Org Chem》.1961,第26卷(第11期),第4605-4609页. * |
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