CN106543035A - 一种苯腙类化合物、其制备方法、检测方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种苯腙类化合物、其制备方法、检测方法和用途。该化合物如式(I)所示，是依达拉奉合成过程中产生的一种有关物质。将苯肼、乙酰乙酸乙酯，亚硫酸氢钠加入水或有机溶剂中反应，反应完毕后，经硅胶柱色谱分离得到该化合物。本发明还提供了一种高效液相色谱法测定该化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，该方法操作简便，测定结果准确可靠。该化合物可作为杂质对照品用于依达拉奉原料药及其制剂的有关物质检查，控制依达拉奉产品的质量，提高安全性和可控性。

Description

一种苯腙类化合物、其制备方法、检测方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及到一种苯腙类化合物的合成、分离、检测以及在药物生产过程中的用途。此化合物是依达拉奉生产过程中产生的有关物质，将用于依达拉奉药品质量控制中。
背景技术
依达拉奉(Edaravone)是第一个用于治疗脑梗塞的自由基清除剂，由日本三菱制药公司开发并于2001年在日本批准上市，其化学名为3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，化学结构式如下：
文献报道的依达拉奉化学合成方法有多种，其中以下为主要两种合成路线：
1)苯肼与丁酮酰胺在水中缩合反应可得依达拉奉(全国原料药工艺汇编，1980，737-739)，此方法产品收率较高，但丁酮酰胺价格较高。
2)苯肼与乙酰乙酸乙酯在水或有机溶剂中缩合反应得依达拉奉(US 4857542)，此方法中乙酰乙酸乙酯是常用的工业试剂，有利于大规模生产。
在依达拉奉生产、储存、运输过程中，往往产生一些有关物质，这些有关物质影响药品的质量。现在已有报道的有关物质主要是依达拉奉二聚体、三聚体和硫化物(Eman，A等，Journal of the Chinese Chemical Society.2004；51:859-862。Abolfath，R等，Oriental Journal of Chemistry.2012；28：153-164)，然而，在发明人在研制过程中，又分离和鉴定出一种新的依达拉奉有关物质，即式(I)的苯腙类化合物。该化合物是在依达拉奉合成过程中产生的，发明人分离出该化合物，并确证了其结构，式(I)化合物为黄色油状液体物质，严重影响依达拉奉原料药的颜色，进一步，发明人通过动物实验发现式(I)化合物在一定浓度范围内能够导致健康小鼠的死亡。
发明内容
第一方面，本发明提供式(I)化合物，名称为N′-苯基乙烷亚肼酸乙酯，分子式是C10H14N2O，分子量为178.23的黄色油状液体物质：
第二方面，本发明提供一种制备式(I)化合物的方法，其包括：将苯肼、乙酰乙酸乙酯、亚硫酸氢钠加入水或有机溶剂或其混合物中反应，反应完毕析出依达拉奉固体后，滤液经硅胶柱色谱法使用石油醚和乙酸乙酯的混合液作为洗脱液分离得式(I)化合物。
在一个优选的实施方案中，所述反应在油浴中进行1-5小时，优选2-4小时，反应温度为70-120℃，优选80-100℃。
在另一个优选的实施方案中，所述苯肼:乙酰乙酸乙酯:亚硫酸氢钠的重量比为4-10:5-12:1，优选为5:6:1或10:12:1或4:5:1。
在另一个优选的实施方案中，所述有机溶剂选自乙醇、乙酸、甲醇、甲酸、丙酮、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、己烷、二甲基亚砜和乙酸乙酯，优选乙醇或乙酸；水和有机溶剂的混合物选自乙醇-水、乙酸-水、甲醇-水、甲酸-水、丙酮-水、正丙醇-水、异丙醇-水、叔丁醇-水和二甲基亚砜-水，优选乙醇-水或乙酸-水。
在另一个优选的实施方案中，所述硅胶柱色谱法中洗脱液石油醚:乙酸乙酯的体积比为9:1至1:9。
该制备方法重复性好，产品纯度高，易于保存。
发明人在用高效液相色谱法(HPLC)检测依达拉奉及其有关物质时发现，由于新的有关物质(即式(I)化合物)与依达拉奉极性相差较大，多数HPLC条件并未检测到该化合物。然而，发明人采用梯度洗脱，能够灵敏的检测到该有关物质。
第三方面，本发明提供一种高效液相色谱法(HPLC)测定式(I)化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，其中：
依达拉奉相关物质为依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体；
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，优选ZORBAX SB-C18柱，规格250×4.6mm或150×4.6mm；
流动相选自甲醇-水，甲醇-缓冲盐水溶液、乙腈-水、乙腈-缓冲盐水溶液和甲醇-乙腈-缓冲盐水溶液系统，梯度洗脱，所述缓冲盐水溶液优选选自磷酸缓冲盐水溶液和醋酸缓冲盐水溶液，更优选磷酸二氢铵水溶液；
流速为0.8-1.2mL/min；
柱温为20-40℃；以及
采用DAD检测器，检测波长为245nm。
在一个优选的实施方案中，以50mmol/ml磷酸二氢铵水溶液，用20体积％磷酸水溶液调节pH至3.5为流动相A，甲醇为流动相B进行梯度洗脱：
在此条件下，式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体的相对保留时间分别为31.0min、10.1min、18.7min和27.4min。
在另一个优选的实施方案中，以10mmol/ml磷酸二氢铵水溶液，用氨水调节pH至5.5为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱：
在此条件下，式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体的相对保留时间分别为46.6min、13.3min、21.1min和38.4min。
该HPLC测定法可以在生产过程中高效、灵敏、准确地检测依达拉奉及其有关物质，确定其含量，从而保证依达拉奉产品质量。
进一步，发明人对国内五家已上市的依达拉奉药品的进行检测，发现都不同程度的含有式(I)化合物。由于式(I)化合物含有一个苯腙活性基团，发明人通过动物实验结果发现式(I)化合物能够在一定浓度范围内导致健康小鼠死亡。因此发明人将式(I)化合物列为依达拉奉药品生产过程中质量监控的一个新的有关物质，结合依达拉奉的临床应用，应在依达拉奉的生产中加以控制。
因此，第四方面，本发明涉及式(I)化合物作为监控依达拉奉杂质的对照品的用途。换言之，式(I)化合物可作为杂质对照品用于依达拉奉原料药及其制剂的有关物质检查，控制依达拉奉产品的质量，提高安全性和可控性。
运用本发明的制备方法能够简单、快速分离纯化和精制出符合有关物质对照品要求的产品，满足依达拉奉药品在生产过程中有关物质检测该杂质对照品的要求。
附图说明
图1为适合于依达拉奉原料药中的本发明式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体系统适用性HPLC色谱图。
图2为适合于依达拉奉注射液中的本发明式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体系统适用性HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不对本发明有任何限制。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商:Thermo,型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自海诺泰化工、江苏强盛功能化学、上海润捷、Sigma、中国食品药品检定研究院、默克等公司。
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例1：式(I)化合物的制备
分别称取乙酰乙酸乙酯300g(上海诺泰化工)、亚硫酸氢钠50g(江苏强盛功能化学)加入1300ml水中，滴加苯肼250g(上海诺泰化工)。置95℃油浴中加热2小时。反应完毕，冷却析出依达拉奉固体，过滤得固体360g(依达拉奉)，向固体中加入500ml乙酸乙酯(上海润捷)萃取，萃取液浓缩后，经硅胶柱色谱法用石油醚/乙酸乙酯(9/1→1/9)作为洗脱液，分离得式(I)化合物，黄色液体19.8g，收率4.8％。式(I)化合物用质谱和核磁共振进行结构确认。
1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ1.40-1.44(m,3H),2.29(s,3H),4.10-4.13(m,2H),5.47(s,1H),7.22-7.24(t,1H),7.39-7.43(t,2H),7.77-7.76(t,2H)。
13CNMR(CDCl3,100MH)δ154.9,148.7,138.9,128.7,125.6,121.6,86.3,67.8,14.6,14.5。
Ms(ESI):202(M+Na)。
实施例2：式(I)化合物的制备
分别称取苯肼25g、亚硫酸氢钠5g加入125ml水中，滴加乙酰乙酸乙酯30g。置95℃油浴中加热2小时。反应完毕，冷却析出固体，过滤，得到35g固体，向固体中加入60ml乙酸乙酯和30ml乙醇，加热溶清，冷却析出依达拉奉固体，过滤出依达拉奉固体34.6g，滤液浓缩后，经硅胶柱色谱法分离用石油醚/乙酸乙酯(9/1→1/9)洗脱，得黄色液体2.05g，收率5.0％。产物用质谱和核磁共振进行结构确认，结果与实施例1相同，即式(I)化合物。
实施例3：式(I)化合物的制备
分别称取苯肼50g、亚硫酸氢钠5g、乙酰乙酸乙酯60g加入600ml水中。置95℃油浴中加热2.5小时。反应完毕，冷却析出固体，过滤出固体76g，向固体中加入80ml乙酸乙酯和40ml乙醇，加热溶清，冷却析出依达拉奉固体，过滤出固体70g，滤液浓缩后经硅胶柱分离用石油醚/乙酸乙酯(9/1→1/9)洗脱，得黄色液体2.80g，收率3.4％。产物用质谱和核磁共振进行结构确认，结果与实施例1相同，即式(I)化合物。
实施例4：式(I)化合物的制备
分别称取乙酰乙酸乙酯120g、亚硫酸氢钠10g加入1600ml乙醇中，滴加苯肼100g。置80℃油浴中加热2.5小时。反应完毕，冷却析出固体，过滤得到固体146g，向固体中加入80ml乙酸乙酯和160ml乙醇，加热溶清，冷却析出依达拉奉固体，过滤出依达拉奉固体138g，滤液浓缩后，经硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯(9/1→1/9)洗脱，得黄色液体5.11g，收率3.1％。产物用质谱和核磁共振进行结构确认，结果与实施例1相同，即式(I)化合物。
实施例5：式(I)化合物的制备
分别称取乙酰乙酸乙酯156g、亚硫酸氢钠31.2g加入2000ml乙酸中，滴加苯肼130g。置95℃油浴中加热2.5小时。反应完毕，冷却析出固体，过滤得到固体167g，向固体中加入120ml乙酸乙酯和240ml乙醇，加热溶清，冷却析出依达拉奉固体，过滤出依达拉奉固体159g，滤液浓缩后，经硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯(9/1→1/9)洗脱，得黄色液体7.05g，收率3.3％。产物用质谱和核磁共振进行结构确认，结果与实施例1相同，即式(I)化合物。
实施例6：适合于依达拉奉原料药中的本发明式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体检测方法的建立
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱(ZORBAX SB-C18 250×4.6mm)，以50mmol/ml磷酸二氢铵水溶液(用20体积％磷酸水溶液调节pH至3.5)为流动相A，甲醇为流动相B进行梯度洗脱；
流速为1.0ml/min，检测波长为245nm，HPLC为Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD)。柱温为20-40℃。
取依达拉奉对照品(中国食品药品检定研究院，100620-201202,99.9％)适量，用溶剂(1)(甲醇-0.05mol/l磷酸二氢铵溶液，用20％磷酸水溶液调节pH值至3.5，比例为35:65)溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为依达拉奉对照品溶液；
取本发明式(I)化合物适量，用甲醇配制成每1ml约含10μg的溶液，作为式(I)化合物对照品溶液；
取依达拉奉二聚体(Sigma,BCBJ7420V,纯度98.0％)适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含2μg的溶液，作为依达拉奉二聚体对照品溶液；
取依达拉奉三聚体(由发明人参照Schulz,M等，Journal fur PraktischeChemie/Chemike-Zeitung.1993；335(7):607-615公开的方法制备)适量，用甲醇配制成每1ml约含1μg的溶液，作为依达拉奉三聚体对照品溶液；
取上述对照品溶液各1ml，置同一10ml容量瓶中，用溶剂(1)稀释至刻度，混匀作为系统适用性溶液。精密量取10μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)。
由HPLC图谱结果(图1)可以看出依达拉奉、依达拉奉二聚体、依达拉奉三聚体和式(I)化合物的相对保留时间分别为10.1min、18.7min、27.4min和31.0min。依达拉奉与各杂质峰之间分离度良好，柱效高，灵敏度高，将适合于依达拉奉原料药的质量分析检测。
实施例7：依达拉奉原料药的检测
分别称取依达拉奉原料药三批(批号：20130508，20130515和20130521，由发明人参照US 4857542公开的方法制备)适量，用上述实施例6溶剂(1)溶解并定量稀释制成含依达拉奉1mg/ml的溶液，再用溶剂(1)定量稀释制成含依达拉奉1μg/ml的溶液，之后精密量取10μl注入液相色谱仪，依照实施例6的色谱条件及检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算依达拉奉、依达拉奉二聚体、依达拉奉三聚体和式(I)化合物的量，其检测结果如下：
结果显示，实施例6的检测方法能够有效的检测出样品中依达拉奉、式(I)化合物、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体，适合依达拉奉原料药的质量分析。
实施例8：适合于依达拉奉注射液中的本发明式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体检测方法的建立
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱(ZORBAX SB-C18 150×4.6mm)；以10mmol/ml磷酸二氢铵水溶液(用氨水调节pH至5.5)为流动相A，乙腈(默克，4L))为流动相B进行梯度洗脱；
流速为1.0ml/min，检测波长为245nm，HPLC为Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD)。柱温为20-40℃。
取依达拉奉对照品(中国食品药品检定研究院，100620-201202,99.9％)适量，用溶剂(2)(乙腈-0.05mol/L磷酸二氢铵溶液，用20％磷酸溶液调节pH值至5.5，比例为35:65)溶解并稀释制成每1ml中约含1μg的溶液，作为依达拉奉对照品溶液。
取本发明式(I)化合物适量，用甲醇配制成每1ml约含3μg的溶液，作为式(I)化合物对照品溶液。
取依达拉奉二聚体(Sigma,BCBJ7420V,纯度98.0％)适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含2μg的溶液，作为依达拉奉二聚体对照品溶液。
取依达拉奉三聚体(由发明人参照Schulz,M等，Journal fur PraktischeChemie/Chemike-Zeitung.1993；335(7):607-615公开的方法制备)适量，用甲醇配制成每1ml约含1μg的溶液，作为依达拉奉三聚体对照品溶液。
取上述溶液各1ml，置同一10ml容量瓶中，用溶剂(2)稀释至刻度，混匀作为系统适用性溶液。精密量取10μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。
由HPLC图谱结果(图2)可以看出依达拉奉、依达拉奉二聚体、依达拉奉三聚体和式(I)化合物的相对保留时间分别为13.3min、21.1min、38.4min和46.6min。依达拉奉与各杂质峰之间分离度良好，柱效高，灵敏度高，将适合于依达拉奉注射液的质量分析检测。
实施例9：依达拉奉注射液(规格：20ml:30mg)的检测
分别取依达拉奉注射液三批(规格：20ml:30mg。批号:20131031 1-2，20131101 1-2和20131105 1-2，由发明人参照Japanese patent publication(Kokoku)No.Hei 7-121861和US7211596公开的方法制备)适量，定量稀释制成含依达拉奉0.3mg/ml的溶液，再用水定量稀释制成含依达拉奉3μg/ml的溶液,精密量取10μl注入液相色谱仪，依照实施例8的色谱条件及检测方法进行检测,记录色谱图，按外标法以峰面积计算依达拉奉、依达拉奉二聚体、依达拉奉三聚体和式(I)化合物的量。结果显示依达拉奉注射液样品中,依达拉奉与各杂质峰如式(I)化合物、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体之间分离度良好，柱效高，灵敏度高，适合于依达拉奉注射液的质量分析与检测，检测结果如下：
结果显示，实施例8的依达拉奉注射液检测方法能够有效的检测出样品中(I)化合物、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体，适合依达拉奉注射液的质量分析。
实施例10：依达拉奉注射液(规格：100ml:30mg)的检测
取依达拉奉注射液三批(规格：100ml:30mg,批号:20160324-1，20160324-2，20160324-3，由发明人参照US7211596公开的方法制备)，依照实施例8的色谱条件及检测方法进行检测，检测结果如下：
结果显示，实施例8的依达拉奉注射液检测方法能够有效的检测出依达拉奉注射液(规格：100ml:30mg)样品中(I)化合物、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体，适合依达拉奉注射液(规格：100ml:30mg)的质量分析。
实施例11、式(I)化合物的动物体内毒性测定
6周龄雌性和雄性健康ICR小鼠各半(上海西普尔－必凯实验动物有限公司)购入后，在上海中医药大学动物中心(上海中医药大学伦理委员会批准)适应性饲养7天，随机分组，每组6只。精确称取适量式(I)化合物与橄榄油混溶，制成混合悬液。每日腹腔注射，橄榄油为空白对照，连续给药2周，每天称重和观察动物生理状况，结果如下：
结果显示2周给药后，590mg/kg以上给药量致死率为100％，560mg/kg致死率为83.4％，530mg/kg和500mg/kg致死率分别为66.6％与33.3％，说明该化合物剂量大于450mg/kg时可引起ICR小鼠死亡，有一定的毒性。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员常规理解的相同含义。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。相关领域的普通技术人员将容易理解，其它对于本文描述的方法和应用的合适的修饰和修改是显而易见的，并且将不偏离本发明或其任何实施方案的范围。此外，所述材料、方法、和实施例仅是例证性的并不旨在限制本发明。本文引用的所有专利、专利申请、和出版参考文献的全部以引用的形式并入本文。

Claims (12)

1.式(I)化合物：
2.一种制备根据权利要求1所述的式(I)化合物的方法，其包括：将苯肼、乙酰乙酸乙酯、亚硫酸氢钠加入水或有机溶剂或其混合物中反应，反应完毕析出依达拉奉固体后，滤液经硅胶柱色谱法使用石油醚和乙酸乙酯的混合液作为洗脱液分离得式(I)化合物。
3.根据权利要求2所述的制备式(I)化合物的方法，其中所述反应在油浴中进行1-5小时，优选2-4小时，反应温度为70-120℃，优选80-100℃。
4.根据权利要求2所述的制备式(I)化合物的方法，其中所述苯肼:乙酰乙酸乙酯:亚硫酸氢钠的重量比为4-10:5-12:1，优选为5:6:1或10:12:1或4:5:1。
5.根据权利要求2所述的制备式(I)化合物的方法，其中所述有机溶剂选自乙醇、乙酸、甲醇、甲酸、丙酮、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、己烷、二甲基亚砜和乙酸乙酯，优选乙醇或乙酸；水和有机溶剂的混合物选自乙醇-水、乙酸-水、甲醇-水、甲酸-水、丙酮-水、正丙醇-水、异丙醇-水、叔丁醇-水和二甲基亚砜-水，优选乙醇-水或乙酸-水。
6.根据权利要求2所述的制备式(I)化合物的方法，其中所述硅胶柱色谱法中洗脱液石油醚:乙酸乙酯的体积比为9:1至1:9。
7.一种高效液相色谱法测定根据权利要求1所述的式(I)化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，其中：
依达拉奉相关物质为依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体；
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，优选ZORBAX SB-C18柱，规格250×4.6mm或150×4.6mm；
流动相选自甲醇-水，甲醇-缓冲盐水溶液、乙腈-水、乙腈-缓冲盐水溶液和甲醇-乙腈-缓冲盐水溶液系统，梯度洗脱，所述缓冲盐水溶液优选选自磷酸缓冲盐水溶液和醋酸缓冲盐水溶液，更优选磷酸二氢铵水溶液；
流速为0.8-1.2mL/min；
柱温为20-40℃；以及
采用DAD检测器，检测波长为245nm。
8.根据权利要求7所述的高效液相色谱法测定式(I)化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，其中以50mmol/ml磷酸二氢铵水溶液，用20体积％磷酸水溶液调节pH至3.5为流动相A，甲醇为流动相B进行梯度洗脱：
9.根据权利要求8所述的高效液相色谱法测定式(I)化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，其中式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体的相对保留时间分别为31.0min、10.1min、18.7min和27.4min。
10.根据权利要求7所述的高效液相色谱法测定式(I)化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，其中以10mmol/ml磷酸二氢铵水溶液，用氨水调节pH至5.5为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱：
11.根据权利要求10所述的高效液相色谱法测定式(I)化合物、依达拉奉及其相关物质的方法，其中式(I)化合物、依达拉奉、依达拉奉二聚体和依达拉奉三聚体的相对保留时间分别为46.6min、13.3min、21.1min和38.4min。
12.根据权利要求1所述的式(I)化合物作为监控依达拉奉杂质的对照品的用途。
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