CN101969953B - 用于治疗bh4反应性疾病的喋呤类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了四氢生物喋呤类似物、包含四氢生物喋呤类似物的组合物，及通过给予该类似物治疗罹患四氢生物喋呤反应性疾病个体的方法。这些类似物预期可用于治疗四氢生物喋呤反应性疾病，无论目前是否使用四氢生物喋呤。

Description

用于治疗BH4反应性疾病的喋呤类似物
相关申请的交互参照
根据美国专利法35 U.S.C.第119条规定，本申请案享有于2008年1月3日提交的申请号为61/018,735和于2008年1月8日提交的申请号为61/019,753的美国临时申请的利益，每项临时申请公开的内容均以交互参照的方式纳入本说明书。
发明背景
技术领域
本发明总的涉及四氢生物喋呤类似物、包含四氢生物喋呤类似物的组合物，及通过给予该类似物治疗罹患四氢生物喋呤反应性病症个体的方法。
相关技术简述
四氢生物喋呤(在本说明书中也指“BH4”)是一种天然存在的化合物，属于喋呤类家族中的一种生物活性胺。其中一种立体异构体沙丙喋呤如下列式II所示：
Figure BPA00001178891800011
天然存在的四氢生物喋呤也可通过多种方法合成，目前已公开了其中的某些方法，例如美国专利2,601,215；3,505,329；4,540,783；4,550,109；4,587,340；4,595,752；4,649,197；4,665,182；4,701,455；4,713,454；4,937,342；5,037,981；5,198,547；5,350,851；5,401,844；5,698,408；和5,698,408，以及申请号为2,420,374的加拿大专利申请。
喋呤类为双环化合物，包括一个哌嗪环和一个嘧啶环，嘧啶环上有一个羰基和一个氨基基团。喋呤可作为酶催化反应中的辅助因子发挥其生理功能。四氢生物喋呤可作为许多不同酶类的辅助因子，这其中包括苯丙氨酸羟化酶(PAH)，酪氨酸-3-羟化酶，色氨酸-5-羟化酶以及一氧化氮合成酶的三种同工酶(NOS)。四氢生物喋呤同时也是法式原虫(Crithidia fasciculata)的生长因子，对造血细胞增殖具有促进作用，同时也可作为一氧化氮中毒的自身保护因子发挥作用。Thony等(2000)Biochem.J.347：1-16综述了四氢生物喋呤的这些和其它辅助因子作用和细胞功能以及与四氢生物喋呤缺乏有关的疾病。在“四氢生物喋呤和相关生物胺类的紊乱”《遗传疾病的代谢与分子基础》(1275-776页)(第8版，McGraw-Hill出版公司，纽约，NY 2001)中，Blau等综述了与四氢生物喋呤缺乏有关的疾病。
四氢生物喋呤是一个亲水性化合物，难以透过生物膜，也难以通过血脑屏障进行转运。血脑屏障一般指控制血液中物质进入中枢神经系统(CNS)的膜状结构。该结构是局部血管与CNS大多数结构之间的物理屏障，它可以阻止某些(以及许多)物质进入中枢神经系统。体内毛细血管壁由被分隔成小间隙的内皮细胞组成。这些间隙可允许组织内水溶性化学物质进入到血流中，因此化学物质可进行全身转运，并从血液分布到不同组织中。在脑内由于这些内皮细胞结合更为紧密，因此内皮细胞的间隙极为狭小。除具有脂溶性可穿透细胞膜(例如氧气、二氧化碳、乙醇)及可通过特殊转运系统转运的分子(例如，糖类，特定氨基酸)之外，几乎所有的分子转运都可被这些狭小间隙所阻断。许多药物分子通过血脑屏障的量无法达到治疗有效量从而导致治疗失败。除为CNS提供物理屏障之外，大脑内皮细胞也可代谢某些分子(药物)，使这些分子无法达到CNS。
本发明提供一种更为有效的将四氢生物喋呤递送入体内及CNS系统的方法，从而为四氢生物喋呤相关性疾病和病症提供有效的治疗。
发明概述
本说明书所公开的内容为四氢生物喋呤类似物，包含四氢生物喋呤类似物的组合物，以及通过给予一种或多种四氢生物喋呤类似物治疗罹患四氢生物喋呤反应性病症个体的方法。
本发明所涉及的化合物为四氢生物喋呤类似物，也可以是四氢生物喋呤前药，或是可在体内分别生成四氢生物喋呤或其衍生物的四氢生物喋呤衍生物。四氢生物喋呤是一种天然存在的化学物质，它也用本领域技术人员已知的化学合成方法制得。
已发现四氢生物喋呤口服给药的生物利用度很低。据信其低生物利用度至少与下列因素之一有关：胃肠道(GI)吸收差、胃肠道内和/或血液中氧化代谢，吸收前药物降解或代谢，吸收后药物降解或代谢。此外，据信四氢生物喋呤的溶解性(脂溶性)很差，在胃内和血液中存在潜在的化学不稳定性，以及无法穿透胃肠道壁进行转运。
本发明的一个方面是对需要服用治疗有效量四氢生物喋呤类似物和/或前药的患者改善其四氢生物喋呤生物利用度。如果该类似物为BH4的前药，内源性酶类可将其在体内代谢而释放活性四氢生物喋呤或四氢生物喋呤衍生物。前药设计方法对于四氢生物喋呤是适用的，因为该化合物至少与六种不同酶类(例如苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶、内皮细胞型一氧化氮合成酶、神经元型一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶)发生相互作用。此外，四氢生物喋呤参与羟基化反应后进行再循环，其中需要两种其它酶。因此如果四氢生物喋呤类似物不能与这六种酶恰当地发生相互作用，也不能与其他两种酶作用而再循环，那么其可能无法发挥其辅助因子作用，也无法计量使用，特别是如果不能恰当地再循环时。基于上述原因，可生成天然四氢生物喋呤化合物的某种类似物显著优于生物利用度虽高却不能与四氢生物喋呤酶所有细胞内靶恰当地相互作用的化合物。
因此，本发明的一个方面涉及四氢生物喋呤类似物。一种四氢生物喋呤类似物是式I所示化合物(所示的一种具体立体异构体)或其药学上可接受的盐：
Figure BPA00001178891800041
同时考虑的有BH4其他7个可能的立体异构体。BH4类似物可以但不局限于是可在生物环境下释放BH4的一种前体药物。
按照式I化合物的一个具体实施方式，R3、R4、R5、R6和R7均为氢，R1和R2连在一起为-C(Rc)Rd-基团并构成一个五元环结构，或R1和R2独立地为氢、C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，C(O)SRa，或为某种氨基酸衍生物，但是R1和R2不同为氢、C(O)H、糖苷基、氨基糖苷基或相同的C(O)C1-10烷基。在一个实施方式中，R1和R2独立地选自于氨基酸衍生物和氢，而非氨基酸衍生物中的R为氢。在一个实施方式中，R1选自于氨基酸衍生物而R2则为氢。在另一个实施方式中，R2选自氨基酸衍生物而R1则为氢。该氨基酸衍生物(例如R1或R2基团所表示的基团)可以包括但不限于缬氨酰基氨基酸基团。
按照式I化合物的另一个实施方式，R1，R2，R5，R6和R7均为氢；而R3和R4则独立地选自氢，C3-8环烷基，C2-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烃基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa，但是当R3为氢时，R4不为氢或核糖；当R4为氢时，R3不为氢，C(O)H，醋酸酯，羟甲基，或氨基烷基。
按照式I化合物的另一个实施方式，R1，R2，R3，R4，和R5均为氢；而R6和R7独立选自氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa，但是，当R6为氢时，R7不为氢，甲基，CH2(CH2)4CO2H或CH2CH2-芳基；当R7为氢时，R6不为氢。
按照式I化合物的另一个实施方式，R1，R2，R3，R4，R6和R7均为氢；而R5为C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa。
按照式I化合物的另一类受关注的实施方式，R3，R4，R5，R6和R7均为氢，而R1和R2则分别独立选自于氢和一种氨基酸衍生物，其中R1和R2不同时为氢。在一个此类实施方式中，氨基酸衍生物通过形成酯键而成为式I所示化合物的组成部分。在特定实施方式中，氨基酸衍生物为单一氨基酸，而在其他实施方式中，氨基酸衍生物是通过酰胺键或酯键或两者皆有的方式共价连接成的2个、3个、4个或更多的氨基酸。例如，在受关注的具体实施方式中，R1为氢而R2包括丙氨酸、缬氨酸或由谷氨酸和丙氨酸构成的二肽结构。在其他具体实施方式中，R1和R2均包括丙氨酸。
在式I化合物的另一类受关注的实施方式中，R1，R2，R4，R5，R6和R7均为氢，而R3则为一种氨基酸衍生物。在一种此类实施方式中，氨基酸衍生物为一个单一的氨基酸，而在其他实施方式中，氨基酸衍生物是通过酰胺键或酯键或两者皆有的方式共价连接成的2个、3个、4个或更多的氨基酸。
在每一种上述式I化合物的实施方式中，Ra和Rb为独立的氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，聚乙二醇，C(O)C2-40亚烯基芳基，或C(O)C2-40亚烯基杂芳基。
同样的，在每一种上述式I化合物的实施方式中，Rc和Rd连起来为氧代，或Rc和Rd独立选自氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，或C(O)C2-40亚烯基杂芳基。
本发明也旨在提供一种可用于治疗罹患四氢生物喋呤反应性病症个体的药物组合物。该药物组合物可包括上述式I化合物中的任何一种，以及可任选地包括药学上可接受的一种辅料，例如稀释剂或载体。
此外，本发明的另一方面是提供一种通过给予上述任何一种药物组合物治疗罹患四氢生物喋呤反应性病症患者个体的方法。该方法包括给予患者个体治疗有效量的式I化合物。BH4反应性病症通常包括对BH4或其衍生物起反应的病症。BH4反应性病症包括糖尿病相关的血管并发症，包括但不限于一般血管功能病变(血管顺应性异常、内皮功能障碍和高血压)；顽固性高血压，胰岛素敏感性/血糖控制失调；外周灌流异常(间歇性跛行、外周灌流降低、皮肤血流下降和伤口愈合缺陷)；心脏疾病(充血性心衰、肺动脉高压伴有/不伴有充血性心衰、活动相关性心绞痛、冠心病、相关动脉粥样硬化)；眼科疾病(视神经萎缩、糖尿病性视网膜病)；和肾脏疾病(糖尿病肾病微量白蛋白尿、肾衰、肾小球滤过率下降)。
BH4反应性病症也包括选自下列与糖尿病无关的血管疾病，其中包括肺血管病，溶血性贫血，中风及有关缺血性血管疾病(如中风、心脏病或冠状动脉病、动脉硬化或外周血管病)、血栓症、与移植有关的内皮功能紊乱和心脏病或冠状动脉病。在一个实施方式中，肺部血管病包括但是不限于镰形红细胞贫血和其他血红蛋白疾病引起的肺张力提高、特发性肺动脉高压，新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)。在另一个实施方式中，溶血性贫血包括遗传性溶血性贫血和获得性溶血性贫血。遗传性溶血性贫血包括但是不限于镰形红细胞贫血、地中海贫血、因G6PD缺陷引起或与溶血相关的溶血性贫血，丙酮酸激酶缺乏症，遗传性椭圆形红细胞性贫血、遗传性球形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、遗传性卵形红细胞症、阵发性夜间血红蛋白尿症，及血红蛋白SC疾病。获得性溶血性贫血包括但是不限于微血管病性溶血性贫血，特发性自身免疫性溶血性贫血，因化学或物理物质或装置(左心辅助装置)引起的非免疫性溶血性贫血、机械性心脏瓣膜和搭桥装置)，以及继发性免疫应答性溶血性贫血。
在另一实施例中，脑卒中及有关的缺血性血管病包括但是不限于血管痉挛，如脑卒中后脑血管痉挛。血栓病包括但是不限于血栓形成、血栓症、凝血和血凝聚。另一实施例中，与移植有关的内皮功能障碍包括但是不限于实体器官移植后的血管功能障碍以及环孢菌素A诱发的内皮功能障碍。另一实施例中，心脏或冠脉疾病包括但是不限于充血性心力衰竭、血管功能障碍及与高胆固醇血症有关的心绞痛以及与吸烟有关的血管功能障碍和心绞痛。
对于本说明书描述的组合物和方法，可从本说明书提供的各种实施例中遴选出优选的特征，如成分、其组成范围、条件和步骤。
参阅下面的详细描述并结合所附的权利要求，本发明的其他特性对于本领域技术人员而言会变得明了的。
附图的简单描述
图1显示生物喋呤测定方法流程图。
图2显示体液和组织中生物喋呤含量测定方法验证的结果概要。
图3显示实施例2，3，4和20制备的化合物60分钟内在人体血浆中的稳定性。
图4显示实施例2，3，4和20制备的化合物60分钟内在大鼠血浆中的稳定性。
图5显示实施例2，3，4和20制备的化合物60分钟内在模拟胃液中的稳定性。
图6显示禁食猴口服各种BH4类似物后25小时内的BH4血浆水平，以口服BH4为对照。
图7显示食蟹猴单次静脉注射BH4(2mg/kg)后体内BH4、BH2和生物喋呤的药代动力学性质。
图8显示食蟹猴口服BH4(40mg/kg)后体内BH4、BH2和生物喋呤的药代动力学性质。
图9显示食蟹猴单次静脉注射实施例5的化合物(与2mg/kg剂量的BH4等效)后体内BH4、BH2和生物喋呤的药代动力学性质。
图10显示食蟹猴单次口服实施例5的化合物(与5mg/kg剂量的BH4等效)后体内BH4、BH2和生物喋呤的药代动力学性质。
图11显示食蟹猴单次口服实施例5的化合物(与20mg/kg剂量的BH4等效)后体内BH4、BH2和生物喋呤的药代动力学性质。
图12显示口服BH4(40mg/kg，为便于比较转换成5mg/kg)或实施例5化合物在5mg/kg或20mg/kg服药剂量下(BH4等效剂量)的BH4药代动力学性质比较结果。
图13显示静脉注射BH4(2mg/kg)或实施例5的化合物(与2mg/kg的BH4等效)的药代动力学性质。
图14显示静脉注射BH4(2mg/kg)或实施例5的化合物(与2mg/kg的BH4等效)后BH4的药代动力学性质
图15显示静脉注射BH4(2mg/kg)或实施例5化合物(与2mg/kg的BH4等效)后BH4、BH2和生物喋呤的药代动力学性质。
图16显示实施例5的化合物给药后2小时食蟹猴的BH4血药浓度色谱图(2％甲醇作为流动相)。
图17显示各种浓度BH4及实施例5、7和9的化合物给药5小时后亚硝酸盐+硝酸盐的增加百分比。
图18显示各种浓度BH4及实施例5、7和9的化合物给药17小时后亚硝酸盐+硝酸盐的增加百分比。
图19显示各种浓度BH4及实施例5、7和9的化合物给药22小时后亚硝酸盐+硝酸盐的增加百分比。
图20显示各种浓度BH4及实施例5和6的化合物给药5小时后亚硝酸盐+硝酸盐增加的百分比(以μM浓度表示)。
图21显示各种浓度BH4及实施例5和6的化合物给药20小时后亚硝酸盐+硝酸盐增加的百分比(以μM浓度表示)。
图22显示各种浓度缓冲液、对照药、BH4、实施例5的化合物和6S-BH4处理后用体外无细胞eNOS增强试验测定的亚硝酸盐+硝酸盐增加的百分比(以μM浓度表示)。
图23显示各种浓度体外缓冲液、对照药、BH4，实施例5、实施例6、实施例7和实施例9化合物处理后用体外无细胞eNOS产生试验测定亚硝酸盐+硝酸盐的增加百分比(以μM浓度表示)。
图24显示给予水(Wistar-Kyoto大鼠与自发性高血压大鼠(SHR))、赋形剂(SHR)、各种浓度BH4及实施例5的化合物3周内动物体重变化情况，比较高血压效应。
图25显示给水3周内Wistar-Kyoto大鼠(WKY)和鼠龄匹配的自发性高血压大鼠(SHR)的收缩压变化情况。
图26显示给予水或赋形剂3周内SHR的收缩压变化情况。
图27显示赋形剂或BH4100mg/kg/日剂量给药3周内SHR的收缩压变化情况。
图28显示赋形剂或实施例5化合物2mg/kg/日给药3周内SHR的收缩压变化情况。
图29显示赋形剂或实施例5化合物10mg/kg/日给药3周内SHR的收缩压变化情况。
图30显示赋形剂或实施例5化合物30mg/kg/日给药3周内SHR的收缩压变化情况。
图31显示赋形剂、BH4(100mg/kg/日)或实施例5化合物10mg/kg/日给药3周内SHR的收缩压变化情况。
发明详述
四氢生物喋呤的口服生物利用度低，进入血液的药量常常不能达到治疗有效量；或需要服用更大剂量的药物以便实现显著的临床疗效。此外，虽然血脑屏障在通常情况下可被小分子穿透，但是它却是四氢生物喋呤摄取的天然屏障。本发明提出四氢生物喋呤口服给药后的低生物利用度问题及为四氢生物喋呤反应性病症提供体内和CNS治疗有效量四氢生物喋呤的困难性。
本发明一般涉及四氢生物喋呤类似物、含有四氢生物喋呤类似物的药学组合物，及通过给予所述类似物治疗罹患四氢生物喋呤反应性病症患者个体的方法。所有这些内容都将在以下作更详细的描述。
由于BH4为一种具有多种生理活性的天然产物，难以制备一种不仅需要具有改善的生物利用度而且必须保留其细胞多靶点作用能力的类似物，因此制备其类似物显得尤为有用。如果一种类似物(例如一种前药)可在从胃肠道入血后转化成为原型天然产物，那么该类似物的抑制性或意外的毒性作用则可以避免。
术语
本说明书所使用的术语“生物利用度”系指给药剂量中进入系统循环的药物量。如果药物通过静脉注射给药，其生物利用度理论上为100％。但是，如该药物通过其他途径给药(例如口服)，因胃肠道吸收不完全、吸收前降解或代谢和/或肝脏首过效应的结果，其生物利用度典型地低于100％。
本说明书所使用术语“烷基”系指直链和支链的碳氢基团，非限制性的烷基的例子包括甲基、乙基及直链和支链丙基和丁基基团。术语“烷基”也包括“桥环烷基”，即一种双环或多环碳氢基团，例如降冰片烷基、金刚烷基、二环[2.2.2]辛基、二环[2.2.1]庚基、二环[3.2.1]辛基或萘烷基。烷基也可被取代，例如被羟基(OH)、卤素、芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基和氨基取代。特别受关注的是根据式I所描述的类似物中，包括说明书中描述的任何实施方式，烷基由1-40个碳原子或1-25个碳原子或1-15个碳原子或1-12个碳原子或1-10个碳原子或1-8个碳原子或1-6个碳原子组成。
本说明书使用的术语“环烷基”系指一种环状碳氢基团，例如环丙基、环丁基、环己基以及环戊基。“杂环烷基”与“环烷基”定义相似，但是其环结构中含有独立地选自氧、氮和硫的1-3个杂原子。杂环烷基的非限制性例子包括哌啶基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、二氢呋喃基以及类似基团。环烷基和杂环烷基可以是饱和或部分不饱和的环系统，可任选地被独立选自烷基、亚烷基OH、C(O)NH2、NH2、氧代(＝O)、芳基、卤代烷基、卤素和羟基的1-3个基团所取代。杂环烷基还可任选地进一步被烷基、羟基烷基、亚烷基芳基或亚烷基杂芳基N-取代。
本说明书使用的术语“链烯基”定义与“烷基”相同，但是其结构中至少含有一个碳-碳双键。
本说明书使用的术语“亚烷基”可参见具有取代基的烷基。例如术语“亚烷基杂环烷基”系指有一个杂环烷基取代的烷基。亚烷基可任选地被选自上述列为任选的烷基取代基的1个或多个取代基取代。
本说明书所使用的术语“亚烯基”定义与“亚烷基”相同，但是其基团中至少含有一个碳-碳双键。
本说明书所使用的术语“芳基”系指一种单环或稠环芳香性基团。芳基可以但不限于是一种单环或双环结构的芳香基团，例如苯基或萘基。除特别标明外，芳基可以是未取代的或被一个或几个基团取代，特别是被独立选自于例如卤素、烷基、链烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H，CO2烷基、芳基和杂芳基的1-4个基团所取代。芳基的实例包括但是不限于苯基、萘基、四氢萘基、氯苯基、甲苯基、甲氧苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、2，4-甲氧氯苯基以及类似基团。
本说明书所使用的术语“杂芳基”系指包含一个或两个芳香环的在环结构中至少含有一个氮、氧或硫原子的单环或二环芳香性基团。除特别标明外，杂芳基可以是未取代的或被一个或几个基团取代，特别是被选自于例如卤素、烷基、链烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H，CO2烷基、芳基和杂芳基的1-4个基团所取代。杂芳基的实例包括但是不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、苯硫基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
本说明书所使用的术语“氨基酸衍生物”系指结构中含有胺官能团(如NH2，NHR或NR2)和羧酸官能团的一种分子。氨基酸可以是α-氨基酸、β-氨基酸或γ-氨基酸。除特殊指定外，本文所指的氨基酸结构可以包括任何可能的立体异构体，例如D或L-对映体。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸的L-对映体。也可使用其他氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸的D-对映体，或其它氨基酸如鸟氨酸、取代苯丙氨酸(例如4-甲氧基苯丙氨酸)、吡啶基丙氨酸等等。这些氨基酸可根据已知技术合成，也可从供应商处购买，例如Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)或Chem-ImpexInternational Inc(Wood Dale，IL)。氨基酸衍生物可以是但不限于缬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸的衍生物。例如，在某类实施例中可考虑氨基酸衍生物含有2个或更多的氨基酸，如下列式I化合物，其中R2为γ-D-谷氨酸-D-丙氨酸衍生物：
Figure BPA00001178891800131
本说明书所使用的术语“聚乙二醇”系指含有式RO(CH2CH2O-)n的化学基团，其中R为烷基而n则为1至1000之间的整数，例如10-500，20-300，25-250或30-200。
本说明书所使用的术语“保护基”系指显示下列特征的一种化学基团：(1)与预期官能团可选择性发生反应并可以良好的收率获得受保护底物，该底物对于期望进行保护的反应是稳定的；(2)可从被保护底物中选择性去除以获得所需要的官能团；(3)可用与在该保护反应中生成的其他官能团相容的试剂以良好的收率去除。保护基的例子可参考Greene等.“Protective Groups inOrganic Synthesis，”第二版(John Wiley & Sons，Inc.，New York，1991)。
在禁止对施用于人体的方法授予专利的地区，组合物对人体“给药”的意思应当限于处方一种受治疗者用任何技术(例如口服、吸入、局部施用、注射、植入等)自我给药的受控制的物质。本说明书意在给出与限定可专利主题的法律或法规相符合的最合理的解释。在不禁止对施用于人体的方法授予专利的地区，组合物对人体“给药”包括施用于人体的方法，也包括上述内容。
四氢生物喋呤类似物
本发明的一个实施方式是提供四氢生物喋呤类似物。四氢生物喋呤类似物可以为但不限于四氢生物喋呤前药。四氢生物喋呤(例如某种前药)可以是下列通式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其在各种条件下可被代谢或转化成四氢生物喋呤：
C-1′和/或C-2′位上的结构修饰
在式I化合物的一个实施方式中，该化合物只在C-1′和C-2′位的一个或两个部位进行结构改造。在这样的实施方式中，R3，R4，R5，R6和R7均为氢，而R1和R2连在一起为-C(Rc)Rd-并形成五元环，或R1和R2为独立的氢原子，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa，但是限制R1和R2不同为氢，C(O)H，糖苷基，氨基糖苷基，或相同的C(O)C1-10烷基。
Ra和Rb独立选自氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，聚乙二醇，C(O)C2-40亚烯基芳基，或C(O)C2-40亚烯基杂芳基。
Rc和Rd都可为氧代，或Rc和Rd为独立的氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，或C(O)C2-40亚烯基杂芳基。
BH4的酯类和双酯也考虑作为其类似物，并可为前药，如本说明书所公开的。可通过多种常见的化学试剂将一级与二级醇类转化成为酯类，这些试剂例如酰氯(例如乙酰氯)和酸酐。在缚酸剂(如三乙胺)的存在下，酰氯(例如乙酰氯)可与醇分子发生反应，生成相应的酯和盐酸。同样，酸酐(例如醋酐)可与醇分子发生反应形成相应的酯和醋酸。由于酸酐反应的副产物为相应的有机酸(例如醋酐反应生成醋酸)，与矿酸(例如乙酰氯生成盐酸)相比，醇类与酸酐进行的反应更为温和。见实例Harden等(1989)J.Med.Chem.32：1738-43。四氢生物喋呤(一种二醇类结构)可通过这些试剂以及其他试剂进行转化，这是本领域所熟知的。为了在氨基官能团存在情况下选择性衍生化四氢生物喋呤的一个或多个羟基结构，可研究这些基团和官能团的电性特征和立体因素，并恰当地保护这些基团和官能团，如下所述。
可通过多种方法对一个或两个C-1′和C-2′位进行结构改造。例如，可将四氢生物喋呤(后文也称作“BH4”)溶于碱性缚酸剂中，如吡啶或三乙胺。溶解后的BH4可与1摩尔数过量的酸酐形成单酯BH4，继续反应可使C-1′和C-2′位的双羟基转化成为双酯类似物(例如，前药)。如下所示反应式(I)提供了利用一种酸酐对一个或两个C-1′和C-2′位进行结构改造的代表性合成方法：
Figure BPA00001178891800161
备选合成方法可包括利用保护基团保护位于C-2，N-3，N-5和N-8位上的潜在反应活性胺。
作为类似物公开的受关注的BH4酯类和双酯类也可从氨基酸衍生而来，例如BH4的1′，2′-二醇也可转化成为氨基酸酯。阿昔洛韦的羟基结构转化成为L-缬氨酸酯，可导致生物利用度的显著提高，这种作用主要是通过人肠道的肠肽转运体hPEPT1主动转运完成的。其他氨基酸也可发挥类似的作用。反应副产物具有良好的生物相容性。可制备的氨基酸(AA)衍生物的例子概况列于反应式(IA)、(IA′)和(IB)。反应式(IA)显示制备BH4氨基酸类似物的一种方法，其中氨基酸结构位于C1’，C2’，或两者皆有，反应式(IA’)显示一个备选方案特例，该方法可使双叔丁氧羰基保护的亚胺在4N盐酸/二氧六环中直接脱保护生成终产物。反应式(IB)显示一种制备BH4的肽类衍生物的方法，其结构中的C1’，C2’，或两个位置同时引入二肽、三肽或四肽结构。利用相似的合成方法可获得更长的肽链改造。采用已知技术或商品化原料途径(例如Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)或Chem Impex(Wood Dale，IL))，可获得区分保护的氨基酸衍生物。
Figure BPA00001178891800191
Figure BPA00001178891800201
环状缩酮与缩醛可通过二醇结构分别与酮和醛类反应生成。见例如Harden等.(1989)J.Med.Chem.32：1738-43；Song等.(2005)J.Med.Chem.48：1274-77。环状缩酮和缩醛可在体内通过水解或酶解转化回二醇。R1和R2连在一起为-C(Rc)Rd-并形成五元环时，可按如下反应式(II)所示进行结构修饰形成BH4缩酮类似物，即将BH4的1′，2′-二醇与一种醛类(例如N，N-二甲基氨基甲酰胺(DMF))与2，2-二甲氧基丙烷和对甲基苯磺酸单水合物(pTSA)反应，形成BH4的缩酮类似物。
Figure BPA00001178891800211
R1和R2连在一起为-C(Rc)Rd-并形成五元环时，可将BH4的1′，2′-二醇在催化剂存在下与一种缩酮或酮反应，达到结构修饰，形成BH4的缩酮类似物，如下面的反应式(III)所示：
N-5和/或N-8位修饰
在式I化合物的另一实施方式中，该化合物可在N-5和N-8位的1个或2个位置上进行修饰。在该实施方式中，R1，R2，R5，R6，和R7均为氢；而R3和R4为独立的氢、C3-8环烷基，C2-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa，但以下为例外：在R3为氢时，R4不为氢或核糖；R4为氢时，R3不为氢，C(O)H，醋酸酯，羟甲基，或氨烷基。在某类实施方式中，R3+为一种氨基酸衍生物。
可采用多种方法对N-5和N-8的1个或2个位置进行修饰。例如，在咪唑存在下将BH4经一摩尔过量的合适醇类保护试剂(例如叔丁基二甲基氯硅烷，TBDMSCl)保护反应性二醇羟基位后可制备BH4的酰胺(或二酰胺)类似物。随后，可将经保护的BH4与一种碱反应后再与一种酰氯反应，得到保护的N-5和/或N-8中间体。完成这些反应后，中间体的二醇结构可通过合适的脱保护试剂(例如对于TBDMSCl保护试剂，可采用四正丁基氟化铵(TBAF)作为脱保护试剂)脱保护获得BH4的酰胺类似物。合成通常按反应式(IV)进行，如下所示：
Figure BPA00001178891800221
在另一实施方式中，将BH4在咪唑存在下经一摩尔过量的合适醇类保护试剂(如TBDMSCl)保护反应性二醇羟基位后可制备BH4的氨基甲酰基(或二氨基甲酰基)类似物。随后，可将经保护的BH4与一种碱反应后再与一种氯甲酸酯(例如氯甲酸丁酯)反应。完成这些反应后，可用TBAF处理中间体使中间体的二醇位脱保护，获得BH4的双氨基甲酰基类似物。合成通常按反应式(V)进行，如下所示：
Figure BPA00001178891800231
在另一类实施方式中，式I中化合物的N-5位可被氨基或肽分子修饰。这些衍生物可按反应式(VI)制备，如下所示：
C-2位的结构修饰
在式I化合物的另一种实施方式中，化合物只在C-2位进行修饰。在该实施方式中，R1，R2，R3，R4，和R5均为氢；R6和R7为独立的氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa，但是，R6为氢时，R7不为氢、甲基，CH2(CH2)4CO2H，或CH2CH2-芳基；R7为氢时，R6为非氢。
可通过多种常见的有机化学技术对C-2位进行修饰，这其中包括用已知反应在C-2位对NH2修饰(例如从胺转化成酰胺、胺类的烷基化反应、胺类的芳香化反应等)前采用保护基团保护二醇结构。然后，被保护的二醇部分可任选地脱保护，得到只在C-2位修饰的BH4类似物。
N-3位的结构修饰
在式I化合物的另一个实施方式中，化合物可在3-位上进行修饰。在此类实施方式中，R1，R2，R3，R4，R6，和R7均为氢；R5为C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基芳基，C(O)C2-40亚烯基杂芳基，C(O)NRaRb，C(O)ORa，或C(O)SRa。
在此前提及的式I化合物的每种实施方式中，Ra和Rb独立地为氢，C3-8环烷基，C1-40烷基，C1-40取代烷基，C3-8杂环烷基，C1-40亚烷基C3-8环烷基，C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，芳基，杂芳基，亚烷基芳基，亚烷基杂芳基，C3-8环烯基，C2-40链烯基，C2-40取代链烯基，C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基C3-8环烷基，C2-40亚烯基C3-8环烯基，C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，C2-40亚烯基芳基，C2-40亚烯基杂芳基，C(O)H，C(O)C3-8环烷基，C(O)C1-40烷基，C(O)C1-40取代烷基，C(O)C3-8杂环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8环烷基，C(O)C1-40亚烷基C3-8杂环烷基，C(O)芳基，C(O)杂芳基，C(O)亚烷基芳基，C(O)亚烷基杂芳基，C(O)C3-8环烯基，C(O)C2-40链烯基，C(O)C2-40取代链烯基，C(O)C3-8杂环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8环烯基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烷基，C(O)C2-40亚烯基C3-8杂环烯基，聚乙二醇，C(O)C2-40亚烯基芳基，或C(O)C2-40亚烯基杂芳基。
可通过多种常见的有机化学技术对N-3位进行修饰，这其中包括用已知的反应(例如将胺类转化成酰胺、胺类的烷基化、胺的芳化等)对胺修饰前将BH4二醇结构部分用保护基团进行保护。
BH4的酰基衍生物
同时受关注的还有BH4在C1’，C2’和N5上修饰获得三乙酰基衍生物。此类化合物可按照反应式(VII)所示加以制备。
Figure BPA00001178891800251
四氢生物喋呤类似物的评价方法
可用多种方法评价本发明公开的四氢生物喋呤类似物。例如，可评价这些类似物的代谢稳定性。药物代谢通过肝脏的两种主要酶反应进行。第一相代谢酶类包括位于滑面内质网上的细胞色素450(CYP)酶家族。第一相反应包括氧化、还原和/或水解，大多数这些反应由CYP酶介导，同时需要NADPH作为辅酶参与。第二相反应在细胞质和内质网上进行，包括药物分子与葡萄糖醛酸、谷胱甘肽、硫酸盐和谷氨酰胺的结合作用。第二相反应可导致药物失活和/或促进药物分子从体内消除。药物分子可被第一相或第二相反应代谢，也可同时被这两相反应代谢。确定待测化合物的代谢稳定性用以评估化合物在第一相代谢过程中生成具有潜在毒性或药理失活的代谢物，或因代谢降解不充分而引起体内蓄积的情况。肝微粒体属于亚细胞结构(分布于内质网上)，在其结构中含有许多药物代谢酶类，其中包括细胞色素酶系。肝微粒体常用作体外模型系统以评估试验化合物的代谢情况。影响代谢稳定性的其他因素可能与四氢生物喋呤或其衍生物的氧化有关。四氢生物喋呤在哺乳动物机体体温和氧化还原电位环境作用下经代谢或物理作用而易于氧化。此外，可通过能够分解类似物且分布在组织和血液中的酯酶及其他酶类检测类似物的代谢情况。
可同时评价这些类似物的水溶性和脂溶性。水溶性是决定药物候选物生物利用度及有用性的一个重要因素。比浊法(光散射)是一种广泛采用的快速确定大量先导化合物表观溶解度的方法。亲脂性则可采用辛醇：水分配系数作为膜结构模型加以确定。辛醇：水分配系数也可用计算机片段计算法进行计算。如果分配系数的对数值(log P)高于2，则认为其代表膜渗透的最适log P值。
此外，对这些类似物的膜通透性也进行了评价。CaCO-2细胞通常用于评价膜通透性以及预计口服生物利用度。Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞株，并且通常可以汇合单层生长或在包埋于扩散室的多孔滤膜上生长。根据试验化合物在接受室中的富集率测定化合物的膜通透性。单层细胞的顶端(供体)表面由微绒毛组成，因此保留了小肠刷状缘的特征。此外，这类细胞还可表达功能性转运蛋白以及代谢酶(Inui等，J.Pharmacol.Exp.Ther.261：195-201(1992)；Lu等，Pharm.Res.11：S-258(1994)；Jorge等，Pharm.Res.8：1441-1443(1991))。采用CaCo-2细胞进行化合物体外评估被认为对人胃肠道吸收具有预测作用(Stewart等，Pharm.Res.12：693-699(1995))。来源于人小肠的Caco-2细胞已被确定可表达多种酯酶，这些酶类可在药物穿透肠细胞膜时从前药中释放出原药。(Imai等，Drug Metabolism and Disposition 2005，33，1185-1190；Miyazaki等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2004，48，2604-2609)。已从人小肠源性CaCO-2细胞中鉴定出可水解缬氨酸某些醇酯的联苯羟化酶样蛋白(Amidon等，J.Biol.Chem.2003，273，25348-25356.)。
这些类似物还可进一步进行肠通透性评价。在商业化药物开发过程中意向设计成口服制剂的化合物的肠通透性评估对于药物候选物的选取发挥了重要的作用。按照吸收能力对系列先导化合物进行排序有利于化合物的选取和优化。通过比较CaCO-2或MDCK单层培养细胞测定的表观通透性来研究系列化合物吸收性是目前接受的研究方法(Artusson and Borchardt，Pharm.Res.1997，14，1655-1657)。在进一步开发过程中这些吸收模型也可用于研究化合物在吸收上的任何问题，其中也包括了主动转运机制。
可采用大鼠或犬类等动物模型对类似物的生物利用度以及BH4转化率做进一步评价。在这些研究过程中比较药物口服与静脉注射给药，分析两种途径血药浓度的药代动力学性质。可分析四氢生物喋呤在肝脏、心脏、血管系统以及大脑等感兴趣组织的分布情况，并比较类似物与原药形式给药后在产生血药浓度上的差异。
含式I化合物的组合物
本发明的另一个方面涉及包括本发明化合物及药学上可接受的辅料如稀释剂或载体的药学组合物。适用于本发明的化合物与药学组合物包括可以有效量给药达到治疗目的的化合物。该化合物的给药具体叙述如下。
/本领域技术人员根据给药途径以及预期给药剂量可确定合理的药剂学配方。见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，1435-712(第18版，Mack Publishing Co，Easton，Pennsylvania，1990)。药物配方可影响给药物质的物理状态、稳定性、体内释放速率及体内清除率。根据给药途径，可按照体重、体表面积或器官大小计算合适的给药剂量。本领域普通技术人员无需过多经验即可作出确定适当给药剂量所需的进一步精确计算，尤其是借鉴本说明书公开的剂量信息及通过动物或人体临床试验所获取的药物动力学数据而作出计算。
术语“药学上可接受”或“药理学上可接受”系指动物或人给药后不会产生副作用、变态反应或其他不良反应的药物分子和组合物。本说明书所使用的“药学上可接受的载体”包括如何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌和抗真菌物质、等渗和吸收缓释物质等等。这些辅料对于药物活性物质中的应用在本领域是众所周知的。除非是任何常规介质或物质与治疗组合物不相容，否则它在治疗性组合物中的应用都应考虑在内。作为补充的活性成分也可包括在组合物中。在示范性实施例中，药物配方可包括玉米糖浆固形物，高油酸红花子油，椰子油，豆油，L-亮氨酸，三价磷酸钙，L-酪氨酸，L-脯氨酸，L-赖氨酸醋酸盐，DATEM(乳化剂)，L-谷氨酰胺，L-缬氨酸，磷酸氢二钾，L-异亮氨酸，L-精氨酸，L-丙氨酸，甘氨酸，L-天冬酰胺一水合物，L-丝氨酸，柠檬酸钾，L-苏氨酸，柠檬酸钠，氯化镁，L-组氨酸，L-甲硫氨酸，抗坏血酸，碳酸钙，L-谷氨酸，L-胱氨酸盐酸盐，L-色氨酸，L-天冬氨酸，氯化胆碱，牛磺酸，m-肌醇，硫酸亚铁，抗坏血酸棕榈酸酯，硫酸锌，L-肉碱，α-生育酚醋酸酯，氯化钠，烟酰胺，混合生育酚，泛酸钙，硫酸铜，氯化盐酸硫胺素，维生素A棕榈酸酯，硫酸锰，核黄素，盐酸吡哆醇，叶酸，β-胡萝卜素，碘化钾，维生素K1，生物素，硒酸钠，氯化铬，钼酸钠，维生素D3和维生素B12。补充的氨基酸，矿物质和维生素应根据每种成分的推荐每日剂量进行添加。
本说明书使用的术语“药学上可接受的盐”包括例如碱加成盐和酸加成盐。
药学上可接受的碱加成盐可由金属或胺类(例如碱金属和碱土金属或有机胺类)形成。化合物的药学上可接受的盐也可用药学上可接受的阳离子制备。合适的药学上可接受的阳离子是本领域技术人员所熟知的，包括碱金属、碱土金属、铵类和季铵阳离子。也可考虑采用碳酸盐或碳酸氢盐。可作为阳离子的金属实例包括钠、钾、镁、铵、钙或铁等等。合适的胺类包括异丙基胺、三甲胺、组胺、N，N′-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因。
药学上可接受的酸加成盐包括无机或有机酸的盐。合适的酸加成盐的实例包括盐酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、硝酸盐、磷酸盐。其他合适的药学上可接受的盐是本领域技术人员所熟知的，例如乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐或马来酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或磷酸盐；有机羧酸盐、磺酸盐、磺酸或磷酸或N-取代氨磺酸盐，例如与醋酸、三氟乙酸(TFA)，丙酸，羟基酸，琥珀酸，马来酸，羟基马来酸，甲基马来酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，乳酸，草酸，葡萄糖酸，葡萄糖二酸，葡萄糖醛酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，水杨酸，4-氨基水杨酸，2-苯氧基苯甲酸，2-乙酰氧基苯甲酸，双羟萘酸，烟酸，异烟酸的盐，以及与各种氨基酸形成的盐，如在天然蛋白质合成中所涉及的20个α-氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸，也包括苯基乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷1，2-二磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸盐、葡萄糖6-磷酸、N-环己基氨基磺酸(形成环己氨磺酸类)，或者与其他酸性有机化合物的盐，例如与抗坏血酸的盐。
类似物的盐可以与无机或有机酸形成。非限定性的备选类似物盐类实例包括醋酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、富马酸和马来酸的类似物盐。在一个具体实施例中，此处叙述的组合物中所使用的类似物为双盐酸盐。
含有本发明的类似物的药学组合物可通过传统技术生产，例如通过传统的混合、溶解、制粒、包衣、磨细、乳化、包封、捕获或冻干工序。合适的配方取决于所选的给药途径。当治疗有效量的本发明类似物口服给药时，该组合物的典型制剂通常为固体(例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂或锭剂)或液体制剂(例如水混悬剂、溶液剂、酏剂或糖浆剂)。
以片剂形式给药时，组合物还可包含具有功能性的固体和/或固体载体，如明胶或一种辅料。片剂、胶囊剂和粉剂可含有约1％-约95％的本发明类似物，例如含有约25-约90％的本发明类似物。
以液体或混悬剂形式给药时，可添加功能性液体和/或液体载体如水、石油类烷烃或动物油或植物油。液体组合物还可含有生理盐水、糖醇溶液、葡萄糖或其它糖溶液或乙二醇。在一项特殊实施例中添加糖醇溶液。以溶液剂或混悬剂形式给药时，组合物可含有约0.5％-约90％质量百分比的本发明类似物。例如含有约1％-50％的本发明类似物。在一个被考虑的实施方式中，液体载体为非水性或基本非水性的。对于液体形式给药，组合物可以速溶固体制剂形式提供，在临用前即时溶解或悬浮该组合物。
有效量的本发明类似物通过静脉、皮肤或皮下注射方式给药时，组合物是无热原、肠道外给药可接受的水溶液。这种肠道外可接受的溶液的制备，应考虑pH、等渗性、稳定性等因素，这是本领域所熟知的技术。在一个实施方式中，用于静脉、皮肤或皮下注射给药的组合物，除了含有本发明的化合物之外，典型地还含有一种等渗介质。这种类似物的组合物可制备成游离碱或其药理学上可接受的盐的水溶液或混有表面活性剂(例如羟丙基纤维素)的水溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇或其混合物或在油相中制备分散剂。在正常贮藏和使用环境下，这些制剂可任选地含有防腐剂以预防滋生微生物。
可供注射用的类似物组合物可包括灭菌水溶液、混悬液或分散液，及在临用前即时配制灭菌可注射水溶液、混悬液或分散液的灭菌干粉。在所有情况下，制剂必须是无菌的且必须符合易被注射器抽取的流动性要求。制剂必须在生产和贮藏条件下保持稳定，而且必须具有抵御微生物例如细菌和真菌污染的能力，可任选地在制剂中添加一种防腐剂。载体可为一种含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、其合适的混合物及植物油的溶剂或分散介质。在一个可考虑的实施方式中，载体为非水性或基本非水性的介质。可通过包衣方法(例如采用卵磷脂)、在分散制剂中维持所要求的类似物颗粒大小以及采用表面活性剂的方法维持适当的流动性。可选用多种抗菌和抗真菌物质抑制微生物繁殖，例如苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞，等等。本发明组合物中可含有等渗剂，例如糖类和氯化钠。通过在组合物中添加可推迟吸收的物质，例如硬脂酸镁和明胶，可延长注射用组合物的吸收时间。
灭菌注射用溶液可由活性化合物以所需要的量在合适的溶剂中与上述各种其他成分(根据需要)混合配制而成，然后滤过除菌。一般而言，分散液是通过将各种灭菌的活性成分加入到一种含有基本分散介质和以上所列其他所需的成分的灭菌载体中配制而成。对于配制灭菌注射溶液用的无菌干粉，制备方法包括运用真空干燥和冷冻干燥技术获得含有活性成分及其他所需的添加性成分(来源于其滤过除菌溶液)的干粉。
对于口服给药，将本发明类似物与药学上可接受的辅料如本领域熟知的载体合并可容易地配制适用的组合物。利用这些辅料和载体可将本发明化合物配制成供受治疗的患者经口摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、乳浊剂、混悬剂等等。口服用的药物制剂可通过式I化合物添加至固体赋形剂中，可研磨得到混合物，制成颗粒混合物，按需添加合适的辅料后，得到片剂或糖衣片的片芯。合适的赋形剂包括例如填充剂及纤维素制品。如果需要，可添加崩解剂。对于各种配方制剂，药学上可接受的成分是众所周知的，例如可以是粘合剂(例如天然或合成聚合物)、润滑剂、表面活性剂、甜味剂和调味剂、包衣材料、防腐剂、染色剂、增稠剂、佐剂、抗微生物剂、抗氧剂以及各种剂型的载体。
组合物中常用粘合剂的非限定性实例包括黄蓍胶，阿拉伯胶，淀粉，明胶，可生物降解聚合物如二羧酸的均聚或共聚酯，亚烷基乙二醇、聚亚烷基二醇和/或脂肪族羟基羧酸；二羧酸的均聚或共聚酰胺，亚烷基二胺、和/或α-氨基羧酸；相应的聚酯-聚酰胺-共聚物，聚酸酐，聚原酸酯，聚磷腈和聚碳酸酯。生物可降解聚合物可为直链、支链或交联结构。具体实例为聚乙醇酸，聚乳酸以及聚d，l-丙交酯/乙交酯。其他聚合物实例为水溶性聚合物，如聚氧不饱和烃(聚氧乙烯、聚氧丙烯及其混合型聚合物)、聚丙烯酰胺和羟烷基化聚丙烯酰胺、聚马来酸及其酯类或酰胺类，聚丙烯酸及其酯类或酰胺类，聚苯乙烯醇及其酯类或醚类，聚苯乙烯咪唑类，聚苯乙烯吡咯酮类及壳聚糖等天然聚合物。
此处描述的组合物中所使用的压片赋形剂的非限定性实例包括磷酸盐类如磷酸氢钙。
此处描述的组合物中所用的表面活性剂可以为阴离子型、阳离子型、两性型或中性型等。此处描述的组合物中所用的表面活性剂的非限定性实例包括卵磷脂、磷脂、硫酸辛酯、十二烷基硫酸盐，十四烷基硫酸盐，十六烷基硫酸盐和十八烷基硫酸盐，油酸钠或癸酸钠，1-酰基氨基乙烷-2-磺酸类，如1-辛酰氨基乙烷-2-磺酸，1-癸酰氨基乙烷-2-磺酸，1-十二烷酰氨基乙烷-2-磺酸，1-十四烷酰氨基乙烷-2-磺酸，1-十六烷酰氨基-2-磺酸和1-十八烷酰氨基乙烷-2-磺酸，以及牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸、胆酸及其盐类，例如胆酸、去氧胆酸以及甘氨胆酸钠、癸酸钠或月桂酸钠，油酸钠，十二烷基硫酸钠，十六烷基硫酸钠，硫酸化蓖麻油和二辛基琥珀酰磺酸钠，椰油酰氨丙基甜菜碱和月桂基甜菜碱，脂肪醇，胆固醇，硬脂酸单或双甘油酯，油酸单或双甘油酯，棕榈酸单或双甘油酯以及硬脂酸聚氧乙烯酯。
此处描述的组合物中所用甜味剂的非限定性实例包括糖醇类，如甘露醇，木糖醇，山梨醇，甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，巴糖醇，异麦芽糖、麦芽糖醇和乳糖醇，以及糖精，三氯蔗糖(sucralose)和阿斯巴甜。在一个实施方式中，甜味剂选自糖醇类、阿斯巴甜和三氯蔗糖。另一实施方式中所选用的为非糖类成分。此处描述的组合物中所用调味剂的非限定性实例包括薄荷油，冬青油或水果味调味剂(如樱桃或橙味剂)。
此处描述的组合物中所用包衣材料的非限定性实例包括滑石粉，玉米淀粉，二氧化硅，十二烷基硫酸钠，明胶，蜡，虫胶，糖，生物可降解聚合物和金属硬脂酸盐。在一个实施方式中，包衣材料选自滑石粉，玉米淀粉，二氧化硅，十二烷基硫酸钠，明胶，蜡，生物可降解聚合物和金属硬脂酸盐。包衣材料在组合物中所占的重量比为约0.2wt.％至约15wt.％，例如从约0.5wt.％至约5wt.％。
可用于组合物中的润滑剂包括但不限于天然或合成油类、脂肪、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸钠、硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、氢化棉籽油(Sterotex)、滑石和蜡，包括但是不限于蜂蜡、巴西棕榈蜡、鲸蜡醇、硬脂酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、山萮酸甘油酯、氢化植物油以及硬脂醇。润滑剂在组合物中所占的重量比为约0.2wt.％至约20wt.％，例如从约0.5wt.％至约5wt.％。
此处描述的组合物中所用防腐剂的非限定性实例包括山梨酸，氯丁醇，硫柳汞，苯甲醇，苯扎氯铵，苯酚，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，苯甲酸，苯氧基乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，尼泊金丙酯和任何上述成分的组合。
此处描述的组合物中所用佐剂的非限定性实例包括氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝钾(明矾)，硫酸铍，硅石，高岭土，碳，油包水型乳化剂，水包油型乳化剂，胞壁酰二肽，细菌内毒素、脂质X，短小棒状杆菌(痤疮丙酸杆菌)，百日咳杆菌，多核糖核苷酸类，海藻酸钠，羊毛脂，溶血卵磷脂，维生素A，皂甙，脂质体，左旋咪唑，DEAE-葡聚糖，嵌段共聚物或其他合成佐剂。这些佐剂可从不同非销售商处购买，例如默克佐剂65(Merck andCompany，Inc.，Rahway，N.J.)或福氏非完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。通常所使用的佐剂为爱菲金(Alhydrogel)(水包油型)，铝胶复合佐剂(氢氧化铝)或者爱菲金/铝胶混合物。
此处描述的组合物中所用抗微生物剂的非限定性实例包括三氯生，苯氧异丙醇，苯氧基乙醇，PCMX，天然精油及其主要成分，以及它们的组合物。
此处描述的组合物中所用抗氧剂的非限定性实例包括抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)，维生素A，硒，β-胡萝卜素，类胡萝卜素，黄酮类，类黄酮，叶酸，黄烷酮类，异黄酮类，儿茶素，花青素，查尔酮以及这些物质的组合。
为了达到活性化合物在胃肠道接触体液后控释释放，及提供基本稳定和有效的活性化合物血药浓度，本说明书描述的类似物也可制成缓释或持续释放剂型。例如，可通过一次或多次溶出、分散以及离子交换的方式控制药物释放。此外，缓释技术还可通过胃肠道内可饱和或限制途径增强药物吸收。例如，为此目的类似物可被包封在可生物降解的聚合物基质、水溶性聚合物或者两者的混合物，以及任选的合适表面活性剂中。在上下文中，包封系指微颗粒掺入聚合物基质中。也可通过对已知的分散或乳化包衣技术得到的分散微颗粒或乳化微液滴进行胶囊封装以获得控释制剂。
为了吸入给药，本发明的化合物通常以气雾剂的形式从使用合适抛射剂的加压包或雾化装置进行递药。加压气雾剂中，通过提供递药计量阀可确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊或药盒可配制成包含活性化合物及合适的粉末状基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
类似物可配制用于胃肠外注射给药，例如静脉注射或静脉滴注。注射剂型可以例如安瓿或多剂量容器的剂量单位形式(其中添加防腐剂)提供。组合物可为混悬剂、溶液剂、油性或水性介质中的乳剂，也可含有如助悬剂、稳定剂和/或分散剂等辅料。
用于胃肠外给药的药物剂型包括水溶性形式的类似物水溶液。此外，类似物的混悬液可制成合适的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或介质包括脂肪油或合成脂肪酸酯。水性注射混悬液可含有增加混悬液粘性的物质。任选地，混悬液也可含有合适的稳定剂或改善化合物溶解性的物质，以便配制成高浓度溶液。或者本发明的组合物可以是粉剂，在临用前用合适的介质(如无热原的灭菌注射用水)重建后使用。
本发明类似物也可制成直肠给药用组合物，例如包含常规栓剂基质的栓剂或灌肠剂。除了此前所述剂型外，也可将类似物制成缓释剂型。此类长效剂型可通过植入(例如皮下或肌内)或肌注方式给药。因此，这些化合物可用合适的多聚材料或疏水性材料(例如在一种可接受的油脂中的乳剂)或离子交换树脂辅料制成制剂，也可制成难溶性衍生物，例如难溶性盐类。
特别是，本发明的类似物可以含有赋形剂(包括淀粉或乳糖)的片剂形式、或以胶囊剂或胚珠形式(单独或与赋形剂的混合物)、或含有调味剂或染色剂的酏剂或混悬液的形式进行口服、口腔或舌下给药。这些液体制剂可添加药学上可接受的添加剂如助悬剂加以制备。类似物也可经胃肠外途径给药，例如，静脉注射、肌肉注射、皮下注射或直肠给药。对于胃肠外途径给药，灭菌水溶液制剂是类似物的最佳剂型，该制剂中可含有其他物质，例如盐类、维持溶液与血液等渗性的糖醇类如甘露醇或葡萄糖。
对于兽医学上的用途，本发明类似物或其无毒盐可以符合兽药标准的可接受的合适制剂给药，兽医可容易地确定对于某一特定动物最合适的给药方案及给药途径。
从本发明的某些方面而言，所有治疗疾病的必要组件可包装在一个药盒中，所述必要组件使用单独的BH4类似物或与另一药物或与此类疾病传统使用的干预手段联合应用。尤其是本发明提供了疾病治疗干预上使用的药盒，其中包括BH4类似物或其衍生物，及制备所述药物给药形式的缓冲剂和他组分，和/或这些药物的给药装置，和/或与BH4基药物合用的任何药物，和/或与药物一起包装的疾病治疗说明书。该说明书可固定于任何有形媒介，例如印刷纸张，或电脑可读取的磁盘/光盘，或参照远程计算机数据源的说明，例如通过互联网访问的万维网网页。
利用式I化合物的治疗方法
如上所述，本发明的一个方面包括含四氢生物喋呤类似物的组合物。本发明的另一个方面包括了通过给予任何一种上述组合物进行对罹患BH4反应性病症的个体进行治疗的方法。该方法包括给予患者治疗有效量的式I化合物。BH4-反应性病症通常包括对BH4或其衍生物敏感的疾病。BH4-反应性病症包括I型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病性视网膜病变，糖尿病肾病，血管疾病，溶血性贫血(例如，与溶血有关的贫血)，镰状细胞性贫血，神经精神障碍，与BH4缺乏有关的神经精神障碍，伴酪氨酸羟化酶功能下降或色氨酸羟化酶功能下降有关的神经精神障碍，代谢性疾病如代谢紊乱综合症，高血压，外周动脉疾病，间歇性跛行，严重肢体缺血，心力衰竭，动脉粥样硬化，内皮功能障碍和高苯丙氨酸血症。这些疾病将在以下内容中作更具体的描述。
“治疗有效量”系指有效治疗或预防受治疗者疾病发展、或减轻受治疗者现有症状所需的量。有效量的确定是在本领域技术人员能力范围之内的，尤其是在本发明提供的详细内容基础上更是如此。通常“治疗有效量”系指可达到预期治疗效应的类似物的量。例如，在一个实施方式中，在血流介导舒张研究中本发明所公开的治疗有效量的BH4类似物可对诸如5分钟缺血的正常信号产生约50或100％或更高程度的血管扩张效应。在另一个实施方式中，本发明所公开的治疗有效量的BH4类似物可降低5mmHg或10mmHg舒张压，某些患者的甚至下降15mmHg或更多。在另一实施方式中，本发明所公开的BH4类似物可降低如血流介导舒张测定的内皮细胞功能障碍，或细胞黏附分子的表达、过量氧化性物质的产生，或促进凝血或血栓生成的趋势等其它方面。在另一个实施方式中，在BH4反应性患者治疗中本发明所公开的BH4类似物在治疗有效量下可升高至少10％的左旋多巴或五羟色胺神经递质的水平。
类似物的毒性和疗效可通过在细胞培养物或实验动物上的标准药学研究程序加以确定，例如确定LD50(达到50％受试物死亡的剂量)和ED50(在50％受试物上治疗有效的剂量)。毒性剂量与治疗有效剂量的比值为治疗指数，以LD50和ED50的比率表示。优选高治疗指数的化合物。获取的数据可用于确定人用剂量范围的制定。这些化合物的剂量优选在包括ED50而几无毒性或无毒性的血液浓度范围内。根据采用的剂型及给药途径，剂量可在此范围内变化。
根据具体治疗的疾病以及患者的情况，医生可选择正确的剂型、给药途径和剂量。给药剂量及给药间隔可分别进行调整以提供足以维持疗效的BH4类似物、BH4或其组合物的血浆浓度水平。
类似物的给药剂量取决于接受治疗的患者(其年龄、健康状况、性别和体重)、目前的治疗类型(如存在)、病痛的严重程度、所需疗效的性质、治疗方式及治疗频率，以及处方医生的判断。给药频率也可取决于对动脉血氧分压的药效学效应。但是正如本领域技术人员所理解并决定的，无需太多的实验可对患者个体定制最恰当的剂量。这主要包括对标准剂量进行调整，如患者体重较轻则减少给药剂量。
本领域技术人员可根据患者的不同需要确定类似物有效量的优选范围。对于症状或疾患明确的患者进行治疗或预防性治疗，本发明类似物的典型给药剂量可以是每千克体重每日约0.1mg活性分子(mg/kg)至约40mg/kg，例如至少0.2mg/kg，至少0.3mg/kg，至少0.4mg/kg，或至少0.5mg/kg；例如30mg/kg或低于30mg/kg，20mg/kg或低于0mg/kg，比如可以是约2.5mg/日(0.5mg/kg×5kg)至约2000mg/日(20mg/kg×100kg)。此剂量可单次给药或分成多次剂量给药。在典型实施例中，每日给药剂量可为0.5mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，3mg/kg，4mg/kg，5mg/kg，6mg/kg，7mg/kg，8mg/kg，9mg/kg，10mg/kg，11mg/kg，12mg/kg，13mg/kg，14mg/kg，15mg/kg，16mg/kg，17mg/kg，18mg/kg，19mg/kg或20mg/kg，以及任何其他剂量。
通过使用已建立的测定血中苯丙氨酸(Phe)水平与相关的剂量反应数据的方法，可以确定合理的给药剂量。主治医生可在考虑影响药物作用的因素之后确定最终给药剂量方案，这些因素为例如药物的比活性、损伤的严重性、患者的反应性，患者的年龄、症状、体重、性别以及饮食状况，感染的严重程度，给药时间以及其他临床因素。随着研究的进行，将提供制定治疗具体疾病和症状的合理给药剂量水平以及疗程的进一步信息。
人们将会认识到，本发明所涉及的药物组合物以及治疗方法可用于人类医学或兽医学领域。因此治疗个体(或受治疗者)可以为哺乳动物，例如人类或其他动物。对于在兽医学上的用途，受治疗者包括，例如，奶牛、绵羊、猪、马和山羊等农场动物；犬、猫类等宠物，野生和/或动物园驯养动物，包括小鼠、大鼠、家兔、豚鼠和仓鼠在内的实验室动物；也包括如鸡，火鸡，鸭和鹅等家禽。
虽然考虑可每日连续性给药，但是在具体临床指标改善至某一阈值范围以上的情况下，停止治疗可能是合乎需要的。当然在临床改善的指标恶化时，可重新开始治疗。事实上，医生通常为患者个体确定最合适的实际给药方案，给药剂量可随着特定患者的年龄、体重及反应性而变化。上述剂量范围为平均情况下的一个范例，但是在具体情况下选择较高或较低给药剂量给药更为有利，这也落入本发明的范围内。
本发明类似物可单独用药或与针对该疾病或它的其它症状的治疗剂联合用药。该类似物通常以按预定给药途径及药学实践规范选择的药学上可接受的载体的混合物形式给药。因此，按本发明使用的药学组合物可采用一种或几种生理学上可接受载体以常规的方法进行制备，所述生理学上可接受载体包括有利于将类似物加工成可药用制剂的赋形剂和添加剂。
BH4-反应性疾病
如上所述，BH4反应性疾病包括I型糖尿病，II型糖尿病，糖尿病性视网膜病变，糖尿病肾病，血管疾病，溶血性贫血，镰状细胞性贫血，神经精神障碍，与BH4缺乏症有关的神经精神障碍，酪氨酸羟化酶功能减退或酪氨酸羟化酶功能减退有关的神经精神疾病，代谢性疾病如代谢综合症，高血压，外周动脉疾病，间歇性跛行，严重肢体缺血，心力衰竭，动脉粥样硬化，内皮功能紊乱，和高苯丙氨酸血症。
BH4反应性疾病中包括I型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病性视网膜病变以及糖尿病性肾病。糖尿病和其他心血管疾病的特征为一氧化氮(NO)生物活性的丧失，导致内皮组织血管扩张与收缩因子的平衡发生改变，且诱发内皮功能障碍。内皮功能障碍成为血管收缩的基础，导致了高血压、血管应对血流或其他信号扩张不足，血栓生成与血小板聚集作用增加，细胞表面粘附分子如选择蛋白增加，凝血因子水平升高，因过量自由基如活性氧族(ROS)如超氧化物分子的生成加速了动脉粥样硬化。由于NO在维持血管内环境稳态中发挥了核心作用，NO生物活性缺失促进血管疾病病理，同时也是这些疾病的负面结果的一种标记物。此外，因缺乏足量四氢生物喋呤所生成的活性氧族也可加速动脉粥样硬化。
动脉中的BH4暴露在氧化应激下可加速生物合成与分解代谢，促进了内皮功能障碍病理形成，目前已知这种病理情况存在于糖尿病患者动脉中。此外，血糖升高可对BH4合成通路中关键的生物合成酶GTP环水解酶产生抑制作用，从而抑制细胞水平上BH4的升高。未偶联的内皮一氧化氮合成酶生成过量活性氧族可导致四氢生物喋呤的进一步降解，同时也可引起BH4与eNOS比值的利用度下降。BH4的部分缺乏可增强eNOS活性产生氧化物族的生成，这些氧化物族(例如生成过氧化亚硝酸盐的超氧化物)可进一步破坏BH4，导致维持自身螺旋形向下。幸运的是，在动物和人体中试验性补充BH4已被证实有利于改善内皮功能。预料本发明公开的BH4类似物可产生相似的有益效应，但是与天然BH4相比只需相当低的剂量。利用糖尿病或动脉粥样硬化动物的血管环以及来源于糖尿病患者的哺乳类动物血管环进行的高剂量BH4补充研究结果支持BH4可改善血管内皮功能，降低氧化应激，恢复血管机能。预料保护膜公开的BH4类似物同样可改善内皮功能和恢复血管机能。关于BH4对心血管疾病和糖尿病患者的一些正面效应的实例包括：在糖尿病或高胆固醇血症患者上BH4给药可增强NO-介导的前臂血流效应，但是对健康受试者无效(Heitzer等，Diabetologia.43(11)：1435-8(2000))。对冠脉搭桥移植手术后的糖尿病患者急性BH4给药可恢复静脉移植血管和动脉血管的功能(Guzik等，Circulation 105(14)：1656-1662(2002))。与对照受试者相比，BH4可增强II型糖尿病和冠心病患者对胰岛素的敏感性(Nystrom等，Am J Physiol Endocrinol Metab.2004Nov；287(5)：E919-25.Epub(2004))。生物合成途径中补充BH4前体也显示出可促进细胞内BH4水平的升高，增强体内NO合成并改善血管内皮功能。
另一种BH4反应性疾病为血管性疾病。该血管性疾病可选自外周血管病，间歇性跛行，冠心病，伴有高胆固醇血症的血管疾病，与吸烟有关的血管疾病，高血压，顽固或无法控制的高血压，肺动脉高压，特发性肺动脉高压，新生儿肺部高压(PPHN)，动脉粥样硬化，脑卒中，脑卒中后血管痉挛，心肌梗死，缺血再灌注损伤，充血性心脏衰竭，移植后缺血再灌注损伤，移植后血管损伤，血管痉挛，血栓形成，血栓病，凝血与血凝聚。
一般来说，血管疾病的治疗针对维持内环境稳定、提供辅助治疗和提供特异疗法以改善临床相关的终点。这些效应的介导通过改善应对正常信号的血管扩张、减少对血管的氧化损伤和动脉粥样硬化的普遍减轻和可能的逆转及血管系统易于阻塞或血栓形成的其他情况。这些临床终点可包括降低心肌梗死发生率、心绞痛入院率、心血管疾病死亡率、外周血液灌注差所致四肢缺损和皮肤溃疡。可通过血流介导性扩张法评估缺血5分钟后肱动脉的舒张反应来测量血管功能的改善情况，或用分级平板试验评估不产生小腿疼痛情况下的行走能力或产生疼痛的行走时间以测量外周静脉血液灌注情况。也可通过运动负荷试验研究患者的心绞痛诱发或心脏灌流下降体征或机能情况。此外，超声心动图也可用于评估患者射血分数、心输出量、心脏舒张功能、心脏大小、三尖瓣返流速度以及心血管疾病的其他体征。可通过血管造影术检查冠状动脉，评估心脏灌流对乙酰胆碱的反应性。通过纠正导致血管功能紊乱的因素可维持内环境稳态，这些因素包括低水平的BH4以及NO产生不足，不产生有害的自由基(例如可产生过氧化亚硝酸盐的超氧化物自由基)。辅助性治疗一般包括给予药物或干预措施，可以提高原始疗法的疗效。具体治疗在于维持患者正常临床相关终点的稳定性。
我们设想本发明所公开的BH4类似物可用于患有多种血管性疾病的患者人群治疗，这其中包括但是不限于以下疾病：顽固性或无法控制的高血压、间歇性跛行，冠状动脉功能障碍，心脏衰竭，肺动脉高压以及包括镰状细胞疾病在内的溶血性贫血，无论是否患有糖尿病。本发明公开的BH4类似物可单独给药，也可与其他治疗性药物和/或介入措施联合应用治疗血管性疾病。用于治疗糖尿病的药物包括但不限于，改善胰岛素敏感性的药物，如PPAR gamma配基(噻唑烷二酮类，格列酮类，曲格列酮，罗格列酮(文迪雅)，吡格列酮)；促胰岛素分泌药物例如磺酰脲类(格列喹酮，甲苯磺丁脲，格列美脲，氯磺丙脲，格列吡嗪，格列本脲，乙酰磺环己脲)以及苯甲酸衍生物类(美格列奈，瑞格列奈，那格列奈)以及减少肝脏葡萄糖生成的药物如二甲双胍。血管性疾病治疗药物包括但不局限于常用于高血压和其他内皮功能障碍性疾病治疗的内皮素受体拮抗剂，如波生坦，达卢生坦，恩拉生坦，替唑生坦，阿曲生坦，安倍生坦，司他生坦；平滑肌松弛药物，例如PDE5抑制剂(间接作用药物)和米诺地尔(直接作用药物)；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，如卡托普利，依那普利，赖诺普利，福辛普利，培哚普利，喹那普利，群多普利，贝那普利，雷米普利；血管紧张素II受体拮抗剂，例如厄贝沙坦，氯沙坦，缬沙坦，以普沙坦，奥美沙坦，坎地沙坦，替米沙坦；β-受体阻断剂，例如阿替洛尔，美托洛尔，纳多洛尔，比索洛尔，吲哚洛尔，醋丁洛尔，倍他洛尔，普萘洛尔；利尿药例如氢氯噻嗪，呋塞米，托塞米，美托拉宗；钙通道阻滞剂，如氨氯地平，非洛地平，尼索地平，硝苯地平，维拉帕米，地尔硫卓；α-受体阻断剂，如多沙唑嗪，特拉唑嗪，阿夫唑嗪，坦索罗辛；以及中枢α-激动剂如可乐定。治疗高脂血症的药物包括但是不限于降低LDL的药物如他汀类(阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀，罗苏伐他汀钙，辛伐他汀)和烟酸，激动PPARα的药物如贝特类药物，吉非贝齐，非诺贝特，苯扎贝特，环丙贝特；可结合并预防胆酸重吸收以及降低胆固醇水平的药物，例如胆酸多价螯合剂，消胆胺和考来替泊；以及胆固醇吸收抑制剂。
如上所述，本发明公开了血管疾病的治疗方法，给予受治疗者单独包含BH4类似物或与传统血管疾病治疗药物合用的组合物，与缺少BH4类似物独用或与传统血管疾病治疗药物合用的情况下相比，该疗法可有效改善患者的临床相关终点。本发明的一个实施方式可包括给予临床相关终点异常的患者BH4类似物，其量为使数值正常化的有效量。在另一实施方式中，患者被诊断为特殊的血管病。被诊断为特殊血管病的患者表现为特殊症状和/或用于特殊血管病诊断的常规检查结果特征，本发明拟给予患者改善临床终点至正常水平的本发明描述的BH4类似物治疗。
BH4反应性疾病也包括溶血性贫血以及镰状细胞性贫血。已有数据表明溶血性贫血患者存在内皮功能障碍以及NO缺乏。BH4缺乏很可能是由于BH4储库被氧化破坏或内皮系统受损导致的生物合成和维持BH4储库的能力下降所引起。动物试验表明NO对与镰状细胞病有关慢性血管损害具有补偿作用。循环系统中血红蛋白以及超氧化物的综合效应可导致NO的破坏(Reiter，等，Current Opinions in Hematology 10：99-107(2003))。目前已考虑选用提高NO的生物利用度或抑制与镰状细胞病有关的氧化应激和自由基增殖失控的新治疗方案。精氨酸与羟基脲联合用药可增加NO的生成并改善病情平稳的SCD患者对精氨酸的利用。见Morris等(2003)J.PediatricHematology 25：629-34。除羟基脲和精氨酸外，也可考虑采用其他治疗方案，例如通过吸入NO提高NO水平，用别嘌呤醇减少NO破坏，用他汀类药物和西地那非给药增强NO反应性。见Mack等，(2005，待发表)Intl.J.Biochem.Cell Biol。美国专利申请公开公报2003/0078231描述了正分子的磺酸基-腺苷甲硫氨酸衍生物作为具有抗氧功能的营养或食品补充剂，可用于治疗因氧化应激和自由基增殖失控所致的多种疾病，包括镰状细胞病。美国专利申请公开公报2005/0239807 A1描述了反应活性氧生成酶的一种抑制剂，其结构中含有可提供NO供体生物活性的基团(例如别嘌呤醇)，用于治疗与氧化应激有关的疾病，如镰状细胞病。
在镰状细胞病中，NO降低了黏附分子在内皮细胞上的表达，进而减少了红细胞与白细胞的黏附，从而预防血管梗塞危象的产生。见Space等(2000)Am.J.Hematology 63：200-04。已有研究显示细胞关联的NADPH氧化酶是超氧化物的来源。见Wood等(2005)FASEB J.19：989-91。镰状细胞病伴随的超氧化物自由基的快速增殖可引发次级反应活性氧以及氮类代谢物如OH和ONOO的生成，已知这些物质可氧化BH4从而导致BH4缺乏。在一项研究中，镰状细胞转基因小鼠(βS)在接受BH4的一种前体墨喋呤给药后可减少血细胞黏附。见Wood等(2006)J.Free Radical Biology & Medicine40：1443-53。虽然该研究结果与本发明相符，但是作者特别指出墨喋呤缺少外源性BH4的抗氧化与自氧化特性，而BH4的使用是本发明中所关注的。此外，转基因镰状细胞病小鼠模型可能无法准确反映出在人体上观察到的控制NOS、NO和BH4水平的复杂内环境稳态机制。见Reiter等(2003)CurrentOpinion in Hematology 10：99-107。本发明所公开的BH4类似物预期可与BH4同样用于治疗溶血性贫血和镰状细胞病之类疾病。
BH4反应性疾病也包括神经精神性疾病，与BH4缺乏有关的神经精神性疾病，以及与酪氨酸羟化酶功能减退或色氨酸羟化酶功能减退有关的神经精神性疾病。在一个实施方式中，神经精神性疾病选自帕金森氏病，多动症，双相情感障碍，自闭症，抑郁症和肌张力障碍。
在通常情况下多种神经精神疾病与神经递质水平降低或缺乏有关。对于抑郁症，五羟色胺水平不足可引起患者抑郁，故而五羟色胺重摄取抑制剂可用于提高神经末梢的五羟色胺水平。BH4是五羟色胺生物合成以及缺乏情况下所必需的一种辅助性因子，补充BH4可刺激五羟色胺的生成，该结果已在PKU患者血小板五羟色胺水平的研究中观察到。目前还观察到精神分裂症患者体内儿茶酚胺水平和生物喋呤水平很低，考虑到在儿茶酚胺类生物合成途径中BH4在酪氨酸羟基化过程中的作用，因此补充BH4可促进儿茶酚胺神经递质的生成。此外，一些研究还提示，BH4可与神经末梢的受体结合，改变递质的释放，这可能是BH4在控制神经传递上的另一个作用。BH4还被提议用于儿童ADD/ADHD或多动症的治疗。兴奋剂的使用有助于抑制这些患者升高的活性水平并控制更佳的浓度。BH4可升高或改善兴奋性神经递质的生成或释放，从而提高对多动行为的抑制作用。在此同样提出本发明所公开的BH4类似物与BH4同样可用于治疗神经精神性疾病、与BH4缺乏有关的神经精神性疾病、与酪氨酸羟化酶功能减退或色氨酸羟化酶功能减退有关的神经精神性疾病。
治疗有效量的本发明的BH4类似物(例如前药)预期可提高酪氨酸羟化酶或色氨酸羟化酶的功能。
另一种BH4反应性疾病为代谢综合征。代谢综合征患者通常会出现血压升高、胰岛素抗性、高脂血症、体重指数增加和动脉粥样硬化加剧。虽然对代谢综合征确切的潜在病因仍然存在很大争议，但是高脂肪/高碳水化合物饮食和运动减少可导致肥胖。这种疾病患者体内BH4水平低，这可能是导致该综合征发生和发展的一部分因素。导致胰岛素抵抗的果糖喂养大鼠模型中，BH4水平很低，而使用BH4替代治疗可改善胰岛素抵抗状态的血管效应。预期本发明所公开的BH4类似物与BH4同样可用于代谢综合征的治疗。
BH4-反应性疾病也包括高苯丙氨酸血症。在一个实施方式中，高苯丙氨酸血症选自轻度苯丙酮尿症、典型苯丙酮尿症和严重苯丙酮尿症(PKU)，以及与BH4生物合成或再循环的基因缺陷有关的非典型或恶性高苯丙氨酸血症，肝脏疾病伴有的高苯丙氨酸血症以及疟疾伴有的高苯丙氨酸血症。
PKU通常由苯丙氨酸羟化酶的基因或表达或活性存在缺陷引起，从而导致了血液中高苯丙氨酸水平。高苯丙氨酸水平导致脑损伤以及包括癫痫、皮疹、注意力涣散、行动机能衰退以及脑白质异常。高苯丙氨酸水平通常通过严格控制医学饮食限制苯丙氨酸摄入进行控制。众多发表的病例及系列报告中均采用BH4口服摄入降低血中苯丙氨酸水平(Blau等2002)。PKU患者成功地进行超过5年的治疗，苯丙氨酸水平达到具有临床意义的显著下降，从而使患者减少对严格医学饮食的依赖性。对于BH4缺乏症患者，给予BH4可显著降低血中苯丙氨酸水平并可改善脑脊液中的神经递质水平。但是由于BH4对中枢神经系统的通透性较低，该脑部疾病难以得到充分治疗。预期本发明所公开的BH4类似物与BH4相似，同样可用于高苯丙氨酸血症的治疗。
本发明描述了血管性疾病的一种药物介入治疗，该治疗基于BH4类似物给药。进一步预期，以稳定形式或其他形式存在的类似物可用于治疗患有各种类型血管疾病的患者人群，无论其是否患有糖尿病，这些疾病包括但是不限于高血压，顽固或失控性高血压，肺动脉高压，特发性肺动脉高压，新生儿肺动脉高压(PPHN)，及包括镰状细胞病在内的溶血性贫血，冠状动脉疾病，包括冠状动脉、颈动脉、脑动脉或外周血管动脉在内的任何动脉的动脉粥样硬化，脑卒中，脑卒中后血管痉挛，心肌梗死，缺血再灌注损伤，充血性心脏衰竭，移植后缺血再灌注损伤，移植后血管损伤，血管痉挛，血栓形成，血栓症，凝血，血凝，内皮受损，器官和组织供氧不足，全身血管阻力升高(高血压)，血管平滑肌细胞增生，血管狭窄(血管变窄)与炎症恶化，缺血再灌注损伤，高血压，糖尿病，糖尿病性血管病变，心血管疾病，外周血管疾病，间歇性跛行，伴有高胆固醇血症的血管疾病，与吸烟有关的血管疾病，或因缺血和/或血管炎症引起的神经退行性病变。
因此可考虑按照本发明的方法对这些疾病进行治疗。这些基于BH4的组合物可单独用药，也可与常用于治疗有关临床症状或潜在疾病(包括糖尿病、血管疾病、高血压和高脂血症)的其他治疗剂和/或介入治疗(包括本说明书描述的已知治疗剂)联合使用。
本发明的一些实施方式针对血管功能障碍的治疗，其治疗方式为给予受治疗者一种包含BH4类似物或其前体或衍生物的组合物，单独给药或与常规血管疾病治疗联合使用，其中采用类似物单独用药或与常规血管疾病治疗联合使用与不采用类似物单独用药或与常规血管疾病治疗联合使用相比，可有效改善所述受治疗者的临床相关终点。
在示例性实施方式中，BH4类似物或前体或衍生物以有效量给药可降低BH4反应性疾病患者血压平均约5mmHg，或可升高BH4反应性疾病患者的NO血清或尿液浓度约5％，10％，15％，20％或30％，最高可达约200％的。
如作为交互参照的美国专利6,410,535所述，一氧化氮合成酶活性增强还可降低过高的超氧化物水平，提高胰岛素的敏感性，并缓解与胰岛素抵抗有关的血管功能障碍。因此，预期按照本发明可治疗糖尿病(I型和II型)，高胰岛素血症或胰岛素抵抗。与胰岛素抵抗有关的血管功能障碍疾病包括胰岛素抵抗引起的疾病或胰岛素抵抗引起的病情加重，或因胰岛素抵抗而延缓治愈进程的疾病，例如高血压，高血脂，动脉硬化，冠状动脉血管收缩性心绞痛，劳力型心绞痛，脑血管狭窄性病变，脑血管功能不足，脑血管痉挛，外周循环障碍，经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)或冠状动脉旁路移植术(CABG)后冠状动脉狭窄，肥胖，胰岛素非依赖型糖尿病，高胰岛素血症，血脂代谢异常，冠状动脉硬化性心脏疾病等等与胰岛素抵抗有关的疾病。预期罹患这些疾病患者在服用BH4后，BH4可通过激活NOS功能、增加NO生成并抑制活性氧族以改善血管内皮细胞病变等方式预防和治疗这些疾病。预期BH4还可减少糖尿病下游并发症，如视网膜病变或糖尿病性肾病。
脑卒中、偏头痛、阿尔茨海默氏病以及对吗啡的耐受性和依赖性与NOS生成过多的NO有关。对于这些疾病中的任何一种，可给予BH4衍生物。可给予BH4衍生物的其他神经精神疾患的例子包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、精神分裂症、精神分裂症样精神障碍，情感分裂性精神障碍，短时精神障碍，妄想性精神障碍，分享性精神障碍，常见医学疾患引起的精神障碍，药物性精神障碍，或其他精神障碍，迟发性运动障碍，马查多-约瑟夫病，脊髓小脑变性，小脑性共济失调，肌张力障碍，慢性疲劳综合征，急慢性抑郁症，慢性应激综合征，纤维肌痛，偏头痛，注意力缺陷障碍(多动症)，双向抑郁症以及自闭症。神经精神障碍可能与酪氨酸羟化酶功能或色氨酸羟化酶功能降低有关。此处所述的神经精神性疾病可任选地排除帕金森氏病、抑郁症和阿尔茨海默氏病。
按照本发明的方法，BH4衍生物可与一种或多种其他神经精神活性剂联合给药，包括抗抑郁药、神经递质前体(如色氨酸、酪氨酸、五羟色胺)、去甲肾上腺素系统激活剂(如洛非帕明，地昔帕明，瑞波西汀和酪氨酸)、优先作用于五羟色胺的物质或去甲肾上腺素和五羟色胺摄取双重抑制剂(如文拉法辛、度洛西汀或米那普仑)、多巴胺和去甲肾上腺素重摄取双重抑制剂(如安非他酮)。
在示例性实施方式中，对BH4反应性患者施用BH4或前体或衍生物，其酪氨酸羟化酶功能或色氨酸羟化酶功能至少可提高5，10，15，20，25，30，35，40％，50，75，或100％；或L-多巴或五羟色胺神经递质水平至少升高5，10，15，20，25，30，40％，50，75，或100％。
示例性代谢型病变包括高苯丙氨酸血症，例如轻度苯丙酮尿症、典型性苯丙酮尿症、严重苯丙酮尿症，与BH4缺乏有关的非典型性或恶性苯丙酮尿症，伴有肝脏疾病的苯丙氨酸血症以及伴有疟疾的高苯丙氨酸血症。具体患者人群包括婴幼儿、儿童、青少年、成人、育龄期妇女和孕妇。未经类似物或前体或衍生物治疗情况下(如治疗前)，患者个体中苯丙氨酸水平可超过约1000μM，而在有效量该化合物给药后血浆苯丙氨酸水平下降至低于约1000μM，或低于约800μM，或低于约700μM，或低于约600μM，或低于约500μM，或低于约450μM±15μM。
实施例
现提供以下实施例阐述本发明，但是这些实施例不对其范围产生限制。
BH4类似物的合成
实施例1-BH4月桂酸酯
本实施例描述BH4的一种类似物的合成。将BH4溶于合适的溶剂，在咪唑存在下与一分子摩尔过量的十二烷酸酰氯发生反应。反应液室温下搅拌过夜，分离并重结晶所得二酰化的BH4类似物。
实施例2-醋酸2-乙酰氧基-1-(5-乙酰基-2-氨基-4-氧代- 3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-丙酯(Ac 3 -BH4)
Figure BPA00001178891800451
2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(0.1g，0.32mmol)置于醋酸(3ml)中打浆。加入醋酐(300μL，3.2mmol)，混合物加热至回流反应12h。反应液浓缩后，粗品经制备RP-HPLC纯化后得终产品，为白色固体(0.096g，82％)。1H NMR(CD3OD)δ5.15(dd，J＝2.4Hz，J＝10Hz，1H)，4.95-4.90(m，1H)，3.36(d，J＝13.6Hz，1H)，3.22(dd，J＝4.4Hz，J＝13.2Hz，1H)，2.16(s，3H)，2.09(s，3H)，1.85(s，3H)，1.26(d，J＝6.4Hz，3H).MS：ESI(正离子谱)：368(M+H).
实施例3-丙酸1-(2-氨基-4-氧代-5-丙基-3，4，5，6，7，8- 六氢-嘌呤-6-基)-2-丙氧基-丙酯(Pr 3 -BH4)
Figure BPA00001178891800461
以2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(0.2g，0.64mmol)、丙酐(0.83ml，6.4mmol)和丙酸(6ml)为原料，按照实施例2描述的方法制备标题化合物，产物为白色固体(0.20g，75％)。1HNMR(DMSO-d6)δ10.11(s，1H)，6.99(d，J＝5.0Hz，1H)，6.23(s，2H)，4.96(dd，J＝2.5Hz，J＝10.1Hz，1H)，4.84-4.78(m，1H)，4.70(dd，J＝4.1Hz，J＝10.1Hz，1H)，3.15(dd，J＝5.3Hz，J＝13Hz，1H)，3.03(dd，J＝4.5Hz，J＝13Hz，1H)，2.67-2.57(m，1H)，2.40-2.35(m，2H)，2.27-2.20(m，1H)，2.15-2.03(m，2H)，1.17(d，J＝6.6Hz，3H)，1.05(t，J＝7.5Hz，3H)，0.92(dt，J＝1.8Hz，J＝7.5Hz，6H).MS：ESI(正离子谱)：410(M+H)。
实施例4-丁酸1-(2-氨基-5-丁基-4-氧代-3，4，5，6，7，8- 六氢-嘌呤-6-基)-2-丁氧基-丙酯(Bu 3 -BH4)
Figure BPA00001178891800462
以2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(0.2g，0.64mmol)、丁酸酐(1.05ml，6.4mmol)和丁酸(6ml)为原料，按照实施例2描述的方法制备标题化合物，产物为白色固体(0.21g，71％)。1H NMR(CD3OD)δ5.18(dd，J＝2.4Hz，J＝10Hz，1H)，4.98-4.93(m，1H)，4.89-4.87(m，1H)，3.34(s，1H)，3.19(dd，J＝4.4Hz，J＝13.2Hz，1H)，2.62-2.54(m，1H)，2.45-2.39(m，1H)，2.36(t，J＝7.2Hz，2H)，2.10(t，J＝7.5Hz，2H)，1.70-1.47(m，6H)，1.27(d，J＝6.6Hz，3H)，0.98(t，J＝7.4Hz，3H)，0.90-0.85(m，6H).MS：ESI(正离子谱)：452(M+H)。
实施例5-2-氨基-4-甲基-戊酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢- 嘌呤-6-基)-2-羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐(Val-BH4)
Figure BPA00001178891800471
a.)2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁 酯
在氮气保护下于2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(BH4，5g，15.9mmol)的吡啶(75ml)混悬液中加入二碳酸二叔丁酯(5.2g，23.8mmol)。在加入更多量BH4(5g，15.9mmol)和二碳酸二叔丁酯(5.2g，23.8mmol)前搅拌反应液。加入4-(二甲氨基)吡啶(催化量)，在氮气保护下将反应液混合物在室温条件下搅拌反应12小时。减压蒸除溶剂，残留物高真空干燥24小时。将残留物溶于甲醇(150ml)后加入30g MP-碳酸盐(Biotage，3.14mmol/g)。混合物在室温条件下缓慢搅拌12小时。将混合物经硅藻土过滤，滤液减压蒸发得黄色固体，不经进一步纯化直接使用。MS：ESI(正离子谱)：342(M+H)。
b.)6-(1，2-二羟基-丙基)-2-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢 -1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将步骤a)的产品溶于75mL DMF后加入N，N-二甲基甲酰胺二乙基缩醛(13mL，76.2mmol)。混合物在室温下搅拌2小时。高真空减压蒸除溶剂(温度＜50℃)。残留物经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度从0至20％甲醇的二氯甲烷溶液)得产物为浅黄色固体(5.7g，两步总收率为45％)。1HNMR(CD3OD)δ8.53(s，1H)，4.12(dd，J＝4.2Hz，J＝10.5Hz，1H)，3.90(m，1H)，3.77(d，J＝12.6Hz，1H)，3.42(d，J＝10.5Hz，1H)，3.26-3.18(m，1H)，3.15(s，3H)3.07(s，3H)，1.46(s，9H)，1.20(d，J＝6.3Hz，3H).MS：ESI(正离子谱)：397(M+H)。
c.)6-[2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁氧基)-1-羟基-丙基]-2-(二甲基氨基 -亚甲氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
在0℃条件下，边搅拌边向N-Boc-L-缬氨酸(19.12g，88mmol)的二氯甲烷(DCM，40ml)溶液中加入DCC(9.1g，44mmol)的DCM(40ml)溶液。所得溶液搅拌反应1小时后形成白色沉淀。滤除白色固体，滤液在搅拌条件下加入步骤b)产物(4.4g，11mmol)的吡啶(200mL)溶液中。在氮气保护下，将混合物室温搅拌反应12小时。反应液混合物加入甲醇(20ml)淬灭。溶剂减压浓缩，残留物经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度从0至6％甲醇的二氯甲烷溶液)得子标题产物，为浅黄色固体(3.1g，47％收率，经HPLC分析区域异构体混合物比例约为～9∶1)。1H NMR(DMSO-d6)δ10.61(s，1H)，8.38(s，1H)，7.04(d，J＝8.7Hz，1H)，6.78(d，J＝4.5Hz，1H)，5.03(d，J＝3.6Hz，1H)，4.77(d，J＝5.7Hz，1H)，4.04-3.92(m，1H)，3.82-3.72(m，1H)，3.66-3.54(m，1H)，3.09(s，3H)，2.96(s，3H)，2.06-1.80(m，1H)，1.37(s，18H)，1.20(d，J＝6.6Hz，3H)，0.92-0.82(m，1H)，0.77(d，J＝6.6Hz，6H).MS：ESI(正离子谱)：596(M+H)。
d.)2-氨基-6-[2-(2-叔丁氧羰酰氨-3-甲基-丁氧基)-1-羟基-丙基]-4-氧代 -4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将步骤c)所得产物(3.1g，5.15mmol)溶于乙腈(ACN，130ml)，并加入1N HCl(13ml，13mmol)。混合物在室温下搅拌反应至无起始原料剩余(～18h)。加入饱和碳酸氢钠溶液将反应混合物调节至中性。然后减压蒸去溶剂(温度＜40℃)得浅黄色固体。将此固体置于DCM(50ml)中打浆后过滤。滤液浓缩后残留物经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度从0至20％甲醇的二氯甲烷溶液)得子标题产物(1.75g，63％，区域异构体混合物比例约为9∶1)。1HNMR(CD3OD)δ5.10-4.98(m，1H)，4.20-4.10(m，1H)，4.02-3.90(m，1H)，3.72(d，J＝12.3Hz，1H)，3.59(d，J＝9.6Hz，1H)，3.20(dd，J＝4.5Hz，J＝12.9Hz，1H)，2.16-1.96(m，1H)，1.46(s，9H)，1.42(s，9H)，1.30(d，J＝6.6Hz，3H)，0.88(d，J＝6.6Hz，3H)，0.84(d，J＝6.9Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：541(M+H)。
e.)2-氨基-3-甲基-丁酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2- 羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐
将步骤d)所得产品(1.75g，3.24mmol)溶于二氧六环(10ml)后加入4N HCl/二氧六环(80mL，320mmol)。在氮气保护下，将反应液混合物室温搅拌反应2小时。过滤分离产品，在45℃条件下经氮气吹扫的真空箱干燥得1.34g(100％)标题化合物，为白色固体。1H NMR(CD3OD)δ5.11(t，J＝6.6Hz，1H)，4.22(dd，J＝2.4Hz，J＝6.9Hz，1H)，4.02(d，J＝4.5Hz，1H)，3.73(d，J＝11.4Hz，1H)，3.66(s，2H)，3.61-3.57(m，2H)，2.4-2.3(m，1H)，1.43(d，J＝6.3Hz，3H)，1.12-1.05(dd，J＝7.0Hz，J＝12Hz，6H)。MS：ESI(正离子谱)：341(M+H)。
f.)2-氨基-3-甲基-丁酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2- 羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐
作为步骤e)的一种备选方案，在氩气保护下，将步骤c产物(0.5g，0.8mmol)溶于二氧六环(5mL)后加入4N HCl/二氧六环(20mL，80mmol)。室温搅拌15小时后形成白色固体。分离该物质后干燥得0.24g(73％)标题化合物。
实施例6-2-氨基-3-甲基-戊酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8- 六氢-嘌呤-6-基)-2-羟基-1-甲基-乙酯(Ile-BH4)
Figure BPA00001178891800501
a.)6-[2-(2-叔丁氧羰酰氨-3-甲基-戊酰氧基)-1-羟基-丙基]-2-(二甲基氨基 -亚甲氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将实施例5，步骤b)的产物采用与实施例5，步骤)c相同的方法处理，但是其中使用N-Boc-L-异亮氨酸(3.70g，16mmol)，得子标题化合物，为浅黄色固体(0.29g，48％)。色谱纯化后得到的产品仍含有杂质，不经进一步纯化直接用于下一步反应。MS：ESI(正离子谱)：610(M+H)。
b.)2-氨基-6-[2-(2-叔丁氧羰酰氨-3-甲基-戊酰氧基)-1-羟基-丙基]-4-氧代 -4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将步骤a)的产物(0.29g，0.48mmol)采用与实施例5，步骤d)相同的方法进行处理，但是反应的残留物经制备RP-HPLC纯化，得子标题化合物，为类白色固体(0.10g，38％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.83(s，1H)，7.04(d，J＝8.7Hz，1H)，6.68(d，J＝4.8Hz，1H)，5.99(s，2H)，5.05(bs，1H)，4.74(d，J＝6.0Hz，1H)，4.04-3.90(m，1H)，3.88-3.78(m，1H)，3.56(dd，J＝4.8Hz and J＝12.3Hz，1H)，3.48-3.30(m，1H)，3.00(dd，J＝4.2Hz and J＝12.3Hz，1H)，1.78-1.60(m，1H)，1.37(s，18H)，1.18(d，J＝6.3Hz，3H)，1.16-1.00(m，2H)0.77(d，J＝5.4Hz，3H)，0.75(d，J＝5.1Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：555(M+H)。
c.)2-氨基-3-甲基-戊酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2- 羟基-1-甲基-乙酯三氟醋酸盐
将步骤b)所得产物(0.1g，0.18mmol)加入三氟醋酸(2ml，27mmol)的2ml二氯甲烷溶液进行处理。在氮气保护条件下，混合物在室温下搅拌反应1小时。加入20mL乙醚沉淀产物。将产物过滤，经氮气吹扫的真空箱干燥得标题化合物，为白色固体(0.10g，100％)。1H NMR(CD3OD)δ5.11(t，J＝6.6Hz，1H)，4.09-4.07(m，1H)，4.05(d，J＝3.8Hz，1H)，3.60-3.54(m，2H)，3.43-3.38(m，1H)，2.07-2.00(m，1H)，1.51-1.44(m，1H)，1.42(d，J＝6.3Hz，3H)，1.37-1.29(m，1H)，1.06(d，J＝7.0Hz，3H)，0.96(t，J＝7.4Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：355(M+H)。
实施例7-2，6-二氨基-己酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢- 嘌呤-6-基)-2-羟基-1-甲基-乙酯三盐酸盐(Lys-BH4)
a.)6-[2-(2，6-双-叔丁氧羰酰氨-己酰氧基)-1-羟基-丙基]-2-(二甲基氨基- 亚甲氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将实施例5，步骤b)产物采用实施例5，步骤d)描述的相同方法进行处理，其中使用N-Boc-L-赖氨酸-N-Boc(8.26g，23.8mmol)，减压蒸除溶剂后，粗品溶于乙酸乙酯，经1N柠檬酸(2x)、饱和碳酸氢钠(2x)和饱和食盐水相继洗涤。有机相经硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂。粗品经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度0-8％甲醇的二氯甲烷溶液)，得子标题化合物，为浅黄色固体(2.55g，74％)。经色谱纯化后所得产物仍含有杂质，不经进一步纯化直接用于下步反应。1H NMR(CD3OD)δ8.53(s，1H)，5.08-4.96(m，1H)，4.24-4.12(m，1H)，4.10-3.90(m，1H)，3.76(d，J＝12.3Hz，1H)，3.59(d，J＝11.4Hz，1H)，3.28-3.18(m，1H)，3.15(s，3H)，3.08(s，3H)，3.06-2.94(m，2H)，1.56-1.36(m，33H)，1.31(d，J＝6.6Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：725(M+H)。
b.)2-氨基-6-[2-(2，6-双-叔丁氧羰酰氨-己酰氧基)-1-羟基-丙基]-4-氧代 -4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将步骤a)所得产品(2.55g，3.52mmol)采用实施例5步骤d)描述的方法进行处理，但是反应液残留物经制备型RP-HPLC纯化后得子标题化合物，为类白色固体(1.30g，55％)。分析型HPLC显示存在两种区域异构体，两者比例为8∶2。1H NMR(CD3OD)δ5.08-4.96(m，1H)，4.22-4.10(m，1H)，4.10-3.96(m，1H)，3.72(d，J＝12.9Hz，1H)，3.61(d，J＝9.6Hz，1H)，3.28-3.16(m，1H)，3.08-2.94(m，2H)，1.86-1.36(m，33H)，1.30(d，J＝6.6Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：670(M+H)。
c.)2，6-二氨基-己酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2-羟 基-1-甲基-乙酯三盐酸盐
将步骤b)的产物(1.30g，1.94mmol)采用实施例5，步骤e)描述的方法进行处理，得标题化合物，为白色固体(0.93g，100％)。1H NMR(CD3OD)δ5.09-5.04(m，1H)，4.24(dd，J＝2.7Hz，J＝7.2Hz，1H)，4.17(t，J＝6.3Hz，1H)，4.00(t，J＝6.3Hz，1H)，3.74-3.56(m，3H)，2.96(t，J＝7.7Hz，3H)，2.03-1.93(m，3H)，1.76-1.68(m，3H)，1.61-1.51(m，3H)，1.47(d，J＝6.3Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：370(M+H)。
实施例8-4-氨基-4-(1-羧基-乙基氨甲酰基)-丁酸2-(2-氨基-4-氧代 -3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2-羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐
Figure BPA00001178891800521
a.)6-{2-[4-叔丁氧羰酰氨-4-(1-叔丁氧羰基-乙基氨甲酰基)-丁氧基]-1-羟 基-丙基}-2-(二甲基氨基-亚甲氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁 酯
在搅拌下于实施例19，步骤b)产物(0.45g，1.20mmol)的吡啶(10ml)溶液中加入EDC(0.23g，1.20mmol)和DMAP(0.15g，1.20mmol)。在氮气保护下，反应液混合物在室温下搅拌反应2小时，随后加入实施例4，步骤c)所得产物(0.12g，0.30mmol)。混合物继续搅拌48小时。减压蒸除溶剂，残留物经制备型RP-HPLC纯化得子标题化合物，为浅黄色半固体(0.12g，55％)。经色谱纯化后的产物仍含有杂质，不经进一步纯化直接用于下步反应。分析型HPLC显示区域异构体的比例为10∶1。MS：ESI(正离子谱)：753(M+H)。
b.)2-氨基-6-{2-[4-叔丁氧羰酰氨-4-(1-叔丁氧羰基-乙基氨甲酰基)-丁氧 基]-1-羟基-丙基}-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将步骤a)产物(0.12g，0.16mmol)按照实施例5，步骤d)描述的方法进行处理，其中，反应残留物经制备型RP-HPLC纯化后得子标题化合物，为类白色固体(0.048g，44％)。1H NMR(CDCl3)δ9.89(s，1H)，5.71(bd，J＝6.0Hz，2H)，5.08-4.90(m，1H)，4.88-4.68(m，1H)，4.66-4.54(m，1H)，4.32-4.10(m，1H)，4.08-3.96(m，1H)，3.88-3.70(m，2H)，3.36-3.26(m，1H)，2.40-1.76(m，6H)，1.74-1.58(m，1H)，1.56-1.36(m，27H)，1.31(d，J＝6.6Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：698(M+H)。
c.)4-氨基-4-(1-羧基-乙基氨基甲酰基)-丁酸2-(2-氨基-4-氧代 -3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2-羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐
步骤b)产物(0.048g，0.07mmol)经三氟醋酸(1ml，27mmol)的1ml二氯甲烷溶液处理。在氮气保护下，反应液混合物室温搅拌反应2小时。加入20ml乙醚后，产物形成沉淀。产品过滤后经氮气吹扫的真空干燥箱干燥，得标题化合物，为白色固体(0.051g，98％)。1H NMR(CD3OD)δ4.45-4.39(m，2H)，4.23-4.20(m，2H)，3.94(t，J＝6.3Hz，1H)，2.60-2.55(m，2H)，2.49-2.24(m，2H)，2.17-2.12(m，3H)，1.45(dd，J＝7.4Hz，J＝9.7Hz，6H)。MS：ESI(正离子谱)：442(M+H)。
实施例9-吡咯烷基-2-羧酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6- 基)-2-羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐(Pro-BH4)
Figure BPA00001178891800541
a.)吡咯烷基-1，2-二羧酸2-{2-[5-叔丁氧羰基-2-(二甲基氨基-亚甲氨 基)-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基]-2-羟基-1-甲基-乙基}酯1-叔丁基酯
将实施例5，步骤b)的产物采用实施例5，步骤c)描述的方法进行处理，其中采用N-Boc-L-脯氨酸(13.6g，63.1mmol)，得子标题化合物，为棕褐色固体(5.2g，69％)。MS：ESI(正离子谱)：594(M+H)。
b.)吡咯烷基-1，2-二羧酸2-[2-(2-氨基-5-叔丁氧羰基-4-氧代-3，4，5，6，7，8- 六氢-嘌呤-6-基)-2-羟基-1-甲基-乙基]酯1-叔丁基酯
将步骤a)产物(5.2g，8.76mmol)采用实施例5，步骤d)描述的方法进行处理，其中反应液在室温下搅拌24小时，反应残留物经快速柱层析纯化(洗脱梯度从0-14％甲醇的二氯甲烷溶液)，然后采用制备型RP-HPLC分离区域异构体混合物，得子标题化合物，为淡黄色固体(1.5g，32％)。MS：ESI(正离子谱)：539(M+H)。所得另一区域异构体为白色固体(0.6g，13％)。MS：ESI(正离子谱)：539(M+H)。
c.)吡咯烷基-2-二羧酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2- 羟基-1-甲基-乙酯二盐酸盐
步骤b)产物采用实施例5，步骤e)描述的方法进行处理，其中，反应搅拌24小时，得标题化合物，为淡黄色固体(1.2g，90％)。1H NMR(CD3OD)δ5.10(m，1H)，4.48(t，J＝7.9Hz，1H)，4.17(dd，J＝2.2Hz，J＝7.2Hz，1H)，3.73-3.66(m，1H)，3.57-3.55(m，2H)，3.44-3.36(m，3H)，2.51-2.43(m，1H)，2.18-2.05(m，3H)，1.43(d，J＝6.4Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：339(M+H)。
实施例10-2-氨基-3-甲基-丁酸2-(2-氨基-3-甲基-丁氧基)-1-(2-氨基-4-氧代 -3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-丙酪三盐酸盐(Val 2 -BH4)
Figure BPA00001178891800551
a.)6-[1，2-双-(2-叔丁氧羰酰氨-3-甲基-丁氧基)-丙基]-2-(二甲基氨基-亚 甲氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
在0℃条件下于N-Boc-L-缬氨酸(9.08g，41.8mmol)的二氯甲烷(DCM，20ml)溶液中加入DCC(4.3g，20.9g mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液。所得溶液搅拌1小时后形成白色沉淀。滤除白色固体后滤液在搅拌条件下加入到实施例5，步骤b)产物(1.8g，4.54mmol)的吡啶(75ml)溶液中。加入4-(二甲基氨基)吡啶(催化量)，在氩气保护下混合物室温搅拌12小时。将反应液混合物加入甲醇(20ml)淬灭，真空蒸去溶剂。粗品溶于乙酸乙酯，相继用1N柠檬酸(2x)、饱和碳酸氢钠水溶液(2x)和饱和食盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥后减压蒸除溶剂。粗品经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度从0至5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得子标题化合物，为黄色固体(1.6g，45％)。MS：ESI(正离子谱)：795(M+H)。
b.)2-氨基-6-[1，2-双-(2-叔丁氧羰酰氨-3-甲基-丁氧基)-丙基]-4-氧代 -4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
步骤a)产品(1.6g，2.02mmol)溶于乙腈(ACN，50ml)，加入1N HCl(5ml，5mmol)处理。混合物室温搅拌至无初始原料(约20小时)。加入饱和碳酸氢钠溶液调节至中性。真空蒸去溶剂(温度＜40℃)，得棕褐色固体。该固体置于甲醇中打浆后过滤，滤液浓缩至干，残留物经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度0-12％甲醇的二氯甲烷溶液)，得子标题化合物，为棕褐色固体(0.45g，30％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.92(s，1H)，7.34(d，J＝7.5Hz，1H)，6.90(d，J＝8.4Hz，1H)，6.82(s，1H)，6.04(s，2H)，4.92(d，J＝7.8Hz，2H)，4.17(bs，1H)，3.84-3.72(m，2H)，3.25(bs，1H)，2.97(d，J＝8.7Hz，1H)，2.07-1.92(m，2H)，1.41-1.28(m，29H)，0.94(d，J＝6.6Hz，6H)，0.75(d，J＝6.6Hz，3H)，0.71(d，J＝6.9Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：740(M+H)。
c.)2-氨基-3-甲基-丁酸2-(2-氨基-3-甲基-丁氧基)-1-(2-氨基-4-氧代 -3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-丙酯二盐酸盐
在氩气保护下将步骤c)产物(1.0g，1.35mmol)溶于二氧六环(10ml)，加入4N HCl/二氧六环(20ml，80mmol)。反应混合物室温搅拌2小时。过滤分离产物，经经氮气吹扫的真空干燥箱在45℃干燥后得0.78g(100％)标题化合物，为棕褐色固体。1H NMR(CD3OD)δ5.50-5.41(m，2H)，4.10(d，J＝4.2Hz，1H)，4.00(d，J＝4.5Hz，1H)，3.66(s，2H)，3.61-3.55(m，1H)，3.46-3.40(m，1H)，2.42-2.32(m，2H)，1.47(d，J＝6.3Hz，3H)，1.47(d，J＝7.2Hz，3H)，1.09(d，J＝6.9Hz，6H)，1.05(d，J＝6.9Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：440(M+H)。
实施例11-2，6-二氨基-己酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6- 基)-2-(2，6-二氨基-己酰氧基)-1-甲基-乙酯五盐酸盐(Lys 2 -BH4)
Figure BPA00001178891800561
a.)6-[1，2-双-(2，6-双-叔丁氧羰酰氨-己酰氧基)-丙基]-2-(二甲基氨基-亚 甲氨基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将实施例5，步骤b)所得产物采用实施例10，步骤a)描述的方法进行处理，其中使用N-Boc-L-赖氨酸-N-Boc(28.9g，83.5mmol)，得到子标题化合物，为淡黄色固体(3.2g，33％)。1H NMR(CD3OD)δ8.56(s，1H)，7.19(d，J＝6.6Hz，1H)，5.13-5.05(m，2H)，4.40(m，1H)，4.08(m，1H)，3.94(m，2H)，3.43(d，J＝13.5Hz，1H)，3.17(s，3H)，3.09(s，3H)，3.05-2.95(m，4H)，1.82-1.70(m，3H)，1.47-1.39(m，48H)，1.26(m，2H)。MS：ESI(正离子谱)：1054(M+H)。
b.)2-氨基-6-[1，2-双-(2，6-双-叔丁氧羰酰氨-己酰氧基)-丙基]-4-氧代 -4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-羧酸叔丁酯
将步骤a)产物(3.2g，3.03mmol)采用实施例10，步骤b)描述的方法进行处理，得到子标题化合物，为棕褐色固体(1.46g，48％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.92(s，1H)，7.36(d，J＝6.0Hz，1H)，6.99(d，J＝8.1Hz，1H)，6.77-6.73(m，3H)，6.04(s，2H)，4.91(d，J＝8.7Hz，2H)，4.14(bs，1H)，3.87(d，J＝6.9Hz，1H)，3.72(bs，1H)，3.19(bs，1H)，2.97-2.85(m，6H)，1.62(bs，2H)，1.40-1.22(m，58H)。MS：ESI(正离子谱)：999(M+H)。
c.)2，6-二氨基-己酸2-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6- 基)-2-(2，6-二氨基-己酰氧基)-1-甲基-乙酯五盐酸盐
将步骤b)产物(1.46g，1.46mmol)采用实施例10，步骤c)描述的方法进行处理，得到标题化合物，为棕褐色固体(0.99g，68％)。1H NMR(CD3OD)δ5.52-5.48(m，1H)，5.42-5.39(m，1H)，4.32(t，J＝6.2Hz，1H)，4.14(t，J＝6.4Hz，1H)，3.65(s，1H)，3.57-3.50(m，1H)，3.25-3.22(m，1H)，2.98(t，J＝7.8Hz，4H)，2.16-1.89(m，4H)，1.79-1.71(m，4H)，1.61-1.56(m，4H)，1.45(d，J＝6.6Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：498(M+H)。
实施例12-吡咯烷基-2-羧酸1-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6- 基)-2-(吡咯烷基-2-甲酰氧基)-丙酯三盐酸盐(Pro 2 -BH4)
a.)吡咯烷基-1，2-二羧酸2-[2-(2-氨基-5-叔丁氧羰基-2-(二甲基氨基-亚 甲氨基)-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-1-甲基-2-(1-叔丁氧羰基-吡咯烷 基-2-甲酰氧基)-乙基]酯1-叔丁酯
将实施例5，步骤b)的产物采用实施例10，步骤a)描述的方法进行处理，其中使用N-Boc-L-脯氨酸(12.6g，5.87mmol)，得到子标题化合物，为浅黄色固体(3.0g，60％)。MS：ESI(正离子谱)：791(M+H)。
b.)吡咯烷基-1，2-二羧酸2-[2-(2-氨基-5-叔丁氧羰基-4-氧代-3，4，5，6，7，8- 六氢-嘌呤-6-基)-1-甲基-2-(1-叔丁氧羰基-吡咯烷基-2-甲酰氧基)-乙基]酯1- 叔丁酯
将步骤a)产物(3g，3.79mmol)采用实施例10，步骤b)描述的方法进行处理，得到子标题化合物，为棕褐色固体(1.4g，50％)。1H NMR(CD3OD)δ5.19-5.14(m，2H)，4.31(dd，J＝4.4Hz，J＝8.1Hz，2H)，4.09-4.06(m，1H)，3.49-3.44(m，3H)，3.34(m，1H)，3.14(m，1H)，2.30(m，1H)，2.08-1.96(m，4H)，1.89-1.80(m，4H)，1.48(s，27H)，1.42(m，3H)。MS：ESI(正离子谱)：736(M+H)。
c.)吡咯烷基-2-羧酸1-(2-氨基-4-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-嘌呤-6-基)-2-(吡 咯烷基-2-甲酰氧基)-丙酯三盐酸盐
将步骤b)的产物(1.4g，mmol)采用实施例10，步骤c)描述的方法进行处理，得到标题化合物，为深棕褐色固体(0.85g，82％)。1H NMR(CD3OD)δ5.53-5.46(m，2H)，4.62(t，J＝8.4Hz，1H)，4.47(t，J＝8.4Hz，1H)，3.82-3.79(m，1H)，3.65-3.59(m，1H)，3.54-3.32(m，5H)，2.53-2.44(m，2H)，2.31-2.25(m，1H)，2.18-2.07(m，5H)，1.47(d，J＝6.6Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：436(M+H)。
实施例13-2-氨基-5-(2-氨基-3-甲基-丁基)-6-(1，2-二羟基-丙基)- 5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮盐酸盐(N-Val-BH4)
Figure BPA00001178891800591
a.){1-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-甲酰 基]-2-甲基-丙基}-氨基甲酸叔丁酯
在0℃条件下，于N-Boc-L-缬氨酸(4.56g，21mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中搅拌加入DCC(2.17g，10.5mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液。所得溶液搅拌1小时后，形成白色沉淀。滤除白色固体，滤液于搅拌下加入到2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(3.0g，9.55mmol)的吡啶(80mL)溶液中。在氮气保护下，将混合物室温搅拌1.5小时。加入甲醇(20ml)淬灭反应液混合物，减压蒸去溶剂，残留物经制备型RP-HPLC纯化得到子标题化合物，为棕褐色固体(3.2g，76％)。MS：ESI(正离子谱)：441(M+H)。
b.)2-氨基-5-(2-氨基-3-甲基-丁基)-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H- 嘌呤-4-酮盐酸盐
将步骤a)产物(3.13g，7.04mmol)溶于二氧六环(10ml)，加入4NHCl/二氧六环(60ml，240mmol)处理。在氮气保护下，将反应液混合物室温搅拌反应4小时。滤过分离产物，用异丙醇重结晶，真空烘箱45℃干燥，得到1.15g(43％)标题化合物，为棕褐色固体。1H NMR(CD3OD)δ4.64(dd，J＝4.2Hz，J＝10.2Hz，1H)，3.99(d，J＝6.9Hz，1H)，3.92(d，J＝13.2Hz，1H)，3.71(m，1H)，3.45(dd，J＝2.4Hz，J＝10Hz，1H)，3.27(m，1H)，2.17-2.10(m，1H)，1.20(d，J＝6.3Hz，3H)，0.95(dd，J＝4.8Hz，J＝6.9Hz，6H)。MS：ESI(正离子谱)：341(M+H)。
实施例14-2-氨基-5-(2-氨基-3-甲基-戊酰基)-6-(1，2-二羟基-丙基) -5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮盐酸盐(N-Ile-BH4)
Figure BPA00001178891800601
a.){1-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-甲酰 基]-2-甲基-丁基}-氨基甲酸叔丁酯
用实施例13，步骤a)描述的方法制备子标题化合物，其中采用N-Boc-L-异亮氨酸(4.86g，21mmol)。粗品溶于甲醇后经制备型RP-HPLC纯化，得到子标题化合物，为棕褐色固体(3.48g，82％)。MS：ESI(正离子谱)：455(M+H)。
b.)2-氨基-5-(2-氨基-3-甲基-戊酰基)-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢 -1H-嘌呤-4-酮盐酸盐
将步骤a)产物采用实施例13，步骤b)描述的方法进行处理，得到标题化合物，为淡黄色固体(1.67g，56％)。1H NMR(CD3OD)δ4.65(dd，J＝4.2Hz，J＝10.2Hz，1H)，4.04(d，J＝6.6Hz，1H)，3.94(d，J＝12.6Hz，1H)，3.70(m，1H)，3.45(dd，J＝2.4Hz，J＝10Hz，1H)，3.27(m，1H)，1.91-1.85(m，1H)，1.47-1.40(m，1H)，1.21(d，J＝6.3Hz，3H)，1.17-1.11(m，1H)，0.93-0.87(m，6H)。MS：ESI(正离子谱)：355(M+H)。
实施例15-2-氨基-5-(2，6-二氨基-己酰基)-6-(1，2-二羟基-丙基)- 5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(N-Lys-BH4)
Figure BPA00001178891800611
a.){6-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5- 基]-5-叔丁氧羰酰氨-6-氧代-己基}-氨基甲酸叔丁酯
采用实施例13，步骤a)描述的方法制备子标题化合物，其中采用N-Boc-L-赖氨酸-N-Boc(7.28g，21mmol)。粗品溶于甲醇，经制备型RP-HPLC纯化得到子标题化合物，为棕褐色固体(2.16g，40％)。MS：ESI(正离子谱)：570(M+H)。
b.)2-氨基-5-(2，6-二氨基-己酰基)-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H- 嘌呤-4-酮盐酸盐
将步骤a)产物采用实施例13，步骤b)描述的方法进行处理，但无需采用重结晶方法，得标题化合物，为白色固体(1.1g，48％)。1H NMR(CD3OD)δ4.64(dd，J＝4.2Hz，J＝10.2Hz，1H)，4.26(t，J＝6.6Hz，1H)，3.94(d，J＝13Hz，1H)，3.72-3.66(m，1H)，3.46(dd，J＝2.6Hz，J＝10.2Hz，1H)，2.90(t，J＝7.5Hz，2H)，1.86-1.75(m，2H)，1.67-1.59(m，2H)，1.40-1.33(m，2H)，1.20(d，J＝6.6Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：370(M+H)。
实施例16-2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5-(吡咯烷基-2-甲酰基)- 5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(N-Pro-BH4)
a.)2-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5-甲酰 基]-吡咯烷基-1-羧酸叔丁酯
采用实施例13，步骤a)描述的方法制备子标题化合物，但采用N-Boc-L-脯氨酸(4.5g，21mmol)。粗品溶于甲醇后加入MP碳酸盐(Biotage，3.14g/mmol)搅拌，然后经制备型RP-HPLC纯化得到产物，为白色固体(2g，48％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.87(s，1H)，7.00(d，J＝5.4Hz，1H)，6.26(s，2H)，4.87(dd，J＝3.3Hz，J＝8.7Hz，1H)，4.61(d，J＝4.8Hz，1H)，4.31(dd，J＝4.5Hz，J＝10.2Hz，1H)，4.11(d，J＝5.7Hz，1H)，3.62(t，J＝6.0Hz，1H)，3.52(dd，J＝5.7Hz，J＝12.3Hz，1H)，3.26-3.16(m，3H)，2.95(dd，J＝4.8Hz，J＝10Hz，1H)，1.89-1.82(m，1H)，1.65-1.54(m，2H)，1.35(s，10H)，0.97(d，J＝6.3Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：439(M+H)。
b.)2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5-(吡咯烷基-2-甲酰基)-5，6，7，8-四氢-1H- 嘌呤-4-酮二盐酸盐
将步骤a)产物采用实施例13，步骤b)描述的方法进行处理，但无需进行重结晶，得到标题化合物，为白色固体(1.63g，69％)。1H NMR(D2O)δ4.73(t，J＝8.2Hz，1H)，4.58(dd，J＝4.0Hz，J＝10.2Hz，1H)，3.79(d，J＝13Hz，1H)，3.73(dd，J＝2.5Hz，J＝6.4Hz，1H)，3.54(dd，J＝2.5Hz，J＝10.2Hz，1H)，3.43-3.35(m，3H)，2.33-2.24(m，1H)，2.03-1.96(m，2H)，1.83-1.75(m，1H)，1.17(d，J＝6.5Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：339(M+H)。
实施例17-2-氨基-5-丁基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8- 四氢-1H-嘌呤-4-酮(N-Bu-BH4)
Figure BPA00001178891800631
2-氨基-5-丁基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮
以2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(0.5g，1.59mmol)、丁酸酐(0.31ml，1.91mmol)、吡啶(7.5ml)和催化量的4-(二甲基氨基)吡啶为原料，采用实施例5描述的方法制备标题化合物，得到的产物为黄色固体(0.27g，55％)。1H NMR(CD3OD)δ4.62(dd，J＝4.0Hz，J＝10.4Hz，1H)，3.78(m，1H)，3.74(d，J＝12.4Hz，1H)，3.44(dd，J＝2.4Hz，J＝10.4Hz，1H)，3.18(dd，J＝4.8Hz，J＝12.8Hz，1H)，2.56-2.49(m，1H)，1.42-1.34(m，1H)，1.63-1.52(m，2H)，1.15(d，J＝6.8Hz，3H)，0.87(t，J＝7.4Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：312(M+H)。
实施例18-2-{2-氨基-5-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢 -1H-嘌呤-5-基]-5-氧代-戊酰基氨基}-丙酸三氟醋酸盐
Figure BPA00001178891800641
a.)2-{5-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-5- 基]-2-叔丁氧羰酰氨-5-氧代-戊酰基氨基}-丙酸
向2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(0.55g，1.76mmol)与实施例19，步骤b)产物(0.66g，1.76mmol)的DMF悬浮液中，在搅拌条件下加入HOBt水合物(0.24g，1.76mmol)、EDC(0.51g，2.64mmol)和DIPEA(1.1ml，6.17mmol)。在氩气保护下，将混合物室温搅拌16小时。减压蒸除溶剂，残留物粗品经RP-制备型HPLC纯化得到子标题化合物，为白色固体(0.145g，14％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.92(s，1H)，7.99(d，J＝6.6Hz，1H)，6.99(s，1H)，6.77(d，J＝9.3Hz，1H)，6.23(bs，2H)，4.61(d，J＝5.1Hz，1H)，4.36(d，J＝6.3Hz，1H)，4.11-4.06(m，2H)，3.81(m，1H)，3.50(m，2H)，3.21(m，1H)，2.98(m，1H)，2.65(m，2H)，2.22(m，1H)，1.82(m，1H)，1.68(m，1H)，1.36(s，18H)，1.22(d，J＝6.3Hz，3H)，0.95(d，J＝6.3Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：598(M+H)。
b.)2-{2-氨基-5-[2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-1H-嘌 呤-5-基]-5-氧代-戊酰基氨基}-丙酸
将步骤a)产物溶于1∶1 TFA∶DCM，室温搅拌1.5h。真空蒸除溶剂，用少量乙醇溶解残留物。溶液中加入乙酸乙酯直至出现固体沉淀。溶液置于冰箱中存放14小时，过滤分离标题化合物，为白色固体(60mg，56％)。1H NMR(CD3OD)δ4.61(dd，J＝4.2Hz，J＝10.2Hz，1H)，4.39(q，J＝7.2Hz，1H)，3.84(t，J＝6.3Hz，1H)，3.77-3.71(m，2H)，3.45(dd，J＝2.4Hz，J＝10.2Hz，1H)，3.25(dd，J＝4.2Hz，J＝12.6Hz，1H)，3.01-2.93(m，1H)，2.68-2.59(m，1H)，2.18-2.09(m，2H)，1.43(d，J＝7.2Hz，3H)，1.16(d，J＝6.3Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：442(M+H)。
实施例19-4-叔丁氧羰酰氨-4-(1-叔丁氧羰基-乙基氨基甲酰基)-丁酸
Figure BPA00001178891800651
a.)4-叔丁氧羰酰氨-4-(1-叔丁氧羰基-乙基氨基甲酰基)-丁酸9H-芴-9- 基甲基酯
向Boc-D-Glu(OFm)(2.5g，5.88mmol)和HOBt水合物(0.79g，5.88mmol)的DMF(50ml)溶液中于搅拌条件下加入DIPEA(1.1ml，6.46mmol)、H-Ala-OtBu HCl(1.07g，5.88mmol)和EDC(1.69g，8.81mmol)。在氩气保护下将混合物室温搅拌16小时。真空蒸除溶剂，将粗残留物溶于乙酸乙酯，相继用饱和碳酸氢钠溶液(3x)和5％醋酸水溶液(3x)洗涤。有机相经硫酸镁干燥，真空蒸除溶剂。粗品经快速硅胶柱层析纯化(洗脱梯度为0-40％乙酸乙酯的正己烷溶液)，得到标题化合物，为白色固体(2.3g，71％)。1H NMR(CDCl3)δ7.77(d，J＝7.5Hz，2H)，7.60(d，J＝6.9Hz，2H)，7.41(t，J＝7.5Hz，2H)，7.30(t，J＝7.5Hz，2H)，6.69(d，J＝7.2Hz，1H)，5.27(d，J＝7.8Hz，1H)，4.46-4.37(m，3H)，4.22(t，J＝7.2Hz，2H)，2.62-2.54(m，2H)，2.18-2.14(m，1H)，1.96-1.91(m，1H)，1.45(d，J＝7.5Hz，18H)，1.38(d，J＝7.2Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：553(M+H)。
b.)4-叔丁氧羰酰氨-4-(1-叔丁氧羰基-乙基氨基甲酰基)-丁酸
将步骤a)产物(2.3g，4.16mmol)溶于二氯甲烷(17ml)，加入TEA(2.9ml，20.8mmol)处理。混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用DCM稀释后，经1M HCl(2x)洗涤。有机相经硫酸镁干燥，真空蒸除溶剂。粗品于醚中打浆，过滤得标题化合物，为白色固体(0.72g，46％)。1H NMR(CDCl3)δ6.95(d，J＝9.2Hz，1H)，5.40(d，J＝7.5Hz，1H)，4.42(t，J＝6.6Hz，1H)，4.30(d，J＝6.6Hz，1H)，2.52(m，2H)，2.12(m，1H)，1.93(m，1H)，1.45(d，J＝9.2Hz，18H)，1.38(d，J＝7.2Hz，3H)。MS：ESI(正离子谱)：397(M+Na)。
实施例20-2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-4-氧代-4，6，7，8- 四氢-1H-嘌呤-5-羧酸苄酯
在氮气保护下，将2-氨基-6-(1，2-二羟基-丙基)-5，6，7，8-四氢-1H-嘌呤-4-酮二盐酸盐(1.63g，5.2mmol)溶于50mL吡啶。溶液中加入氯甲酸苄基酯(1.93ml，13.5mmol)。将反应液混合物真空脱气后，置于氮气保护下。混合物室温下搅拌12小时。真空蒸除溶剂，残留物经制备型RP-HPLC纯化，得到子标题化合物，为白色固体(0.93g，48％收率)。1H NMR(DMSO-d6)δ10.02(s，1H)，7.41-7.30(m，5H)，6.84(s，1H)，6.12(s，2H)，5.10-4.99(m，2H)，3.93(d，J＝6.0Hz，1H)，3.66(dd，J＝2.4Hz，J＝6.3Hz，1H)，3.56(dd，J＝4.8Hz，J＝12Hz，1H)，3.25(d，J＝10.5Hz，1H)，3.03(dd，J＝4.5Hz，J＝12.4Hz，1H)，1.26(d，J＝6.3Hz，1H)。MS：ESI(正离子谱)：376(M+H)。
在人、大鼠血浆中和模拟胃液中的稳定性研究
在人、大鼠以及模拟胃液中对本说明书中所公开的各化合物的稳定性进行测定。在每一时间点上测定化合物剩余浓度，每一个化合物的测定时间为1小时。实施例2、3、4和20化合物的测定结果如图3(人血浆中稳定性)、图4(大鼠血浆中稳定性)和图5(模拟胃液中稳定性)所示。如图3-5所示，所测定的每一个化合物在各种环境下均表现出高度的稳定性。
BH4类似物的代谢研究
本实施例描述了代谢稳定性的一种测定方法，可用于对BH4类似物与BH4的稳定性进行比较。
将待测化合物(10uM)与小鼠、大鼠和人肝脏微粒体(蛋白浓度为0.5mg/mL)和1mM NADPH在磷酸盐缓冲液中于37℃条件下进行孵育。每次试验重复三次。孵育开始于微粒体的加入，被加入等量甲醇而淬灭。在2至3个时间点上采集样品用于分析(典型的采集时间点为0，30分钟，60分钟)。进行适用的阳性对照和阴性对照孵育。用LC-MS/MS进行待测化合物消失或测定物％转化率的定量测定。
BH4类以物的溶解性
本实施例描述了一种测定溶解性的方法，可用于BH4类似物和BH4的比较。待测物溶于DMSO，在96孔板中，用磷酸盐缓冲食盐水(pH 7.4)(PBS)作系列稀释。化合物稀释后终浓度在1-1000mg/mL之间，且含DMSO量≤1％。室温孵育30分钟后，在实验室系统的浊度计上通过检测光散射情况对沉淀进行测定。通过对每个样品浓度四份样品的NU值(浊度计测量单位)与空白溶剂孔的NU值进行的比较确定溶解性。不溶性的定义为空白校正的NU值显著高于溶剂空白值的浓度。用Student′s t检验计算所得的1％差异性被认为具有显著性。
BH4类似物的通透性
本实施例描述了采用Caco-2单层细胞进行通透性筛选的方法，该方法可用于比较BH4类似物与BH4的通透性。适用于化合物通透性研究的Caco-2细胞单层细胞培养物，在24孔或96孔聚碳酸酯膜插入板上生长21至30日。单层细胞层维持于37℃温度、95％相对湿度、5％CO2中直至生长至汇合。单层细胞层的成熟度与膜的完整性通过跨上皮细胞电阻(TEER)或荧光标记物荧光黄的表观通透性的测定加以确定。
以10mM单一浓度作双份测定，确定系列受试化合物和选定的标记化合物在顶侧至基底侧方向的表观通透性。将待测化合物加入到顶侧孔中开始转运研究，在实验过程中培养板维持在孵育条件下。基底侧孔分别暴露30分钟和60分钟后，采集最终顶侧孔样品并通过LC-MS/MS分析受试化合物含量。根据这些数据计算每一受试化合物的回收及表观通透性。实验中包括了合适的对照以代表单层细胞层的特征。在有和无一种P-gp抑制剂如维拉帕米存在的情况下也同时进行了从基底侧至顶侧的转运试验。
RH4类似物的生物利用度
本实施例描述了BH4类似物与BH4的生物利用度/药代动力学研究概况。药代动力学研究的目的是为研究系统对药物及任何代谢物的暴露情况提供信息。该数据可用于解释药理或毒理学问题，也为毒物代谢动力学研究设计提供帮助。同时还测定药代动力学参数，例如AUC、半衰期、清除率以及分布容积。
本研究的目的是为了评价类似物化合物可能的口服生物利用度，通过统计学近似推断药代动力学参数，并与原型药物BH4所得的相应参数进行比较。为血浆分析开发了一种简便的non-GLP提取和LC-MS/MS分析方法。审视受试化合物的配方及结构信息并推断其在血浆中的稳定性。如果受试化合物在血浆中稳定性较差，根据需要对方法进行改良。研究涉及每一受试化合物采用两种性别的健康大鼠各三只。选用受试化合物的剂量配方为其水、生理盐水、吐温、PEG或类似载体的溶液剂或混悬剂。对于每一受试化合物，三只大鼠在一个时间点上口服灌胃给药，在四个时间点上(第1，2，4，8小时)采集血样。采用LC-UV或LC-MS/MS测定药物的血浆浓度，并绘制出血药浓度-时间曲线。利用WinNonlin(Pharsight Corp.)软件计算药代动力学参数，如Cmax，Tmax，和药时曲线下面积(AUC)。
如采用小鼠替代大鼠进行试验，则每一受试化合物使用12只小鼠。在每一时间点上采集三只小鼠的血样，用每一时间点的平均血药浓度数据计算药代动力学参数。
利用体外代谢数据，也可推算主要代谢物的浓度。体内研究期间采集动物排泄物，并对其所含母体药物和代谢物进行分析，以推算药物消除情况。
采用下列公式计算生物利用度％：
BH4的生物利用度％＝BH4的AUC(口服)/BH4的AUC(静注)x BH4的剂量(IV)/BH4的剂量(口服)
BH4类似物的生物利用度％＝BH4类似物的AUC(口服)/BH4的AUC(静注)x BH4剂量(静注)/BH4类似物的剂量(口服)
BH4类似物的可水解性
本实施例描述了测定BH4类似物(例如化合物I)是否在体内发生水解反应且是否可生成预期产物(包括BH4)并判断水解反应动力学是否合理的方法。
将试验化合物(例如BH4的一种双酯)(50μM)，溶于缓冲液(pH 6.8，20mM NaPhos，150mM NaCl)中，稀释至2mL总体积。加入酯酶(0.1单位，Sigma-Aldrich，羧酸酯酶E.C.3.1.1.1)。在5分钟时间点上，从反应液中采集50μl样品，并用等量氯仿萃取。收集12份氯仿样品后，每一样品独立进样到配备有标准C4色谱柱的HPLC中，以标准乙腈/水/三氟醋酸作梯度洗脱。以被酯化酸作为时间函数，通过比较被酯化酸的纯标准曲线计算被酯化酸的生成量。曲线斜率为反应速率。也可采用配备有C18色谱柱的反相HPLC方法分析水相检测游离BH4。考虑到BH4存在被氧化的倾向，由于在不考虑BH4状态的情况下仍可对被酯化酸进行检测，因此这是一种合适的备选方案。
进入人体或动物血液或组织样品中的BH4酯化衍生物的水解由组织中的内源性酯酶决定，而不选用商品化的酯酶。该方法有助于确定酯在体内所需部位的水解概率。对反应产物的溶剂提取物进行HPLC分析是必要的。
采集人或动物的血清标本，加入0.5M磷酸钠溶液(pH至6.8)稀释血清至总量为20μM。双酯化的BH4衍生物(50uM)溶于pH控制的血清中，加入酯酶(0.1单位)。在5分钟时间点上，从反应溶液中采集50μl样品，并加入同体积氯仿进行萃取。收集氯仿相用于被酯化酸的分析和/或水相用于BH4分析。采集12个样品后，每一样品被进样到以乙腈/水/三氟醋酸作洗脱梯度且配备有标准C4色谱柱的HPLC中进行丁酸分析，或被进样到C18柱中用于BH4分析。以被酯化酸或BH4作为时间函数，通过比较纯标准曲线计算被酯化酸或BH4的生成情况。曲线斜率为反应速率。
BH4类似物百分转化率通过下列公式进行计算：
总生物喋呤中BH4、BH2和B的％BH4类似物＝(总生物喋呤-(BH4+BH2+B)/总生物喋呤)*100
剂量中BH4、BH2和B的％BH4类似物＝(总生物喋呤-(BH4+BH2+B)/剂量)*100
剂量中％BH4类似物＝％BH4类似物/剂量
可用分析样品浓度或AUC值完成上述计算。
BH4类似物对大鼠给药后的药代动力学性质
本实施例描述了大鼠单次口服给药后类似物(化合物I)和BH4的药代动力学性质的比较。
第一组雄性Sprague Dawly SD大鼠(6周龄)禁食条件下灌胃给药单剂量BH4(10和100mg/kg)。第一组雄性Sprague Dawly SD大鼠(6周龄)禁食条件下灌胃给药单剂量化合物I。
对于给予BH4的大鼠，灌胃给药后2小时和1小时血浆中总生物喋呤的最高浓度分别为108ng/ml(即约为内源性水平的3倍)和1227ng/ml(即约为内源性水平的30倍)。其后生物喋呤的消除半衰期(t1/2)约为1.1小时，10mg/kg剂量组动物给药9小时后恢复至内源性水平，100mg/kg剂量组动物给药24小时后恢复至内源性水平。根据扣除静脉注射10mg/kg的内源性水平后所得的药时曲线下面积(AUC)，10和100mg/kg灌胃给药的生物利用度(F)分别为6.8％和11.8％。血浆总生物喋呤中生物喋呤的减少比例(即降解形式的比例)相对稳定(73％-96％)。
采用相似的方法进行BH4类似物的测试和评估。由于其生物利用度提高，AUC与浓度峰值(Cmax)比BH4提高约50％。根据类似物的不同，其生物利用度比BH4至少提高15、20或30％或更高，最高可升高至500％。
BH4类似物在食蟹猴中的药代动力学性质
食蟹猴禁食后经口灌服BH4和BH4类似物(n＝3)，类似物给药量与80mg BH4等效。在给药后25小时内的多个时间点测量BH4(直接给药)或类似物的血浆浓度。PK数据结果如图6所示。下表中也给出了药代动力学数据，其中括号内的数字为标准差。
表.BH4类似物的药代动力学性质及与6R-BH4相比的相对生物利用度a
化合物   AUC0-t(ng*hr/mL)   Cmax(ng/mL)   Tmax(hr)   与6R-BH4比较的相对生物利用度
  BH4   288(15.5)   42.0(12.6)   3.0(0)   nab
  Ex.5   2669(552)   1016(228)   2(0)   9.3(2.1)
  Ex.7   572(148)   82.3(27.2)   2.7(0.6)   2.0(0.5)
  Ex.9   384(214)   61.9(34.8)   2.0(0)   1.3(0.7)
  Ex.10   625(294)   138(123)   1.8(1.3)   2.1(0.9)
  Ex.11   617(336)   115(65.4)   1.5(0.09)   2.1(1.0)
  Ex.12   438(211)   73.6(42.9)   3.0(1.0)   1.5(0.7)
  Ex.13c   13.7   2.2   6.0   0.045
  Ex.14   63.2(25.6)   5.2(2.1)   12.1(11.9)   0.22(0.10)
  Ex.15   36.8(37.6)   5.7(1.7)   12.0(10.4)   0.13(0.14)
  Ex.16   88.1(31.5)   7.6(2.7)   6.0(0)   0.31(0.12)
a-测量值为总生物喋呤值
b-不适用
c-n＝2
此前研究表明BH4类似物给药后所测定的BH4生物利用度高于6R-BH4，尤其是实施例5化合物在总生物喋呤上更是如此。本研究按照不完全拉丁方设计，雄性食蟹猴接受BH4母体或BH4类似物的单次静脉注射或口服剂量给药，以确定BH4的药代动力学性质与相对生物利用度。
六只雄性成年食蟹猴给药前禁食过夜且在给药后禁食约4小时。根据每个给药日所记录到的动物体重计算动物的个体化给药剂量。根据不完全拉丁方设计对食蟹猴的五个实验组进行评价：实验组1-2mg/kg BH4静脉注射；实验组2-40mg/kg口服灌胃；实验组3-2mg/kg BH4类似物静脉注射；实验组4-5mg/kg BH4类似物口服灌胃；实验组5-20mg/kg BH4类似物口服灌胃。按照BH4的mg/kg等效剂量确定BH4类似物给药剂量(根据BH4和BH4类似物双盐酸盐分子量计算)。为便于进行统计学分析，选用不完全拉丁方设计以降低动物之间个体差异性对剂量贯序效应的影响。食蟹猴分别接受其个体化BH4静注给药、(2mL/kg，溶于含100μM坏血酸与5％甘露醇的灭菌注射用水中，SWFI)，实施例5化合物静注给药(2mL/kg，溶于含100μM抗坏血酸与5％甘露醇的pH 3柠檬酸缓冲溶液中)或者BH4或实施例5化合物的口服灌胃(4mg/kg，溶于含100μM抗坏血酸的灭菌注射用水中)。临用前采用0.22微米注射滤器(Millex GS或GV；Millipore)将所有静注给药制剂过滤到最终给药器具中。
接受静脉注射给药的每个动物在给药前及给药后第0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，18和24小时采集血样(约1mL)。口服给药的每个动物在给药前及给药后第0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，18和24小时采集血样(约1mL)。将采集到的血液标本置于含有K2-EDTA抗凝剂的试管中，维持于振摇状态，离心获取血浆。离心操作在血液标本采集30分钟内开始。离心后将每一血浆标本采集三份，每分100-μL等份标本，立即转移至含0.1％(w/v)二硫赤藓糖醇(DTE)的各个样品管中贮藏。一旦加入血浆标本，每个样品管即进行涡旋混匀，然后立即贮藏在干冰上。
所得PK数据如下表所示，表中的括号内数字表示标准差。PK数据也同时如图7-15所示。
表：根据食蟹猴静注6R-BH4数据得到的6R-BH4和BH4类似物
(实施例5化合物)的口服生物利用度a
Figure BPA00001178891800731
a-n＝6
b-按照BH4的mg/kg等效剂量确定BH4类似物给药剂量(根据BH4和BH4类似物双盐酸盐分子量计算)
c-不适用
根据食蟹猴血浆中总生物喋呤测量结果，6R-BH4、Val-BH4(5mg/kg)和Val-BH4(20mg/kg)的绝对生物利用度分别为8.2、40.7和25.6％；与6R-BH4的相对生物利用度分别为5.7和3.6。根据BH4测定结果，三种给药的绝对生物利用度分别为9.8，19.7和14.0％，相对生物利用度分别为2.3和1.7。总生物喋呤测定可包括Val-BH4，Val-BH2，Val-B，BH4，BH2和B。
表：食蟹猴灌胃给药后保留在循环系统中的BH4类似物
(实施例5化合物，Val-BH4)的百分比％a
剂量b(mg/kg) Val-BH4/BH4(％)   Val-BH4/(BH4+BH2+B)(％)   Val-BH4/总生物喋呤c(％)
  5mg/kg   56.3(25.2)   36.4(16.0)   23.5(5.6)
  20mg/kg   81.0(18.1)   51.6(11.6)   40.7(11.1)
a-n＝6，从AUC0-t测得
b-按照BH4的mg/kg等效量确定BH4类似物(实施例5化合物)的剂量(用BH4和BH4类似物双盐酸盐分子量计算)。
c-总生物喋呤根据BH4类似物进行调整。
表：BH4类似物(实施例5化合物)在食蟹猴中的绝对生物利用度a
  剂量，mg/kgb   绝对生物利用度(％)
  5   36.2(26.3)
  20   33.2(29.2)
a-n＝6
b-按照BH4的mg/kg等效量确定BH4类似物的剂量(根据BH4和BH4类似物双盐酸盐分子量计算)。
5mg/kg以及20mg/kg剂量的Val-BH4灌胃给药后，保留在系统循环中的Val-BH4的百分比按照Val-BH4调整的总生物喋呤测量值增加23.5±5.6％。食蟹猴口服5mg/kg和20mg/kg的绝对生物利用度分别为36％和33％。
表：静脉注射6R-BH4和BH4类似物(5mg/kg)
在食蟹猴中的药代动力学性质a
药物 AUC0-t(mM*hr) AUCinf(nM*hr) Tmax(hr) Cmax(nM) t1/2(hr) Vz(L/kg) Vdss(L/kg)   CL(L*hr/kg)
6R-BH4   6762(1224)   6955(1203)   0.11(0.07)   7053(1599)   2.3(0.8) 3.1(1.2)   2.0(0.8) 0.9(0.1)
Val-BH4   4166(3484)   5241(4983) 0.08(0)   13055(10414)   1.50(2.07)   6.35(8.43)   3.78(6.35)   2.48(1.76)
a-n＝6
表：静脉注射6R-BH4和BH4类似物(5mg/kg)
在食蟹猴中的药代动力学性质a
药物   剂量b(mg/kg)   AUC0-t(nM*hr)   AUCinf(nM*hr)   Tmax(hr)   Cmax(nM)   t1/2(hr)
6R-BH4 40   11944(4602)   13361(5353)   3.7(1.4)   2328(1182)   5.9(4.9)
Val-BH4 5   1671(534)   1734(457)   1.0(0.5)   1140(580)   5.2(8.2)c
Val-BH4 20   7235(1956)   7596(2386)   1.2(0.4)   2903(267)   9.1(20)c
a-n＝6
b-按照BH4的mg/kg等效量确定BH4类似物的剂量(根据BH4和BH4类似物双盐酸盐分子量计算)。
c-t1/2指标的巨大差异可能与动物个体所测量的t1/2，α和t1/2，β有关，但是在绝大多数动物尚无足够t1/2，β测量数据。
2mg/kg剂量静脉注射给药后，Val-BH4与6R-BH4的药代动力学研究结果表明，Val-BH4的Cmax均值更高，而6R-BH4的AUC均值更高且t1/2略长。Val-BH4的Cmax较高可能是与肠壁细胞对药物的主动转运有关。而Val-BH4的AUC值较低则可能与其更快的组织分布有关。Val-BH4与6R-BH4口服给药后的药代动力学研究表明6R-BH4达到Cmax的时间较长且t1/2较长。
上述生物利用度数据表明5mg/kg剂量的Val-BH4口服给药后动物对BH4的系统暴露以总生物嘌呤计为6R-BH4的六倍。而Val-BH4口服给药后动物对BH4的系统暴露以BH4计则比6R-BH4大两倍。该数据也表明血浆中存在较高浓度的Val-BH4，且绝对生物利用度约为33-36％。
图7-11显示了在五种剂量情况下血浆中的PK数据：BH4或BH4类似物(2mg/kg，IV)，BH4(40mg/kg，口服)，BH4类似物(5mg/kg或20mg/kg，口服)。BH4以40mg/kg剂量灌胃后，可检测到比BH2及生物喋呤更高的BH4剂量，但是BH4、BH2与B的Tmax值相同(图8)。BH4类似物(实施例5化合物)5mg/kg口服剂量后，类似物可在约4小时内迅速吸收并快速分布(图10)。且BH4给药后的血药浓度达峰时间Tmax晚于BH2与生物喋呤，这表明BH2可经Val-BH2生成。
在比较口服BH4(为便于比较调整为5mg/kg)及BH4类似物(5和20mg/kg)在生成BH4浓度的差异后，BH4类似物给药后在血浆中可检测到比BH4本身给药后更高的BH4浓度(图12)。
图13显示了BH4及BH4类似物(与2mg/kg的BH4等效)静注给药后对数值的比较结果。图14比较了BH4和BH4类似物静脉注射给药后所生成的BH4值，而图15也包括BH2和生物喋呤。有趣的是，BH4类似物静脉注射后产生的BH4及BH2和生物喋呤的浓度远低于BH4给药后的浓度。该结果似乎提示，首过代谢的是产生生物转化的主要机制，且血液中酯酶活性较弱。
不受任何特殊理论的束缚，假定通过首过代谢完成的生物转化可能是主要的机制。生物利用度数据表明以5mg/kg的剂量口服Val-BH4后，对BH4以及总生物蝶呤的系统暴露值分别比6R-BH4高2倍和6倍。数据也表明血浆中存在高浓度的Val-BH4，其绝对生物利用度约为33至36％。
BH4类似物在胃肠道的吸收
在一项双盲交叉研究中对人胃肠道吸收情况进行评价。
除特别指明外，受试者在禁食10小时后分别接受1、5和10mg/kg剂量的四氢生物喋呤(BH4)或BH4类似物。研究中受试者分别接受BH4或BH4类似物。给药后0，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24，48，72，96，120，144小时采集血样在肝素化小管中。在单剂量给药及相对生物利用度的研究中，给药后0.25，0.75以及1.5小时采集血浆样本，测定总生物喋呤量以便对BH4或BH4类似物的胃肠道吸收部位进行评估。
受试者分别接受剂量为1，5和10mg/kg的BH4或BH4类似物口服或静脉注射，随后按顺序测定血浆总生物喋呤浓度，根据血浆总生物喋呤增加值(ΔCp)-时间曲线(ΔAUC)下面积测定BH4或BH4类似物在胃肠道中的吸收率。为实现与BH4口服给药相同水平的生物利用度，静脉注射所需的BH4剂量较低。例如，为实现1mg/kg剂量静脉注射给药相同水平的生物利用度，口服给药的BH4给药剂量可能需要达到10mg/kg。由于BH4类似物有助于改善生物利用度，为实现1mg/kg剂量静脉注射给药相同水平的生物利用度，BH4类似物的口服剂量可能只需2.5mg/kg。
根据血浆总生物喋呤增加值(ΔCp)-时间曲线下面积(ΔAUC)，按照下式估算在BH4或BH4类似物给药后胃肠道中BH4或BH4类似物的吸收率：
吸收率(％)＝(口服给药后ΔAUC/静注给药后ΔAUC)
                     X
      (静注给药剂量/口服给药剂量x100)
某些BH4类似物可能需要在更长周期内释出活性BH4。因此只测量血液中游离或释出的BH4水平可能无法准确反映出治疗有效的BH4总量。因此，为了准确或更为精确地确定血液中BH4水平以便评价生物利用度及比较类似物和BH4的生物利用度，有必要测定类似物与BH4的总浓度。
BH4代谢物的测定
生物喋呤测定：按照Fukishima等(Anal.Biochem.102：176(1980))的方法测定血浆、血液以及其他组织中的总生物蝶呤与氧化生物蝶呤的浓度。生物喋呤含有四种不同的类型，包括两种还原态喋呤，R-四氢生物喋呤(BH4)和醌型R-二氢生物喋呤(q-BH2)；以及两种氧化态生物喋呤，二氢生物喋呤(BH2)和生物喋呤(BP)。在所有这些类型的喋呤中，只有还原态的生物喋呤具有辅酶活性。还原态生物喋呤在酸性条件下发生碘化反应转化成BP，而在碱性条件下则转化成为喋呤。氧化态喋呤在酸性和碱性条件下都可发生碘化反应转化成为BP。利用喋呤类的这一性质，总生物蝶呤量可在酸性条件下进行碘化反应后测定，而氧化型喋呤则可在碱性条件下通过碘化反应测定，故而可以通过上述两者测量值的差值计算还原态的生物蝶呤量。当作为辅酶使用时，BH4转化为q-BH2。而q-BH2可通过二氢喋呤还原酶立刻转化成为BH4，或q-BH2在不被还原的情况下可被氧化成为BH2或DHPT。由于生物喋呤在体内难以以q-BH2的形式存在，还原态生物喋呤测定可用BH4替代。
采集到的血浆及全血标本在酸性氧化性溶液(含0.6％碘化钾(KI)，0.3％碘(I2)和0.6N三氯醋酸(TCA)的0.6N盐酸溶液)及碱性氧化性溶液(0.7N氢氧化钠(NaOH))中可被立刻氧化。BP通过HPLC法测定，而放射活性则用液闪计数器测定。
BH4通过配备有串联质谱(LC/MS/MS)的反相HPLC(RP)测定。反相高效液相色谱(RP)与串联质谱(LC/MS/MS)联用已被证明对人体血浆中的BH4具有选择性，其对BH4测定的灵敏度范围为5-1000ng/mL。因标本在采集与贮藏过程中BH4可被氧化，该方法过程中约有50％的BH4被转化。样品可在含有乙二胺四乙酸二钾盐(K2EDTA)的血浆中稳定保存超过3个月。预处理步骤的回收率约为75％。测定本方法准确度和精密度，其变异系数(CV)％低于15％(在定量下限为20％，LLOQ)。
反相高效液相色谱(RP)与串联质谱(LC/MS/MS)联用已被证实在BH4试验物质检测上优于单独使用的HPLC，其优势在于：(1)增加对检测药物-BH4的选择性(而HPLC只测定总生物蝶呤)；(2)定量范围更广；(3)明确的转化率；(4)在人类受试者上经广泛的鉴定和功效的验证；(5)适合多种物种和基质的新型有用的检测方法。
改良方法包括以下步骤：将血液、血浆、组织匀浆或尿液的样品在酸性或碱性条件下氧化。酸性条件下氧化处理后，(1)样品经氯化钾(KCl)、盐酸(HCl)或三氯醋酸处理1小时；(2)然后将酸性氧化的样品使用碘量法标定；(3)样品通过一根离子交换柱处理；(4)利用HPLC和串联质谱联用技术测定包括BH4、q-BH2(由于q-BH2在体内可被迅速氧化成为喋呤，因此主要根据BH4测定还原型生物喋呤)、BH2和BP在内的总生物喋呤。在碱性氧化条件下，(1)样品经KI，I2或NaOH处理1小时；(2)随后将碱氧化样品用盐酸或三氯醋酸酸化处理；(3)使用碘量法标定；(4)样品通过一根离子交换柱处理；(5)测量包括BH2和BP在内的氧化型喋呤；(6)采用HPLC和串联质谱对不同种类进行测定；(7)计算总生物喋呤量与氧化型喋呤之间的差值确定还原型生物喋呤的量(BH4+q-BH2)。
图1和2提供了生物蝶呤测定方法流程图及其方法学验证概要
测定方法优化
配备有电化学检测(ECD)和荧光(FL)检测器的HPLC方法在多种独立的生物喋呤化合物(BH4，BH2和B)及类似物如前药和同型物(如Val-BH4，Val-BH2和Val-B)的检测中具有优势。
经初步反相HPLC分离后，经ECD和FL检测器测定不同生物喋呤(BH4，BH2和B)及Val-生物喋呤的浓度。BH4和Val-BH4通过ECD检测器测定，其中BH4和Val-BH4被电极1氧化成为醌型二氢生物喋呤形式(分别为qBH2或Val-qBH2)，这是一种短暂存在的二氢生物喋呤中间体，随后在电极2处被还原成BH4或Val-BH4。检测器利用该还原反应产生的电流，分别测定BH4或Val-BH4的浓度。BH2，Val-BH2，B和Val-B则使用荧光检测器测定。BH2和Val-BH2的柱后氧化在控制保护室中完成，在最适电位下分别将BH2和Val-BH2氧化成为B和Val-B。BH2(及其它种类)通过柱后氧化步骤氧化成为生物蝶呤(B)。由于BH2既不具有荧光活性又不易被测定，必须转化为用荧光法容易检测的生物蝶呤，因此这种氧化方法是可取的。综上所述，这些方法可用于六种物质(BH4，BH2，B，Val-BH4，Val-BH2，和Val-B)的测定。在一个实施方式中，采用含10％甲醇的流动相测定生物喋呤类似物，如缬氨酸生物喋呤衍生物；而生物喋呤类则可用含2％甲醇的流动相测定。
因此，含多种生物喋呤的混合物中的生物喋呤的检测方法包括(a)通过反相HPLC方法分离混合物中的生物喋呤类，但是对于BH4及其类似物；(b1)使用电化学检测，用初级电极将BH4及其类似物氧化成为醌型二氢喋呤，随后用次级电极将醌型还原成BH4及其类似物，或Val-BH4。测定该还原反应产生的电流，从而测定各种生物喋呤的浓度；和/或(b2)对于BH2及其类似物、生物喋呤或其类似物，可在将BH2类经柱后氧化成为生物喋呤后进行荧光检测。
采用这种方法可对缓冲液中的实施例5化合物进行检测并提取。使用该方法测定食蟹猴在给予实施例5化合物后BH4，BH2和B，数据结果表明生物利用度明显改善(见图16)。在图16中，约5分钟出现BH4的特征峰，且在该5分钟出峰的峰高是食蟹猴接受BH4给药时观察到的数倍。峰高与峰面积代表了化合物浓度。使用含10％甲醇流动相的检测方法还观察到食蟹猴给药后2小时实施例5化合物的出峰情况。
BH4类似物对一氧化氮生成的影响
培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用墨喋呤还原酶抑制剂N-乙酰五羟色胺(NAS)3mM进行预处理。抑制该通路一般可导致内源性BH4的丢失，内源性eNOS活性下降至远低于正常值，这为eNOS活性恢复性试验提供了一种测定方法。
因此，将接近汇合的HUVECs细胞接种到24孔板上，在EGM2培养基(完全培养基)中培养过夜。第二日上午在培养板的孔中添加新鲜培养基(300μL/孔)和墨喋呤还原酶(内源性BH4合成通路的组成部分)抑制剂N-乙酰五羟色胺(NAS)3mM，以抑制内源性BH4水平。孵育1.5小时后，于培养孔中分别加入50、100或200mM BH4，或实施例5、实施例6、实施例7或实施例9的化合物。维持细胞与BH4或实施例5、实施例6、实施例7或实施例9的化合物反应5-22小时。加入硝酸还原酶处理后，进行Griess反应，测量NO的生成作为总量(亚硝酸盐+硝酸盐)的变化值。将90μL反应混合物(25mM Tris-HCL，pH7.4，1μM FAD，1μM FMN，100μM L-精氨酸，2.5mM CaCl2，1mM NADPH，0.04mg/ml钙调素)与5μl eNOS(15单位/ml)和5μl BH4或BH4类似物(1，10，100μM)混合后，在37℃水浴中孵育90分钟。然后，在每一反应液中加入100μl水和20μl亚硝酸盐荧光探针DAN(2，3-二氨基萘，316μM)，并在室温条件下孵育10分钟。染料DAN可与亚硝酸盐发生反应生成荧光产物萘酚三唑。加入10μl NaOH(2.8M)终止反应，用激发频率为375nm、发射频率为415nm的荧光检测器读取样品的荧光。BH4或实施例5、实施例7或实施例9的化合物中硝酸盐+亚硝酸盐百分比如图17(5小时后)、图18(17小时后)及图19(22小时后)所示。实施例6的结果如图20(5小时后)和图21(20小时后)所示。
于NAS-处理细胞中加入实施例化合物5，6，7或9的化合物以剂量依赖性的方式增加NO的生成。此外，细胞经实施例5化合物处理后产生约60-80％的BH4效应，这表明类似物可在细胞内去酯化生成活性BH4。实施例6、7和9的化合物对NAS-处理细胞的作用相似或略差。
实施例5化合物表现出预期的体外药理活性(在培养的内皮细胞中刺激内皮一氧化氮合成酶生成亚硝酸盐)，在此细胞培养体系中产生约60％至80％游离BH4的效应。在暴露5小时或22小时后类似物与游离BH4表现出相似的趋势；但是暴露22小时后则两者略有差异。这些结果表明内皮细胞中含有可辅助产生游离的活化BH4的酯酶。
在从各纯化成分重建的无细胞测定系统上也测试了BH4类似物与游离BH4相比在刺激eNOS活性上的效应。将90μL反应混合物(25mMTris-HCL，pH7.4，1μM FAD，1μM FMN，100μM L-精氨酸，2.5mM CaCl2，1mM NADPH，0.04mg/ml钙调素)与5μl eNOS(15单位/ml)和5μl BH4或BH4类似物(1、10、100μM)混合后，在37℃水浴中孵育90分钟。然后于每一反应液中加入100μl水和20μl硝酸盐荧光探针DAN(2，3-二氨基萘，316μM)，在室温下孵育10分钟。染料DAN与亚硝酸盐发生反应生成荧光产物萘酚三唑。然后，加入10μl NaOH(2.8M)终止反应，用激发频率为375nm、发射频率为415nm的荧光检测器读取样品的荧光。
与作为阴性对照的6S-BH4(生物活性较差的BH4相关异构体)相似，实施例5化合物(val-BH4)经无细胞纯化成份检测系统测定并不能显著增强eNOS活性(见图22)。BH4以剂量依赖性方式增强eNOS的活性。由于实施例5化合物可增强培养的内皮细胞的eNOS活性，该结果表明实施例5化合物是一种需细胞处理(例如去酯化反应)后生效的类似物，即实施例5可作为一种前药发挥作用。
对BH4的赖氨酸(实施例7)、脯氨酸(实施例9)和异亮氨酸(实施例6)酯也进行了二次无细胞测定，检测结果如图23所示。赖氨酸酯与脯氨酸酯对eNOS活性具有微弱的作用，但是这些效应与BH4的效应不具有可比性。两种可能的解释如下：在酯类样品中存在的杂质如少量游离BH4可引起少量eNOS活性增强作用；赖氨酸酯或脯氨酸酯的立体结构允许其分子结构中的BH4部分与eNOS活性部位发生程度轻微的相互作用。
BH4类似物的抗高血压作用
此前的研究中，已证实以10，100和500mg/kg/日剂量灌胃给药两周后，BH4可降低自发性高血压大鼠(SHR)的血压。本研究目的在于确定BH4类似物是否具有相似的降压作用以及血浆中BH4的稳态药代动力学(PK)性质。
开始试验前七日，将雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和SHR大鼠(Elevage Janvier，France，7周龄)饲养在昼夜节律颠倒(10:00/22:00)但自由进食标准饲料和饮水的场所。驯化一周后，接下来一周内采用尾套管法系统对实验动物进行训练(三次)。接下来一周测量两次血压基线值。
在21日给药期内，(10周龄)大鼠每日一次分别接受水、赋形剂、BH4类似物(实施例5，Val-BH4)2、10或30mg/kg/日或BH4 100mg/kg/日灌胃给药(8mL/kg，溶于100μM抗坏血酸)。根据BH4的mg/kg等效量配制BH4类似物的剂量(用BH4和BH4类似物双盐酸盐分子量进行计算)。每周测量动物体重三次，用最近测得的动物体重调整药物及赋形剂的日摄入量。共对7个大鼠试验组进行了评价：第1组-血压正常的WKY大鼠，水灌胃；第2组-高血压SHR大鼠，水灌胃；第3组-高血压SHR大鼠，赋形剂灌胃；第4组-高血压SHR大鼠，100mg/kg/日剂量的BH4灌胃给药；第5组-高血压SHR大鼠，2mg/kg/日剂量的BH4类似物灌胃给药；第6组-高血压SHR大鼠，10mg/kg/日剂量的BH4类似物灌胃给药；第7组-高血压SHR大鼠，30mg/kg/日剂量的BH4类似物灌胃给药。考虑到实验处理期间出现动物丢失或动物不合格，每组使用10只大鼠，期望获得至少8只大鼠可解释的结果。在3周给药期内每周测量动物的收缩压(SBP)和心率(HR)两次。
采用尾套法测定收缩压(SBP)和心率(HR)，动物在给药前测量两次，3周给药期内每周测量两次(给药期内共测定6次)。大鼠被置于塑料限制容器中并加热至20-30℃，其尾部与气动脉冲感应器相连接。套带膨胀后，测量SBP数据，并通过每分钟记录脉冲数测量心率。在每测定一次血压过程中，需要完成至少10次套带膨胀操作。
每组大鼠的体重测量值如图24所示。所有给药均未造成动物体重发生变化。图25显示灌胃给予水的SHR组与对照WKY组动物的收缩压(SBP)。SHR大鼠的收缩压显著高于对照WKY大鼠。图26显示水灌胃与赋形剂灌胃的SHR大鼠的SBP值。赋形剂对SHR大鼠的收缩压无明显影响。图27显示给予赋形剂与给予6R-BH4(100mg/kg/日)的SHR大鼠的收缩压。给药三周后，6R-BH4可降低收缩压约8.4mmHg。图28-30显示实施例5化合物在2，10和30mg/kg/日给药剂量下分别对SHR大鼠收缩压的效应。每日给予实施例5化合物(Val-BH4)在以2，10和30mg/kg/日剂量给药三周后，产生剂量依赖性的收缩压降低，分别降低6.8、13.9和13.7mmHg。图31显示6R-BH4在100mg/kg/日给药剂量下与实施例5化合物(Val-BH4)在10mg/kg/日给药剂量下对SHR大鼠收缩压的影响结果比较。三周给药期内，每日给予实施例5化合物(10mg/kg/日)与十倍于其给药剂量的BH4(100mg/kg)产生相同程度的降压收缩压效果。
12只动物的亚组(每组三只动物，年龄在13.5-14.5周之间)，按四个组在给药4-5周后达到稳态时接受终末次灌胃给药以作药代动力学评估：组1-高血压SHR大鼠，BH4，100mg/kg/日，灌胃给药；组2-高血压SHR大鼠，BH4类似物，2mg/kg/日，灌胃给药；组3-高血压SHR大鼠，BH4类似物，10mg/kg/日，灌胃给药；组4-高血压SHR大鼠，BH4类似物，30mg/kg/日，灌胃给药。给药前(第-3日至第-1日)，灌胃前一小时在相似的时间采集用于药代动力学评估的12只动物及不用于PK评估的32只大鼠的血样以测定血浆BH4水平。在下列每一个时间点(给药前及灌胃后第0.5，1，2，4，6，8和12小时)，在异氟烷麻醉下，从大鼠尾静脉采集约250μL全血。血液样品采集到含有EDTA钾的微型管中。随后在4℃及8000RPM下离心5分钟。将两等份45μL的血浆转移至含10mM DTE的PBS溶液5μL的两个冷却的新微型管中，混匀。将样品用液氮速冻并贮藏于-80℃直至进行分析。
上述所引用的所有出版物，其相关内容均纳入本说明书作为参考文。任何出版物的引用均不能解释为其构成本发明公开内容的现有技术。
前面的叙述仅仅是为了理解更加清楚，不应理解为不必要的限制，因为在本发明范围内进行修改对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

Claims (21)

1.具有如下式所示结构的化合物
Figure FDA00002039142800011
或其药学上可接受的盐。
2.一种组合物，包含权利要求1所述化合物和药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述载体是稀释剂。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物适合口服给药。
5.如权利要求2-4之一所述的组合物，其性状为固体。
6.如权利要求2-4之一所述的组合物，其性状为液体。
7.权利要求1所述化合物或权利要求2-6之一所述组合物用于制备治疗BH4反应性疾病的药物上的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述BH4反应性疾病选自血管疾病和代谢综合征。
9.如权利要求7所述的应用，其中BH4反应性疾病选自高血压，外周动脉疾病，严重肢体缺血，心力衰竭，动脉粥样硬化，内皮功能障碍，II型糖尿病，糖尿病性视网膜病变，与I型糖尿病相关的血管内皮功能障碍以及糖尿病肾病。
10.如权利要求7所述的应用，其中BH4反应性疾病为间歇性跛行。
11.如权利要求7所述的应用，其中所述BH4反应性疾病选自冠状动脉疾病，伴有高胆固醇血症的血管疾病，与吸烟有关的血管疾病，顽固或失控性高血压，肺动脉高压，脑卒中，心肌梗死，缺血再灌注损伤，充血性心脏衰竭，移植后血管损伤，血管痉挛和血栓病。
12.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述BH4反应性疾病选自特发性肺动脉高压，新生儿肺动脉高压（PPHN），脑卒中后血管痉挛，移植后缺血再灌注损伤，血栓形成和血凝。
13.如权利要求7所述的应用，其中所述BH4反应性疾病为与溶血性或镰状细胞性贫血有关的溶血性贫血。
14.如权利要求7所述的应用，其中所述BH4反应性疾病为神经精神障碍。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述神经精神障碍为选自帕金森氏症、多动症、双相情感障碍、孤独症、忧郁症和肌张力障碍的疾病。
16.如权利要求14所述的应用，其中所述BH4反应性疾病为与BH4缺乏有关的神经精神障碍。
17.如权利要求14所述的应用，其中所述BH4反应性疾病为酪氨酸羟化酶功能或色氨酸羟化酶功能低下有关的神经精神障碍。
18.如权利要求17所述的应用，其中治疗有效量的权利要求1所述的化合物提高酪氨酸羟化酶功能或色氨酸羟化酶功能。
19.如权利要求7所述的应用，其中所述BH4反应性疾病为与高血压、高脂血症、体重指数增加、胰岛素抵抗或其结合有关的代谢综合征。
20.如权利要求7所述的应用，其中所述BH4反应性疾病为高苯丙氨酸血症。
21.如权利要求20所述的应用，其中所述高苯丙氨酸血症选自轻度苯丙酮尿症，典型苯丙酮尿症，严重苯丙酮尿症，与BH4缺乏有关的苯丙氨酸血症，伴有肝脏疾病的高苯丙氨酸血症，伴有疟疾的高苯丙氨酸血症所组成的疾病类型。
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