CN101968471A - 高效液相色谱法分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准曲线法对2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐样品的纯度进行了分析，经方法的回收率与精密度试验测试，该分析结果准确可靠。本发明的优点为：色谱柱和检测器采用常见的C18柱和紫外检测器，且色谱条件容易实现，普适性强。该色谱条件下，样品稳定性强，分析结果的重现性好，经方法验证表明该分析方法的准确度和精密度高。

Description

高效液相色谱法分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法
技术领域
本发明涉及一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，具体为以高效液相色谱法分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，属于医药中间体的分析领域。
背景技术
2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐（以下简称为硫酸盐）是合成广谱抗病毒药阿昔洛韦(acyclovir)及抗贫血药叶酸(folic acid)的重要中间体， 但一直以来其样品的分析方法却未见有文献报道。目前国内亦有少数企业开始合成该中间体，但由于缺少统一的分析方法，故难以对该产品进行质量监控。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，以填补现有技术的空白。
本发明的技术方案可以通过以下技术方案来实现。
一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准曲线法对2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐样品的纯度进行了分析，经方法的回收率与精密度试验测试，该分析结果准确可靠。
其具体步骤为：
1）内标液配制：精密称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；
2）标样与样品溶液的配制：
(1)精密称取硫酸盐标样（95%）50mg，置于50mL容量瓶中，以6mL浓盐酸和流动相溶解并定容至刻度；
(2)分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的上述硫酸盐标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的硫酸盐标准溶液，用于标准工作曲线试验；分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的上述硫酸盐标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的硫酸盐标准溶液，用于精密度与回收率试验；
(3)精密称取该硫酸盐样品50mg，置于50mL容量瓶中，以6mL浓盐酸和流动相溶解，并定容至刻度；
(4)准确移取3.0mL的上述硫酸盐样品储备液，并以流动相定容至10mL；
3）含内标物的混合液的配制：分别移取0.5mL的内标液和0.5mL的上述各浓度的硫酸盐标准溶液或样品溶液，配制成添加了内标物的混合溶液，用于色谱进样使用；
4）硫酸盐标样和样品进样：采用20μL定量环在一定的色谱操作条件下对硫酸盐标样和样品分别进样，以内标物与硫酸盐标样的峰面积比（Y=Ai/As）对标样的质量浓度（Ci）作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式，从而测定出硫酸盐样品的纯度。
本发明采用的色谱仪为通用性强的C18色谱柱配紫外检测器。
所述的色谱仪的紫外检测波长设定为255-275nm, 优选为265nm。
由于2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐为易解离化合物，故需配制合适pH值的缓冲溶液作为流动相，以抑制样品组分的解离；本发明采用H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，调节缓冲溶液的pH值在3.4-4.4之间，优选为pH=3.9。
由于该硫酸盐为强极性化合物，在C18柱上没有保留，故流动相中需添加离子对试剂——烷基磺酸钠，优选为10mmol/L的庚烷磺酸钠。
所述的缓冲溶液与甲醇的体积比为80/20-95/5， 优选为90/10。
所述的流动相的流速设定为0.3-1.0mL/min, 优选为0.6mL/min。
本发明的优点为：
色谱柱和检测器采用常见的C18柱和紫外检测器，且色谱条件容易实现，普适性强 。该色谱条件下，样品稳定性强，分析结果的重现性好，经方法验证表明该分析方法的准确度和精密度高。
附图说明
图1为2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐标样色谱图；
图2为某市售2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐样品色谱图；
图3为添加内标物后的该硫酸盐样品色谱图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
HPLC操作条件如下:
1. 流动相V 甲醇/V 缓冲溶液=10/90；
2. 缓冲溶液的组成为：50mmol/L的KH2PO4+10mmol/L的庚烷磺酸钠，滴加浓磷酸，小心调节至缓冲溶液的pH=3.9；
3. 流动相流速=0.6mL/min；
4. UV检测器，检测波长：265nm；
5. 色谱柱：Agilent-Hypersil ODS (100×4.6mm, 5um)；
6. Waters 515 液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；
7. 进样量: 1-20μL。
溶液配制及色谱进样
1、内标液配制
精密称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度。
2、标样与样品溶液的配制
(1) 硫酸盐标准储备液（注意现用现配）
精密称取硫酸盐标样（95%）50mg，置于50mL容量瓶中，以6mL浓盐酸+流动相溶解并定容至刻度；
(2) 硫酸盐标准溶液（注意现用现配）
分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的上述硫酸盐标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的硫酸盐标准溶液，用于标准工作曲线试验；
分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的上述硫酸盐标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的硫酸盐标准溶液，用于精密度与回收率试验；
(3) 硫酸盐样品储备液（注意现用现配）
精密称取该硫酸盐样品50mg，置于50mL容量瓶中，以6mL浓盐酸+流动相溶解，并定容至刻度；
(4) 硫酸盐样品溶液（注意现用现配）
准确移取3.0mL的上述硫酸盐样品储备液，并以流动相定容至10mL。
3、含内标物的混合液的配制
分别移取0.5mL的内标液（见溶液配制1）+0.5mL的上述各浓度的硫酸盐标准溶液或样品溶液（见溶液配制2(2)或2(4)），配制成添加了内标物的混合溶液，用于色谱进样使用。
4、硫酸盐标样和样品进样
采用20μL定量环在本发明的色谱操作条件下对硫酸盐标样和样品分别进样，色谱图分别见图1和图2。
分析方法考察
1、线性关系考察
在本发明的色谱操作条件下，采用20μL定量环对前述溶液配制及色谱进样步骤中的含内标物的该硫酸盐标样混合液进行色谱进样， 以内标物与硫酸盐标样的峰面积比（Y=Ai/As）对标样的质量浓度（Ci）作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式为： Y=3.41×10-4+1.85 Ci，r=0.9999 (n=5)。
2、精密度与回收率试验
Figure 402200DEST_PATH_IMAGE001
硫酸盐样品纯度测定
（注：因标样纯度为95%，故直接测定结果需再×95%进行校正）
在本发明的色谱操作条件下，采用20μL定量环对前述溶液配制及色谱进样步骤中配制的含内标物的某市售2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐样品的混合液进行色谱进样（色谱图如图3所示），采用内标标准曲线法计算该硫酸盐样品的纯度，测定结果如表2所示；
Figure 45671DEST_PATH_IMAGE002
。
由表2可见该市售2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐样品的平均纯度为93.42%，相对平均偏差(n=3)为1.13%。
由图1、图2和图3各色谱图可见，在本方案的色谱操作条件下，该目标化合物（2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐）与各杂质及内标化合物在较短的分析时间内均得到了基线分离。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准曲线法对2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐样品的纯度进行了分析，经方法的回收率与精密度试验测试，其具体步骤为：
1）内标液配制：精密称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；
2）标样与样品溶液的配制：
(1)精密称取硫酸盐标样（95%）50mg，置于50mL容量瓶中，以6mL浓盐酸和流动相溶解并定容至刻度；
(2)分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的上述硫酸盐标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的硫酸盐标准溶液，用于标准工作曲线试验；分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的上述硫酸盐标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的硫酸盐标准溶液，用于精密度与回收率试验；
(3)精密称取该硫酸盐样品50mg，置于50mL容量瓶中，以6mL浓盐酸和流动相溶解，并定容至刻度；
(4)准确移取3.0mL的上述硫酸盐样品储备液，并以流动相定容至10mL；
3）含内标物的混合液的配制：分别移取0.5mL的内标液和0.5mL
的上述各浓度的硫酸盐标准溶液或样品溶液，配制成添加了内标物的混合溶液，用于色谱进样使用；
4）硫酸盐标样和样品进样：采用20μL定量环在一定的色谱操作条件下对硫酸盐标样和样品分别进样，以内标物与硫酸盐标样的峰面积比（Y=Ai/As）对标样的质量浓度（Ci）作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式，从而测定出硫酸盐样品的纯度。
2.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所采用的色谱仪为通用性强的C18色谱柱配紫外检测器。
3.根据权利要求2所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的色谱仪的紫外检测波长设定为255-275nm。
4.根据权利要求3所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的色谱仪的紫外检测波长设定为265nm。
5.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的流动相为H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系，调节缓冲溶液的pH值在3.4-4.4之间。
6.根据权利要求5所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：缓冲溶液的pH值为pH=3.9。
7.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶
硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的流动相中添加离子对试剂：烷基磺酸钠。
8.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的流动相中添加离子对试剂：10mmol/L的庚烷磺酸钠。
9.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的流动相中，缓冲溶液与甲醇的体积比为80/20-95/5。
10.根据权利要求9所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：缓冲溶液与甲醇的体积比为90/10。
11.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的流动相的流速设定为0.3-1.0mL/min。
12.根据权利要求1所述的一种分析2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐纯度的方法，其特征在于：所述的流动相的流速为0.6mL/min。
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