CN101912601A - 因子vii多肽的稳定化固体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含因子VII或因子VII相关多肽的化学和物理上稳定的组合物，使得这些组合物能够在室温进行贮藏、操作和使用。该组合物中包含至少一种选自下组的稳定剂：a)抗氧化剂与甘露醇的组合；b)甲硫氨酸与多元醇的组合；c)糖与甘露醇的组合；d)蔗糖与多元醇的组合；和e)甲硫氨酸。所述抗氧化剂是例如同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸或谷胱甘肽。所述糖是例如蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精或葡聚糖。所述多元醇是例如甘露醇、山梨醇或木糖醇。

Description

因子VII多肽的稳定化固体组合物
本申请是申请号为038173735(PCT/DK2003/000419)、申请日为2003年6月20日、发明名称为“因子VII多肽的稳定化固体组合物”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及包含因子VII或因子VII相关多肽的化学和物理上稳定的组合物，使得这些组合物能够在室温进行贮藏、操作、和使用。
背景技术
因子VII是参与血液凝结过程的多肽。现在，可以通过重组技术来生产因子VIIa(rFVIIa)，而且它广泛用作前止血剂。美国专利号4,784,950已经描述了(人野生型)因子VII。现在，rFVIIa为发生出血的血友病个体提供了快速且高效的前止血响应。有利的是，rFVIIa可用于治疗因抗体形成而不能用其它凝血因子产品进行治疗的血友病个体。同样，患有因子VII缺陷的个体或者具有正常凝血系统但仍发生过度出血的个体也可用rFVIIa成功治疗。
在开发包含多肽诸如例如因子VIIa的药物时需要考虑几个参数。例如，药物必须是有效的、安全的、且具有良好患者顺应性。此外，可以使用制药学可接受赋形剂配制成肠胃外施用的药物，这必须获得各种全世界医学管理机构的批准。为了肠胃外施用的目的，非常希望配方是大致等渗的，而且配方的pH能使得在注射/灌输后处于生理学合适范围内，否则它可能导致患者疼痛和不适。关于蛋白质配方的一般综述参阅例如Cleland等人，《The development of stable protein formulations：A closerlook at protein aggregation，deamidation and oxidation》即稳定蛋白质配方的开发：对蛋白质聚集、脱酰胺、和氧化的密切关注，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1993，10(4)：307-377；和Wang等人，《Parenteral formulations of proteins and peptides： Stability and stabilizers》即蛋白质和肽的肠胃外配方：稳定性和稳定剂，Journal of Parenteral Science and Technology，1988(增刊)，42(2S)。
然而，对于包含多肽的药物而言，安全性可能与多肽的物理和化学稳定性直接相关。作为多肽，因子VII或因子VII相关多肽易受物理降解的影响，包括变性和聚集，诸如形成可溶性或不溶性的二聚体、寡聚物、和多聚物形式的聚集体；或者易受化学降解的影响，包括例如水解、脱酰胺、和氧化。因此，所述物理和化学不稳定性可能导致因子VII多肽活性的损失、有毒且免疫原性降解产物的形成、在注射降解的因子VII多肽后诱发血栓症的严重风险、堵塞用于注射的针头和非均质的风险等。
因此，至关重要的是提供包含在物理和化学降解方面被稳定化的因子VII多肽的组合物。
现在以冻干产品形式提供的重组生产的FVII多肽意欲贮藏于大约2℃-大约8℃。对冷却条件的要求造成了对制造商或供应商以及终端用户(患者)的负担和不便。
目前，重组生产的FVII产品有NovoSeven(Novo Nordisk A/S，丹麦)，它包含1.2mg重组人因子VIIa、5.84mg NaCl、2.94mg CaCl2·2H2O、2.64mg甘氨酰甘氨酸、0.14mg聚山梨酸酯80、和60.0mg甘露醇。加入2.0ml注射用水(WFI)复水后，pH是5.5，而且由此配制的含FVII溶液足以在室温稳定24小时。
本发明的研究人员发现，将冻干的NovoSeven产品于25℃贮藏6个月后，占初始含量大约6-7％w/w的rFVIIa以聚集体的形式存在。
因此，包含因子VII多肽的组合物需要稳定化，从而能够在环境温度进行贮藏和操作。然而，多肽的不稳定性涉及几个参数，而且不可能预测将因子VIIa或因子VII相关多肽稳定化的正确方式。
将蛋白质稳定化的一种方法涉及将蛋白质脱水，例如诸如以冻干块的形式提供蛋白质，即在冻干处理后获得的最终物质。然而，冻干处理自身对蛋白质有害；在冻干过程中，首先冷却蛋白质溶液直至充分冻结，蛋白质溶液中大量的水将在此阶段结冰。因此，蛋白质易受由冷冻诱导的压力，导致变形和沉淀。在下一步中，即所谓的第一干燥阶段，冰升华；而在第二干燥阶段，在较高温度下除去吸附或结合水。在此脱水过程中，蛋白质 可能松开主要由氢键提供的正确构象。
因此，为了在冻干过程中保持蛋白质的构象、活性、和稳定性，需要为多肽溶液补充足够量的具有防冻剂和/或防溶剂特性的适当赋形剂，从而分别保护蛋白质免于由冷冻诱导的压力和/或脱水过程中的压力。
另外，在提供冻干产品时，关键的特征涉及冻干块的特性。它需要具有在形式和结构方面的优良特性，即它应当不会崩塌，因为这些崩塌块难以或甚至不可能在使用前溶解(复水)。相反，冻干块的物理结构最好不要太松太软。因此，在冻干前向蛋白质溶液中加入一种或多种所谓的膨胀剂(bulking agent)。
下面列出了多肽稳定化方面有用的其它发表物：
US 20010031721A1(American Home Products)关注高度浓缩、冻干且液态的因子IX配方。
WO 97/26909(Genetics Institute)关注适于贮藏和施用的因子IX冻干制剂。这些制剂可以包含蔗糖或甘露醇作为防冻剂。
WO 95/28954(Genetics Institute)关注适于贮藏和施用的因子IX制剂。这些制剂可以包含蔗糖作为防冻剂。
本发明的一个目的是提供稳定的因子VII多肽组合物，优选在环境温度贮藏较长时间例如至少6个月后基本上不存在降解产物且因子VII多肽活性没有降低。本发明的另一目的是适于肠胃外施用从而不会给患者引起任何不便的稳定组合物。
发明内容
本发明的研究人员发现，可以在足够稳定的组合物中提供因子VII多肽，从而能够在室温贮藏大约至少8个月。研究人员发现，稳定化作用涉及一些制药学可接受赋形剂的适当组合。
因此，在第一个方面中，本发明涉及含湿量不超过大约3％且包含因子VII多肽和至少一种选自由i-v组成之组的稳定剂的稳定化组合物：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸。
在另一个方面中，本发明涉及用于制备稳定的因子VII多肽的方法，包括下列步骤：
1)在包含至少一种选自由i-v组成之组的稳定剂的溶液中提供所述因子VII多肽：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸
2)加工所述溶液以获得含湿量不超过大约3％w/w的固体组合物。
如上所述，需要有稳定化的因子VII多肽，从而在将因子VII多肽以治疗性目的施用时将不利事件的风险降至最低并改进安全性和功效。因此，在还有一个方面中，本发明涉及因子VII多肽用于配制治疗因子VII反应性综合症的药物中的用途，所述药物包含含有因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂的组合物：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸，
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
最后，本发明涉及施用所述因子VII多肽以治疗因子VII反应性综合症，包括对有此需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂：
1)抗氧化剂与甘露醇的组合；
vi.甲硫氨酸与多元醇的组合；
vii.糖类与甘露醇的组合；
viii.蔗糖与多元醇的组合；和
ix.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
发明详述
本发明涉及包含因子VII多肽且贮藏稳定的组合物。这些组合物可以在室温贮藏较长时间而不会引起因子VII多肽的显著降解。室温指室内环境温度；它通常的范围是大约5℃-大约40℃，诸如大约10℃-30℃、或15℃-25℃。
通过特定制药学可接受赋形剂的适当预定组合，本发明的研究人员提供了包含因子VII多肽的稳定化组合物，从而能够将组合物于室温贮藏较长时间，诸如至少大约8个月。有利的是，稳定化组合物不必贮藏于冷却条件，诸如2℃-8℃。
本发明还关注于大约30℃贮藏至少大约8个月时仍稳定的贮藏稳定的组合物。这些组合物优选贮藏于黑暗中。因此，本发明使之有可能将这些组合物贮藏于室温而不会增加对施用这些组合物的患者的不利事件。有利的是，改进的贮藏稳定性还将使花费降低，因为贮藏不需要特殊的冷却条件，还使用户处理组合物更加方便。
术语“因子VII多肽”意指在预防或治疗出血方面有效的任何因子VII多肽。这包括由血液或血浆衍生的因子VII多肽，或者通过重组技术生产的因子VII多肽。
在用于本文时，“因子VII多肽”涵盖但不限于因子VII以及因子VII相关多肽。术语“因子VII”意欲涵盖但不限于具有野生型人因子VII氨基酸序列第1-406位(公开于美国专利号4,784,950)的多肽，以及由其它物种衍生的野生型因子VII，诸如牛、猪、犬、鼠、和鲑鱼，所述因子VII是由血液或血浆衍生的，或者是通过重组技术生产的。它还涵盖个体之间可能存在或发生的因子VII天然等位基因变异。同样，糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可能随所选宿主细胞和宿主细胞环境的性质而变化。 术语“因子VII”还意欲涵盖处于未切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及经过蛋白水解加工而生成的相应生物活性形式，这可以称为因子VIIa。通常，因子VII在第152位与第153位之间得到切割而生成因子VIIa。
如上所述，术语“因子VII多肽”还意指“因子VII相关多肽”。术语“因子VII相关多肽”意欲涵盖处于未切割(酶原)形式的这些多肽，以及经过蛋白水解加工而生成的相应生物活性形式。在用于本文时，“因子VII相关多肽”涵盖但不限于与野生型人因子VII相比展示基本上相同或改进的生物学活性的多肽。这些多肽包括但不限于经过化学修饰的因子VII或因子VIIa，以及导入了略微改变或改进多肽生物学活性的特定氨基酸序列改变的因子VII变体。
此外，因子VII相关多肽(包括与野生型因子VII相比展示基本上相同或更好的生物学活性的因子VII变体)包括但不限于因一个或多个氨基酸的插入、缺失、或取代而具有与野生型因子VII序列不同的氨基酸序列的多肽。
因子VII相关多肽(包括与野生型因子VIIa相比具有基本上相同或改进的生物学活性的变体)涵盖那些在本说明书所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中的一种或多种方法中进行测试时，与在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa相比展示至少大约25％、优选至少大约50％、更优选至少大约75％、更优选至少大约100％、更优选至少大约110％、更优选至少大约120％、且最优选至少大约130％的比活的多肽。
在有些实施方案中，因子VII多肽是因子VII相关多肽，特别是变体，其中在“体外水解测定法”(见下文实施例9)中进行测试时，所述因子VII多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型VIIa)的活性之间的比率是至少大约1.25；在其它实施方案中，该比率是至少大约2.0；在还有一些实施方案中，该比率是至少大约4.0。在本发明的有些实施方案中，因子VII多肽是因子VII相关多肽，特别是变体，其中在“体外蛋白水解测定法”(见下文实施例9)中进行测试时，所述因子VII多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型VIIa)的活性之间的比率是至少大约1.25；在其它实施方案中，该比率是至少大约2.0；在还有一些实施方案中，该比率是至少大约 4.0；在还有一些实施方案中，该比率是至少大约8.0。
与野生型因子VII相比具有基本上相同或改进的生物学活性的因子VII变体的非限制性范例包括：S52A-FVII、S60A-FVII(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.，352：182-192，1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、和S336G-FVII；美国专利号5,580,560中公开的展示蛋白水解稳定性增加的FVIIa变体；在第290位与第291位残基之间或第315位与第316位残基之间受到蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.，48：501-505，1995)；氧化形式的因子VIIa(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.，363：43-54，1999)；PCT/DK02/00189中公开的FVII变体；WO 02/38162(Scripps研究院)中公开的展示蛋白水解稳定性增加的FVII变体；WO 99/20767(明尼苏达大学)中公开的具有经修饰的Gla结构域且展示膜结合增强的FVII变体；WO 01/58935(Maxygen ApS)中公开的FVII变体；WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK 02/00635、丹麦专利申请PA 200201423、丹麦专利申请PA 2001 01627；WO 02/38162(Scripps研究院)中公开的与野生型FVIIa相比生物学活性增加的FVII变体；以及JP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic研究院)中公开的具有增强活性的FVIIa变体。
因子VII或因子VII相关多肽的范例包括但不限于：野生型因子VII、L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII， F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-Factor VII，S60A-Factor VII；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII； 从233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII，从304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII，以及从153Ile至223Arg的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII。
为了本发明的目的，可以使用缺乏因子VII的血浆和促凝血酶原激酶通过测量制剂促进血液凝结的能力而将因子VII多肽的生物学活性(“因子VII生物学活性”)定量，例如美国专利号5,997,864中所述。在这种测定法中，生物学活性表述成凝结时间相对于对照样品的缩短，并且通过与含1U/ml因子VII活性的合并人血清标准品进行比较而转变成“因子VII单位”。或者，可以通过下列方法而将因子VIIa生物学活性定量：
(i)在包含TF(包埋在质膜中)和因子X的系统中测量因子VIIa或因子VIIa相关多肽生成激活的因子X(因子Xa)的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.，272：19919-19924，1997)；
(ii)在水性系统中测量因子X水解(“体外蛋白水解测定法”，见下文实施例12)；
(iii)使用基于表面激元共振(surface plasmon resonance)的仪器测量因子VIIa或因子VIIa相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBSLetts.，413：359-363，1997)；
(iv)测量因子VIIa和/或因子VIIa相关多肽对合成底物的水解(“体外水解测定法”，见下文实施例12)；和
(v)在不依赖TF的体外系统中测量凝血酶的生成。
术语“因子VII生物学活性”或“因子VII活性”意欲包括生成凝血酶的能力；该术语还包括在缺乏组织因子时在激活的血小板的表面上生成凝血酶的能力。
本说明书的实施例12详细描述了可用于测定FVII生物学活性的测定法。
此外，贯穿本说明书，下列术语具有以下含义：
术语“稳定化”意欲涵盖使组合物的贮藏或生产过程中(不溶性的和/或可溶性的)聚集体形成和/或化学降解降至最低，以及维持pH和蛋白质的正确构象，从而实现生物学活性的实质性保持并维持蛋白质稳定性。此 外，稳定化还意指在冻干条件下生产组合物时对蛋白质提供防溶保护(lyoprotection)和防冻保护。
术语“结构性稳定化”或“结构稳定性”意欲涵盖形成具有优良特性和外观的冻干栓或块的能力，例如使得它不崩塌且使用前易于溶解。
术语“贮藏稳定的”意欲定义在5℃-40℃贮藏后稳定且在合适时间(常常是几个月)内保持预定产品规格的产品。
术语因子VII多肽的“物理稳定性”涉及不溶性和/或可溶性的二聚体、寡聚物、和多聚物形式的因子VII多肽聚集体的形成，以及该分子的任何结构变形和变性。
术语“化学稳定性”意指在加速条件下以溶解或固体状态贮藏后因子VII多肽中任何化学变化的形成，例如水解、脱酰胺、和氧化。具体而言，含硫氨基酸易于氧化而形成相应的亚砜。
术语“防冻剂”在用于本文时通常包括针对由冷冻诱导的压力为蛋白质提供稳定性的试剂。防冻剂的范例包括多元醇，诸如例如甘露醇，包括糖类，诸如例如蔗糖，还包括表面活性剂，诸如例如聚山梨酸酯、泊洛沙姆、或聚乙二醇等。防冻剂也有助于配方的张力。
术语“防溶剂”“(Lyoprotectant)”在用于本文时包括在冻干工艺的干燥过程后的脱水过程中为蛋白质提供稳定性的试剂，例如维持蛋白质的正确构象。防溶剂的范例包括糖类，特别是二糖或三糖。防冻剂可能也具有防溶剂的效果。
术语“适于将pH维持在范围3-9内的试剂”涵盖那些将溶液pH维持在可接受范围3.0-9.0内的试剂。能够将pH维持在3-9范围内的试剂的典型范例是柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、PIPES、咪唑、TRIS、乳酸、戊二酸、和甘氨酰甘氨酸的酸形式或盐。应当理解的是，在本发明中还可以使用试剂组合，其中试剂组合适于将pH维持在上文所述范围内。
术语“冻干块”在用于本文时意欲涵盖在一定条件下加工溶解的或至少部分溶解的组合物后得到的固体组合物，所述条件涉及至少一个将所述溶解的/部分溶解的组合物冷却至结冰的步骤，和随后至少一个真空干燥 的步骤。
术语“冻干”涵盖在一定条件下由溶解或至少部分溶解的组合物除去液体的过程，所述条件涉及至少一个将所述溶解的/部分溶解的溶液冷却至结冰、随后真空干燥的步骤。冻干是用于制备固体蛋白质药物的最常用方法。该方法由两个主要步骤组成：将蛋白质溶液冷冻和在真空条件下将冷冻的固体干燥。干燥步骤还可分成两个阶段：第一和第二干燥。第一干燥除去冻结水(冰的升华)，第二干燥除去非冻结的“结合”水(水的解吸附)。对每个冻干步骤的更详细分析提供于例如Wang等人，2000，International Journal of Pharmaceutics，203：1-60(见第4部分，第16页及以下)。
通常，通过将组合物装到瓶中、在冻干机的架子上冷冻、然后建立真空并加热架子以执行第一干燥(或冰的升华)，实现对组合物的冻干。此后，在较高温度进行第二干燥(或吸附水的解吸附)直至完成加工，即组合物的含湿(水)量足够低。冻干的方法在本领域是普遍知道的，参阅例如Wang等人，2000，International Journal of Pharmaceutics，203：1-60。从业人员凭借普通技术就能够在特定组合物的加工过程中将要使用的温度、每个温度下的时间、还有压力方面优化冻干条件。
术语“含湿量”意欲涵盖与产品相关的水，包括但不限于吸附形式的水，诸如冻结溶质相捕获或吸附的非冻结水和/或与无定形相相关的非冻结水或结晶固体吸附的非冻结水。术语“含水量”与“含湿量”可互换使用。期望的残余湿气水平(含湿量)是第二干燥步骤的持续时间和温度的函数。本领域知道用于在冻干过程中测定残余含湿量的几种方法；例如可以使用电子湿度计或残余气体分析仪。可以通过本领域知道的几种方法来测定冻干配方的含湿量，诸如例如干燥损失、Karl Fischer滴定、热比重分析(TGA)、气相层析(GC)、或近似IR(参阅例如Wang等人，2000，International Journal of Pharmaceutics，203：1-60)。用于测定含湿量(含湿量)的方法还描述于欧洲和美国药典。例如，可以如美国药典(USP<921，Ic>)或欧洲药典(EP<2.5.32>)中所述通过Karl Fischer电量滴定来进行含水量测定。
简而言之，该方法如下：
通过电量滴定测定含水量：水的电量测定利用Karl Fischer反应，其依据的是无水介质中水与二氧化硫和碘的定量反应。在反应池中以电化学方式即通过碘化物的氧化生成碘。在阳极生成的碘立即与反应池中所含的水和二氧化硫反应。物质中水的量与电量成正比，直至滴定终点。当池中的水都耗尽时，达到终点，由此出现过量的碘，这可以通过量电法检测，由此指示终点。然后计算物质中存在的含水量百分比。
可以根据分析时小瓶中的样品重量(即固体加上存在的水-称为湿重基数)来定义含湿量，或者可以根据校正样品中测量到的水(即干重基数)来进行定义。在具有低含湿量的冻干产品的情况中，两种测量方法(湿重基数对干重基数)产生非常相似的结果。在用于本文时，含湿量是根据固体加上存在的水(即湿重基数)来定义的。
术语“膨胀剂”(bulking agent)通常包括提供优良冻干块特性、形成制药学精致产品、帮助蛋白质克服多种压力(例如与冻干加工有关的剪切/冻结)、和有助于在冻干过程及后续贮藏过程中维持蛋白质活性水平的试剂。膨胀剂的典型范例包括甘露醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖。这些试剂可能对配方的张力也有贡献。
术语“张力调节剂”(tonicity modifier)意指能够调节组合物的张力、使得在使用时将组合物溶解后组合物的张力在血液、腹膜液、或其它相关体液的生理范围内的任何试剂。显然，张力还可取决于复水溶液是否包含张力调节剂。
术语“表面活性剂”通常包括那些保护蛋白质免于由空气/溶液界面诱导的压力和由溶液/表面诱导的压力的影响的试剂。例如，表面活性剂可以保护蛋白质免于聚集。合适的表面活性剂可以包括例如聚山梨酸酯、聚氧乙烯烷基醚诸如Brij 35、或泊洛沙姆诸如吐温20、吐温80、或泊洛沙姆188。优选的去污剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407；聚氧乙烯烷基醚，例如Brij 35
Figure GSA00000080853100132
、Cremophor A25、Sympatens ALM/230；和聚山梨酸酯/吐温，例如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80。更优选的是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188，和吐温，例如吐温20和吐温80。
术语“初始含量”指配制时加到组合物中的因子VII多肽的量。本文给出的浓度(mg/ml)指除湿前(例如冻干前)的因子VII多肽溶液或复水组合物中因子VII多肽的浓度，或者在涉及固体组合物例如冻干块中的浓度时表述成％w/w。
在用于本文时，所述量理解为±大约10％，因此大约50mM包括50mM±5mM，4％包括4％±0.4％，等等。
如上所述，本发明的研究人员对本领域的本质贡献是将因子VII多肽稳定化从而能够长时间贮藏而不会引起用户的风险和不便增加。
本发明的研究人员发现，在将因子VII多肽稳定化时需要调整许多至关重要的参数。一个重要的参数至少部分涉及含湿量，例如水。含湿量应当受到限制。作为另一个重要参数，组合物应当至少包含一种稳定剂。依照本发明，适当稳定剂包括选自下组的至少两组制药学可接受赋形剂的组合：抗氧化剂、糖类、和多元醇。糖类和多元醇具有防溶剂和/或防冻剂特性，这在将组合物进行冻干的情况中可能是重要的，至少部分重要。一般而言，可以通过至少两组赋形剂的适当组合而部分实现稳定性的改进。然而，更具体的说，发现当所述组合包含糖类(蔗糖)或抗氧化剂(甲硫氨酸)时，稳定效果可能甚至更加显著。此外，还令人惊讶的发现甲硫氨酸可预防因子VII多肽的氧化性降解。
因此，在第一个方面中，本发明涉及包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂的组合物：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
也就是说，本发明的一个实施方案包含抗氧化剂与甘露醇的组合；第二个实施方案包含甲硫氨酸与多元醇的组合；另一个实施方案包含糖类与甘露醇的组合；在还有一个实施方案中，组合物包含蔗糖与多元醇的组合； 最后，在另一个合适实施方案中，组合物包含甲硫氨酸。
如上所述，依照本发明的稳定剂包括组合至少两组制药学可接受赋形剂。在合适实施方案中，稳定剂还包含第三组赋形剂。因此，在一个实施方案中，抗氧化剂与甘露醇的组合中还包含糖类。在第二个实施方案中，甲硫氨酸与多元醇的组合中还包含糖类。在还有一个有趣的实施方案中，糖类与甘露醇的组合中还包含抗氧化剂，而蔗糖与多元醇的组合中还包含抗氧化剂。在一个实施方案中，本发明的组合物包含甘露醇和蔗糖；在另一个实施方案中，组合物包含甘露醇、蔗糖、和甲硫氨酸；在另一个实施方案中，组合物包含甘露醇和海藻糖；在另一个实施方案中，组合物包含甘露醇、海藻糖、和甲硫氨酸。
依照本发明，因子VII多肽意欲涵盖上文所述多肽。在本发明的合适实施方案中，因子VII多肽选自下组：人因子VIIa、重组人因子VIIa、和因子VII序列变体。优选的是，因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa或因子VII相关多肽，其中在本说明书所述“体外蛋白水解测定法”和“体外水解测定法”中的一种或多种方法中进行测试时，所述因子VII相关多肽与野生型因子VII的活性比率是至少1.25。
如上所述，含湿量应当受到限制。为了本发明的目的，在大量提供因子VII多肽时，它可以是固体或液体的形式。然而，在大量提供因子VII多肽时，它通常是液体的形式。因此，将大量蛋白质进一步加工以制备组合物时需要添加合适赋形剂并由混合物除去液体的步骤，所述添加赋形剂可以在除去液体之前或之后进行。用于由蛋白质除去液体的这样一种方法涉及冻干。因此，在本发明的一个优选实施方案中，组合物是冻干块的形式。然而，本发明不排除适于由散装多肽除去液体以获得含湿量不超过大约3％w/w的固体组合物的其它方法。
此外，依照本发明，含湿量优选不超过大约2.5％w/w，更优选不超过大约2％w/w，最优选不超过大约1.5％w/w。
可以理解，本发明部分涉及在制备过程中例如在混合赋形剂和除去液体以获得含湿量最高3％w/w的固体组合物的过程中限制因子VII多肽的降解，以及由制造至使用(例如直至将组合物施用于患者之时)该固体组 合物这段时间里限制所述降解。
因此，将包含因子VII多肽的组合物稳定化时还有另一个参数，即在溶于水性溶剂，诸如纯水或水性缓冲液后，应当将pH维持在pH范围3-9内。也就是说，除去含湿量之前，例如冻干前，多肽溶液的pH应当维持在大约3-大约9内。有利的是，该pH范围也处于期望的生理范围内，从而不会在通过肠胃外手段进行施用后对使用者造成伤害。优选的是，溶液的pH是大约4.0-大约9.0，诸如4.0-8.0、4.0-7.5、4.0-7.0、4.5-7.0、4.5-6.8、4.5-6.5、5.0-7.0、5.0-6.5、5.0-6.0、5.5-6.5、或大约5.5-大约6.0，诸如大约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、或6.0。
因此，本发明的实施方案还包括适于在溶于水性溶液(如水)后将所述组合物的pH维持在3-9范围内的试剂。因此，在合适实施方案中，适于将pH维持在3-9范围内的试剂选自下组：柠檬酸、醋酸、组氨酸、苹果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、戊二酸、PIPES、和甘氨酰甘氨酸的酸或盐。
另外，用于将pH维持在3-9范围内的合适试剂还可以是至少两种所列试剂的混合物，其中所述混合物能够提供指定范围内的pH值。合适试剂的浓度范围是大约0.1mM-100mM、大约0.2mM-50mM、大约0.5mM-25mM、大约1mM-20mM、或大约1mM-10mM。
正如由实施例5和6可以看出的，通过组合适当量的甘露醇(多元醇)、蔗糖(糖类)、和抗氧化剂(甲硫氨酸)，本发明的研究人员提供了在终止制造过程后(即终止冻干加工后)氧化形式和聚集体含量较低的组合物。因此，依照本发明的组合物的特征是在进行贮藏前具有较低的氧化形式和聚集体初始含量。
氧化途径和聚集途径对因子VII多肽的降解是稳定性的灵敏参数。
通常，在终止冻干后，组合物得到稳定化，使得少于初始含量5％w/w、诸如少于4、3、或2％w/w的因子VII多肽转变成其氧化形式。因子VII多肽的初始含量即配制组合物之后、冻干步骤之前添加到组合物中的量。此外，根据常规分析方法(诸如例如本申请实施例中所述方法)的测定，少于初始含量5％w/w、诸如少于4.0％、3.0％、2.5％、2％、1.5％、或少 于1％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
本发明的研究人员发现，因子VII多肽在贮藏于环境温度后的进一步降解(即计算由终止制造过程时直至于30℃贮藏8个月)很少。正如可以由实施例5看出的，于30℃贮藏8个月后，增量是这样的，其中除了终止冻干时存在的因子VII多肽氧化形式的含量以外，以所述氧化形式回收到的因子VII多肽少于其初始含量的10％w/w。极其重要的是，发现包含抗氧化剂(甲硫氨酸)的组合物针对因子VII多肽的氧化性降解更加稳定。
因此，依照本发明，合适组合物在于环境温度贮藏至少8个月后氧化形式的含量增加有限。也就是说，在还有一些实施方案中，组合物是稳定的，从而在终止制造过程(例如冻干加工)后将组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量大约6％w/w的因子VII多肽被额外降解成氧化形式。在其它合适实施方案中，由终止制造过程时直至于30℃贮藏8个月后计算，不超过大约5、4、3、2、或1.5％w/w的因子VII多肽额外转变成氧化形式。在本发明的这些实施方案中，组合物是稳定的，从而所述组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量大约5％(4、3、2、或1.5％)w/w的因子VII多肽转变成氧化形式。如上所述，初始含量指配制组合物之后、冻干步骤之前添加到组合物中的因子VII多肽的量。
如上所述，聚集途径对因子VII多肽的降解也可看作基本的稳定性指示参数。
本发明的研究人员发现，因子VII多肽在贮藏于环境温度后的进一步降解(即由终止制造过程时直至于30℃贮藏8个月计算)很少。正如可以由实施例6看到的，于30℃贮藏8个月后，以聚集体额外回收到不超过初始含量大约5％w/w、诸如不超过大约4、3、2.5、2.0、1.5、或1.0％w/w的因子VII多肽。同样极其重要的是，发现包含糖类(蔗糖)的组合物在聚集体形成方面更加稳定。
因此，本发明的实施方案涉及稳定的组合物，使得将所述组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量大约5％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。如上所述，所述多肽VII多肽的初始含量指配制组合物之后、冻干步骤之前添加到组合物中的量。通过糖类、多元醇、和抗氧化剂含量的适当 优化，至少是部分优化，组合物是稳定的，从而所述组合物于30℃贮藏8个月后，不超过初始含量大约4.0％、3.0％w/w、诸如2.5、2.0、1.5、或1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
因此，有利的是，终止制造过程之后(即终止冻干加工后)，本发明的组合物具有低含量的氧化形式和聚集体，因此，依照本发明的组合物的特征是在进行贮藏前其中氧化形式和聚集体初始含量较低，例如在终止制造过程后不超过初始含量大约5％w/w、诸如4％、3％、或2％w/w的因子VII多肽转变成氧化形式，而且少于5％w/w、诸如不超过大约4.0％、3.0％、2.5％、2％、1.5％、或不超过大约1％w/w转变成二聚体或高级聚合体形式。
此外，有利的是，本发明的组合物是贮藏稳定的，例如在黑暗中于30℃贮藏至少8个月后少于初始含量10％w/w、诸如6％、5％、4％、3％、2％、或1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化形式，而且少于5％w/w、诸如4％、3％、2.5％、2％、1.5％、或1％w/w转变成二聚体或高级聚合体形式。
如上所述，所述改进的稳定性涉及特定赋形剂的适当组合。依照本发明，赋形剂应当选自下组：糖类、多元醇、和抗氧化剂，因为糖类和多元醇展示防溶剂和/或防冻剂特性。更具体的说，在依照本发明的合适实施方案中，感兴趣的糖类是二糖、三糖、和多糖，而且糖类可以选自下组：蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖。此外，在有些实施方案中，多元醇选自下组：甘露醇、山梨醇、和木糖醇。在还有一些实施方案中，抗氧化剂选自下组：同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽中任意一种的肽。
可以理解，糖类和多元醇赋形剂分别还可以是至少两种所列试剂的混合物。在本发明的一系列实施方案中，所用糖类赋形剂是至少两种二糖、三糖、和/或多糖的组合，诸如例如蔗糖与环糊精的组合、海藻糖与环糊精的组合、蔗糖与葡聚糖的组合、或蔗糖与乳糖的组合。在本发明的一系列实施方案中，所用多元醇赋形剂是至少两种多元醇的组合，诸如例如甘 露醇与山梨醇的组合、甘露醇与木糖醇的组合、或山梨醇与木糖醇的组合。在本发明的一系列实施方案中，所用抗氧化剂赋形剂是至少两种抗氧化剂的组合，诸如例如甲硫氨酸与同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、谷胱甘肽以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽中任意一种的肽中一种或多种的组合。
本发明的研究人员认识到或者至少部分认识到用于实现有利稳定性的多元醇与糖类的适当组合以及它们的含量。
因此，在本发明的有些更加有趣的实施方案中，多元醇存在的量是大约5％w/w-大约90％w/w。优选的是，多元醇存在的量是大约18％w/w-大约88％w/w，诸如大约18％w/w-大约83％w/w、25％-80％、30％-65％、30％-80％、40％-80％、50％-80％、30％-75％、40％-75％、50％-75％、或大约50％-大约70％w/w。
多元醇存在的量是大约0.5-75mg/ml，诸如大约2-60mg/ml、5mg/ml-55mg/ml、8-45mg/ml、10-40mg/ml、10-30mg/ml、或大约2-45mg/ml、5mg/ml-45mg/ml、5-35mg/ml、5-25mg/ml、5-20mg/ml、20-40mg/ml、或诸如大约20-30mg/ml。
此外，在它的有趣实施方案中以及在本发明的其它一些有趣实施方案中，组合物中糖类存在的量是大约0-大约85％w/w。在它的其它有趣实施方案中，其存在量是大约3％w/w-大约80％w/w，诸如大约7％w/w-大约75％w/w、10％-70％、10％-50％、20％-50％、10％-40％、或大约10％w/w-大约35％w/w。
糖类存在的量应当是大约0.5-75mg/ml，诸如大约2-60mg/ml、大约5mg/ml-55mg/ml、大约8-45mg/ml、大约10-40mg/ml、大约10-30mg/ml、大约2-45mg/ml、大约5mg/ml-45mg/ml、大约5-35mg/ml、大约5-25mg/ml、诸如大约5-20mg/ml。
此外，本发明的研究人员认识到抗氧化剂的适当量应当是大约0.05-10mg/ml，诸如大约0.1-5mg/ml、0.1mg/ml-2.5mg/ml、0.1-2mg/ml、或大约0.1-1mg/ml。
重要的是，需要适当调节多元醇与糖类之间的比率。在本发明的合适 实施方案中，所述多元醇相对于所述糖类的重量比率的范围是大约100∶1-1∶50。在它的甚至更合适实施方案中，所述重量比率是大约50∶1-1∶10，更优选大约20∶1-1∶5。在其它合适实施方案中，重量比率涉及范围大约10∶1-1∶2和大约6∶1-1∶2。然而，正如本发明的研究人员发现的(见实施例5)，冻干块在插入较大量的糖类后崩塌。因此，在非常合适的实施方案中，所述糖醇相对于所述糖类的重量比率的范围是大约4∶1-1∶1，诸如大约4∶1-3∶2或大约1∶1-3∶2。
在本发明的有些实施方案中，多元醇是甘露醇；在还有一些实施方案中，糖类是蔗糖。此外，在还有一些实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。
还可以通过插入其它制药学可接受赋形剂来合适配制组合物，以获得能够肠胃外施用、特别是静脉内施用的组合物。用于制备肠胃外施用的组合物的实际方法对于本领域熟练技术人员而言是知道的，而且更加详细的描述于例如《Remington：The Science and Practice of Pharmacy》即雷明顿：制药科学和实践，第19版，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1995。术语“赋形剂”包括为蛋白质提供优良冻干块特性(膨胀剂)以及提供防溶保护和防冻保护、在贮藏过程中维持pH、维持可接受张力以及蛋白质的正确构象从而实现生物学活性的实质性保持并维持蛋白质稳定性的制药学可接受试剂。
因此，依照本发明，组合物还包含张力调节剂。张力调节剂可以选自下组：醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、和氯化钙。然而，不排除其它合适的张力调节剂。还应当指出的是，组合物可以包含更高浓度的张力调节剂，只要组合物在使用前制成等渗或接近等渗(例如略微高渗或低渗)即可，例如散剂组合物不必与生理范围等渗。
可以通过添加表面活性剂来获得包含因子VII多肽的组合物的进一步稳定化。因此，在本发明的还有一些有趣实施方案中，组合物还包含选自下组的表面活性剂：聚山梨酸酯，例如吐温
Figure GSA00000080853100201
，诸如聚山梨酸酯20或80；聚氧乙烯烷基醚，例如聚烃氧基23月桂醇醚(Brij 35
Figure GSA00000080853100202
)或泊洛沙姆，诸如泊洛沙姆188(例如Pluronic
Figure GSA00000080853100203
)或泊洛沙姆407(例如Lutrol
Figure GSA00000080853100204
)和其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇(PEG)诸如PEG 8000。通常，表面活性剂 的添加量是0.005-5mg/ml。优选的量是0.01-3mg/ml，对于吐温20和/或吐温80，更优选的是0.01-0.3mg/ml；对于泊洛沙姆188，更优选的是0.05-3.0mg/ml。
在本发明的还有一些优选实施方案中，组合物还包含担当膨胀剂的其它制药学赋形剂。也就是说，组合物中包含除了甘露醇以外的膨胀剂。具体而言，在通过冻干制备的组合物中包含膨胀剂。
组合物中因子VII多肽的初始含量优选大约0.6mg/ml-大约10.0mg/ml，诸如大约0.6mg/ml-大约6.0mg/ml、大约0.6mg/ml-大约5mg/ml、或大约0.6mg/ml-大约4mg/ml。
在一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、和吐温80，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、甲硫氨酸、和吐温80，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、组氨酸、和吐温80，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、甲硫氨酸、组氨酸、和吐温80，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、和泊洛沙姆188，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、甲硫氨酸、和泊洛沙姆188，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、组氨酸、和泊洛沙姆188，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在另一个实施方案中，组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖、组氨酸、甲硫氨酸、和泊洛沙姆188，具有不超过大约3％的含湿量，而且在溶于水后具有5.0-7.0范围内的pH。在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。在一个实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa。
在还有一些实施方案中，组合物如下文表A所示。
表A
  化合物   配方A   配方B   配方C   配方D
  FVII多肽   0.6-10mg/ml   0.6-10mg/ml   0.6-10mg/ml   0.6-10mg/ml
  CaCl2·2H2O   5-20mM   5-20mM   5-20mM   5-20mM
  NaCl   0-50mM   0-50mM   0-50mM   0-50mM
  甘氨酰甘氨酸   0-15mM   0-15mM   0-15mM   0-15mM
  L-组氨酸   0-20mM   0-20mM   0-20mM   0-20mM
  甘露醇   20-40mg/ml   20-40mg/ml   20-40mg/ml   20-40mg/ml
  蔗糖   5-20mg/ml   -   -   5-20mg/ml
  甲硫氨酸   0-1mg/ml   0-1mg/ml   0-1mg/ml   0-1mg/ml
  吐温80   0.05-0.15mg/ml   0.05-0.15mg/ml   -   -
  泊洛沙姆188   -   -   0.5-3mg/ml   0.5-3mg/ml
  pH   5.0-7.0   5.0-7.0   5.0-7.0   5.0-7.0
在还有一些实施方案中，组合物如下文表B所示。
表B
  化合物   配方E   配方F   配方G   配方H
  FVIIa多肽   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml
  CaCl2·2H2O   10mM   10mM   10mM   10mM
  NaCl   39mM   39mM   39mM   39mM
  甘氨酰甘氨酸   10mM   10mM   10mM   10mM
  甘露醇   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml
  蔗糖   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml
  甲硫氨酸   0.5mg/ml   0.5mg/ml   0.5mg/ml   0.5mg/ml
  吐温80   0.1mg/ml   -   0.1mg/ml   -
  泊洛沙姆188   -   1.0mg/ml   -   1.0mg/ml
  L-组氨酸   -   -   10mM   10mM
  pH   6.0   6.0   6.0   6.0
[0146] 表B(续前表)
  化合物   配方I   配方J   配方K   配方L
  FVII多肽   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml
  CaCl2·2H2O   10mM   10mM   10mM   10mM
  NaCl   39mM   39mM   39mM   39mM
  甘氨酰甘氨酸   10mM   10mM   10mM   10mM
  甘露醇   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml
  蔗糖   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml
  甲硫氨酸   -   -   -   -
  吐温80   0.1mg/ml   -   0.1mg/ml   -
  泊洛沙姆188   -   1.0mg/ml   -   1.0mg/ml
  L-组氨酸   -   -   10mM   10mM
  pH   6.0   6.0   6.0   6.0
在还有一些实施方案E1-L1中，组合物包含赋形剂，而且它们的量如上文表B所列，但配制成pH5.9。
在还有一些实施方案E2-L2中，组合物包含赋形剂，而且它们的量如上文表B所列，但配制成pH5.8。
在还有一些实施方案E3-L3中，组合物包含赋形剂，而且它们的量如上文表B所列，但配制成pH5.7。
在还有一些实施方案E4-L4中，组合物包含赋形剂，而且它们的量如上文表B所列，但配制成pH5.6。
在还有一些实施方案E5-L5中，组合物包含赋形剂，而且它们的量如上文表B所列，但配制成pH5.5。
如上所述，通过在包含选定制药学可接受赋形剂(重要的是包含稳定剂)的固体组合物中提供蛋白质，本发明的研究人员提供了用于将因子VII多肽稳定化的方法。依照本发明，这种稳定剂由选自糖类、多元醇、或抗氧化剂中的至少两组赋形剂的组合组成。此外，本发明的研究人员发现，糖类(蔗糖)和抗氧化剂(甲硫氨酸)是改进因子VII多肽稳定性所必需的。
因此，本发明的还有一个方面涉及用于制备稳定的因子VII多肽的方法。该方法包括下列步骤：
1)在包含至少一种选自下组的稳定剂的溶液中提供所述因子VII多肽：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
2)加工所述溶液以获得含湿量不超过大约3％w/w的固体组合物。
在其特别感兴趣的实施方案中，该方法中所述抗氧化剂选自下组：同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽中任意一种的肽。在一个优选的实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。在还有一些有趣的实施方案中，所述糖类选自下组：蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖。在一个优选的实施方案中，多元醇是甘露醇，糖类是蔗糖。此外，在其优选实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。
优选的是，应当调节所述溶液中糖类的含量和任选的抗氧化剂的含量，以获得优异的稳定化因子VII多肽。
依照本发明，糖类的存在量范围应当是大约0.5-75mg/ml，诸如大约2-60mg/ml、大约5-55mg/ml、大约8-45mg/ml、大约10-40mg/ml、大约10-30mg/ml、或大约2-45mg/ml、大约5-45mg/ml、大约5-35mg/ml、大约5-25mg/ml，诸如大约5-20mg/ml。
依照本发明，多元醇的存在量范围应当是大约0.5-75mg/ml，诸如大约2-60mg/ml、大约5-55mg/ml、大约8-45mg/ml、大约10-40mg/ml、大约10-30mg/ml、或大约2-45mg/ml、大约5-45mg/ml、大约5-35mg/ml、大约5-25mg/ml，诸如大约5-20mg/ml。
抗氧化剂的存在量范围应当是大约0.05-10mg/ml，优选大约0.1-5mg/ml，更优选大约0.1mg/ml-2.5mg/ml，甚至更优选大约0.1-2mg/ml， 最优选大约0.1-1mg/ml。
在一个优选的实施方案中，用于制备稳定的因子VII多肽的方法包括冻干。冻干指如下过程，其中将包含所述因子VII多肽的溶液装入冻干瓶等内。所述因子VII多肽可以任选在开始冻干之前进行无菌过滤。对冻干机的架子施以冷却，从而使瓶和溶液在临界产品温度以下冻结。通过引入真空和在冻干机的冷凝器上凝结水蒸汽来脱水。当产品干燥后，通常残余含湿量低于3％(例如如上所述通过Karl Fischer电量滴定来测量)，将瓶封闭并盖帽。制造结束，组合物现在是冻干块的形式。
在通过注射手段施用于患者时，使用前需要将这些组合物在合适液体中复水。也可以为了其它目的而将它们复水，例如用于再配制成其它制药学组合物。然而，本发明不排除可以以固体形式将组合物施用于患者。
使用可接受的、优选无菌的稀释剂或载体、优选水性载体将组合物复水。可以使用多种水性载体，例如水(例如注射用水/WFI)、缓冲液、盐水(例如0.4％盐水)、甘氨酸(例如0.3％甘氨酸)、组氨酸等。复水稀释剂还可以包含一种或多种盐类，诸如钙盐(例如CaCl2)或钠盐与钙盐的组合(例如NaCl和CaCl2)。
复水组合物意欲肠胃外施用，以进行预防性和/或治疗性处理。优选的是，对制药学组合物进行肠胃外施用，即静脉内、皮下、或肌肉内，或者通过连续或脉动灌输进行施用。
因此，本发明的还有一个方面涉及固体稳定化组合物用于配制治疗因子VII反应性综合症的药物中的用途。
也就是说，本发明的一个实施方案涉及因子VII多肽用于配制治疗因子VII反应性综合症的药物中的用途，所述药物包含含有因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂的组合物：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
另外，在另一个方面中，本发明涉及对患者施用所述稳定化的因子VII多肽以治疗因子VII反应性综合症。因此，本发明涉及用于治疗因子VII反应性综合症的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的组合物，所述组合物包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
在不同的实施方案中，所述因子VII反应性综合症是血友病A、血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术、或创伤。另外，因子VII反应性综合症可能与抗凝剂疗法有关。
如上所述，组合物处于固体形式。因此，在合适的实施方案中，药物应当适于溶解，从而能够进行肠胃外施用。因此，在对患者施用组合物时，包括有在施用步骤之前将组合物溶于合适液体的步骤。
本文所用缩写：
FVII            单链形式的凝血因子VII
FVIIa           经过切割的、激活的双链形式的凝血因子VII
rFVII(rFVIIa)  重组因子VII(重组因子VIIa)
附图说明
图1a和图1b是按照实施例11所测定的小瓶贮藏的稳定性的结果。
图2a和图2b是按照实施例9所测定的配方A和配方B中聚集体形式和氧化形式的含量。
提供下列实施例作为例示而非限制。
具体实施方式
实施例1
显示了依照实施例2配制的包含因子VII多肽的组合物。其中显示了典 型的赋形剂及其典型用量。
表1显示了组合物处于液体形式(即完成制造如完成冻干前的组合物)或复水溶液时活性成分和赋形剂的浓度。
表2显示了组合物处于固体形式即冻干形式时活性成分和赋形剂的浓度。
表1：组合物，溶液中的赋形剂含量
  主要功能：   赋形剂：   液体组合物中的含量(mg/ml)：
  活性成分   rFVIIa   0.6-5
  张力调节剂   NaCl   0-4
  张力调节剂/稳定剂   CaCl2·2H2O   1-7
  缓冲剂   甘氨酰甘氨酸   1.32(0-1.5)
  表面活性剂   聚山梨酸酯80   0.05-2
  膨胀剂/防冻剂/防溶剂   甘露醇   10-40
  膨胀剂/防冻剂/防溶剂   蔗糖   10-40
  抗氧化剂   甲硫氨酸   0-1.0
  pH   5-6
表2：组合物，冻干形式中的赋形剂含量
  主要功能：   赋形剂：   固体组合物中的含量(％w/w)：
  活性成分   rFVIIa   0.6-19
  张力调节剂   NaCl   0-15
  张力调节剂/稳定剂   CaCl2·2H2O   1.0-24.0
  缓冲剂   甘氨酰甘氨酸   0-6.0
  表面活性剂   聚山梨酸酯80   0.05-8.0
  膨胀剂/防冻剂/防溶剂   甘露醇   13-76
  膨胀剂/防冻剂/防溶剂   蔗糖   13-76
  抗氧化剂   甲硫氨酸   0-4.2
  pH   5-6
实施例2：组合物的制造
一般而言，由纯化的大量溶液制备组合物。添加赋形剂，并将溶液稀释至期望的rFVIIa浓度。使用无菌滤膜(0.2微米孔径或相当物)将由此得到的溶液无菌过滤，并装到无菌玻璃瓶中。将小瓶冻干，塞住，并用铝制弹开式瓶帽密封。
实施例3
依照实施例2中所述方法配制包含不同量的氯化钠、甘露醇、蔗糖、和甲硫氨酸且具有不同pH值的组合物1-19。这些组合物包含固定浓度的因子VII(1.0mg/ml)、CaCl2·2H2O(1.47mg/ml)、甘氨酰甘氨酸(1.32mg/ml)、和聚山梨酸酯80(1.0mg/ml)。
表3：组合物1-19
Figure GSA00000080853100291
实施例4：用于测定稳定性指示参数的分析方法
A.通过反相HPLC(RP-HPLC)测定氧化形式：
HPLC柱：用粒度5μm且孔径 
Figure GSA00000080853100301
的丁基键合硅石填充4.5x250mm柱。柱温：70℃。洗脱液A：水99.9％v/v和三氟乙酸0.1％v/v。洗脱液B：乙腈80％v/v、三氟乙酸0.09％v/v和水19.91％v/v。用30分钟X％B-(X+13)％B的线性梯度对柱进行洗脱。流速：1.0ml/min。检测：214nm。
氧化形式是因子VII多肽的甲硫氨酸亚砜。例如，FVII的两种主要衍生物是Met(O)298 FVII和Met(O)306 FVII。
氧化形式的含量表述成配制后组合物中以氧化形式回收的因子VII占因子VII初始量的百分比。
B.通过高效凝胶渗透层析(GP-HPLC)测定因子VII多肽的聚集体
在7.5x300mm的Waters Protein Pak 300SW柱上进行GP-HPLC，使用含5％异丙醇的0.2M硫酸铵pH7.0作为流动相。流速：0.5ml/min。检测：215nm。
聚集体的含量表述成配制后组合物中以二聚体、寡聚物和多聚物形式回收的因子VII占因子VII初始量的百分比。
实施例5：终止冻干处理并贮藏后氧化形式因子VIIa的含量
终止冻干并于30℃贮藏2和8个月后，通过方法A(实施例4)对实施例3的组合物1-19分析氧化形式的含量。
表4：氧化形式的含量及其贮藏8个月后的增量
Figure GSA00000080853100311
统计学分析显示，包含甲硫氨酸的组合物在氧化性降解方面更加稳定。
实施例6：终止冻干处理并贮藏后因子VIIa聚集体的含量
终止冻干并于30℃贮藏2和8个月后，通过方法B(实施例4)对实施例3的组合物1-19分析聚集体的含量。
表5：聚集体的含量及其贮藏8个月后的增量
Figure GSA00000080853100321
统计学分析显示，组合物中存在蔗糖对于降低聚集体形成而言是重要的。
实施例7：终止冻干处理后二聚体和寡聚物形式因子VIIa的含量
依照实施例2中所述方法配制包含下表所列多元醇和糖类的组合物A。该组合物还包含因子VIIa(1.0mg/ml)、CaCl2·2H2O(1.47mg/ml)、甘氨酰甘氨酸(1.32mg/ml)、和聚山梨酸酯80(0.7mg/ml)。pH是5.0。
终止冻干并于30℃贮藏1和2个月后通过方法B(实施例4)对组合物A分析聚集体的含量。表6列出了以聚集体回收的因子VIIa占初始含量的百分比。
表6
Figure GSA00000080853100331
实施例8
对多种组合物1-19(见实施例3)显示了冻干块的结构稳定性。报告了每一种组合物中甘露醇与蔗糖的比率。
表7：依照甘露醇与蔗糖之间比率统计的冻干块的稳定性
Figure GSA00000080853100332
C：崩塌块；Man：甘露醇；Suc：蔗糖；OK：轻微崩塌或未崩塌
实施例9
如实施例2中所述配制下列配方，填充体积为1和5ml。
  配方   A   B   C
  rFVIIa(mg/ml)   0.6   1.0   1.0
  CaCl2(mM)   10   10   10
  甘氨酰甘氨酸   10   10   10
  L-组氨酸(mM)   -   10   10
  NaCl(mM)   50   39   39
  吐温80(mg/ml)   0.038   0.07   0.07
  甲硫氨酸(mg/ml)   -   0.5   2.0
  甘露醇(mg/ml)   30   25   25
  蔗糖(mg/ml)   -   10   10
  pH   5.5   5.5   5.5
调查各配方在25℃、30℃、和40℃的稳定性，并获得了下列结果。分析前将小瓶复水。
二聚体和寡聚物形式
如实施例4中所述通过GP-HPLC测量二聚体和寡聚物的含量。所有结果表述成百分比。
5ml填充体积：
Figure GSA00000080853100341
1ml填充体积：
Figure GSA00000080853100342
另外，可以由图2a看出配方A(Ref)和配方B(New)中聚集体形式的含量，填充体积5ml。
氧化形式
如实施例4中所述通过RP-HPLC测量氧化形式的含量。
5ml填充体积：
Figure GSA00000080853100351
1ml填充体积：
Figure GSA00000080853100352
另外，由图2b可以看出配方A(Ref)和配方B(New)中氧化形式的含量。
活性
如实施例12中所述通过一步凝结测定法对已经于30℃贮藏3个月的配方测量活性。根据配方中的rFVIIa含量计算比活，并获得了下列结果。
  配方   比活(IU/mg)
  A   50523
  B   58373
  C   60318
对结果的解释：
结果显示，包含甘露醇、蔗糖、和甲硫氨酸的配方B和C更加稳定-即二聚体和寡聚物形式以及氧化形式的含量增加较慢。因此，于30℃贮藏3个月后这些配方的活性较高。
实施例10
如实施例2中所述配制下列配方，填充体积5ml。
  配方   A   B   C   D   E
  rFVIIa(mg/ml)   1.0   1.0   1.0   1.0   1.0
  CaCl2(mM)   10   10   10   10   10
  甘氨酰甘氨酸(mM)   10   10   10   10   10
  L-组氨酸(mM)   10   10   10   10   10
  NaCl(mM)   39   39   39   39   39
  甲硫氨酸(mg/ml)   0.5   0.5   0.5   0.5   0.5
  吐温20(mg/ml)   0.1
  吐温80(mg/ml)   0.1
  泊洛沙姆188(mg/ml)   1.0
  Brij 35(mg/ml)   0.1
  甘露醇(mg/ml)   25   25   25   25   25
  蔗糖(mg/ml)   10   10   10   10   10
  pH   5.5   5.5   5.5   5.5   5.5
将小瓶复水，并摇动19小时，以测试配方的物理稳定性。通过目测和400nm的UV吸光率测量(下表中的吸光率)来研究摇动效果。下面的结果清楚显示了通过添加去污剂获得了物理稳定性的增加。
Figure GSA00000080853100361
实施例11
如实施例2中所述配制六种配方。配方的组成是：
rFVIIa        1.0mg/ml
CaCl2         10mM
甘氨酰甘氨酸  10mM
L-组氨酸      10mM
NaCl          39mM
吐温80        0.07mg/ml
甘露醇        25mg/ml
蔗糖          10mg/ml
将六种配方分别调至不同pH：
配方A：pH5.0
配方B：pH5.5
配方C：pH6.0
配方D：pH6.5
配方E：pH7.0
配方F：pH7.5
调查了六种配方于25℃和40℃进行小瓶贮藏的稳定性。获得了下表所示结果(以及图1a和1b)。
Figure GSA00000080853100371
Figure GSA00000080853100381
二聚体和寡聚物形式以及氧化形式的含量是如实施例4中所述测定的。
实施例12：用于测试因子VII多肽的生物学活性的测定法
因子VIIa活性的测试：
可以通过简单的初步体外测试(“体外水解测定法”)来进行测试因子VIIa活性从而选择合适因子VIIa变体的合适测定法。
体外水解测定法
可以测定天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(二者在下文中都称为“因子VIIa”)的比活。可以进行平行测定，从而直接比较它们的比活。该测定法是在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行的。向因子VIIa(终浓度100nM，溶于含有0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4)中加入呈色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺(S-2288，Chromogenix，瑞典)至终浓度1mM。在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，美国)中连续测量405nm的吸光率。将保温20分钟期间形成的吸光率减去不含酶的空白孔的吸光率，用于计算变体与野生型因子VIIa的活性之间的比率：
比率＝(因子VIIa变体的405nm吸光率)/(野生型因子VIIa的405nm吸光率)。
据此，可能鉴定出与天然因子VIIa相比活性相当或更高的因子VIIa变体，诸如例如变体的活性与天然因子VII(野生型因子VII)的活性之间的比率接近或超过1.0的变体。
还可以使用生理学底物来测量因子VIIa或因子VIIa变体的活性，诸如因子X，合适的浓度是100-1000nM，其中在加入合适呈色底物(如S-2765)后测量所生成的因子Xa(“体外蛋白水解测定法”)。另外，活性测定法可以在生理温度进行。
体外蛋白水解测定法
平行测定天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(二者在下文中都称为“因子VIIa”)，从而直接比较它们的比活。该测定法是在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行的。将因子VIIa(10nM)和因子X(0.8μM)(溶于100μl含0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mMHepes pH7.4)保温15分钟。然后加入50μl含有0.1M NaCl、20mM EDTA、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4终止对因子X的切割。加入呈色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)至终浓度0.5mM，测量所生成的因子Xa的量。在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，美国)中连续测量405nm的吸光率。将10分钟内形成的吸光率减去不含FVIIa的空白孔的吸光率，用于计算变体与野生型因子VIIa的蛋白水解活性之间的比率：
比率＝(因子VIIa变体的405nm吸光率)/(野生型因子VIIa的405nm吸光率)。
据此，可能鉴定出与天然因子VIIa相比活性相当或更高的因子VIIa变体，诸如例如变体的活性与天然因子VII(野生型因子VII)的活性之间的比率接近或超过1.0的变体。
凝血酶生成测定法：
可以在包含生理浓度的所有相关凝血因子和抑制剂以及活化血小板的测定法中测量因子VII或因子VII相关多肽或者因子VIII或因子VIII相关多肽(如变体)生成凝血酶的能力，如Monroe等人，Brit.J.Haematol.， 99：542-547，1997的第543页所述(收入本文作为参考)。
凝结测定法：
还可以使用一步凝结测定法(测定法4)来测量因子VII多肽的活性，该方法基本上如WO 92/15686或US 5,997,864中所述进行。简而言之，将待测样品在50mM Tris(pH 7.5)、0.1％BSA中稀释，并取100μl与100μl缺乏因子VII的血浆和200μl含10mM Ca2+的促凝血酶原激酶C一起保温。测量凝结时间，并与使用连续稀释的参考标准或含柠檬酸盐的正常人血浆合并液获得的标准曲线进行比较。

Claims (54)

1.一种组合物，其中包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
2.依照权利要求1的组合物，其中抗氧化剂与甘露醇的组合还包含糖类。
3.依照权利要求1的组合物，其中甲硫氨酸与多元醇的组合还包含糖类。
4.依照权利要求1的组合物，其中糖类与甘露醇的组合还包含抗氧化剂。
5.依照权利要求1的组合物，其中蔗糖与多元醇的组合还包含抗氧化剂。
6.依照上述权利要求任一项的组合物，其中抗氧化剂选自下组：同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、和谷胱甘肽之任意一种的肽。
7.依照上述权利要求任一项的组合物，其中糖类选自下组：蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖。
8.依照上述权利要求任一项的组合物，其中多元醇选自下组：甘露醇、山梨醇、和木糖醇。
9.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量大约5％w/w、优选不超过大约4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、1.5％w/w、或1.0％w/w的因子VII多肽转变成聚集体。
10.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物是稳定的，从而在将该组合物于30℃贮藏8个月后不超过初始含量大约6％、优选不超过大约5％w/w、4.0％w/w、3.0％w/w、2.5％w/w、2.0％w/w、或1.5％w/w的因子VII多肽转变成氧化形式。
11.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述多元醇的存在量范围是大约5％w/w-90％w/w、优选大约18％w/w-88％w/w、18％-83％、25％-80％、40％-80％、50％-80％或大约50％w/w-70％w/w。
12.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述糖类的存在量范围是大约0％w/w-85％w/w、优选大约3％w/w-80％w/w、7％-75％、10％-70％、10％-50％、10％-40％、或大约10％w/w-35％w/w。
13.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述多元醇与所述糖类的重量比率的范围是大约100∶1-1∶50、优选大约50∶1-1∶10、20∶1-1∶5、10∶1-1∶2、6∶1-1∶2、4∶1-1∶1、或大约4∶1-3∶2。
14.依照上述权利要求任一项的组合物，其中还包含适于在溶于水性溶剂时将所述组合物的pH维持在3-9范围内的试剂，pH优选在4-7范围内，更优选在4.5-6.5范围内，甚至更优选在5-6范围内。
15.依照权利要求14的组合物，其中所述试剂选自下组：柠檬酸盐、醋酸盐、组氨酸、苹果酸盐、磷酸盐、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、PIPES、咪唑、TRIS、乳酸盐、谷氨酸盐、和甘氨酰甘氨酸。
16.依照上述权利要求任一项的组合物，其中还包含张力调节剂。
17.依照权利要求16的组合物，其中张力调节剂选自下组：醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、和氯化钙。
18.依照上述权利要求任一项的组合物，其中还包含表面活性剂。
19.依照权利要求18的组合物，其中表面活性剂选自下组：聚山梨酸酯，诸如聚山梨酸酯20或80；聚氧乙烯烷基醚，诸如Brij 35
Figure FSA00000080853000021
或泊洛沙姆，诸如泊洛沙姆188或407；以及其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物或聚乙二醇(PEG)，诸如PEG 8000。
20.依照上述权利要求任一项的组合物，其中还包含担当膨胀剂的其它制药学赋形剂。
21.依照上述权利要求任一项的组合物，其中糖类是蔗糖。
22.依照上述权利要求任一项的组合物，其中多元醇是甘露醇。
23.依照上述权利要求任一项的组合物，其中因子VII多肽选自下组：人因子VIIa、重组人因子VIIa、和因子VII序列变体。
24.依照权利要求23的组合物，其中因子VII多肽是人因子VIIa或重组人因子VIIa。
25.依照权利要求1-23任一项的组合物，其中因子VII多肽是因子VII相关多肽，在本说明书所述“体外蛋白水解测定法”和“体外水解测定法”中一种或多种方法中进行测试时，所述因子VII相关多肽与野生型因子VII的活性比率是至少1.25。
26.依照权利要求23-25任一项的组合物，其中因子VII多肽存在的浓度是大约0.6mg/ml-大约10.0mg/ml，诸如大约0.6mg/ml-大约6mg/ml、大约0.6mg/ml-大约5mg/ml、或大约0.6mg/ml-大约4mg/ml。
27.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述含湿量不超过大约2.5％w/w，优选不超过大约2％w/w，最优选不超过大约1.5％w/w。
28.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物是冻干块。
29.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物包含因子VII多肽、甘露醇、蔗糖和选自下组的表面活性剂：聚山梨酸酯或泊洛沙姆，诸如吐温80
Figure FSA00000080853000031
或泊洛沙姆188
Figure FSA00000080853000032
。
30.依照权利要求29的组合物，其中还包含甲硫氨酸。
31.依照权利要求29或30任一项的组合物，其中还包含L-组氨酸。
32.依照权利要求29-31任一项的组合物，其中还包含一种或多种选自下组的成分：CaCl2、NaCl、和甘氨酰甘氨酸。
33.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物选自下表配方A-D：
  化合物   配方A   配方B   配方C   配方D   FVII多肽   0.6-10mg/ml   0.6-10mg/ml   0.6-10mg/ml   0.6-10mg/ml   CaCl2·2H2O   5-20mM   5-20mM   5-20mM   5-20mM   NaCl   0-50mM   0-50mM   0-50mM   0-50mM   甘氨酰甘氨酸   0-15mM   0-15mM   0-15mM   0-15mM   L-组氨酸   0-20mM   0-20mM   0-20mM   0-20mM
  甘露醇   20-40mg/ml   20-40mg/ml   20-40mg/ml   20-40mg/ml   蔗糖   5-20mg/ml   -   -   5-20mg/ml   甲硫氨酸   0-1mg/ml   0-1mg/ml   0-1mg/ml   0-1mg/ml   吐温80   0.05-0.15mg/ml   0.05-0.15mg/ml   -   -   泊洛沙姆188   -   -   0.5-3mg/ml   0.5-3mg/ml   pH   5.0-7.0   5.0-7.0   5.0-7.0   5.0-7.0
34.依照上述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物选自下表配方Ex-Lx：
  化合物   配方Ex   配方Fx   配方Gx   配方Hx   FVIIa多肽   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml   CaCl2·2H2O   10mM   10mM   10mM   10mM   NaCl   39mM   39mM   39mM   39mM   甘氨酰甘氨酸   10mM   10mM   10mM   10mM   甘露醇   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml   蔗糖   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml   甲硫氨酸   0.5mg/ml   0.5mg/ml   0.5mg/ml   0.5mg/ml   吐温80   0.1mg/ml   -   0.1mg/ml   -   泊洛沙姆188   -   1.0mg/ml   -   1.0mg/ml   L-组氨酸   -   -   10mM   10mM   pH   5.5-6.0   5.5-6.0   5.5-6.0   5.5-6.0   化合物   配方Ix   配方Jx   配方Kx   配方Lx   FVII多肽   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml   1.0mg/ml   CaCl2·2H2O   10mM   10mM   10mM   10mM
  NaCl   39mM   39mM   39mM   39mM   甘氨酰甘氨酸   10mM   10mM   10mM   10mM   甘露醇   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml   25mg/ml   蔗糖   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml   10mg/ml   甲硫氨酸   -   -   -   -   吐温80   0.1mg/ml   -   0.1mg/ml   -   泊洛沙姆188   -   1.0mg/ml   -   1.0mg/ml   L-组氨酸   -   -   10mM   10mM   pH   5.5-6.0   5.5-6.0   5.5-6.0   5.5-6.0
35.依照权利要求29-34任一项的组合物，其中因子VII多肽是人因子VIIa。
36.用于制备稳定的因子VII多肽的方法，包括下列步骤：
1)在包含至少一种选自下组的稳定剂的溶液中提供所述因子VII多肽：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
2)加工所述溶液以获得含湿量不超过大约3％w/w的固体组合物。
37.依照权利要求36的方法，其中抗氧化剂选自下组：同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和谷胱甘肽中任意一种的肽。
38.依照权利要求36或37的方法，其中所述糖类选自下组：蔗糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糖糊精、和葡聚糖。
39.依照权利要求36-38任一项的方法，其中所述多元醇选自下组：甘露醇、山梨醇、和木糖醇。
40.依照权利要求36-39任一项的方法，其中所述多元醇存在的量是大约0.5-大约75mg/ml，优选大约2-45mg/ml，诸如大约5mg/ml-45mg/ml、大约5-35mg/ml、大约5-25mg/ml、5-20mg/ml、20-40mg/ml、或大约20-大约30mg/ml。
41.依照权利要求36-40任一项的方法，其中所述糖类存在的量是大约0.5-大约75mg/ml，优选大约2-45mg/ml，诸如大约5mg/ml-45mg/ml、大约5-35mg/ml、大约5-25mg/ml、或大约5-20mg/ml。
42.依照权利要求36-41任一项的方法，其中所述抗氧化剂的存在量范围是大约0.05-10mg/ml，优选大约0.1-5mg/ml，更优选大约0.1mg/ml-2.5mg/ml，甚至更优选大约0.1-2mg/ml，最优选大约0.1-1mg/ml。
43.依照权利要求36-42任一项的方法，其中糖类是蔗糖。
44.依照权利要求36-43任一项的方法，其中抗氧化剂是甲硫氨酸。
45.依照权利要求36-43任一项的方法，其中多元醇是甘露醇。
46.依照权利要求36-45任一项的方法，其中所述加工包括冻干。
47.用于治疗因子VII反应性综合症的方法，包括对有此需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
48.依照权利要求47的方法，其中所述综合症选自下组：血友病A、血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术、创伤、稀释性凝血症、抗凝剂疗法。
49.依照权利要求47或48任一项的方法，包括在施用步骤之前将组合物溶于合适液体的步骤。
50.依照权利要求47-49任一项的方法，其中组合物如权利要求1-33任一项定义。
51.因子VII多肽用于配制治疗因子VII反应性综合症的药物中的用途，所述药物包含含有因子VII多肽和至少一种选自下组的稳定剂的组合物：
i.抗氧化剂与甘露醇的组合；
ii.甲硫氨酸与多元醇的组合；
iii.糖类与甘露醇的组合；
iv.蔗糖与多元醇的组合；和
v.甲硫氨酸；
所述组合物具有不超过大约3％的含湿量。
52.依照权利要求51的用途，其中所述综合症选自下组：血友病A、血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、存在凝结因子抑制剂、手术、创伤、和抗凝剂疗法。
53.依照权利要求51或52任一项的用途，其中所述药物适于溶解。
54.依照权利要求51-53任一项的用途，其中所述组合物如权利要求1-35中任一项定义。
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