CN101904848B - 增强红细胞生成的HIFα稳定剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节或增强红细胞生成和铁代谢、及治疗或预防缺铁和慢性疾病性贫血的方法和化合物。

Description

增强红细胞生成的HIFα稳定剂的应用
本申请是2004年6月4日提交的题为“增强红细胞生成的HIFα稳定剂的应用”的中国专利申请200480019307.0的分案申请。
本申请要求2003年6月6日递交的序列号为60/476,704的、2004年4月29日递交的序列号为60/566,488的、2004年4月29日递交的序列号为60/566,237的、以及2004年5月10日递交的序列号为60/569,797的美国临时申请的优先权。所有上述申请以其全文并入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及用于调节或增强红细胞发生和铁代谢、治疗或预防缺铁和慢性疾病性贫血的方法和化合物。
发明背景
贫血一般是指导致血液中氧的水平降低的血红蛋白或红细胞的任何异常。贫血也可以与例如慢性感染、肿瘤疾病、慢性炎症包括接下来发生骨髓的炎症性抑制的病变等慢性疾病相关而发生。慢性疾病性贫血是医学领域中最常见的综合征之一。
慢性疾病性贫血(anemia of chronic disease，ACD)通常与缺铁相关。ACD可由于铁的利用度不充分(例如缺铁性贫血)或者在整个机体的铁是足够的但血红蛋白生成缺陷(例如功能性缺铁)而发生。铁是骨髓红细胞生成前体细胞产生红细胞血红蛋白所必需的。
在慢性疾病性贫血的患者中观测到许多生理学缺陷，包括红细胞生成素(EPO)产生降低，骨髓的EPO应答降低、及铁代谢降低，包括从肠道吸收的铁减少，跨肠细胞转运的铁减少，由膜铁转运辅助蛋白(hephaestin)或血浆铜蓝蛋白将铁氧化为三价铁状态的铁氧化作用降低，由运铁蛋白和运铁蛋白受体进行的铁的结合及摄取降低，及至骨髓(利用铁的部位，包括血红素合成)的铁的转运降低。单独地或协同地，这些生理性缺陷导致了红细胞生成无效或削弱，引起与血红蛋白产生减少及氧的转运降低相关的小红细胞性贫血和低血色素红细胞。
慢性疾病性贫血与炎性细胞因子的产生增加相关(Means(1995)Stem cells 13：32-37及Means(1999)Int J Hematol 70：7-12)，所述细胞因子包括例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)。在一些体外和体内动物模型系统中，炎性细胞因子负面影响介导EPO产生、EPO应答及铁代谢的协同调节的能力(Roodman et al.(1989)Adv Exp Med Biol 271：185-196；Fuchs et al.(1991)Eur J Hematol 46：65-70；Jelkmann et al.(1994)Ann NY Acad Sci718：300-311；Vannucchi et al.(1994)Br J Hematol 87：18-23；及Oldenburg et al.(2001)Aliment Pharmacol Ther 15：429-438)。给予红细胞生成素不能逆转持续暴露于TNF-α的小鼠的贫血状况(Clibon et al.(1990)Exp Hematol 18：438-441)。炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β和INF-γ的水平增加导致在慢性疾病性贫血患者中观察到缺陷的EPO产生和EPO抗性(Jelkmannet al.(1991)Ann NY Acad Sci 718：300-311及Macdougall and Cooper(2002)Neprol Dial Transplant 17(11)：39-43)。因此，有各种各样的细胞因子，例如炎性细胞因子和与炎症相关的细胞因子，参与慢性疾病性贫血发病机理的许多方面，包括造血祖细胞的抑制、EPO产生的抑制及用于红细胞发生的铁的释放和铁利用度的削弱。
因此本领域需要治疗或预防慢性疾病性贫血的方法。本领域还需要克服目前应用重组EPO治疗慢性疾病性贫血的方法的不足之处。特别地，本领域还需要通过改善与EPO产生、EPO应答和信号传导及铁的利用度、利用、摄取、转运、加工等相关的代谢途径以生产有效克服与慢性疾病性贫血相关的EPO产生抑制及EPO应答降低的方法和化合物、有效增强铁代谢的调节及克服铁代谢和利用改变或异常的方法和化合物、以及有效增强全部或完全的红细胞生成的方法和化合物。本领域还需要克服或改善慢性疾病性贫血患者体内细胞因子诱导的作用结果的方法。
缺铁是全世界最常见的营养缺乏症之一，并且是在全球基础上导致贫血的主要原因。铁平衡主要是由红细胞生成的速度和铁贮存的大小而调节的。缺铁可以伴随贫血或不贫血，并且与认知发展减弱相关。
缺铁是指铁的供给(水平或贮存)不足或者机体铁的利用度或利用不足。这可以归因于营养缺乏，例如饮食中缺少铁；归因于例如手术(胃切除术后)或疾病(克隆氏病(Crohn′s disease))导致的铁吸收障碍；或者归因于由于受伤或外伤、月经、献血、抽血(如各种程序、手术所致)所致慢性或急性失血引起的铁供给中的损耗或者铁丧失增加；或者归因于例如婴幼儿或青春期、妊娠期、红细胞生成素治疗等中的快速生长所致的铁的需要增加。
缺铁也可以是功能性缺铁，例如特征在于患者取得和利用铁贮存的能力减弱引起的缺铁。铁的比率不足以使得红细胞正常血红蛋白化，导致网织红细胞和红细胞血红蛋白含量减少。功能性缺铁经常可见于健康个体，铁的贮存显然正常甚至增加，但是铁的利用度削弱，如通过例如低水平的运铁蛋白饱和度百分比测定到的。这种类型的缺铁通常与急性或慢性炎症相关。
任何种类的缺铁均可以导致缺铁性或铁受限性红细胞生成，其中红细胞数目减少并且循环中的红细胞比正常红细胞小(小红细胞)，并且缺乏足够的血红蛋白，颜色是苍白的(低血色素)。
缺铁包括功能性缺铁的患者可以发展为血红蛋白合成削弱、运铁蛋白饱和度百分比降低、及血红蛋白和血细胞比容水平降低，导致缺铁性贫血。缺铁性贫血是世界上最常见的贫血。铁是血红蛋白的必需成分；没有铁则骨髓不能有效地产生血红蛋白。缺铁性贫血可以发生在铁供给耗竭或削弱的患者，或者可以在铁以贮存形式存在但不可利用，例如不可用于血红蛋白产生时发生在功能性缺铁的患者中。
综上所述，本领域需要治疗或预防与铁代谢相关的疾病的方法，及需要增强铁代谢的方法。本领域需要治疗或预防缺铁，包括功能性缺铁的方法，及需要治疗或预防与如小红细胞症和缺铁性贫血相关的病变的方法。
本发明提供了用于增强有助于完全和有效的红细胞生成的代谢和生理学途径的方法和化合物，特别提供了用于治疗慢性疾病性贫血的方法和化合物。本发明还提供了用于克服炎性细胞因子对EPO产生和应答的阻抑/抑制作用的方法和化合物。另外，本发明还提供了用于增强铁代谢、治疗或预防与铁代谢减弱相关的病变如缺铁包括功能性缺铁、缺铁性贫血、小红细胞症、缺铁性红细胞生成等的方法和化合物。
发明概述
本发明涉及用于在对象中诱导增强的或完全的红细胞生成的方法和化合物。特别地，所述方法包括通过稳定对象中的HIFα而诱导增强的或完全的红细胞生成。本发明特别涉及通过抑制HIF脯氨酰羟化酶而诱导增强的红细胞生成。在特别的实施方案中，所述方法包括给予对象本发明的化合物。
在各种实施方案中，所述对象可以是细胞、组织、器官、器官系统或整个生物体。在特别的实施方案中，所述生物体是哺乳动物，优选是人。
一方面，所述方法增加了红细胞从造血祖细胞包括例如造血干细胞(HSC)、CFU-GEMM(集落形成单位粒细胞/类红细胞/单核细胞/巨核细胞)细胞等中分化所需的因子的产生。刺激红细胞生成的因子包括但非限于红细胞生成素。另一方面，所述方法增加了铁的摄取、转运和利用所需要的因子的产生。这些因子包括但非限于类红细胞氨基乙酰丙酸合酶、运铁蛋白、运铁蛋白受体、血浆铜蓝蛋白等。再一方面，所述方法增加了红细胞分化所需的因子及铁摄取、转运和利用所需的额外的因子。
在另一个实施方案中，本发明的方法增强了造血前体细胞对红细胞生成素的应答。如上所述，这种前体细胞包括HSC、CFU-GEMM等。所述前体细胞的应答可以例如通过改变红细胞生成素受体、参与红细胞生成素信号传导的胞内因子及促进红细胞生成素与受体相互作用的分泌因子的表达而增强。
另一方面，所述方法可用于克服炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等诱导的红细胞生成的抑制。特别地，所述方法可用于治疗对外源给予的红细胞生成素有抗性的贫血。这种贫血可以是例如由慢性炎症或自身免疫疾病包括但非限于慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、风湿性关节炎、风湿热、克隆氏病和溃疡性结肠炎所致。
在某些实施方案中，本发明的方法可用于治疗慢性疾病性贫血。本发明特别提供了诱导慢性疾病性贫血患者体内增强的或完全的红细胞生成的方法。在特殊的实施方案中，所述方法增加了可利用的铁的量以产生新的红细胞。
另一方面，本发明提供了用于增强骨髓EPO应答的方法。
本发明特别提供了用于抑制TNF-α对EPO的抑制的方法，及抑制IL-1β对EPO的抑制的方法。
本发明涉及用于治疗/预防慢性疾病性贫血的方法，及调节铁的加工的方法以及用于治疗/预防与缺铁和/或铁加工缺乏相关的病变的方法。
一方面，本发明提供了用于治疗对象慢性疾病性贫血的方法，所述方法包括给予对象有效量的可以稳定缺氧诱导因子(hypoxiainducible factor，HIF)的α亚基的化合物，从而治疗受试者的慢性疾病性贫血。本发明还提供了在患有慢性疾病性贫血患者体内达到特殊生理学作用的方法，本发明特别涉及在患有慢性疾病性贫血的患者体内增加网织红细胞、增加平均红细胞体积、增加平均红细胞血红蛋白量、增加血细胞比容、增加血红蛋白及增加红细胞计数等的方法，每种方法均包括给予患者有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物，从而达到希望的生理学作用。在各个方面，所述慢性疾病性贫血与例如炎症、自身免疫疾病、缺铁、小红细胞症、恶性肿瘤等相关。
在各种实施方案中，所述对象是细胞、组织或器官。在其它实施方案中，所述对象是动物，优选哺乳动物，最优选是人。当所述对象是细胞时，本发明特别包括了所述细胞可以是分离的细胞，原核或真核细胞都可以。在所述对象是组织的情况中，本发明特别包括了内源组织和体外组织，例如培养物中生长的组织。在优选的实施方案中，所述对象是动物，特别是哺乳动物物种的动物，包括大鼠、兔、牛、绵羊、猪、鼠、马、和灵长类动物物种。在最优选的实施方案中，所述对象是人。
HIFα的稳定可以通过本领域技术人员可利用的及已知的的任何方法实现，并且可以包括使用与HIFα或与HIFα相互作用的因子相互作用、结合或修饰它们的任何制剂(包括例如底物是HIFα的酶)。在某些方面，本发明包括提供了组成型稳定的HIFα变体，例如稳定的HIF突变蛋白等，或者编码这种变体的多核苷酸。在其它方面，本发明包括稳定HIFα，包括给予稳定HIFα的制剂。所述制剂可以由多核苷酸例如反义序列、多肽、抗体、其它蛋白质、碳水化合物、脂肪、脂质、及有机物和无机物例如小分子等组成。
在一个优选的实施方案中，本发明包括通过给予对象稳定HIFα的制剂而稳定例如在所述对象中的HIFα，其中所述制剂是一种稳定HIFα的化合物，例如小分子化合物等。
在各个方面，HIFα是HIF1α、HIF2α或HIF3α。在一优选的方面，稳定HIFα包括给予对象有效量的抑制HIF羟化酶活性的一种化合物。在某些方面，所述HIF羟化酶选自由EGLN1、EGLN2和EGLN3组成的一组。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加对象平均红细胞体积的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于增加对象中平均红细胞血红蛋白水平的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在另一个实施方案中，本发明涵盖了一种用于减少对象小红细胞症的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。
本发明进一步提供了一种用于治疗或预防小红细胞性贫血的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。
一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防对象的与缺铁相关的病变的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在一特殊方面，本发明提供了一种用于改善对象中铁加工的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。本发明还提供了一种用于治疗或预防对象中铁利用度降低相关的病变的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。
在其它的实施方案中，本发明涉及一种用于克服对象中细胞因子诱导的效应的方法。特别地，本发明一方面提供了一种用于克服对象中细胞因子对EPO产生的抑制作用的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。本发明进一步提供了一种用于克服对象中细胞因子对铁利用度的抑制作用的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。另一方面，本发明涵盖了一种用于治疗或预防对象中细胞因子相关的贫血的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。本发明还提供了在对象中存在细胞因子的情况中用于增加EPO产生的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在特殊的实施方案中，所述细胞因子选自包括TNF-α和IL-1β的一组。
一方面，本发明提供了一种减少对象中细胞因子诱导的VCAM表达的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在一特殊方面，所述细胞因子是TNF-α或IL-1β。一方面，所述方法用于减少内皮细胞中细胞因子诱导的VCAM表达。另一方面，所述对象患有选自由炎症疾病、自身免疫疾病和慢性疾病性贫血组成的一组的病变。
另一方面，本发明提供了一种用于减少对象中细胞因子诱导的E-选择蛋白表达的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子的α亚基的化合物。
在一特殊方面，所述细胞因子是TNF-α或IL-1β。一方面，所述方法用于减少对象中细胞因子诱导的E-选择蛋白在内皮细胞中的表达。另一方面，所述对象患有选自炎症疾病、自身免疫疾病和慢性疾病性贫血的一组的病变。
本发明提供了用于各种调节/增强铁加工和铁代谢的方法。一方面，本发明提供了用于增加对象中铁的转运、摄取、利用和吸收的方法，每种方法均包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在特殊的实施方案中，本发明提供了用于增加运铁蛋白表达、运铁蛋白受体表达、IRP-2表达、铁蛋白表达、血浆铜蓝蛋白表达、NRAMP2表达、sproutin表达和ALAS-2表达的方法，每种方法均包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在其它的实施方案中，本发明提供了用于降低海帕西啶(hepcidin)表达的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。本发明还提供了通过给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物而增加对象血红素合成的方法。
在某些方面，本发明涉及用于增加对象中血清铁、增加运铁蛋白饱和度、增加可溶的运铁蛋白受体水平、及增加血清铁蛋白水平的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。在进一步的方面，本发明提供了用于增加对象中铁运至骨髓的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定缺氧诱导因子(HIF)的α亚基的化合物。
一方面，本发明的方法用于治疗患有本文所述任何疾病或病变的对象，优选人，或者用于生产治疗本文所述任何疾病或病变的药物。应理解与临床病变相关的各种参数可以根据年龄、性别等加以变化。一方面，所述对象的血清铁蛋白水平低于正常范围，例如低于50-200μg/L；因此血清铁蛋白水平低于200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、75ng/ml及50ng/ml的对象可以是适于本发明提供的方法和应用本发明的药物进行治疗的对象。或者，合适的对象可以通过表明总的铁结合能力(TIBC)低于正常范围而鉴别，例如TIBC低于300-360μg/dL。
在另一个实施方案中，所述对象的血清铁水平低于正常范围，例如低于50-150μg/dL。用于鉴别合适的对象的其它适当的参数包括运铁蛋白饱和度测定值低于30-50％，骨髓成高铁红细胞测定值低于40-60％，血红蛋白水平低于大约10-11g/dL。上述任何参数均是在例如标准血液学检验、血液化学和全血计数(CBC)分析中测定，典型地以一些血液参数的测定值表示，例如通过测定红细胞计数、白细胞计数、血小板计数和红细胞指数的自动设备分析血液而获得。可以通过血液学和/或生物化学血液分析的任何标准设备进行测定，所述设备包括例如自动系统如CELL DYN 4000分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park IL)、Coulter GenS分析仪(Beckman Coulter，Inc.，FullertonCA)、Bayer ADVIA 120分析仪(Bayer Healthcare AG，Leverkusen，Germany)等等。
一方面，本发明涵盖了一种用于治疗或预防对象中缺铁的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防对象中的缺铁情况。进一步地，所述缺铁是功能性缺铁；与贫血相关；与选自由炎症、感染、免疫缺陷疾病和肿瘤疾病组成的一组的病变相关；或者与选自由慢性疾病性贫血、缺铁性贫血(IDA)和小红细胞性贫血组成的一组的病变相关。
本发明的对象可以是具有临床公认的缺铁的或处于发生缺铁危险中的标准测定指征的对象。例如，在某些实施方案中，所述对象血清铁蛋白水平低(＜20ng/ml)，或者运铁蛋白饱和度百分比降低，例如低于16％(成人)。特别涉及血清铁蛋白水平低于50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml。注意如果所述对象的缺铁是功能性缺铁，则血清铁蛋白水平可以增高至正常范围以上，例如200ng/ml及更高。缺铁可以通过发生铁受限的/缺铁的红细胞生成而观测到(当运铁蛋白饱和度百分比下降至低于15-20％时，典型观测到血红蛋白合成减少)。这些铁的参数可以使用上述任何标准的CBC或生物化学分析测定，和/或通过使用更特异地针对铁进行分析的自动设备测定，例如使用Unimate 5 Iron和Unimate 7 UIBC试剂盒(Roche，Switzerland)。
可得益于本发明的治疗或预防方法的对象可以是患有或处于缺铁性贫血危险中的对象，例如运铁蛋白饱和度在10-15％或低于10％的对象。
一方面，患有或处于缺铁危险中的对象患有或处于患有功能性缺铁危险中。网织红细胞血红蛋白含量低于28皮克/细胞可以是这种病变的指征。另一方面，患有或处于患有功能性缺铁危险中的对象表现高于5％的低血色素红细胞。
在某些实施方案中，所述对象患有或处于患有慢性疾病性贫血危险中。这种对象可表现为轻度或中度贫血，例如血红蛋白水平为大约10-13g/dL，或者更特别地为10-11g/dL。在其它的实施方案中，表现为更急性的贫血，例如血红蛋白水平低于10g/dL，包括低于5g/dL及3g/dL。在一些实施方案中，患有或处于患有慢性疾病性贫血危险中的对象表现为铁的分布异常。这种异常可以是例如血清铁水平低于大约60μg/dL，或者血清铁蛋白水平高于正常范围，例如高于200ng/ml、高于300ng/ml或高于400ng/ml。
在某些方面，所述对象可以患有或处于患有小红细胞性贫血危险中。这种对象可例如表现为在全血计数分析中平均红细胞体积小于80飞升(femtoliter)。在其它方面，所述对象的平均红细胞体积小于正常体积(90±8飞升)。在各个方面，所述对象可以具有降低的平均细胞血红蛋白计数，例如平均血红蛋白计数低于30±3皮克血红蛋白/细胞，或者具有降低的平均细胞血红蛋白浓度，例如平均细胞血红蛋白浓度低于33±2％。
本发明还提供了一种用于治疗或预防对象功能性缺铁的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防功能性缺铁。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于调节或增强对象中铁代谢或铁代谢过程的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而调节或增强对象中铁代谢或铁代谢过程。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于调节或增强铁代谢过程的方法，所述铁代谢过程选自由铁的摄取、铁的吸收、铁的转运、铁的贮存、铁的加工、铁的动员及铁的利用组成的一组，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而调节或增强对象中的铁代谢过程。
本发明还提供一种用于增加对象中铁吸收的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的吸收。在某些方面，所述铁的吸收是在肠道内；是饮食中铁的吸收；或者在十二指肠肠细胞内吸收。
本发明还涉及如下方法：一种用于增加对象中铁的转运的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的转运；一种用于增加对象中铁的贮存的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的贮存；一种用于增加对象中铁的摄取的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的摄取；一种用于增加对象中铁的加工的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的加工；一种用于增加对象中铁的动员的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的动员；及一种用于增加对象中铁的利用的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中铁的利用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于增加对象中针对红细胞生成的铁利用度的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中针对红细胞生成的铁的利用度。在各种实施方案中，增加针对红细胞生成的铁利用度是增加对于血红素合成的铁利用度；是增加对于血红蛋白产生的铁利用度；或者是增加对于红细胞产生的铁利用度。
本发明进一步提供了用于调节对象中铁调节因子的表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而调节对象中铁代谢因子的表达。
本发明还涵盖了用于增加某些铁调节因子的表达的方法，包括：一种用于增加对象中运铁蛋白受体表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中运铁蛋白受体的表达；一种用于增加对象中运铁蛋白表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中运铁蛋白的表达；一种用于增加对象中血浆铜蓝蛋白表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血浆铜蓝蛋白的表达；一种用于增加对象中NRAMP2(slc11a2)表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中NRAMP2的表达；一种用于增加对象中十二指肠细胞色素b还原酶1表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中十二指肠细胞色素还原酶1的表达；及一种用于增加对象中5-氨基乙酰丙酸合酶表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中5-氨基乙酰丙酸合酶的表达。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加对象中血清铁水平的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血清铁水平。在某些实施方案中，所述对象是人，所述血清铁水平增加至50-150μg/dL。
另一方面，本发明提供了用于增加对象中总的铁结合能力(TIBC)的方法。所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中TIBC。在一优选方面，所述对象是人，所述总铁结合能力增加至300-360μg/dL。
本发明提供了用于在对象中调节血清铁蛋白水平的方法和化合物。在某一实施方案中，所述对象是人，所述血清铁蛋白水平增加至15μg/L以上。在另一个实施方案中，所述对象是成人男性，所述血清铁蛋白水平增加至大约100μg/L。在另一实施方案中，所述对象是成人女性，所述血清铁蛋白水平增加至大约30μg/L。
一方面，本发明包括一种用于增加对象中运铁蛋白饱和度的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象的运铁蛋白饱和度。一方面，所述运铁蛋白饱和度增加至高于一个选自由10％、15％、20％、30％、40％和50％组成的一组的水平。本发明涵盖了增加对象中运铁蛋白饱和度百分比的方法。在一个实施方案中，所述对象是人，所述运铁蛋白饱和度百分比增加至18％以上。在另一实施方案中，所述运铁蛋白饱和度百分比增加至25-50％。运铁蛋白饱和度百分比典型地使用公式“(血清铁)(100)/(TIBC)”计算。
本发明还提供了用于增加对象中可溶的运铁蛋白受体水平的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象的可溶的运铁蛋白受体水平。本发明进一步提供了增加通过例如血清运铁蛋白受体水平测定的总的类红细胞骨髓量的方法。一方面，所述对象是人，所述血清运铁蛋白受体水平通过免疫分析确定增加至4-9μg/L。
本发明提供了一种用于降低对象中海帕西啶(hepcidin)表达的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而降低对象中海帕西啶的表达。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗或预防对象与缺铁相关的病变的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防与对象缺铁相关的病变。在一个实施方案中，所述缺铁是功能性缺铁。在各种实施方案中，所述疾病选自由炎症、感染、免疫缺陷疾病及肿瘤疾病组成的一组；或者选自由慢性疾病贫血症、缺铁性贫血和小红细胞性贫血组成的一组。
本发明提供了一种用于增强患有或处于患有缺铁危险中的对象中红细胞生成的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增强对象中的红细胞生成。本发明包括了在某一方面所述缺铁是功能性缺铁。
本发明进一步提供了一种用于增强对象中红细胞生成的方法，其中所述对象具有或者处于具有功能性缺铁的危险中，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增强对象中红细胞生成。在各个方面，所述慢性疾病选自由炎症、感染、免疫缺陷疾病和肿瘤疾病组成的一组。
本发明另外提供了一种用于增强对象中红细胞生成的方法，其中所述对象具有或者处于具有慢性疾病性贫血的危险中，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增强对象中红细胞生成。
在一个实施方案中，本发明涵盖了一种用于增强对象中红细胞生成的方法，其中所述对象EPO治疗难以奏效，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增强对象中红细胞生成。
本发明还提供了一种用于治疗或预防对象的慢性疾病性贫血的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防对象的慢性疾病性贫血。在某些方面涉及所述慢性疾病性贫血与选自由炎症、感染、免疫缺陷疾病和肿瘤疾病组成的一组的病变相关。
本发明特别包括如下方法：一种用于增加患有慢性疾病的对象中网织红细胞的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中网织红细胞；一种用于增加患有慢性疾病的对象血细胞比容的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象血细胞比容；一种用于增加患有慢性疾病的对象中血红蛋白的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血红蛋白；一种用于增加患有慢性疾病的对象中红细胞计数的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中红细胞计数；一种用于增加患有慢性疾病的对象中平均红细胞体积的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中平均红细胞体积；一种用于增加患有慢性疾病的对象中平均红细胞血红蛋白的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中平均红细胞血红蛋白；一种用于增加患有慢性疾病的对象中血清铁水平的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血清铁水平；及一种用于增加患有慢性疾病的对象中运铁蛋白饱和度的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中运铁蛋白饱和度。在任一这些方法中，所述慢性疾病在某些实施方案中选自由炎症、感染、免疫缺陷疾病和肿瘤疾病组成的一组；或者选自由慢性疾病性贫血、缺铁性贫血、缺铁、功能性缺铁和小红细胞性贫血组成的一组。
本发明另外提供了如下方法：一种用于增加具有缺铁的对象中网织红细胞的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中网织红细胞；一种用于增加具有缺铁的对象中血细胞比容的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血细胞比容；一种用于增加具有缺铁的对象中血红蛋白的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血红蛋白；一种用于增加具有缺铁的对象中红细胞计数的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中红细胞计数；一种用于增加具有缺铁的对象中平均红细胞体积的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中平均红细胞体积；一种用于增加具有缺铁的对象中平均红细胞血红蛋白的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中平均红细胞血红蛋白；一种用于增加患有具有缺铁的对象中血清铁水平的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血清铁水平；及一种用于增加具有缺铁的对象中运铁蛋白饱和度的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中运铁蛋白饱和度。在任一这些方法中，所述缺铁在某些实施方案中是功能性缺铁。
本发明进一步涉及如下方法：一种用于增加具有功能性缺铁的对象中网织红细胞的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中网织红细胞；一种用于增加具有功能性缺铁的对象中血细胞比容的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血细胞比容；一种用于增加具有功能性缺铁的对象中血红蛋白的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血红蛋白；一种用于增加具有功能性缺铁的对象中红细胞计数的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中红细胞计数；一种用于增加具有功能性缺铁的对象中平均红细胞体积的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中平均红细胞体积；一种用于增加具有功能性缺铁的对象中平均红细胞血红蛋白的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中平均红细胞血红蛋白；一种用于增加具有功能性缺铁的对象中血清铁水平的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中血清铁水平；及一种用于增加具有功能性缺铁的对象中运铁蛋白饱和度的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中运铁蛋白饱和度。
一方面，本发明包括一种用于克服或改善对象中细胞因子诱导的红细胞生成减少所引起的后果的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定HIFα的化合物，从而克服或改善对象中细胞因子诱导的红细胞生成减少所引起的后果。在各个方面，所述细胞因子诱导的红细胞生成减少是EPO生成受抑制，或者铁的代谢削弱。在上述任何方法中，所述细胞因子是炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子选自由TNF-α、IL-1β和IFN-γ组成的一组。
本发明还提供了用于降低细胞因子诱导VCAM-1表达和/或E-选择蛋白表达的方法，所述方法包括给予对象有效量的稳定HIFα的化合物，从而降低细胞因子诱导VCAM-1表达和/或E-选择蛋白表达。
在上述任何方法中，所述细胞因子是炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子选自由TNF-α、IL-1β和IFN-γ组成的一组。
本发明提供了用于治疗或预防对象与细胞因子活性相关的疾病的方法，所述疾病选自由缺铁、功能性缺铁、缺铁性贫血、慢性疾病性贫血和小红细胞性贫血组成的一组，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防与细胞因子活性相关的疾病。在任何上述方法中，所述细胞因子是炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子选自由INF-α、IL-1β和IFN-γ组成的一组。
本发明还提供了用于治疗或预防对象与细胞因子活性相关的疾病的方法，所述疾病与选自由炎症、感染、免疫缺陷和肿瘤疾病组成的一组的病变相关，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防与细胞因子活性相关的疾病。在任何上述方法中，所述细胞因子是炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子选自由INF-α、IL-1β和IFN-γ组成的一组。
一方面，本发明涵盖了一种用于对象中存在细胞因子的情况下增加EPO产生的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而增加对象中EPO产生。本发明还提供了一种用于治疗或预防对象小红细胞症的方法，所述方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物，从而治疗或预防小红细胞症。进一步地，所述小红细胞症与选自慢性疾病、慢性疾病性贫血、缺铁、功能性缺铁和缺铁性贫血的疾病相关。在任何上述方法中，所述细胞因子是炎性细胞因子。在进一步的实施方案中，所述细胞因子选自由TNF-α、IL-1β和IFN-γ组成的一组。
在本发明的任何治疗或预防方法中，可以给予本发明的化合物作为组合治疗的一部分，另外包括给予另一种治疗剂，例如EPO、铁和维生素如B族维生素等等。
本发明提供了一种试剂盒，其包含一种稳定HIFα的化合物和至少一种其它补剂。一方面，所述补剂选自由红细胞生成素、铁和B族维生素组成的一组，本发明还提供了一种药物组合物，其包含一种稳定HIFα的化合物及选自由红细胞生成素、铁和B族维生素的至少一种补剂组成的一组。
本发明提供了用于治疗或预防慢性疾病性贫血的化合物和方法，其中所述慢性疾病性贫血与细胞因子水平升高相关。特别地，本发明提供了用于克服或改善细胞因子水平升高的对象中细胞因子诱导的作用结果的方法和化合物，所述细胞因子诱导的作用结果例如是细胞因子抑制EPO产生、细胞因子诱导的各种细胞粘着因子的表达等等。
在一个实施方案中，本发明提供了用于克服细胞因子抑制EPO产生的方法和化合物。这些方法和化合物用于克服TNFα和/或IL-1β抑制EPO产生，例如通过在培养的Hep3B细胞中克服TNFα和/或IL-1β抑制EPO产生的能力而测定。
在一个实施方案中，本发明提供了用于降低细胞因子诱导的各种细胞粘着因子表达增加的方法和化合物。所述方法和化合物可用于克服TNFα、IL-1β和IFN-γ诱导的内皮细胞粘着因子例如VCAM-1和E-选择蛋白表达增加，例如通过在内皮细胞(HUVEC等)中VCAM-1或E-选择蛋白的表达水平降低测定。
本发明提供了用于治疗或预防对象中缺铁的方法和化合物。特别地，本发明的方法和化合物可用于增强铁的代谢，或者用于治疗或预防与铁的代谢削弱相关的疾病和病变，例如铁的摄取、贮存、加工、转运、动员和利用等的削弱。
一方面，所述方法和化合物调节参与铁代谢(例如转运、利用、贮存等)的因子的表达。例如所述方法和化合物增加运铁蛋白受体的表达，例如通过肝细胞(例如Hep3B、HepG2)、肾细胞(例如HK-2)或淋巴细胞(例如HP-1)内运铁蛋白受体表达增加或者人受试者体内可溶的运铁蛋白受体水平增加而测定。本发明的方法和化合物增加血浆铜蓝蛋白基因表达，例如通过小鼠肾和Hep3B细胞中基因表达增加而测定。一方面，本发明提供了用于降低海帕西啶(hepcidin)基因表达的方法和化合物，例如通过小鼠肝脏内海帕西啶基因表达降低而测定。另一方面，本发明的方法和化合物用于增加一些因子包括NRAMP2、十二指肠细胞色素b还原酶1等的表达，例如通过小鼠肠道中基因表达增加而测定。本发明的方法和化合物增加5-氨基乙酰丙酸合酶的表达，例如通过小鼠肠道中基因表达增加而测定。这种酶是血红素合成途径中的第一种酶并且是血红素合成的限速酶。
本发明的方法和化合物可用于增强铁的代谢。特别地，所述方法和化合物增强铁的代谢，例如通过铁代谢削弱的大鼠模型中血清铁的水平增加、运铁蛋白饱和度百分比增加及小红细胞症减少而测定。
本发明提供了用于诱导红细胞生成增强的方法和化合物。特别地，本发明的方法和化合物增强红细胞生成，例如通过在红细胞生成削弱的大鼠模型或人体对象中网织红细胞计数、血细胞比容和红细胞计数增加而测定，或者通过例如在红细胞生成削弱的大鼠模型中血红蛋白水平增加而测定。
本发明的方法和化合物减轻小红细胞症，例如通过红细胞生成削弱的大鼠模型中平均红细胞血红蛋白水平增加及平均红细胞体积增加而测定。
本发明的方法包括给予对象一种有效量的稳定HIFα的化合物。这种稳定可以通过例如抑制HIF羟化酶活性而进行。本发明优选的化合物是抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的化合物。所述抑制可以是直接或间接抑制，可以是竞争或非竞争抑制，等等。在各个实施方案中，本发明的化合物选自2-氧代戊二酸盐模拟物、铁螯合剂和脯氨酸类似物。一方面，2-氧化戊二酸模拟物是一种化学式I、Ia或Ib所示的杂环羰基甘氨酸。另一方面，铁螯合剂是化学式III所示的一种异羟肟酸。在特殊的实施方案中，如本文所例证，所述化合物是化合物D。
本发明示范性的化合物包括[(1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物A)，[(4-羟基-7-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物B)，[(4-羟基-7-苯磺酰-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物C)及3-{[4-(3，3-联苄基-脲基)-苯磺酰基]-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羟基-丙酰胺(化合物D)。本发明还提供了根据本发明的另外的化合物及鉴别这些化合物的方法。
附图简述
图1A和1B列出了显示本发明的方法和化合物克服TNF-α对EPO产生的抑制作用的数据。
图2A和2B列出了显示本发明的方法和化合物在用TNF-α预处理的细胞中克服TNF-α对EPO产生的抑制作用的数据。
图3A和3B列出了显示本发明的方法和化合物克服IL-1β对EPO产生的抑制作用的数据。
图4A和4B列出了显示本发明的方法和化合物在用IL-1β预处理的细胞中克服IL-1β对EPO产生的抑制作用的数据。
图5列出了显示本发明的方法和化合物降低与TNF-α相关的VCAM-1表达的数据。
图6A、6B和6C列出了显示在用本发明的化合物对小鼠进行处理后，运铁蛋白受体和铁转运蛋白(图6A)、肠道铁转运蛋白(图6B)和5-氨基乙酰丙酸合酶(图6C)表达增加。
图7列出了显示本发明的方法和化合物使慢性疾病性贫血的动物模型中网织红细胞计数增加的数据。
图8列出了显示本发明的方法和化合物使慢性疾病性贫血的动物模型中血细胞比容增加的数据。
图9列出了显示本发明的方法和化合物使慢性疾病性贫血的动物模型中血红蛋白水平增加的数据。
图10列出了显示本发明的方法和化合物使慢性疾病性贫血的动物模型中红细胞计数增加的数据。
图11列出了显示本发明的方法和化合物使慢性疾病性贫血的动物模型中小红细胞症减少的数据。
图12列出了显示本发明的方法和化合物使慢性疾病性贫血的动物模型中平均红细胞血红蛋白增加及改善低血色素的数据。
图13列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中血细胞比容增加的数据。
图14列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中血红蛋白水平增加的数据。
图15列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中红细胞计数增加的数据。
图16列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中平均红细胞体积改善的数据。
图17列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中平均红细胞血红蛋白水平改善的数据。
图18A和18B列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中血清铁水平(图18A)和运铁蛋白饱和度(图18B)增加的数据。
图19列出了显示本发明的方法和化合物使正常动物和慢性疾病性贫血的动物模型中NRAMP2(slc112a)和sproutin(CYBRD1，十二指肠细胞色素b还原酶1)基因表达增加的数据。
图20列出了显示在给予正常健康人对象本发明的化合物之后网织红细胞增加的数据。
图21列出了显示在给予正常健康人对象本发明的化合物之后红细胞计数增加的数据。
图22列出了显示在给予正常健康人对象本发明的化合物之后可溶性运铁蛋白受体水平增加的数据。
图23列出了显示在给予正常健康人对象本发明的化合物之后血清铁蛋白水平降低的数据。
图24A和24B列出了显示本发明的方法和化合物使TNF-α相关的VCAM-1和E-选择蛋白表达降低的数据。
图25列出了显示本发明的方法和化合物使TNF-α和IL-1β相关的VCAM-1表达降低的数据。
图26列出了显示本发明的方法和化合物使TNF-α、IL-1β和IFN-γ相关的E-选择蛋白表达降低的数据。
图27A和27B列出了显示本发明的方法和化合物与IL-6协同增加肝细胞中EPO的水平。
发明描述
在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明非限于所述特定的方法学、方案、细胞系、分析和试剂，这些可以变化。还应理解本发明使用的术语是用于描述本发明特定的实施方案，绝无限制所附权利要求所述本发明范围之意。
必须注意本文及所附权利要求书中所用单数形式的“一个”除非特别指出则包括复数形式。因此，例如“一个片段”包括众多的这种片段；“一种化合物”是指多种化合物之一并且是指本文所述及本领域技术人员已知的其等价物，等等。
除非另外指出，本文所用所有技术和学术术语均具有本发明所属领域技术人员已知的含义。尽管在实践和测试本发明中可以使用与本文所述相似的任何方法和材料，现在描述优选的方法、设备和材料。为了描述并公开在本文所引用的出版物中报道的可能与本发明相关应用的方法、试剂和工具，所有出版物均以其全文并入参考。本文的任何描述都不应被解释为认为本发明已被这些依赖于更早发明的公示所公开。
除非特别说明，实践本发明将应用本领域内常规的化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药物学方法。这些技术在文献中已被充分说明。见例如Gennaro，A.R.，ed.(1990)Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.；Hardman，J.G.，Limbird，L.E.，and Gilman，A.G.，eds.(2001)ThePharmacological Basis of Therapeutics，10th ed.，McGraw-Hill Co.；Colowick，S.et al.，eds.，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.；Weir，D.M.，和Blackwell，C.C.，eds.(1986)Handbook of ExperimentalImmunology，Vols.I-IV，Blackwell Scientific Publications；Maniatis，T.etal.，eds.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Vols.1-111，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.，eds.(1999)Short Protocols in Molecular Biology，4th edition，John Wiley& Sons；Ream et al.，eds.(1998)Molecular Biology Techniques：AnIntensive Laboratory Course，Academic Press；Newton，C.R.，andGraham，A.，eds.(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series)，2nded.，Springer Verlag。
定义
术语“慢性疾病性贫血(anemia of chronic disease)”是指由于例如长期的感染、炎症、肿瘤疾病等的结果产生的任何贫血症。这样产生的贫血通常特征在于红细胞寿命缩短及铁在巨噬细胞中汇集，导致可用于产生新的红细胞的铁的数量减少。与慢性疾病性贫血相关的疾病包括但非限于慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、风湿热、溃疡性结肠炎、及肿瘤疾病。进一步的疾病包括与感染、炎症和肿瘤相关的疾病和病变，包括例如炎症性感染(例如肺脓肿、肺结核、骨髓炎等)、炎症性非感染性病变(例如风湿性关节炎、系统红斑狼疮、克隆氏病、肝炎、炎症性肠道疾病等)、及各种癌症、肿瘤和恶性肿瘤(例如癌症、肉瘤、淋巴瘤等)。
术语“疾病”和“病变”可互换使用，是指与偏离正常的任何状况。
术语“红细胞生成素”是指任何重组或天然发生的红细胞生成素，包括例如人红细胞生成素(GenBank登记号No.AAA52400；Lin et al.(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：7580-7584)、EPOETIN人重组红细胞生成素(Amgen，Inc.，Thousand Oaks CA)、ARANESP人重组红细胞生成素(Amgen)、PROCRIT人重组红细胞生成素(Ortho BiotechProducts，L.P.，Raritan NJ)等等。
术语“HIFα”是指缺氧诱导因子蛋白的α亚基。HIFα可以是任何人或其它哺乳动物蛋白或者其片段，包括人HIF-1α(GenBank登记号Q16665)、HIF-2α(GenBank登记号AAB41495)和HIF-3α(GenBank登记号AAD22668)；小鼠HIF-1α(GenBank登记号Q61221)、HIF-2α(GenBank登记号BAA20130和AAB41496)及HIF-3α(GenBank登记号AAC72734)；大鼠HIF-1α(GenBank登记号CAA70701)、HIF-2α(GenBank登记号CAB96612)和HIF-3α(GenBank登记号CAB96611)；及牛HIF-1α(GenBank登记号BAA78675)。HIFα也可以是任何非哺乳动物蛋白或其片段，包括光滑爪蟾(Xenopus laevis)HIF-1α(GenBank登记号CAB96628)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)HIF-1α(GenBank登记号JC4851)和鸡HIF-1α(GenBank登记号BAA34234)。HIFα基因序列也可以通过常规的克隆技术获得，例如通过使用上述全部或部分HIFα基因序列作为探针，以在其它物种中获得并测定HIFα基因的序列。
HIFα的片段包括由人HIF-1α所限定的如下区域：氨基酸401-603(Huang et al.，如前)，氨基酸531-575(Jiang et al.(1997)J BiolChem 272：19253-19260)，氨基酸556-575(Tanimoto et al.，如前)，氨基酸557-571(Srinivas et al.(1999)Biochem Biophys Res Commun260：557-561)和氨基酸556-575(Ivan and Kaelin(2001)Science 292：464-468)。进一步的，HIFα的片段包括含有基序LXXLAP至少出现一次的任何片段，例在HIFα的天然序列中出现于L397TLLAP和L559EMLAP。另外，HIFα的片段包括保留HIFα的至少一种功能或结构特性的任何片段。
术语“HIF脯氨酰羟化酶”和“HIF PH”是指能羟化HIF蛋白质中脯氨酸残基的任何酶。优选地，由HIF PH羟化的脯氨酸残基包括在基序LXXLAP中发现的脯氨酸，例如在人HIF-1α天然序列中出现于L397TLLAP和L559EMLAP。HIF PH包括Taylor(2001，Gene275：125-132)所描述的Egl-Nine(EGLN)基因家族成员，并且由Aravindand Koonin(2001，Genome Biol 2：RESEARCH0007)、Epstein et al.(2001，Cell 107：43-54)及Bruick and McKnight(2001，Science 294：1337-1340)鉴定。HIF脯氨酰羟化酶的实例包括人SM-20(EGLN1)(GenBank登记号AAG33965；Dupuy et al.(2000)Genomics 69：348-54)、EGLN2同种型1(GenBank登记号CAC42510；Taylor，如前)、EGLN2同种型2(GenBank登记号NP_060025)和EGLN3(GenBank登记号CAC42511；Taylor，如前)；小鼠EGLN1(GenBank登记号CAC42515)，EGLN2(GenBank登记号CAC42511)，和EGLN3(SM-20)(GenBank登记号CAC42517)；大鼠SM-20(GenBank登记号AAA19321)。另外，HIF PH可包括线虫(Caenorhabditiselegans)EGL-9(GenBank登记号AAD56365)和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)CG1114基因产物(GenBank登记号AAF52050)。HIF脯氨酰羟化酶也可包括上述全长蛋白质的任何保持至少一种结构或功能特征的片段。
本文所用术语“脯氨酰羟化酶抑制剂”或“PHI”是指降低或以其它方式调节羟化氨基酸残基的酶的活性的任何化合物。尽管羟化脯氨酸残基的酶活性是优选的，但是也包括羟化其它氨基酸、包括但不限于精氨酸。可用于本发明方法的化合物包括例如铁螯合剂、2-氧化戊二酸模拟物和修饰的氨基酸例如脯氨酸类似物。
在特定的实施方案中，本发明提供了2-氧化戊二酸的结构模拟物的用途。这类化合物可与2-氧化戊二酸竞争性和与铁非竞争性抑制靶2-氧化戊二酸加双氧酶家族成员。(Majamaa et al.，(1984)Eur JBiochem 138：239-245；Majamaa et al.(1985)Biochem J 229：127-133)。本文描述了特别包括在用于本发明的PHI，例如见下述文献：Majamaaet al.文献同上；Kivirikko and Myllyharju(1998)Matrix Biol16：357-368；Bickel et al.(1998)Hepatology 28：404-411；Friedman et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97：4736-4741；Franklin(1991)BiochemSoc Trans 19)：812 815；Franklin et al.(2001)Biochem J 353：333-338；和国际公开WO03/053977和WO03/049686，每一文献均全文引入本文作参考。代表性的PHI，包括[(1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物A)、[(4-羟基-7-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物B)、[(4-羟基-7-苯基sulfanyl-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物C)、3-{[4-(3，3-二苄基-脲基)-苯磺酰]-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羟基丙酰胺(化合物D)用在本说明书实施例中以证实本文公开的本发明方法。
发明
本发明涉及在对象中诱导增强的或完全的红细胞生成的方法和化合物。特别地，本发明方法涉及通过稳定个体中的HIFα而诱导增强的或完整的红细胞生成。特别涉及通过抑制HIF脯氨酰羟化酶而诱导增强的红细胞生成的方法。在具体的实施方案中，所述方法包括将本发明的化合物给予对象。在各种实施方案中，所述对象可以是细胞、组织、器官、器官系统或完整生物。
慢性疾病性贫血是住院病人中最常见形式的贫血。慢性疾病性贫血发生在患有炎症或恶性疾病的病人中，所述炎症或恶性疾病包括炎症感染(例如肺痈、肺结核、骨髓炎等)、炎性非感染性疾病(例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克隆氏病、肝炎、炎症性肠病等)和各种癌症、肿瘤和恶性肿瘤(例如癌、肉瘤、淋巴瘤等)、慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、风湿热、溃疡性结肠炎和肿瘤病变。
在一个方面，本发明提供了诱导增强的或完全的红细胞生成以治疗慢性疾病性贫血的方法。慢性疾病性贫血与许多慢性病有关，所述慢性病包括例如类风湿性关节炎、风湿热、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、血管炎、肿瘤疾病等，以及慢性感染和慢性炎症。降低的或无效的红细胞生成是患有慢性疾病性贫血的患者中的共同病理。降低的或无效的红细胞生成可产生自红细胞生成途径中的各种代谢异常，包括例如被抑制的EPO生成、骨髓中降低的EPO应答、异常铁加工包括例如异常或无效铁摄入、动员、贮存和吸收。
与慢性疾病性贫血相关的疾病的生理学特征是炎性细胞因子产生增加(Means(1995)Stem Cells 13：32-37和Means(1999)Int JHematol 70：7-12)，这些细胞因子包括例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和干扰素-γ(IFN-γ)，它们对介导EPO生成、EPO应答和铁代谢的协同调节的能力产生负面影响。(参见例如，Roodman et al.(1989)Adv Exp Med Biol 271：185-196；Fuchs et al.(1991)Eur J Hematol 46：65-70；Jelkmann et al.(1991)Ann N Y Acad Sci718：300-311；Vannucchi et al.(1994)Br J Hematol 87：18-23；和Oldenburg et al.(2001)Aliment Pharmacol Ther 15：429-438)。本发明提供了用于改善与EPO生成、EPO信号传导和铁利用相关的代谢和生理途径的方法，产生了完全的或增强的红细胞生成以及慢性疾病性贫血的降低或好转。
本发明提供了相对于慢性疾病性贫血的现有技术疗法(例如重组EPO给药)的优点。降低的EPO生成仅仅是降低的红细胞生成的一个方面，已经认识到给予重组EPO不会解决患有慢性疾病性贫血的患者中存在的与降低的红细胞生成相关的其它缺陷。(参见，例如Clibonet al.(1990)Exp Hematol 18：438-441和Macdougall and Cooper(2002)Neprol Dial Transplant 17(11)：39-43)。这些缺陷包括例如骨髓的EPO应答降低，以及有助于全部或完全的红细胞生成的铁代谢的许多方面降低，包括铁从肠道内的吸收、跨肠道细胞转运、铁通过膜铁转运辅助蛋白(hephaestin)或血浆铜蓝蛋白氧化为三价铁状态、铁通过运铁蛋白和运铁蛋白受体的结合和摄取、及铁转运至骨髓(利用铁(包括血红素合成)的部位)均降低。许多患者由于上述原因而对给予重组EPO无效，其中对给予重组EPO的应答降低或缺乏，甚至在给予高剂量的重组EPO时也如此。
慢性疾病性贫血中炎性细胞因子的普遍存在导致例如血清铁水平降低及铁贮存增加，主要是在巨噬细胞中正在形成的红系祖细胞不易于进入的细胞区室内，红系祖细胞的形成需要铁以进行适当的血红素合成。本发明提供了用于增强有助于完全或全部的红细胞生成的代谢途径的方法。在一个实施方案中，所述治疗剂是与进一步增强其效力的补剂例如铁和B族维生素补剂组合给予的。
慢性疾病性贫血与铁蛋白水平增加相关。尽管具有高水平的铁蛋白，但是慢性疾病性贫血的患者不能有效地利用铁。高水平的铁蛋白是再循环至骨髓的铁降低而铁贮存增加的指征，功能性缺铁通常与慢性疾病性贫血和尿毒症慢性肾病患者中经常存在的假炎症状态相关的。通过降低铁蛋白水平，本发明的方法和化合物使得贮存的铁降低并增加了通过运铁蛋白和运铁蛋白受体再循环的铁。降低的血清铁蛋白水平是铁利用增强和再循环至骨髓的铁增加的指征，因此增加了用于血红素产生和红细胞生成的铁利用度。
对缺氧的基因组应答包括基因表达及细胞生理学中的改变，以改善氧匮乏引起的急性和慢性作用。缺氧诱导因子(HIF)是由一个氧调节的α亚基(HIFα)和一个组成型表达的β亚基(HIFβ)组成的转录因子。HIFα在含氧量正常的环境中由于HIF特异性脯氨酸羟化酶(HIF-PH)对特异性脯氨酸残基的羟化而不稳定。然而，当氧变得受限时，例如在低氧环境中，HIF-PH不能羟化HIFα，该亚基不被降解，并且活性的HIF复合物形成，易位于细胞核并激活基因转录。
在某些方面，本发明提供了通过药物学模拟缺氧而治疗慢性疾病性贫血的方法。在某些方面，所述方法以抵抗炎性细胞因子的抑制作用的方式增强EPO产生。EPO产生通常是由缺氧或低氧而诱导的，但在存在炎性细胞因子的情况中表达和分泌保持降低，所述炎性细胞因子如慢性疾病患者中普遍存在的TNF-α、IL-1β和IFN-γ(见例如Means(1995)Stem Cells 13：32-37；Means(1999)Int J Hematol70：7-12；Roodman et al.(1989)Adv Exp Med Biol 271：185-196；Fuchset al.(1991)Eur J Hematol 46：65-70；Jelkmann et al.(1991)Ann NYAcad Sci718：300-311；和Vannucchi et al.(1994)Br J Hematol87：18-23)。脯氨酰羟化酶抑制剂至少部分克服了炎性细胞因子对EPO产生的抑制作用，这通过Hep3B细胞分泌EPO至高于在存在炎性细胞因子的情况中观测到的水平的能力所证实(见例如图1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A和4B)。一些制剂如铁螯合剂、去铁胺(desferrioxamine)在红细胞生成素抗性贫血(例如慢性疾病性贫血)的研究中也示出一些效力(见例如Salvarani et al.(1996)Rheumatol Int16：45-48 and Goch et al.(1995)Eur J Hematol 55：73-77)。
在其它方面，本发明提供了在存在炎性细胞因子的情况中改善EPO受体信号传导的方法。慢性疾病患者中炎性细胞因子的普遍存在导致EPO信号传导的效果降低，这通过许多患者不能应答具有增强红细胞生成素作用的重组EPO而证实。认为这是由于对EPO生物活性的敏感性降低以及骨髓结构和/或微环境中的缺陷所致(见例如Clibon et al.(1990)Exp Hematol 18：438-441和Macdougall and Cooper(2002)Neprol Dial Transplant 17(11)：39-43)。在某些实施方案中，本发明提供了用于诱导全部和完全的红细胞生成的方法，通过恢复适当的细胞对通过EPO受体的信号转导的敏感性而进行。
缺铁是世界上最常见的营养缺乏之一，并且是全球导致贫血的主要原因。铁的平衡最根本是由红细胞生成的速度和铁贮存量调节的。缺铁可以伴随或不伴随贫血，并且与认知发育减弱相关。
缺铁是指铁的供应(水平或贮存)不足或者机体铁的可利用度和利用不足。这可以归因于营养缺乏，例如饮食中铁的缺乏；归因于铁的吸收障碍，例如手术(胃切除术后)或疾病(克隆氏病)；或者归因于得自创伤或外伤、月经、献血、抽血(如各种程序、手术)的慢性或急性失血所致铁的供应损耗或者铁的丧失增加；或者归因于例如婴幼儿或青春期、妊娠期、红细胞生成素治疗中的快速生长所致的铁的需要增加。
缺铁也可以是功能性缺铁，例如特征在于对象取得和利用铁贮存的能力削弱的缺铁。铁的比率不足以使得红细胞正常血红蛋白化，导致网织红细胞和红细胞中细胞血红蛋白含量降低。功能性缺铁经常可见于铁贮存看起来正常或者甚至增加，但铁的利用度削弱的的健康个体，这例如低水平的运铁蛋白饱和度百分比测定到的。这种类型的缺铁通常与急性或慢性炎症相关。
任何种类的缺铁均可导致缺铁性或铁限制性红细胞生成，其中红细胞数减少，循环的红细胞小于正常的红细胞(小红细胞贫血)，及缺乏足够的血红蛋白，由此颜色是苍白的(低血色素贫血)。
缺铁包括功能性缺铁的对象可发生血红蛋白合成削弱，运铁蛋白饱和度百分比降低，血红蛋白和血细胞比容降低，导致缺铁性贫血。缺铁性贫血是世界上最常见的贫血。铁是血红蛋白的必需成分；没有铁，则骨髓不能有效产生血红蛋白。缺铁性贫血可以在铁供应损耗或削弱的对象中发生，或者可以在功能性缺铁的对象中发生，功能性缺铁是指铁以贮存形式存在但不可利用(例如用于血红蛋白产生)。
铁的代谢一般涵盖了这样的过程：细胞、组织、器官、器官系统或整个生物体通过改变(例如增加或降低)铁代谢的特异性过程而保持铁的动态平衡。铁的代谢或铁的代谢过程涵盖了铁的加工、转运、摄取、利用、贮存、动员、吸收等过程。铁的代谢和加工的特殊方面包括促进铁穿过细胞膜运动的铁转运蛋白和酶的表达及铁通过细胞的保留和分泌；参与血液中铁转运的蛋白质的表达改变；运铁蛋白和运铁蛋白受体表达的改变；参与铁吸收的蛋白质的表达和/或活性的改变；铁相关的转录和翻译调节蛋白的表达和活性的改变；及机体或培养液包括例如组织间隙(即细胞外)、细胞内、血液、骨髓等内铁分布的改变。
在某些方面，本发明提供了改善铁的摄取、转运、加工和利用的方法。慢性疾病性贫血与铁利用中负面影响血红素合成及血红蛋白形成的缺陷相关，导致红细胞生成降低(见例如Oldenburg et al.(2001)Aliment Pharmacol Ther 15：429-438)。慢性疾病患者血清铁水平、铁动员的降低及铁贮存中任何相关的增加均可能与在长期炎症条件下巨噬细胞的微生物防御机制相关(见Fuchs et al.(1991)Eur J Hematol46：65-70)。在一些方面，本发明提供了通过稳定HIFα而增加铁的有效代谢的方法。
有许多蛋白质介导铁的代谢，包括蛋白质如红系5-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)(血红素合成中第一个及限速步骤)(Bottomley andMuller-Eberhard(1988)Semin Hematol 25：282-302和Yin et al.(1998)Blood，Cells，Molecules，and Diseases 24(3)：41-533)、运铁蛋白、运铁蛋白受体、铁转运蛋白(参与铁转运)、血浆铜蓝蛋白等。运铁蛋白和运铁蛋白受体表达的增加刺激红系祖细胞摄取铁并促进巨噬细胞摄取铁并将其转运至骨髓(Goswami et al.(2002)Biochem Cell Biol 80：679-689)。血浆铜蓝蛋白促进二价铁氧化为三价铁，以便与运铁蛋白结合(Goswami et al.(2002)Biochem Cell Biol80：679-689)。在某些方面，本发明的方法通过增加参与铁的代谢的蛋白质的表达和活性增加了铁的代谢，所述蛋白质包括红细胞5-氨基乙酰丙酸合酶、运铁蛋白、运铁蛋白受体、NRAMP2、sproutin(十二指肠细胞色素b还原酶1)和血浆铜蓝蛋白。在其它方面，本发明的方法通过降低海帕西啶的表达和活性及通过调节铁蛋白的表达增加了铁的代谢。
在一个实施方案中，本发明提供了用于增加基因表达的方法和化合物，所述基因的表达产物参与铁的代谢和加工，包括铁的摄取、贮存、转运、吸收等。这种基因包括但非限于运铁蛋白受体、血浆铜蓝蛋白、NRAMP2、5-氨基乙酰丙酸合酶、sproutin(CYBRD1)等。对参与铁的代谢和加工的基因进行治疗性增量调节将有效地增加铁的利用度，并从而在慢性疾病性贫血、缺铁性贫血、功能性贫血等的患者体内产生有益作用。在另一实施方案中，本发明提供了用于降低与铁的调节相关的蛋白质海帕西啶(hepcidin)的表达的方法和化合物。
适当的铁代谢部分通过铁应答组件结合蛋白(IRP)而调节，所述铁应答组件结合蛋白与编码例如铁蛋白(铁贮存)、线粒体顺乌头酸酶(能量代谢)、红系-氨基乙酰丙酸合酶和运铁蛋白受体的mRNA的5′-和/或3′-UTR中发现的铁应答组件(IRE)结合。例如在铁蛋白转录中发生的IRP与5′-IRE的结合抑制mRNA的翻译；而例如在运铁蛋白转录中发生的与3′-IRE的结合则保护mRNA免于降解。IRP-2是在细胞内组成型产生的，但在铁充分的条件下被降解并因此失活。然而，在铁损耗和/或低氧条件下IRP-2是稳定的(Hanson et al.(1999)J BiolChem 274：5047-5052)。因为IRP-2降低铁蛋白的表达，这与铁的长期贮存相关，并且IRP-2增加运铁蛋白和运铁蛋白受体的表达，因此IRP-2促进铁的摄取、转运和利用，并因此增强红细胞生成(Klausner etal.(1993)Cell 72：19-28)。最近，已经在也是红细胞生成所必需的其它基因中描述了IRE，所述基因包括5-氨基乙酰丙酸合酶，NRAMP2铁转运蛋白(也称作Slc11a2、DCT1、DMT1、mk(小鼠中小红细胞贫血基因座))，及在十二指肠中介导来源于饮食的铁的吸收的铁转运蛋白(Haile(1999)Am J Med Sci 318：230-240 and Gunshin et al.(2001)FEBS Lett 509：309-316)。
本发明的方法通过模拟低氧条件，除了稳定HIFα之外还潜在性的稳定IRP-2，由此在内源性EPO产生及功能性红细胞产生中增强的铁摄取、转运和利用中产生协同作用。
在成人中，饮食中铁的吸收男性为6％，非妊娠妇女为13％。NRAMP2(也称作DMT1、DCT1、slc11a2)是一种普遍表达的二价金属转运蛋白，其参与未与运铁蛋白结合的铁的跨膜转运。NRAMP2是一种铁转运蛋白，将铁从胃肠道内腔转运至十二指肠肠细胞中并从成红血细胞内体转运至细胞质。在正在经历饮食缺铁的动物中，NRAMP2(slc11a2)在近端十二指肠的柱状吸收上皮中肠细胞顶点的表达显着增加(见例如Canonne-Hergaux et al.(1999)Blood 93：4406-4417)。遗传学啮齿动物模型已经将这个基因与缺铁相关的贫血联系起来，所述模型包括具有突变的NRAMP2基因的低血色素贫血和小红细胞贫血小鼠(mk小鼠)。MK小鼠呈现在铁的吸收和红细胞铁利用方面严重缺陷。
在一些方面中，本发明的方法和化合物用于增加饮食铁的吸收。本发明提供了用于增加与铁转运吸收相关的基因表达的方法和化合物。特别地，本发明的化合物在增加NRAMP2在肠道中表达中是有效的。增加的NRAMP2(slc11a2)表达对于增加铁例如饮食中的铁从肠道中吸收是所希望的。
另外，本发明提供了显示经本发明的化合物处理的动物肠道中sproutin基因表达增加的数据。Sproutin肠道铁还原酶(也称作Dcytb和Cybrd1(CYBRD1，十二指肠细胞色素b还原酶1))是一种三价铁还原酶，催化胞外三价铁还原为与铁吸收相关的二价铁。Sproutin与NRAMP2在缺铁的动物中在十二指肠绒毛的顶部共同表达(见例如McKie et al.(2001)Science 291：1755-1759)。
本发明的方法和化合物用于增加血浆铜蓝蛋白基因表达。血浆铜蓝蛋白，也称作亚铁氧化酶-1，将从贮存部位释放的还原的铁(如铁蛋白)转变为氧化形式。氧化的铁能结合其血浆转运蛋白-运铁蛋白。血浆铜蓝蛋白缺乏与铁在肝脏及其它组织中的积聚相关。有迹象表明血浆铜蓝蛋白促进铁从肝脏中流出并促进铁流入缺铁的细胞中(见例如Tran et al.(2002)J Nutr 132：351-356)。
本发明的化合物降低海帕西啶(hepcidin)mRNA在小鼠肝脏中表达。炎症导致IL-6产生，其作用于肝细胞诱导海帕西啶产生。海帕西啶抑制巨噬细胞铁释放及肠道铁吸收、降低铁的利用度并导致例如血铁过少症。降低的海帕西啶表达与增加的铁从网状内皮组织细胞中释放及增加的铁吸收相关。因此，本发明的方法和化合物可用于降低海帕西啶表达、增加肠道铁的吸收并降低血铁过少症。
本发明特别包括了治疗与丙型肝炎病毒(HCV)感染相关的贫血的方法。目前治疗HCV感染的方法包括组合使用干扰素α和病毒唑(ribaviron)。这种组合疗法导致血红蛋白浓度降低和贫血。一方面，本发明提供了用于治疗与HCV感染相关的贫血的方法和化合物。另一方面，本发明提供了用于治疗与HCV感染的干扰素α疗法相关的贫血的方法和化合物。另一方面，本发明提供了用于治疗与HCV感染的病毒唑疗法相关的贫血的化合物和方法。
本发明还提供了增加红细胞从造血祖细胞中分化所需的因子的产生的方法，所述造血祖细胞包括例如造血干细胞(HSC)、CFU-GEMM(集落形成单位粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞)细胞等。刺激红细胞生成的因子包括但非限于红细胞生成素。另一方面，所述方法增加铁摄取、转运和利用所需的因子的产生。这类因子包括但非限于红系氨基乙酰丙酸合酶、运铁蛋白、运铁蛋白受体、血浆铜蓝蛋白、铁蛋白等。在另一方面，所述方法增加红细胞分化所需的因子及铁摄取、转运和利用所需的额外因子。
本发明还提供了用于增强造血前体应答红细胞生成素的方法。如上所述，这种前体包括HSC、CFU-GEMM等。前体细胞的应答可以增强，所述增强例如通过改变红细胞生成素受体、参与红细胞生成素信号传递的胞内因子及促进红细胞生成素与受体相互作用的分泌的因子的表达而进行。本发明提供了用于例如通过增加EPO受体表达而增强骨髓EPO应答的方法。
方法
本发明提供了各种方法。一方面，所述方法包括给予对象一种稳定HIFα的制剂。
HIFα的稳定可以通过本领域技术人员可利用的及已知的任何方法完成，可以包括使用与HIFα相互作用、结合或修饰HIFα的任何制剂或者与HIFα相互作用的因子，包括例如底物是HIFα的酶。在某些方面，本发明包括提供了一种组成型稳定的HIFα变体，例如稳定的HIF突变蛋白等，或者编码这种变体的多核苷酸(见例如美国专利No.6,562,799和6,124,131；及美国专利No.6,432,927所述)。在其它方面，本发明包括使HIFα稳定，包括给予一种稳定HIFα的制剂。所述制剂可以由多核苷酸例如反义序列(见例如国际公开No.WO03/045440所述)、多肽、抗体、其它蛋白质、碳水化合物、脂肪、脂质、及有机和无机物例如小分子等组成。在一个优选的实施方案中，本发明包括在例如对象中通过给予对象一种稳定HIFα的制剂而稳定HIFα，其中所述制剂是一种稳定HIFα的化合物，例如小分子化合物。
在其它实施方案中，本发明的方法包括通过抑制选自2-氧化戊二酸加双氧酶家族的至少一种酶的活性而稳定HIFα。在一个优选的实施方案中，所述酶是一种HIF羟化酶，例如EGLN-1、EGLN-2、EGLN-3等(见例如Taylor(2001)Gene 275：125-132；Epstein et al.(2001)Cell107：43-54；及Bruick and McKnight(2001)Science 294：1337-1340)。然而本发明特别包括这样的酶，其可以是选自2-氧化戊二酸加双氧酶家族的任何酶，包括例如前胶原赖氨酰羟化酶、前胶原脯氨酰3-羟化酶、前胶原脯氨酰4-羟化酶α(I)和α(II)、胸腺嘧啶7-羟化酶、天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶，ε-N-三甲基赖氨酸羟化酶和γ-丁酰甜菜碱羟化酶等(见例如Majamaa et al.(1985)Biochem J 229：127-133；Myllyharjuand Kivirikko(1997)EMBO J 16：1173-1180；Thornburg et al.(1993)32：14023-14033；及Jia et al.(1994)Proc Natl Acad Sci USA91：7227-7231)。
在某些实施方案中，所述方法包括通过给予对象有效量的稳定HIFα的制剂而治疗慢性疾病性贫血或调节铁代谢。在优选的实施方案中，所述制剂是本发明的一种化合物。一方面，所述化合物通过抑制HIFα的某些残基的羟化而稳定HIFα，所述残基例如脯氨酸残基、天冬酰胺残基等。在一个优选的实施方案中，所述残基是脯氨酸残基。在特异的实施方案中，所述残基可以是HIF-1α中的P564残基，或者另一种HIFα同种型中的同源脯氨酸，或者HIF-1α中的P402残基或者另一种HIFα同种型中的同源脯氨酸等。在其它的实施方案中，本发明的方法可涵盖抑制HIFα天冬酰胺残基的羟化，所述残基例如HIF-1α的N803残基或者另一种HIFα同种型中的同源天冬酰胺残基。
化合物
在优选的方法中，本发明的方法包括给予对象有效量的稳定HIFα的化合物。例如国际公开No.WO 03/049686和No.WO03/053997中所公开的示范性的化合物，这些文献在此以其全文并入参考。特别地，本发明的化合物包括如下化合物。
在某些实施方案中，本发明的化合物是抑制HIF羟化酶活性的化合物。在各种实施方案中，所述活性归因于HIF脯氨酰羟化酶，例如EGLN1、EGLN2或EGLN3等。在其它的实施方案中，所述活性归因于HIF天冬酰胺酰羟化酶，例如包括但非限于FIH。本发明优选的化合物是抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的化合物。所述抑制可以是直接或间接抑制，可以是竞争或非竞争抑制等。
一方面，本发明的化合物是抑制或另外调节2-氧化戊二酸加双氧酶活性的任何化合物。2-氧化戊二酸加双氧酶包括但非限于羟化酶。羟化酶使靶底物残基羟化，所述残基包括例如脯氨酰、赖氨酰、天冬酰胺酰(天冬氨酰)羟化酶等。羟化酶有时通过靶底物描述，例如HIF羟化酶、前胶原羟化酶等，和/或通过底物内的靶残基描述，例如脯氨酰羟化酶、赖氨酰羟化酶等，或者通过这两者一同描述，例如HIF脯氨酰羟化酶、前胶原脯氨酰羟化酶等。代表性的2-氧化戊二酸加双氧酶包括但非限于HIF羟化酶(包括HIF脯氨酰羟化酶，例如EGLN1、EGLN2和EGLN3)、HIF天冬酰胺酰羟化酶(例如抑制HIF的因子(FIH)等)、前胶原羟化酶(例如前胶原赖氨酰羟化酶)、前胶原脯氨酰羟化酶(例如前胶原脯氨酰3-羟化酶、前胶原脯氨酰4-羟化酶α(I)和α(II)等)、胸腺嘧啶7-羟化酶、天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶、ε-N-三甲基赖氨酸羟化酶、γ-丁酰甜菜碱羟化酶等。尽管酶活性可包括与任何2-氧化戊二酸加双氧酶相关的任何活性，但特别包括底物中氨基酸残基的羟化。尽管底物中脯氨酸和/或天冬酰胺残基的羟化被特别包括，但其它氨基酸的羟化也被涵盖。
一方面，显示对一或多种2-氧化戊二酸加双氧酶具有抑制活性的本发明化合物可能还显示出对一或多种另外的2-氧化戊二酸加双氧酶的抑制活性，例如抑制HIF羟化酶活性的化合物另外可抑制胶原脯氨酰羟化酶的活性，抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的化合物可另外抑制HIF天冬酰胺酰羟化酶的活性等等。
因为HIFα是通过脯氨酸羟化(需要氧和Fe2+的反应)修饰的，因此在一方面本发明包括与HIFα羟化相关的酶是2-氧化戊二酸加双氧酶家族的成员。这种酶包括但非限于前胶原赖氨酰羟化酶、前胶原脯氨酰3-羟化酶、前胶原脯氨酰4-羟化酶α(I)和α(II)、胸腺嘧啶7-羟化酶、天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶、ε-N-三甲基赖氨酸羟化酶及γ-丁酰甜菜碱羟化酶等。这些酶需要氧、Fe2+、2-氧化戊二酸和抗坏血酸以进行其羟化酶活性(见例如Majamaa et al.(1985)Biochem J229：127-133；Myllyharjuand Kivirikko(1997)EMBO J 16：1173-1180；Thornburg et al.(1993)32：14023-14033；和Jia et al.(1994)Proc NatlAcad Sci USA 91：7227-7231)。
一方面，本发明的化合物是一种稳定HIFα的化合物。优选地，所述化合物通过抑制HIF羟化酶活性而稳定HIFα。因此本发明特别包括了本发明的化合物选自先前鉴别的羟化酶活性调节剂。例如，已经鉴别了脯氨酰4-羟化酶的小分子抑制剂(见例如Majamaa et al.(1984)Eur J Biochem 138：239-245；Majamaa et al.(1985)Biochem J229：127-133；Kivirikko and Myllyharju(1998)Matrix Biol 16：357-368；Bickel et al.(1998)Hepatology28：404-411；Friedman et al.(2000)ProcNatl Acad Sci USA 97：4736-4741；和Franklin et al.(2001)Biochem J353：333-338；所有文献在此均以其全文并入参考)。本发明包括了这些化合物在本发明的方法中的应用。
在一些方面，本发明的化合物包括例如2-氧化戊二酸的结构模拟物。这种化合物可与2-氧化戊二酸竞争性抑制靶2-氧化戊二酸加双氧酶家族成员，与铁非竞争性抑制靶2-氧化戊二酸加双氧酶家族成员，(Majamaa et al.(1984)Eur J Biochem 138：239-245；及Majamaa et al.Biochem J 229：127-133)。
在某些实施方案中，本发明的方法中所用的化合物选自化学式(I)的一种化合物：
其中
A是1，2-亚芳基，1，3-亚芳基，1，4-亚芳基；或者(C1-C4)-亚烷基，其任选地由一或两种卤素，氰基，硝基，三氟甲基，(C1-C6)-烷基，(C1-C6)-羟烷基，(C1-C6)-烷氧基，-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)Halg，(C1-C6)-氟烷氧基，(C1-C8)-氟链烯氧基，(C1-C8)-氟炔氧基，-OCF2Cl，-O-CF2-CHFCl取代；(C1-C6)-烷基巯基，(C1-C6)烷基亚磺酰，(C1-C6)-烷基磺酰，(C1-C6)-烷基羰基，(C1-C6)-烷氧基羰基，氨基甲酰基，N-(C1-C4)-烷基氨基甲酰基，N，N-二-(C1-C4)-烷基氨基甲酰基，(C1-C6)-烷基羰基氧基，(C3-C8)-环烷基，苯基，苄基，苯氧基，苄氧基，苯胺基，N-甲基苯胺基，苯基巯基，苯基磺酰，苯基亚磺酰，氨磺酰，N-(C1-C4)-烷基氨磺酰，N，N-二-(C1-C4)-烷基氨磺酰取代；或者由取代的(C6-C12)-芳氧基，(C7-C11)-芳烷基氧基，(C6-C12)-芳基，(C7-C11)-芳烷基取代，其在芳基部分中携带1-5个相同或不同的取代基，所述取代基选自卤素、氰基、硝基、三氟甲基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)Halg、-OCF2Cl、-OCF2CHFCl、(C1-C6)烷基巯基、(C1-C6)-烷基亚磺酰、(C1-C6)-烷基磺酰、(C1-C6)-烷基羰基、(C1-C6)-烷氧基羰基、氨甲酰基、N-(C1-C4)-烷基氨甲酰基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨甲酰基、(C1-C6)-烷基羰基氧基、(C3-C8)-环烷基、氨磺酰、N-(C1-C4)-烷基氨磺酰、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨磺酰；或者其中A是-CR5R6，R5和R6各自独立地选自氢、(C1-C6)-烷基、(C3-C7)-环烷基、芳基、或者α-氨基酸的α-碳原子的取代基，其中氨基酸是天然L-氨基酸或其D-异构体。
B是-CO2H，-NH2，-NHSO2CF3，四唑基，咪唑基，3-羟基异恶唑基，-CONHCOR″′，-CONHSOR″′，-CONHSO2R″′，其中R″′是芳基，杂芳基(heteroaryl)，(C3-C7)环烷基或者(C1-C4)-烷基，其任选地由(C6-C12)-芳基，杂芳基，OH，SH，(C1-C4)-烷基，(C1-C4)-烷氧基，(C1-C4)-硫代烷基，(C1-C4)-亚磺酰，(C1-C4)-磺酰，CF3，Cl，Br，F，I，NO2，-COOH，(C2-C5)-烷氧基羰基，NH2，单-(C1-C4-烷基)-氨基，二-(C1-C4-烷基)-氨基或者(C1-C4)-全氟烷基单取代；或者其中B是CO2-G羧基，其中G是醇G-OH的一个基团，其中G选自(C1-C20)-烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C20)-链烯基，(C3-C8)-环链烯基、视黄基、(C2-C20)-炔基、(C4-C20)-链烯炔基(alkenynyl)，其中链烯基，环链烯基，炔基和链烯炔基含有一或多个键；(C6-C16)-碳环芳基、(C7-C16)-碳环芳烷基、杂芳基或杂芳烷基，其中杂芳基或杂芳烷基的杂芳基部分含有5或6个环原子；其中针对G而定义的基团由一或多个如下基团取代：羟基、卤素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-环烷基、(C5-C8)-环烯基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C2-C12)-链烯基、(C2-C12)-炔基、(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基，(C6-C12)-芳氧基，(C7-C16)-芳烷基氧基，(C1-C8)-羟烷基，-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg，-OCF2Cl，-OCF2-CHFCl，(C1-C12)-烷基羰基，(C3-C8)-环烷基羰基，(C6-C12)-芳基羰基，(C7-C16)-芳烷基羰基，肉桂基，(C2-C12)-链烯基羰基，(C2-C12)-炔基羰基，(C1-C12)-烷氧基羰基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基，(C6-C12)-芳氧基羰基，(C7-C16)-芳烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷氧基羰基，(C2-C12)-链烯氧基羰基，(C2-C12)-炔氧基羰基，酰氧基，(C1-C12)-烷氧基羰基氧基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基氧基，(C6-C12)-芳氧基羰基氧基，(C7-C16)芳烷基氧基羰基氧基，(C3-C8)-环烷氧基羰基氧基，(C2-C12)-链烯氧基羰基氧基，(C2-C12)-炔氧基羰基氧基，氨甲酰基，N-(C1-C12)-烷基氨甲酰基，N.N-二(C1-C12)-烷基氨甲酰基，N-(C3-C8)-环烷基-氨甲酰基，N-(C6-C16)-芳基氨甲酰基，N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰基，N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)-氨甲酰基，N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，氨甲酰氧基，N-(C1-C12)-烷基氨甲酰氧基，N，N-二-(C1-C12)-烷基氨甲酰氧基，N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰氧基，N-(C6-C12)-芳基氨甲酰氧基，N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰氧基，N-((C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，氨基，(C1-C12)-烷基氨基，二-(C1-C12)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷基氨基，(C2-C12)-链烯基氨基，(C2-C12)-炔基氨基，N-(C6-C12)-芳基氨基，N-(C-C11)-芳烷基氨基，N-烷基-芳烷基氨基，N-烷基-芳基氨基，(C1-C12)-烷氧基氨基，(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷基羰基氨基，(C3-C8)-环烷基羰基氨基，(C6-C12)-芳基羰基氨基，(C7-C16)-芳烷基羰基氨基，(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C3-C8)-环烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C7-C12)-芳烷基羰基氨基(C1-C8)-烷基，氨基-(C1-C10)-烷基，N-(C1-C10)烷基氨基-(C1-C10)-烷基，N，N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C3-C8)环烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C1-C12)-烷基巯基，(C1-C12)-烷基亚磺酰，(C1-C12)-烷基磺酰，(C6-C16)-芳基巯基，(C6-C16)-芳基亚磺酰，(C6-C12)-芳基磺酰，(C7-C16)-芳烷基巯基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰，(C7-C16)-芳烷基磺酰，氨磺酰，N-(C1-C10)-烷基氨磺酰，N，N-二(C1-C10)-烷基氨磺酰，(C3-C8)-环烷基氨磺酰，N-(C6-C12)-烷基氨磺酰，N-(C7-C16)-芳烷基氨磺酰，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨磺酰，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨磺酰，(C1-C10)-烷基亚磺酰氨基，N-((C1-C10)-烷基)-(C1-C10)-烷基亚磺酰氨基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰氨基，或N-((C1-C10)-烷基-(C7-C16)-芳烷基亚磺酰氨基：其中芳基或含有芳基部分的基团可在芳基上由1-5个相同或不同的如下基团取代：羟基，卤素，氰基，三氟甲基，硝基，羧基，(C1-C12)-烷基，(C3-C8)-环烷基，(C6-C12)-芳基，(C7-C16)-芳烷基，(C1-C12)-烷氧基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)烷基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)烷氧基，(C6-C12)-芳氧基，(C7-C16)-芳烷基氧基，(C1-C8)-羟烷基，(C1-C12)-烷基羰基，(C3-C8)-环烷基-羰基，(C6-C12)-芳基羰基，(C7-C16)芳烷基羰基，(C1-C12)-烷氧基羰基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基，(C6-C12)-芳氧基羰基，(C7-C16)-芳烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷氧基羰基，(C2-C12)-链烯氧基羰基，(C2-C12)-炔氧基羰基，(C1-C12)-烷基羰基氧基，(C3-C8)-环烷基羰基氧基，氨甲酰氧基，N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，氨基，(C1-C12)-烷基氨基，二-(C1-C12)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷基氨基，(C3-C12)-链烯基氨基，(C3-C12)-炔基氨基，N-(C6-C12)-芳基氨基，N-(C7-C11)-芳烷基氨基，N-烷基芳烷基氨基，N-烷基芳基氨基，(C1-C12)-烷氧基氨基，(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷基羰基氨基，(C3-C8)-环烷基羰基氨基，(C6-C12)-芳基羰基氨基，(C7-C16)-烷基羰基氨基，(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C3-C8)-环烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C7-C16)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基，氨基-(C1-C10)-烷基，N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)烷基，N，N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C3-C8)-环烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C1-C12)-烷基巯基，(C1-C12)-烷基亚磺酰，(C1-C12)-烷基磺酰，(C6-C12)-芳基巯基，(C6-C12)-芳基亚磺酰，(C6-C12)-芳基磺酰，(C7-C16)-芳烷基巯基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰，或(C7-C16)-芳烷基磺酰；
X是O或S；
Q是O、S、NR’或一个键；
其中如果Q是一个键，则R4是卤素、腈或三氟甲基；
或者如果Q是O、S或NR’时，则R4是氢、(C1-C10)-烷基、(C2-C10)-链烯基、(C2-C10)-炔基，其中链烯基或炔基含有一或两个C-C多重键；式-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg的未取代的氟烷基，(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C1-C6)-烷氧基-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C4)-烷基，芳基，杂芳基，(C7-C11)-芳烷基，或式Z的基团
-[CH2]v-[O]w-[CH2]t-E                (Z)
其中
E是杂芳基，(C3-C8)-环烷基或式F的苯基
Figure BSA00000189525100451
v是0-6，
w是0或1，
t是0-3，
R7，R8，R9，R10，R11相同或不同并且是氢，卤素，氰基，硝基，三氟甲基，(C1-C6)-烷基，(C3-C8)-环烷基，(C1-C6)-烷氧基，-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg，-OCF2-Cl，-O-CF2-CHFCl，(C1-C6)-烷基巯基，(C1-C6)-羟烷基，(C1-C6)-烷氧基-(C1-C6)-烷氧基，(C1-C6)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C1-C6)-烷基亚磺酰，(C1-C6)-烷基磺酰，(C1-C6)-烷基羰基，(C1-C8)-烷氧基羰基，氨甲酰基，N-(C1-C8)-烷基氨甲酰基，N，N-二-(C1-C8)-烷基氨甲酰基，或(C7-C11)-芳烷基氨甲酰基，任选地由以下基团取代：氟，氯，溴，三氟甲基，(C1-C6)-烷氧基，N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰基，N-(C3-C8)-环烷基-(C1-C4)-烷基氨甲酰基，(C1-C6)-烷基羰基氧基，苯基，苄基，苯氧基，苄氧基，NRYRZ其中RY和RZ独立地选自氢，(C1-C12)烷基，(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基，(C3-C10)-环烷基，(C3-C12)-链烯基，(C3-C12)-炔基，(C6-C12)-芳基，(C7-C11)芳烷基，(C1-C12)-烷氧基，(C7-C12)芳烷氧基，(C1-C12)-烷基羰基，(C3-C8)-环烷基羰基，(C6-C12)芳基羰基，(C7-C16)芳烷基羰基；或者进一步其中RY和RZ一起是-[CH2]h，其中CH2基团可以由以下基团替换：O，S，N-(C1-C4)-烷基羰基亚氨基，或N-(C1-C4)-烷氧基羰基亚氨基；苯基巯基，苯基磺酰，苯基亚磺酰，氨磺酰，N-(C1-C8)-烷基氨磺酰，或N，N-二-(C1-C8)-烷基氨磺酰；或者R7和R8，R8和R9，R9和R10，或R10和R11一起是选自-[CH2]n-或-CH＝CH-CH＝CH-的链，其中该链的CH2基团任选地由O，S，SO，SO2或NRY替换；以及n是3，4或5；且如果E是杂芳基，所述基团可以携带1-3个取代基，所述取代基选自针对R7-R11所定义的那些基团，或者如果E是环烷基，所述基团可以携带一个选自针对R7-R11所定义的那些基团的取代基；
或者如果Q是NR’，则R4是R”，其中R’和R”相同或不同并且是氢，(C6-C12)-芳基，(C7-C11)-芳烷基，(C1-C8)-烷基，(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基，(C1-C10)-烷基羰基，任选地取代的(C7-C16)-芳烷基羰基，或任选地取代的(C6-C12)-芳基羰基；或者R’和R”一起是-[CH2]h，其中CH2基团可以由O，S，N-酰亚氨基或N-(C1-C10)-烷氧基羰基亚氨基替换，并且h是3-7。
Y是N或CR3；
R1，R2和R3相同或不同并且是氢，羟基，卤素，氰基，三氟甲基，硝基，羧基，(C1-C20)-烷基，(C3-C8)-环烷基，(C3-C8)环烷基-(C1-C12)-烷基，(C3-C8)-环烷氧基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C12)-烷氧基，(C3-C8)-环烷基氧基-(C1-C12)-烷基，(C3-C8)-环烷基氧基-(C1-C12)-烷氧基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C8)-烷基-(C1-C6)-烷氧基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C3-C8)-环烷基氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷氧基，(C6-C12)-芳基，(C7-C16)-芳烷基，(C7-C16)-芳烯基，(C7-C16)-芳炔基，(C2-C20)-链烯基，(C2-C20)-炔基，(C1-C20)-烷氧基，(C2-C20)-链烯氧基，(C2-C20)-炔氧基，视黄基氧基，(C1-C20)-烷氧基-(C1-C12)-烷基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基，(C7-C16)-芳烷基氧基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基，(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基，(C1-C16)-羟烷基，(C6-C16)-芳氧基-(C1-C8)-烷基，(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C7-C12)-芳烷基氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C2-C20)-链烯氧基-(C1-C6)-烷基，(C2-C20)-炔氧基-(C1-C6)-烷基，视黄基氧基-(C1-C6)-烷基，-O-[CH2]xCfH(2f+1-g)Fg，-OCF2Cl，-OCF2-CHFCl，(C1-C20)-烷基羰基，(C3-C8)-环烷基羰基，(C6-C12)-芳基羰基，(C7-C16)-芳烷基羰基，肉桂基，(C2-C20)-链烯基羰基，(C2-C20)-炔基羰基，(C1-C20)-烷氧基羰基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基，(C6-C12)-芳氧基羰基，(C7-C16)-芳烷氧基羰基，(C3-C8)环烷氧基羰基，(C2-C20)链烯氧基羰基，视黄基氧基羰基，(C2-C20)-炔氧基羰基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C1-C12)-烷基羰氧基，(C3-C8)-环烷基羰氧基，(C6-C12)-芳基羰氧基，(C7-C16)-芳烷基羰氧基，肉桂基氧基，(C2-C12)-链烯基羰氧基，(C2-C12)炔基羰氧基，(C1-C12)-烷氧基羰氧基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰氧基，(C6-C12)-芳氧基羰氧基，(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基，(C3-C8)-环烷氧基羰氧基，(C2-C12)-链烯氧基羰氧基，(C2-C12)-炔氧基羰氧基，氨甲酰基，N-(C1-C12)-烷基氨甲酰基，N，N-二-(C1-C12)-烷基氨甲酰基，N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰基，N，N-二环-(C3-C8)-烷基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰基，N-((C3-C8)-环烷基-(C1-C6)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C6)-烷基-N-((C3-C8)-环烷基-(C1-C6)-烷基)-氨甲酰基，N-(+)-脱氢枞酸基氨甲酰基，N-(C1-C6)-烷基-N-(+)-脱氢枞酸基氨甲酰基，N-(C6-C12)-芳基氨甲酰基，N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰基，N-((C1-C18)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基；CON(CH2)h，其中CH2基团可以由O，S，N-(C1-C8)-烷基亚氨基，N-(C3-C8)-环烷基亚氨基，N-(C3-C8)-环烷基-(C1-C4)-烷基亚氨基，N-(C6-C12)-芳基亚氨基，N-(C7-C16)-芳烷基亚氨基，N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亚氨基替换，并且h是3-7；式R的氨甲酰基
Figure BSA00000189525100481
其中
Rx和Rv各自独立地选自氢，(C1-C6)-烷基，(C3-C7)-环烷基，芳基，或L-和D-氨基酸所属于的α-氨基酸的α碳的取代基，
s是1-5，
T是OH，或NR*R**，且R*，R**和R***相同或不同并且选自氢，(C6-C12)-芳基，(C7-C11)-芳烷基，(C1-C8)-烷基，(C3-C8)-环烷基，(+)-脱氢枞酸基，(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基，(C1-C10)-烷酰基，任选地取代的(C7-C16)-芳烷酰基，任选地取代的(C6-C12)-芳酰基；或者R*和R**一起是-[CH2]h，其中CH2基团可以由以下基团替换：O，S，SO，SO2，N-酰基氨基，N-(C1-C10)-烷氧基羰基亚氨基，N(C1-C8)-烷基亚氨基，N-(C3-C8)-环烷基亚氨基，N-(C3-C8)-环烷基-(C1-C4)-烷基亚氨基，N-(C6-C12)-芳基亚氨基，N-(C7-C16)-芳烷基亚氨基，N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亚氨基，并且h是3-7；
氨甲酰氧基，N-(C1-C12)-烷基氨甲酰氧基，N，N-二-(C1-C12)-烷基氨甲酰氧基，N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰氧基，N-(C6-C12)-芳基氨甲酰氧基，N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰氧基，N-((C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基氨基，(C1-C12)-烷基氨基，二-(C1-C12)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷基氨基，(C3-C12)-链烯基氨基，(C3-C12)-炔基氨基，N-(C6-C12)-芳基氨基，N-(C7-C11)-芳烷基氨基，N-烷基-芳烷基氨基，N-烷基-芳基氨基，(C1-C12)-烷氧基氨基，(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷酰基氨基，(C3-C8)-环烷酰基氨基，(C6-C12)-芳酰基氨基，(C7-C16)-芳烷酰基氨基，(C1-C12)-烷酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C6-C12)-芳酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C7-C11)-芳烷酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷酰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C3-C8)-环烷酰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳酰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C7-C16)-芳烷酰基氨基-(C1-C8)-烷基，氨基-(C1-C10)-烷基，N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基，N，N-二(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C3-C8)-环烷基氨基(C1-C10)-烷基，(C1-C20)-烷基巯基，(C1-C20)-烷基亚磺酰，(C1-C20)-氨基磺酰，(C6-C12)-芳基巯基，(C6-C12)-芳基亚磺酰，(C6-C12)-芳基磺酰，(C7-C16)-芳烷基巯基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰，(C7-C16)-芳烷基磺酰，(C1-C12)-烷基巯基-(C1-C6)-烷基，(C1-C12)-烷基亚磺酰-(C1-C6)-烷基，(C1-C12)-烷基磺酰-(C1-C6)-烷基，(C6-C12)-芳基巯基-(C1-C6)-烷基，(C6-C12)-芳基亚磺酰-(C1-C6)-烷基，(C6-C12)-芳基磺酰-(C1-C6)-烷基，(C7-C16)-芳烷基巯基-(C1-C6)-烷基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰-(C1-C6)-烷基，(C7-C16)-芳烷基磺酰-(C1-C6)-烷基，氨磺酰，N-(C1-C10)-烷基氨磺酰，N，N-二-(C1-C10)-烷基氨磺酰，(C3-C8)-环烷基氨磺酰，N-(C6-C12)-芳基氨磺酰，N-(C7-C16)-芳烷基氨磺酰，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨磺酰，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨磺酰，(C1-C10)-烷基亚磺酰氨基，N-((C1-C10)-烷基)-(C1-C10)-烷基亚磺酰氨基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰氨基，和N-((C1-C10)-烷基-(C7-C16)-芳烷基亚磺酰氨基；其中芳基可由1-5个选自如下的取代基取代：羟基，卤素，氰基，三氟甲基，酰基，羧基，(C2-C16)-烷基，(C3-C8)-环烷基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C12)-烷基，(C3-C8)-环烷氧基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C12)-烷氧基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C12)-烷基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C12)-烷氧基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C8)-烷基-(C1-C6)-烷氧基，(C3-C8)-环烷基(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷氧基，(C6-C12)-芳基，(C7-C16)-芳烷基，(C2-C16)-链烯基，(C2-C12)-炔基，(C1-C16)-烷氧基，(C1-C16)-链烯氧基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基，(C1-C12)-烷氧基(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基，(C7-C16)-芳烷氧基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基，(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基，(C1-C8)-羟烷基，(C6-C16)-芳氧基-(C1-C8)-烷基，(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，-O-[CH2]xCfH(2f+1-g)Fg，-OCF2Cl，-OCF2-CHFCl，(C1-C12)-烷基羰基，(C3-C8)-环烷基羰基，(C6-C12)-芳基羰基，(C7-C16)-芳烷基羰基，(C1-C12)-烷氧基羰基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基，(C6-C12)-芳氧基羰基，(C7-C16)-芳烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷氧基羰基，(C2-C12)-链烯氧基羰基，(C2-C12)-炔氧基羰基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C3-C8)-环烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基，(C1-C12)-烷基羰基氧基，(C3-C8)-环烷基羰基氧基，(C6-C12)-芳基羰基氧基，(C7-C16)-芳烷基羰基氧基，肉桂酰氧基，(C2-C12)-链烯基羰基氧基，(C2-C12)-炔基羰基氧基，(C1-C12)-烷氧基羰基氧基，(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基氧基，(C6-C12)-芳氧基羰基氧基，(C7-C16)-芳烷基氧基羰基氧基，(C3-C8)-环烷氧基羰基氧基，(C2-C12)-链烯氧基羰基氧基，(C2-C12)-炔氧基羰基氧基，氨甲酰基，N-(C1-C12)-烷基氨甲酰基，N，N-二-(C1-C12)-烷基氨甲酰基，N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰基，N，N-二环-(C3-C8)-烷基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰基，N-((C3-C8)-环烷基-(C1-C6-烷基)氨甲酰基，N-(C1-C6)-烷基-N-((C3-C8)-环烷基-(C1-C6)-烷基)氨甲酰基，N-(+)-脱氢枞酸基氨甲酰基，N-(C1-C6)-烷基-N-(+)-脱氢枞酸基氨甲酰基，N-(C6-C12)-芳基氨甲酰基，N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰基，N-((C1-C16)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨甲酰基，N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨甲酰基，N-(C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨甲酰基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰基，CON(CH2)h，其中CH2基团可由以下基团替换：O，S，N(C1-C8)-烷基亚氨基，N-(C3-C8)-环烷基亚氨基，N-(C3-C8)-环烷基-(C1-C4)-烷基亚氨基，N-(C6-C12)-芳基亚氨基，N-(C7-C16)-芳烷基亚氨基，N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亚氨基，并且h是3-7；氨甲酰氧基，N-(C1-C12)-烷基氨甲酰氧基，N，N-二-(C1-C12)-烷基氨甲酰氧基，N-(C3-C8)-环烷基氨甲酰氧基，N-(C6-C16)-芳基氨甲酰氧基，N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨甲酰氧基，N-((C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨甲酰氧基，N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷基氧基-(C1-C10)-烷基)-氨甲酰氧基，氨基，(C1-C12)-烷基氨基，二-(C1-C12)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷基氨基，(C3-C12)-链烯基氨基，(C3-C12)-炔基氨基，N-(C6-C12)-芳基氨基，N-(C7-C11)-芳烷基氨基，N-烷基-芳烷基氨基，N-烷基-芳基氨基，(C1-C12)-烷氧基氨基，(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷酰基氨基，(C3-C8)-环烷酰基氨基，(C6-C12)-芳酰基氨基，(C7-C16)-芳烷酰基氨基，(C1-C12)-烷酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C3-C8)-环烷酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C6-C12)-芳酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C7-C11)-芳烷酰基-N-(C1-C10)-烷基氨基，(C1-C12)-烷酰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C3-C8)-环烷酰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳酰基氨基-(C1-C8)-烷基，(C7-C16)-芳烷酰基氨基-(C1-C8)-烷基，氨基-(C1-C10)-烷基，N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基，N，N-二(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C3-C8)-环烷基氨基-(C1-C10)-烷基，(C1-C12)-烷基巯基，(C1-C12)-烷基亚磺酰，(C1-C12)-氨基磺酰，(C6-C16)-芳基巯基，(C6-C16)-芳基亚磺酰，(C6-C16)-芳基磺酰，(C7-C16)-芳烷基巯基，(C7-C16)-芳烷基亚磺酰，或(C7-C16)-芳烷基磺酰；
或者其中R1和R2，或者R2和R3形成链[CH2]o，其是饱和的或由一C＝C双键而不饱和，其中1或2个CH2基团任选地由O，S，SO，SO2，或NR′替换，且R′是氢，(C6-C12)-芳基，(C1-C8)-烷基，(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基，(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基，(C1-C10)-烷酰基，任选地取代的(C7-C16)-芳烷酰基，或任选地取代的(C6-C12)-芳酰基；且o是3，4或5；
或者其中R1和R2，或者R2和R3与携带它们的吡啶或哒嗪一起形成5，6，7，8-四氢异喹啉环，5，6，7，8-四氢喹啉环或5，6，7，8-四氢噌啉环；
或者其中R1和R2，或者R2和R3形成碳环或杂环5-或6-元芳环；或者其中R1和R2，或者R2和R3与携带它们的吡啶或哒嗪一起形成一任选地取代的杂环系统，其选自噻吩并吡啶，呋喃并吡啶，吡啶并吡啶，嘧啶并吡啶，咪唑并吡啶，噻唑并吡啶，噁唑酮并吡啶(oxazolopyridines)，喹啉，异喹啉和噌啉；其中喹啉，异喹啉或噌啉优选地满足式Ia，Ib和Ic：
Figure BSA00000189525100531
并且取代基R12至R23在每种情况中各自独立地具有R1，R2和R3的含义；
或者其中R1和R2与携带它们的吡啶一起形成式Id的化合物：
Figure BSA00000189525100532
其中V是S、O或NRk，且Rk选自氢，(C1-C6)-烷基、芳基、或苄基；其中芳基可以任选地由1-5个如上定义的取代基取代；以及
R24，R25，R26，和R27在每种情况下各自独立地具有R1，R2和R3的含义；
f是1-8；
g是0或1至(2f+1)；
x是0-3；和
h是3-7；
包括从其衍生的生理学活性盐和前体药物。
式(I)的示例性化合物在欧洲专利EP0650960和EP0650961中有描述。EP0650960和EP0650961中列出的所有化合物、特别是在化合物权利要求中列出的化合物以及实施例的终产物并入本文作为参考。式(I)的示例性化合物包括但不限于[(3-羟基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸以及[(3-甲氧基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸。
另外，式(I)的示例性化合物在美国专利5,658,933中有描述。美国专利5,658,933中列出的所有化合物、特别是在化合物权利要求中列出的化合物以及实施例的终产物并入本文作为参考。式(I)的示例性化合物包括但不限于3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((十六烷基氧基)-羰基)-甲基)-酰胺盐酸盐，3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((1-辛氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((己氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((丁氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((2-壬氧基)-羰基)-甲基)-酰胺消旋物，3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((庚氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，3-苄氧基吡啶-2-羧酸N-(((辛氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，3-苄氧基吡啶-2-羧酸N-(((丁氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，5-(((3-(1-丁氧基)-丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-((苄氧基羰基)-甲基)-酰胺，5-(((3-(1-丁氧基)-丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((1-丁氧基)-羰基)-甲基)-酰胺，和5-(((3-月桂基氧基)-丙基)氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((苄氧基)-羰基)-甲基)-酰胺。
式(I)的另外的化合物是美国专利5,620,995中描述的取代的杂环氨基甲酰、美国专利6,020,350中描述的3-羟基吡啶-2-氨基甲酰酯、美国专利5,607,954中描述的亚磺酰氨基羰基吡啶-2-氨基甲酰、和美国专利5,610,172和5,620,996中描述的亚磺酰氨基羰基-吡啶-2-氨基甲酰和亚磺酰氨基羰基-吡啶-2-氨基甲酰酯。这些专利列出的所有化合物、特别是在化合物权利要求中列出的化合物以及实施例的终产物并入本文作为参考。
式(Ia)的示例性化合物在美国专利5,719,164和5,726,305中有描述。上述专利中列出的所有化合物、特别是在化合物权利要求中列出的化合物以及实施例的终产物并入本文作为参考。式(Ia)的示例性化合物包括但不限于N-((3-羟基-6-异丙氧基-喹啉-2-羰基)-氨基)-乙酸，N-((6-(1-丁氧基)-3-羟基喹啉-2-基)-羰基)-甘氨酸，[(3-羟基-6-三氟甲氧基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸，N-((6-氯-3-羟基喹啉-2-基)-羰基)-甘氨酸，N-((7-氯-3-羟基喹啉-2-基)-羰基)-甘氨酸和[(6-氯-3-羟基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸。
式(Ib)的示例性化合物在美国专利6,093,730中有描述。美国专利6,093,730中列出的所有化合物、特别是在化合物权利要求中列出的化合物以及实施例的终产物并入本文作为参考。式(Ib)的示例性化合物包括但不限于N-((1-氯-4-羟基-7-(2-丙氧基)异喹啉-3-基)-羰基)-甘氨酸，N-((1-氯-4-羟基-6-(2-丙氧基)异喹啉-3-基)-羰基)-甘氨酸，N-((1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸(化合物A)，N-((1-氯-4-羟基-7-甲氧基异喹啉-3-基)-羰基)-甘氨酸，N-((1-氯-4-羟基-6-甲氧基异喹啉-3-基)-羰基)-甘氨酸，N-((7-丁氧基)-1-氯-4-羟基异喹啉-3-基)-羰基)-甘氨酸，N-((6-苄氧基-1-氯-4-羟基异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸，((7-苄氧基-1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸甲酯，N-((7-苄氧基-1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸，N-((8-氯-4-羟基异喹啉-3-基)-羰基)-甘氨酸，N-((7-丁氧基-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸。
另外，可以用于本发明的方法的式(I)相关的化合物包括但不限于6-环己基-1-羟基-4-甲基-1H-吡啶-2-酮，7-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-5-苯基磺酰甲基-喹啉-8-醇，4-硝基-喹啉-8-醇，5-丁氧基甲基-喹啉-8-醇，[(4-羟基-7-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物B)，和[(4-羟基-7-苯磺酰-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物C)。进一步地，本发明提供了另外的示例性化合物，其中，例如位置A和B一起可以是例如己酸，氰甲基，2-氨基乙基，苯甲酸，1H-苯并咪唑-2-基甲基等。
在其它的实施方案中，本发明方法所用的化合物选自式(III)的化合物或其药物学可接受的盐：
Figure BSA00000189525100561
其中：
a是1-4的整数；
b是0-4的整数；
c是0-4的整数；
Z选自由：(C3-C10)环烷基，独立地由一或多个Y1取代的(C3-C10)环烷基，3-10元杂环烷基和独立地由一或多个Y1取代的3-10元杂环烷基；(C5-C20)芳基，独立地由一或多个Y1取代的(C5-C20)芳基，5-20元杂芳基和独立地由一或多个Y1取代的5-20元杂芳基组成的一组；
Ar1选自由(C5-C20)芳基，独立地由一或多个Y2取代的(C5-C20)芳基，5-20元杂芳基和独立地由一或多个Y2取代的5-20元杂芳基组成的一组；
每个Y1独立地选自由一种亲脂性官能团，(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，5-20元杂芳基和6-26元烷基杂芳基组成的一组；
每个Y2独立地选自由-R′，-OR′，-OR″，-SR′，-SR″，-NR′R′，-NO2，-CN，-卤素，-三卤代甲基，三卤代甲氧基，-C(O)R′，-C(O)OR′，-C(O)NR′R′，-C(O)NR′OR′，-C(NR′R′)＝NOR′，-NR′-C(O)R′，-SO2R′，-SO2R″，-NR′-SO2-R′，-NR′-C(O)-NR′R′，四唑-5-基，-NR′-C(O)-OR′，-C(NR′R′)＝NR′，-S(O)-R′，-S(O)-R″，和-NR′-C(S)-NR′R′组成的一组；
每个R′独立地选自由-H，(C1-C8)烷基，(C2-C8)链烯基，和(C2-C8)炔基组成的一组；
每个R″独立地选自由(C5-C20)芳基和独立地由一或多个-OR′，-SR′，-NR′R′，-NO2，-CN，卤素或三卤代甲基取代的(C5-C20)芳基组成的一组，
或者其中c是0且Ar1是N′取代的脲芳基，所述化合物具有结构式(IIIa)：
Figure BSA00000189525100571
或其药物学可接受的盐，其中：
a、b和Z具有上述定义；并且
R35和R36各自独立地选自由(C1-C8)烷基，(C2-C8)链烯基，(C2-C8)炔基，(C3-C10)环烷基，(C5-C20)芳基，(C5-C20)取代的芳基，(C6-C26)烷芳基，(C6-C26)取代的烷芳基，5-20元杂芳基，5-20元取代的杂芳基，6-26元烷杂芳基，和6-26元取代的烷杂芳基组成的一组；
R37独立地选自由氢，(C1-C8)烷基，(C2-C8)链烯基，和(C2-C8)炔基组成的一组。
式(III)的示例性化合物在国际公开WO 00/50390中有描述。WO 00/50390中列出的所有化合物、特别是化合物权利要求中列出的化合物和实施例中的终产物并入本申请作为参考。式(III)的示例性化合物包括3-{[4-(3，3-联苄基-脲基)-苯磺酰]-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}N-羟基-丙酰胺(化合物D)，3-{{4-[3-(4-氯-苯基)-脲基]-苯磺酰}-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羟基-丙酰胺，和3-{{4-[3-(1，2-二苯基-乙基)-脲基]-苯磺酰}-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羟基-丙酰胺。
本发明还提供了鉴别本发明的化合物的方法。在某些方面，本发明的化合物是一种稳定HIFα的化合物。化合物稳定或激活HIFα的能力可以例如通过直接测定样品中的HIFα而测定，通过例如测定与von Hippel Lindau蛋白相关的HIFα的减少而间接测定(见例如国际公开WO 00/69908所述)，或者通过激活HIF应答靶基因或报道基因构建体而间接测定(见例如美国专利No.5,942,434所述)。在没有或有所述化合物的情况中测定并对比HIF和/或HIF应答靶蛋白质的水平将鉴别稳定HIFα和/或激活HIFα的化合物。
在其它方面，本发明的化合物是抑制HIF羟化酶活性的化合物。对羟化酶活性进行分析在本领域是标准化的。这种分析可直接或间接测定羟化酶活性。例如，一种分析可以测定酶底物中存在的羟化的残基，例如脯氨酸、天冬酰胺等，所述酶底物例如靶蛋白质、合成的肽模拟物或其片段(见例如Palmerini et al.(1985)J Chromatogr 339：285-292所述)。在存在一种化合物的情况下羟化的残基例如脯氨酸或天冬酰胺的还原是抑制羟化酶活性的化合物的指征。或者，分析可以测定羟化反应的其它产物，例如从2-氧化戊二酸中琥珀酸盐的形成(见例如Cunliffe etal.(1986)Biochem J 240：617-619所述)。Kaule和Gunzler(1990；Anal Biochem 184：291-297)描述了测定从2-氧化戊二酸中产生琥珀酸盐的示范程序。
上述程序可用于鉴别调节HIF羟化酶活性的化合物。靶蛋白质可包括HIFα或其片段，例如HIF(556-575)。酶可包括例如得自任何来源的HIF脯氨酰羟化酶(见例如GenBank登记号AAG33965等)或者HIF天冬酰胺酰羟化酶(见例如GenBank登记号AAL27308等)。酶也可以存在于粗制的细胞裂解物中或以部分纯化形式存在。例如，测定HIF羟化酶活性的程序在Ivan et al.(2001，Science 292：464-468；及2002，Proc Natl Acad Sci USA 99：13459-13464)和Hirsila et al.(2003，JBiol Chem 278：30772-30780)中描述；另外的方法在国际公开WO03/049686中描述。在没有或有所述化合物的情况中测定并对比酶活性将鉴别抑制HIFα羟化的化合物。
本发明的化合物是进一步产生在体外或体内可测定的作用的化合物，所述作用如红细胞生成增加、铁的代谢增强或者病变得以治疗性改善，所述病变例如缺铁包括功能性缺铁、慢性疾病性贫血、缺铁性贫血、小红细胞症或小红细胞性贫血，或者与炎症、感染、免疫缺陷或肿瘤疾病相关的病变。
所述可测定的作用可以是如下参数的任一种：增加的血红蛋白、血细胞比容、网织红细胞、红细胞计数、血浆EPO等；改善的铁代谢，如通过观察到的症状减轻而测定，所述症状包括例如慢性疲劳、贫血貌(pallor)、头晕眼花等症状的缓解，或者通过增加的血清铁水平、改变的血清铁蛋白水平、运铁蛋白百分比、总铁结合能力、改善的网织红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容，例如全部通过标准血液计数分析而测定
药物配制品与给药途径
本发明的组合物可以直接输送或者在含有赋形剂的药物学组合物中输送，这些为本领域所熟知。本发明的治疗方法可包含给予具有或处于具有代谢失调危险中的对象有效量的本发明化合物，所述代谢失调尤其是相关于葡萄糖调节的失调，例如糖尿病，高血糖症等。在一个优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物，在最优选的实施方案中，所述对象是人。
化合物或药物的有效量，例如剂量，可以通过常规的实验确定，可以是一种有效及便利的给药途径及适当的配制品。本领域已经可以利用各种配制品和药物输送系统(见例如Gennaro，ed.(2000)Remington′s Pharmaceutical Sciences，如前；及Hardman，Limbird，andGilman，eds.(2001)The Pharmacological Basis of Therapeutics，如前)。
合适的给药途径可例如包括口服、经直肠、局部、鼻、肺、眼、肠道、和非肠道途径给药。非肠道给药的主要途径包括静脉内、肌内和皮下给药。给药的次级途径包括腹膜内、动脉内、关节内、心脏内、脑池内(intracisternal)、皮内、病灶内(intralesional)、眼内、胸膜内、鞘内、子宫内及心室内给药。治疗指征，连同药物的物理、化学和生物学性质，规定了使用的配制品类型及给药途径，以及优选局部输送还是全身性输送。
本发明的化合物的药物剂量形式可以在立即释放、控制释放、持续释放或者靶定药物输送系统中提供。常用的剂型包括例如溶液和悬浮液、(微)乳状液、油膏、凝胶和药膏、脂质体、片剂、糖衣、软胶囊或硬胶囊、栓剂、卵状小体、植入体、非结晶的或晶体粉末、气雾剂、及冻干的配制品。根据使用的给药途径，对于药物的应用或给予需要特殊的设备，例如针管和针头、吸入器、泵、注射笔、涂药器、或特殊的细颈瓶。药物剂型通常由药物、赋形剂和容器/封闭系统组成。本发明的化合物中可以加入一或多种赋形剂(也是指无活性的配料)以改善或促进药物的生产、稳定性、给予及安全性，并且可以提供一种达到希望的药物释放模式的手段。因此加入药物中的赋形剂的类型可以根据各种因素决定，如根据药物的物理和化学性质、给药途径及生产程序决定。本领域可获得药物可接受的赋形剂，包括在各种药典中列出的那些赋形剂(见例如USP、JP、EP和BP、FDA web page(www.fda.gov)，Inactive Ingredient Guide 1996，and Handbook ofPharmaceutical Additives，ed.Ash；Synapse Information Resources，Inc.2002)。
本发明的化合物的药物剂型可以通过本领域熟知的任何方法生产，例如通过常规的混和、筛分、溶解、熔化、粒化、制成糖衣、压片、悬浮、挤压、喷雾干燥、研磨、乳化、(纳米/微米-)胶囊化、包载、或冻干方法进行。如上所述，本发明的组合物可以包括一或多种生理学可接受的无活性配料，以促进活性分子加工成药物制品。
适当的配制品依赖于希望的给药途径。对于静脉内注射而言，例如所述组合物可以在水溶液中配制，如果需要则使用生理学兼容的缓冲液，包括例如磷酸盐、组氨酸或柠檬酸盐以调节配制品的pH，及使用一种张性制剂例如氯化钠或葡萄糖。对于经粘膜或鼻给药，优选半固体、液体配制品或者药膏，可以含有渗透增强剂。这种渗透剂是本领域所熟知的。对于口服，所述化合物可以配制为液体或固体剂型及配制为立即或控制释放的配制品。经口腔摄取的合适剂型包括片剂、药丸、糖衣片、软胶囊或硬胶囊、液体、凝胶、糖浆、粉浆、悬浮液和乳状液。所述化合物也可以配制为经直肠给予的组合物，如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯的基质。
固体口服剂型可以使用赋形剂获得，可包括充填剂、分解剂、结合剂(干或湿)、分解延缓剂、润滑剂、滑动剂、抗吸附剂、阳离子交换树脂、增湿剂、抗氧化剂、防腐剂、色素、和香料。这些赋形剂可以是合成或天然来源的。这些赋形剂例如包括纤维素衍生物、柠檬酸、磷酸二钙、明胶、碳酸镁、十二烷基硫酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸盐、二氧化硅、苯甲酸钠、山梨醇、淀粉、硬脂酸或其盐、糖(即葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、滑石、黄芪胶、植物油(氢化的)、及蜡。乙醇和水可作为粒化辅助剂。在某些情况中，可需要用例如掩饰味道的薄膜、胃酸抗性薄膜或延缓释放的薄膜包被药片。天然的及合成的聚合物组合着色剂、糖和有机溶剂或水通常用于包被药片，产生糖衣片。当首选胶囊而非片剂时，可以将药物粉末、其悬浮液或溶液在相容的硬或软胶囊中输送。
在一个实施方案中，本发明的化合物可以局部给予，如通过皮肤药膏、半固体或液体配制品例如凝胶、(微)乳状液、油膏、溶液、(纳米/微米)-悬浮液或泡沫形式给予。药物渗透入皮肤和皮下组织可以通过例如如下方式调节：使用渗透增强剂；适当选择并组合亲脂性、亲水性和两亲性赋形剂，包括水、有机溶剂、蜡、油、合成及天然的聚合物、表面活性剂、乳化剂；通过pH调节；及使用复合剂。可以使用其它技术如离子电渗法以调节本发明的化合物的皮肤渗透力。优选经皮或局部给药，例如在其中希望最小程度全身暴露的局部给药情况中。
对于吸入给药或者经鼻给药，根据本发明使用的化合物便利地以溶液、悬浮液、乳状液或加压包或雾化器中的半固体气雾剂形式给予，通常使用推进物，例如衍生自甲烷和乙烷、二氧化碳或者任何其它合适气体的卤化碳。对于局部应用气雾剂，使用碳氢化合物如丁烷、异丁烯和戊烷。在加压的气雾剂情况中，合适的剂量单位可以通过提供阀门以输送经过计量的数值而确定。可以配制用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒。这些典型地含有所述化合物与一种合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
通过注射经非肠道给药所配制的组合物通常是无菌的，并且可以单位剂量形式存在，例如安瓶、注射器、注射笔，或者存在于多剂量容器中，后者通常含有防腐剂。所述组合物可以采取如于油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳状液形式，并且可以含有配制剂如缓冲液、张力制剂、粘性增强剂、表面活性剂、悬浮剂和分散剂、抗氧化剂、生物合适的聚合物、螯合剂和防腐剂。根据注射部位，所述载体可以含有水、合成油或植物油、和/或有机共溶剂。在某些情况中，如在冻干产物或浓缩物的情况中，所述非肠道配制品可以重建或稀释之后给予。提供控制释放或持续释放本发明混合物的长效配制品可以包括纳米/微米粒子或纳米/微米结晶体或非微粒化的结晶体的可注射悬浮液。除了本领域熟知的之外，聚合物如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或其共聚物可以作为控制/持续释放基质。其它长效输送系统可以需要切开的植入体和泵的形式存在。
静脉注射本发明的分子的合适载体为本领域所熟知，包括基于水的含有碱如氢氧化钠的溶液，以形成离子化的化合物，蔗糖或氯化钠作为张力剂，例如所述缓冲液含有磷酸盐或组氨酸。可以加入共溶剂如聚乙二醇。这些基于水的系统对于溶解本发明的化合物是有效的，在全身性应用时产生较低毒性。溶液系统的成分比例可以改变，而不破坏溶解性和毒性特性。另外，所述成分的同一性可以改变。例如，可以使用低毒性的表面活性剂，如聚山梨醇酯或泊洛沙姆(poloxamer)，可以是聚乙二醇或其它共溶剂，可以加入生物合适的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，其它糖和多元醇可以取代葡萄糖。
对于用于本发明的治疗方法的组合物，治疗有效量可以使用各种本领域熟知的技术初步评估。用于底物研究中的初始剂量可以基于在细胞培养分析中确定的有效浓度。适于人体对象的剂量范围可以例如使用得自动物研究和细胞培养分析的数据确定。
本发明的化合物、制剂或药物的治疗有效量是指导致对象症状改善或存活期延长的所述化合物、制剂或药物的量。这种分子的毒性和治疗效力可以通过标准药物学程序在细胞培养或实验动物中确定，例如通过确定LD50(半数致死量)和ED50(半数治疗有效量)而进行。毒性与治疗作用的剂量比率是治疗指数，其可以LD50/ED50的比率表示。优选呈现高治疗指数的制剂。
有效量或治疗有效量是所述化合物或药物组合物激发研究人员、兽医、医生或其它临床医生研究的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的量，例如调节葡萄糖代谢，降低升高或增加的血糖水平，治疗或预防与葡萄糖代谢相关的疾病例如糖尿病等。
剂量优选在循环浓度范围内，包括低毒性或无毒性的ED50。剂量在此范围内根据应用的剂型和/或利用的给药途径而变化。应根据本领域已知的方法，综合对象的状况选择精确的配制品、给药途径、剂量及给药间隔时间。
剂量和间隔可以单独调节以提供活性组分的血浆水平足以达到希望的作用，例如调节葡萄糖代谢、降低血糖水平等，即最小有效浓度(MEC).。MEC对于每种化合物有所变化，但可以从例如体外数据和动物实验中估计。达到MEC所必需的剂量依赖于个体特性及给药途径。在局部给药或选择性摄取的情况中，药物的有效局部浓度与血浆浓度可能不相关。
给予的药剂或组合物的量可依赖于各种因素而定，包括对象的性别、年龄和体重，病痛的严重程度，给药方式，及主治医生的判断。
本发明的组合物如果需要则可以在含有一或多个单位剂量形式的含有所述活性配料的包装或分装设备中存在。这种包装或设备可例如包含金属或塑料薄片，如水泡包装，或者具有玻璃和橡胶塞子的小瓶。所述包装或分装设备可以根据给药方式而指导应用。也可以制备在兼容的药物载体中配制的包含本发明化合物的组合物，置于合适的容器中，并针对指定情况的治疗而标明。
根据本文教导，本领域技术人员易于实现本发明的这些及其它实施方案
实施例
参考如下实施例可进一步理解本发明，所述实施例纯粹是本发明的示例。这些实施例仅是举例示出本发明。本发明非限于举例说明的实施方案的范围，它们仅是举例说明本发明的各个方面。功能等价的任何方法均在本发明的范围内。除了本文所述之外，本领域技术人员根据前述描述和附图可以对本发明进行各种修改。这种修改包含在所附权利要求书的范围内。
实施例1：克服TNF-α对EPO生成的抑制作用
将Hep3B细胞用各种浓度(0，0.4，2，10ng/ml)的TNF-α在无或有化合物A或化合物B存在下处理三天。分泌的EPO水平使用可商购的ELISA试剂盒(R & D Systems，目录号DEP00)确定。在不存在化合物的情况中，用TNF-α处理Hep3B细胞以剂量依赖性方式降低EPO生成。在不存在TNF-α的情况下用各种浓度的化合物A(图1A)或化合物B(图1B)处理的Hep3B细胞示出剂量依赖性EPO生成增加。在存在TNF-α时加入这两种化合物的任一种化合物均显著降低TNF-α对EPO生成的抑制作用。在存在低浓度(例如0.4ng/ml)和高浓度(例如10ng/ml)TNF-α的情况中观测到通过脯氨酰羟化酶抑制而克服了TNF-α对EPO生成的抑制作用。因此，炎性细胞因子TNF-α对EPO生成的抑制作用通过使用本发明的化合物和方法抑制脯氨酰羟化酶活性而克服。这些结果提示本发明的化合物和方法可用于增加存在炎性细胞因子TNF-α的情况下的EPO生成。另外，本发明的方法和化合物可用于增加EPO生成，并因此用于治疗患者的贫血，例如其中所述患者患有与TNF-α相关的疾病如急性或慢性炎症或其它慢性疾病性贫血。
进行一系列实验以检验在将细胞暴露于炎性细胞因子TNF-α后(即在已经暴露于TNF-α的细胞中)，本发明的化合物对EPO生成的作用。在这些实验中，TNF-α信号传导因此在加入脯氨酰羟化酶抑制剂之前被起始。将Hep3B细胞用各种浓度(0，0.4，2，10ng/ml)的TNF-α处理2小时，之后向培养的细胞中加入各种浓度的化合物A或化合物B。在加入化合物3天后，分泌的EPO水平如上述测定。
如图2A和2B所示，在用TNF-α对Hep3B细胞预处理2小时后，化合物A和化合物B克服了TNF-α对EPO生成的抑制作用。这个数据表明本发明的化合物和方法可用于在暴露于TNF-α的细胞中增加EPO生成。这些结果还提示用本发明的化合物进行的处理提供了增加EPO生成及治疗EPO生成受到TNF-α抑制的患者的贫血的有用手段。
加入本发明的化合物显著降低了TNF-α对EPO生成的抑制作用。因此，本发明的化合物和方法可用于治疗或预防与增加的TNF-α相关的贫血，例如炎性疾病。
实施例2：克服IL-1β对EPO生成的抑制作用
将Hep3B细胞用各种浓度(0，0.4，2，10ng/ml)的IL-1β在无或有化合物A或化合物B存在下处理3天。分泌的EPO水平使用可商购的ELISA试剂盒(R & D Systems，目录号DEP00)测定。在不存在化合物的情况下，用IL-1β处理Hep3B细胞以剂量依赖性方式降低EPO生成。在不存在IL-1β的情况下用各种浓度的化合物A(图3A)或化合物B(图3B)处理的Hep3B细胞示出EPO生成剂量依赖性增加。在存在IL-1β时加入两种化合物中的任一化合物均显著降低IL-1β对EPO生成的抑制作用。在存在低浓度(例如0.4ng/ml)和高浓度(例如10ng/ml)IL-1β的情况中观测到通过脯氨酰羟化酶抑制而克服了IL-1β对EPO生成的抑制作用。因此，炎性细胞因子IL-1β对EPO的抑制作用通过使用本发明的化合物和方法抑制脯氨酰羟化酶活性而克服。这些结果提示本发明的化合物和方法可用于增加存在炎性细胞因子IL-1β的情况下的EPO生成。另外，本发明的方法和化合物可用于增加EPO生成，并因此可用于治疗患者贫血，例如其中所述患者患有与IL-1β相关的疾病如急性或慢性炎症或其它慢性疾病性贫血。
进行一系列实验以检验在将细胞暴露于炎性细胞因子IL-1β后(即在已经暴露于1L-1β的细胞中)，本发明的化合物对EPO生成的作用。在这些实验中，IL-1β信号传导因此将在加入脯氨酰羟化酶抑制剂之前被起始。将Hep3B细胞用各种浓度(0，0.4，2，10ng/ml)的IL-1β处理2小时，之后向培养的细胞中加入各种浓度的化合物A或化合物B。在加入化合物3天后，分泌的EPO水平如上述测定。
如图4A和4B所示，在用IL-1β对Hep3B细胞预处理2小时后，化合物A和化合物B克服了IL-1β对EPO生成的抑制作用。这个数据表明本发明的化合物和方法可用于在暴露于IL-1β的细胞中增加EPO生成。这些结果还提示用本发明的化合物进行的处理提供了增加EPO生成及治疗EPO生成受到IL-1β抑制的患者的贫血的有用手段。
加入本发明的化合物显著降低IL-1β对EPO生成的抑制作用。因此，本发明的化合物和方法可用于治疗或预防与增加的IL-1β相关的贫血，例如炎性疾病。
实施例3：TNF-α诱导的VCAM-1表达的抑制
内皮细胞对淋巴细胞的粘附部分是通过内皮细胞表达血管细胞粘附分子(VCAM)-1而产生的。内皮细胞中VCAM-1表达是通过各种炎性细胞因子如TNF-α诱导的。为研究HIF脯氨酰羟化酶抑制对TNF-α诱导的VCAM-1表达的作用，将HUVEC(人脐静脉内皮细胞)在无或有各种浓度的化合物B或化合物C的情况下用TNF-α刺激1天。然后测定VCAM表达情况。
如图5所示，TNF-α(1ng/ml)诱导VCAM-1在HUVEC细胞中表达。然而，向TNF-α刺激的细胞中加入化合物B或化合物C导致对TNF-α诱导的VCAM-1表达的剂量依赖性抑制。这个数据表明本发明的方法和化合物对于降低与炎性细胞因子TNF-α相关的VCAM-1表达是有效的。结果进一步提示本发明的化合物和方法可用于抑制与各种炎症和自身免疫疾病如慢性疾病性贫血相关的VCAM-1表达。
实施例4：IL-1β诱导的VCAM-1表达的抑制
内皮细胞中VCAM-1表达也由炎性细胞因子IL-1β诱导。为研究HIF脯氨酰羟化酶抑制对IL-1β诱导的VCAM-1表达的作用，将HUVEC(人脐静脉内皮细胞)在无或有各种浓度的化合物B或化合物C的情况下用IL-1β刺激1天。然后测定VCAM表达情况。
IL-1β(1ng/ml)诱导VCAM-1在HUVEC细胞中表达。然而，向IL-1β刺激的细胞中加入化合物B或化合物C导致对IL-1β诱导的VCAM-1表达的剂量依赖性抑制(数据未示出)。这些数据表明本发明的方法和化合物对于降低与炎性细胞因子IL-1β相关的VCAM-1表达是有效的。结果进一步提示本发明的化合物和方法可用于抑制与各种炎症和自身免疫疾病如慢性疾病性贫血相关的VCAM-1表达。
实施例5：内皮细胞上TNF-α和IL-1诱导的VCAM-1表达的抑制
将HUVEC用载体对照物或各种浓度(0，20，40，80μM)的化合物B或化合物C处理24小时。洗涤细胞，然后用1ng/ml TNF-α或1ng/ml IL-1β刺激4小时。然后通过基于细胞的ELISA测定细胞表面VCAM-1表达。
如图25所示，用脯氨酰羟化酶抑制剂预处理降低了炎性细胞因子TNF-α和IL-1β诱导的细胞表面VCAM-1表达的诱导。这些结果表明本发明的化合物和方法抑制TNF-α和IL-1β的炎性功能并抑制对于介导异型细胞性白细胞粘附重要的细胞表面粘附分子的表达。通过用本发明的化合物处理而抑制白细胞粘附提供了一种降低炎症级联的有效手段，从而降低炎症并降低限制EPO生成及抑制红细胞生成的炎症作用。
实施例6：TNF-α诱导的E-选择蛋白表达的抑制
内皮E-选择蛋白属于在炎症事件中介导白细胞对血管内皮细胞的初始附着的细胞粘附分子的选择蛋白家族。IL-1、TNF-α和脂多糖均诱导E-选择蛋白的表达(见例如Bevilacqua et al.(1987)Proc NatlAcad Sci USA 84：9238-9242 and Bevilacqua and van Furth(1993)JLeukoc Biol 54：363-378)。为研究HIF脯氨酰羟化酶抑制对TNF-α诱导的E-选择蛋白表达的作用，将HUVEC在无或有各种浓度的化合物B或化合物C存在的情况下用1ng/ml TNF-α刺激1天。然后测定E-选择蛋白和VCAM表达。
如图24A和24B所示，化合物B和化合物C示出对HUVEC中TNF-α诱导的VCAM和E-选择蛋白表达的剂量依赖性抑制。图24A和24B中的数据以在应答各种浓度的化合物B(图24A)或化合物C(图24B)中观测到的VCAM和E-选择蛋白表达的抑制百分率表示。在用50μM化合物B或化合物C处理的HUVEC中观测到高于60％抑制百分率的对VCAM和E-选择蛋白表达的抑制。这个数据表明本发明的方法和化合物对于降低内皮细胞中与炎性细胞因子TNF-α相关的VCAM和E-选择蛋白表达是有效的。结果进一步提示本发明的化合物和方法可用于抑制与各种炎症和自身免疫疾病如慢性疾病性贫血相关的VCAM和E-选择蛋白表达。另外，通过本发明的方法和化合物对粘附分子包括VCAM和E-选择蛋白的内皮细胞表达的抑制，提供了降低血管炎症中早期事件的手段。
实施例7：IL-1β诱导的E-选择蛋白表达的抑制
为研究HIF脯氨酰羟化酶抑制对IL-1β诱导的E-选择蛋白表达的作用，将HUVEC在无或有各种浓度的化合物B或化合物C的情况下用1ng/ml IL-1β刺激1天。然后测定E-选择蛋白表达。
化合物B和化合物C示出对HUVEC中IL-1β诱导的E-选择蛋白表达的剂量依赖性抑制(数据未示出)。这些数据表明本发明的方法和化合物对于降低内皮细胞中与炎性细胞因子IL-1β相关的E-选择蛋白表达是有效的。结果进一步提示本发明的化合物和方法可用于抑制与各种炎症和自身免疫疾病如慢性疾病性贫血相关的E-选择蛋白表达。另外，通过本发明的方法和化合物对粘附分子包括VCAM和E-选择蛋白的内皮细胞表达的抑制，提供了降低血管炎症中早期事件的手段。
实施例8：TNF-α、IL-1β和IFN-γ诱导的E-选择蛋白表达的抑制
将HUVEC用载体对照物或者各种浓度的化合物B或化合物C处理24小时。洗涤细胞，然后用1ng/ml TNF-α、1ng/ml IL-1β或者各1ng/ml TNF-α、IL-1β和IFN-γ的组合处理4小时。E-选择蛋白的细胞表面表达通过基于细胞的ELISA测定。
如图26所示，用化合物B或化合物C预处理抑制了由炎性细胞因子TNF-α或IL-1β诱导的细胞表面E-选择蛋白表达的诱导。另外，在存在已知增加E-选择蛋白表达的三种炎性细胞因子(TNF-α，IL-1β和IFN-γ)的情况下用任一化合物预处理均降低了E-选择蛋白表达。这些结果表明本发明的化合物阻断TNF-α、IL-1β和IFN-γ对内皮细胞的炎性功能，这通过对介导白细胞在激活的内皮上滚动的细胞表面粘附分子的表达的抑制而表明。由于白细胞通过E-选择蛋白粘附于激活的内皮是维持(perpetuating)炎症级联的早期步骤，因此通过抑制E-选择蛋白表达而抑制白细胞滚动提供了一种降低进一步限制EPO生成并抑制红细胞生成的炎症级联的手段。
实施例9：EPO生成中的协同增加
将Hep3B细胞在无或有各种浓度(3μM，10μM，30μM)的化合物A或化合物B的情况中用各种浓度(0，0.1，1，10ng/ml)的IL-6处理1或3天。分泌的EPO水平使用可商购的ELISA试剂盒(R & DSystems，目录号DEP00)确定。在不存在化合物的情况中，用IL-6处理Hep3B细胞对EPO生成的作用最小。如图27A和27B所示，用IL-6处理的Hep3B细胞增加EPO表达，略微高于未处理的细胞。特别地，EPO水平在对照细胞中为大约20mIU/ml，而在用10ng/ml IL-6处理的细胞中为大约50mIU/ml。
用化合物A或化合物B处理而无IL-6处理的Hep3B细胞示出EPO水平以剂量依赖性方式增加。然而，用化合物A或化合物B在存在IL-6的条件下处理Hep3B细胞示出EPO水平显著增加(见图27A和27B所示)。在存在IL-6的条件下化合物处理对EPO生成的作用是协同的。例如，用10ng/ml IL-6处理的Hep3B细胞示出大约50mIU/ml的EPO水平。在无IL-6的条件下用10mM化合物A或化合物B处理Hep3B细胞分别产生大约60mIU/ml和220mIU/ml的EPO。在存在10ng/ml IL-6的条件下，加入化合物A和化合物B使EPO水平分别增加至大约270mIU/ml和高于400mIU/ml。因此，本发明的化合物与IL-6在诱导肝细胞中的EPO表达中协同作用。
实施例10：克服细胞因子诱导的对EPO受体信号传导的抑制
刺激细胞系TF-1(人红白血病；ATCC cat # CRL-2003)以使之应答EPO加入而增殖。在存在各种促炎细胞因子的条件下，EPO介导的TF-1细胞增殖增加被弱化。为确定脯氨酰羟化酶抑制对TF-1细胞增殖的作用，将TF-1细胞用各种浓度的促炎细胞因子IL-1β、TNF-α或IFN-γ在无或有脯氨酰羟化酶抑制剂的条件下处理，并且如下测定EPO介导的细胞增殖。将在96孔微滴定平板中一式三份培养的细胞孔与无血清培养基在无或有EPO的条件下保温24小时。在培养的最后4小时期间，向每个孔中加入1μCi含氚胸苷(3H-TdR；Amersham)。细胞对EPO受体信号传导的应答通过测定细胞增殖而确定。细胞增殖通过量化掺入细胞中的3H-TdR的量而测定，首先用水溶解细胞，然后捕捉细胞收集器中的尼龙膜上的DNA。
或者，得自苯肼处理的动物(其引起脾中EPO应答祖细胞占优势)的脾细胞的单细胞悬浮液用作EPO应答细胞的来源。然后如上所述回体(ex vivo)测定EPO介导的增殖。
用EPO处理的TF-1细胞导致细胞增殖增加，这通过含氚胸苷掺入增加而确定。向EPO处理的TF-1细胞中加入促炎细胞因子IL-1β、TNF-α或IFN-γ导致对EPO应答的降低，引起细胞增殖降低。确定本发明的化合物的加入对促炎细胞因子对TF-1细胞中EPO介导的细胞增殖的抑制作用的作用。用EPO和促炎细胞因子处理的TF-1细胞中细胞增殖增加(通过含氚胸苷掺入增加而测定)表明本发明的化合物和方法克服了促炎细胞因子对EPO介导的细胞增殖增加的抑制作用。
实施例11：增加运铁蛋白受体表达
本发明的化合物对运铁蛋白受体表达的作用如下检测。将各种细胞(Hep3B，HepG2，HK-2)与化合物A或化合物B一起保温1天。然后使用CD7-1-PE抗体(Ancell，目录号no.223-050)通过FACS分析细胞的运铁蛋白受体表达情况。结果示于表1。
表1
  细胞类型   处理   平均FL
  Hep3B   DMSO   40.21
  化合物A   40.89
  化合物B   42.43
  HepG2   DMSO   49.59
  化合物A   56.52
  化合物B   53.53
  HK-2   DMSO   10.80
  化合物A   12.20
  化合物B   18.92
如表1所示，向细胞中加入本发明的各种化合物增加了运铁蛋白受体表达。使用本发明的脯氨酰羟化酶抑制剂抑制HIF脯氨酰羟化增加了细胞中运铁蛋白受体的表达。使用本发明的脯氨酰羟化酶抑制剂在肝细胞(例如Hep3B，HepG2)、肾细胞(例如HK-2)和淋巴细胞(例如THP-1)中观测到了运铁蛋白受体表达增加。因此，本发明的方法和化合物可用于在各种细胞类型中增加运铁蛋白受体表达。另外，增加的运铁蛋白受体表达会导致含铁运铁蛋白的运铁蛋白受体介导的胞吞增加，从而增加铁的转运、利用、贮存和代谢。因此，本发明的方法和化合物可用于通过增加铁的转运、利用、贮存和代谢而增强红细胞生成。
实施例12：增加体外运铁蛋白受体表达和铁的摄取
化合物对细胞中铁的摄取的作用如下测定。将原代单核细胞和巨噬细胞及单核细胞和巨噬细胞系(例如THP-1)用各种浓度的脯氨酰羟化酶抑制剂处理1、2或3天。然后使用荧光免疫染色和流式细胞计量术检测细胞表面运铁蛋白受体的存在。结果示出加入脯氨酰羟化酶抑制剂增加了细胞表面运铁蛋白受体表达，这表明脯氨酰羟化酶抑制对增加运铁蛋白与细胞结合及因此的铁与细胞结合的效力。用脯氨酰羟化酶抑制剂处理的细胞对铁的摄取的改变如下确定。将细胞在存在59Fe条件下用化合物处理。用脯氨酰羟化酶抑制剂处理的细胞对铁的摄取增加通过测定细胞结合的59Fe而确定。细胞结合合的59Fe增加表示细胞中铁的摄取增加。
实施例13：增加铁调节蛋白-2水平和活性
铁的摄取、贮存和利用部分是通过参与铁代谢的关键蛋白质的表达和活性而产生，所述关键蛋白质包括反式作用蛋白质，已知是铁调节蛋白(IRP)。IRP-1和IRP-2通过结合参与铁代谢的蛋白质的各种mRNA中的特异性铁应答元件而控制mRNA的稳定性和翻译，从而影响铁代谢的基本上所有方面。缺铁增加了IRP活性，导致运铁蛋白受体表达增加及铁蛋白表达降低。另外，在存在铁的情况下，IRP活性降低，导致运铁蛋白受体表达降低及铁蛋白表达增加。
为检验本发明化合物对铁代谢的各个方面的作用，进行如下实验。将小鼠Hepa-1细胞用脯氨酰羟化酶抑制剂处理直至48小时。然后收获细胞并使用特异于IRP-2的抗体(Alpha Diagnostic International，Inc.，San Antonio TX)通过免疫印迹分析细胞裂解物的IRP-2表达。结果示出在加入化合物后胞质IRP-2水平增加，表明本发明的方法和化合物可用于增加IRP水平并因此增加铁的代谢。
通过铁蛋白和运铁蛋白表达中的变化而测定的本发明的化合物对IRP-2活性的作用如下确定。将小鼠RAW 264.1巨噬细胞系用脯氨酰羟化酶抑制剂处理直至48小时。然后收获细胞并通过免疫印迹(ADI，目录号IRP21-S)分析铁蛋白和运铁蛋白表达。在脯氨酰羟化酶抑制之后铁蛋白表达水平降低及运铁蛋白表达水平增加表明本发明的方法和化合物可用于稳定和增加IRP-2的活性。增加的IRP-2表达降低了负责铁的长期贮存的铁蛋白的表达，并增加了运铁蛋白和运铁蛋白受体的表达，促进铁的摄取、转运和利用，因此增强红细胞生成。通过增加IRP-2的表达和活性，本发明的方法和化合物可用于降低铁蛋白的表达及相关的铁的长期贮存，并增加运铁蛋白和运铁蛋白受体的表达。因此，本发明的方法和化合物可用于增加铁的摄取、转运和利用，并因此用于增强红细胞生成。
实施例14：增强铁的利用
给予大鼠载体对照物或HIF脯氨酰羟化酶抑制剂，之后静脉内注射59Fe-放射标记的柠檬酸亚铁(Amersham)。从尾静脉和全部游离血浆中抽取系列血样，在闪烁计数器中测定红细胞结合的放射性以检测铁的转运和铁掺入红细胞血红素和血红蛋白合成中。增加的红细胞结合的59Fe表明本发明的化合物可用于增强血红素合成、血红蛋白产生和红细胞生成所需的铁的利用。
实施例15：增强的体外红细胞生成基因表达
将Hep3B细胞(ATCC No.HB-8064)在含有8％胎牛血清的DMEM中生长。将Hep3B细胞接种于6孔培养皿中，密度为约500000个细胞/孔。8小时后，将培养基更换为含有0.5％胎牛血清的DMEM，并将细胞额外保温16小时。向细胞中加入化合物B或化合物D(终浓度为25μM)，并将细胞保温不同的时间。对照细胞(未进行化合物处理，只加入DMSO)在0、6和48小时收获。对收获的细胞分析细胞存活力(GUAVA)，或者将其加入RNA提取缓冲液(RNeasy，Qiagen)中，在-20℃贮存以进行随后的RNA纯化。重复的微阵列使用分离自在不同天数进行的重复实验的RNA产生。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从细胞中分离总RNA。
将RNA在0.3M乙酸钠(pH 5.2)、50ng/ml糖原和2.5体积的乙醇中在-20℃沉淀1小时。离心样品并将沉淀用冷80％乙醇洗涤、干燥并再悬浮于水中。双链cDNA根据厂商指导使用T7-(dT)24第一链引物(Affymetrix，Inc.，Santa Clara CA)和SUPERSCRIPT CHOICE系统(Invitrogen)合成。终cDNA使用PHASE LOCK GEL insert(Brinkman，Inc.，WestburyNY)，使用等体积的25∶24∶1苯酚∶氯仿∶异戊醇提取。收集水相，使用0.5体积的7.5M乙酸铵和2.5体积的乙醇沉淀cDNA。或者，使用GENECHIP样品清除模块(Affymetrix)根据厂商指导纯化cDNA。
使用BIOARRAY HighYield RNA转录标记试剂盒(EnzoDiagnostics，Inc.，Farmingdale NY)根据厂商指导在体外翻译(IVT)反应中从cDNA中合成生物素标记的cRNA。最终标记的产物使用GENECHIP样品清除模块(Affymetrix)根据厂商指导进行纯化及片段化。
杂交混合物通过将5μg探针置于100μl的1×杂交缓冲液(100mMMES，1M[Na+]，20mM EDTA，0.01％Tween 20)，100μg/ml鲑精DNA，500μg/ml乙酰化的BSA，0.03nM对照寡B2(Affymetrix)，及1×GENECHIP真核杂交对照物(Affymetrix)中而制备。随后将所述混合物在99℃保温5分钟，然后离心5分钟。将人基因组U133A阵列(Affymetrix)置于室温，然后与1×杂交缓冲液在45℃旋转预杂交10分钟。然后将所述缓冲液用80μl杂交混合物置换，所述阵列在45℃在60rpm抗衡杂交。杂交后，将阵列用6×SSPE，0.1％Tween 20洗涤一次，然后根据厂商指导使用R-藻红蛋白-缀合的链霉抗生物素蛋白(Molecular Probes，Eugene OR)、山羊抗链霉抗生物素蛋白抗体(Vector Laboratories，Burlingame CA)和GENECHIP Fluidics Station400装置(Affymetrix)洗涤和染色。使用GENEARRAY扫描仪(Affymetrix)和Microarray Suite软件(Affymetrix)分析阵列。
人基因组U133A阵列(Affymetrix)代表Human Unigene databasebuild 133(National Center for Biotechnology Information，Bethesda MD)中的所有数据，包括大约14,500个充分鉴定的人基因。
RNA质量通过毛细管电泳(Agilent Bioanalyzer)监测。如述(Affymetrix)制备杂交混合物，并与含有22,283个探针系列的Affymetrix人U133A阵列杂交。使用Affymetrix MicroArray Suite(MAS)软件分析阵列性能，各个探针系列根据软件默认值被指定为“present”、“marginal”和“absent”命令。使用GeneSpring软件(SiliconGenetics)进行统计学分析和产生过滤探针系列表。“表达的”探针系列的截断值(Cutoff)使用Affymetrix″P″命令和得自Genespring′s固有数据误差模型的绝对表达值的组合。数据根据平均对照样品归一化。
如下表2所示，编码红细胞生成蛋白的基因的表达(相对于对照组mRNA水平的增加倍数)在用本发明的化合物处理的Hep3B细胞中增加。(每种条件下的两个血浆铜蓝蛋白数据点在下表2中表示)。特别地，血浆铜蓝蛋白和运铁蛋白受体2基因表达在用本发明化合物处理的Hep3B细胞中增加。
表2
  化合物   时间   血浆铜蓝蛋白(CP)   运铁蛋白受体(TFR2)
  D   6小时   2.06/2.387   未测定
  B   1小时   1.142/0.946   0.575
  B   3小时   1.123/0.955   0.558
  B   6小时   1.555/1.103   0.822
  B   12小时   2.366/2.507   1.253
  B   24小时   5.136/4.909   2.522
  B   48小时   5.82/4.678   4.169
实施例16：动物给药剂量
如下实施例中使用的动物包括得自Simonsen，Inc.(Gilroy CA)、Charles River(Hollister，CA)或Harlan的Swiss Webster雄性小鼠(30-32g)、Sprague Dawley雄性大鼠(200-350g)和Lewis雌性大鼠。动物使用标准程序饲养，随意喂食和给水。在处理期间，监测动物的体重变化及外在毒性和死亡率迹象。
化合物通常通过强饲口服或静脉内注射给予。通过强饲口服的动物接受4-10ml/kg体积的含0.1％聚山梨醇酯80或不含聚山梨醇酯80(0mg/kg/天)的0.5％羧甲基纤维素(CMC；Sigma-Aldrich，St.LouisMO)，或者接受在含或不含0.1％聚山梨醇酯80或不含聚山梨醇酯80的0.5％CMC中的不同剂量的本发明化合物(例如HIF脯氨酰羟化酶抑制剂)，使用不同的剂量方案进行。在处理期间以适当间隔从例如尾静脉(大鼠)、或者经腹部静脉或心脏穿刺(小鼠或大鼠)收集血样。一般地，使用异氟烷麻醉动物，将血样收集在MICROTAINER血清分离试管(Becton-Dickinson，Franklin Lakes NJ)中。为测定血清成分，将试管在室温保温30分钟，然后在4℃在8,000rpm离心10分钟。然后将血清级分进行加工并分析特异成分例如血清铁的存在(由Quality Clinical Labs，Mountain View，CA进行分析)。为确定血细胞比容，将血样收集在MICROTAINER EDTA-2K试管(Becton-Dickinson)中，然后将EDTA-血倒入75mm×1.1-1.2mm I.D.毛细管(ChaseScientific Glass，Inc.，RockwoodTN)中至大约3/4长度，试管的一端用CRITOSEAL密封剂(Sherwood Medical Company)密封，将试管在J-503M MICROHEMATOCRIT离心机(Jorgensen Laboratories，Inc.，Loveland CO)中以12,000rpm离心5分钟。根据读卡读数血细胞比容。当指定时，由Quality Clinical Labs(Mountain View，CA)进行全血计数(CBC)分析，包括血液血红蛋白水平、网织红细胞数目和血细胞比容分析。
在每次研究结束时，动物通过例如在一般麻醉下放血或者吸入CO2窒息而行安乐死，收集器官和组织样品。将组织在中性缓冲的福尔马林中固定或者在-70℃贮存。将进行基因组分析的样品置于RNAlater中。
实施例17：编码铁加工蛋白的基因在体内增加的表达
Swiss Webster雄性小鼠如上述用单剂量的0.5％CMC(Sigma-Aldrich)(0mg/kg)或100mg/kg化合物A处理。在给药后第4、8、16、24、48或72小时麻醉动物，处死动物，分离肾、肝、脑、肺和心的组织样品，在-80℃贮存于RNALATER溶液(Ambion)中。或者，将动物连续4天每天给予0.5％CMC(0mg/kg/天)、于0.5％CMC中的7.5mg/ml化合物A(30mg/kg/天)或者于0.5％CMC中的25mg/ml化合物A(100mg/kg/天)进行处理。最后给药4小时后，麻醉动物，处死动物，分离大约150mg肝和左右肾，于RNALATER溶液(Ambion)中贮存在-20℃。
用下述方案进行RNA分离。将每一器官的一部分切片，加入875μl RLT缓冲液(RNEASY kit，Qiagen Inc.，Valencia CA)，用一转子-定子POLYTRON匀浆器(Kinematica Inc.，Cincinnati OH)将所述切片匀浆约20秒。微型离心匀浆液3分钟以沉淀不溶物质，将上清转移至一新管，根据厂商指导用RNEASY(Qiagen)分离RNA。将RNA洗脱进80微升水中，用RIBOGREEN试剂(Molecular Probes，EugenOR)定量。测量260和280nm处的吸光度以确定RNA纯度和浓度。
或者，将组织样品切片并用一转子-定子POLYTRON匀浆器(Kinematica)在TRIZOL试剂中匀浆。将匀浆液升至室温温度，加入0.2体积氯仿，剧烈混合样品。混合物在室温保温几分钟，然后于4℃以12000g离心15分钟。收集水相并加入0.5体积异丙醇。混合样品，在室温保温10分钟，在4℃以12000g离心10分钟。弃上清，将沉淀用75％乙醇洗涤，在4℃以7500g离心5分钟。测量260和280nm处的吸光度以确定RNA纯度和浓度。
将RNA在0.3M乙酸钠(pH 5.2)、50ng/ml糖原和2.5体积的乙醇中在-20℃沉淀1小时。离心样品并将沉淀用冷80％乙醇洗涤、干燥并再悬浮于水中。双链cDNA根据厂商指导使用T7-(dT)24第一链引物(Affymetrix，Inc.，Santa Clara CA)和SUPERSCRIPT CHOICE系统(Invitrogen)合成。终cDNA使用PHASE LOCK GEL insert(Brinkman，Inc.，WestburyNY)，使用等体积的25∶24∶1苯酚∶氯仿∶异戊醇提取。收集水相，使用0.5体积的7.5M乙酸铵和2.5体积的乙醇沉淀cDNA。或者，使用GENECHIP样品清除模块(Affymetrix)根据厂商指导纯化cDNA。
使用BIOARRAY HighYield RNA转录标记试剂盒(EnzoDiagnostics，Inc.，FarmingdaleNY)，根据厂商指导在体外翻译反应(IVT)中从cDNA中合成生物素标记的cRNA。最终标记的产物使用GENECHIP样品清除模块(Affymetrix)根据厂商指导纯化和片段化。
杂交混合物通过将5μg探针置于100μl的1×杂交缓冲液(100mM MES，1M[Na+]，20mM EDTA，0.01％Tween 20)，100μg/ml鲑精DNA，500μg/ml乙酰化BSA，0.03nM对照寡B2(Affymetrix)和1×GENECHIP真核杂交对照物(Affymetrix)中制备。随后将混合物在99℃保温5分钟及在45℃保温5分钟，然后离心5分钟。将小鼠基因组MOE430Aplus2阵列(Affymetrix)置于室温，然后与1×杂交缓冲液在45℃旋转预杂交10分钟。然后将缓冲液用80μl杂交混合物更换，并将阵列在45℃在60rpm抗衡杂交16小时。杂交后，将阵列用6×SSPE、0.1％Tween 20洗涤1次，然后使用R-藻红蛋白-缀合的链霉抗生物素蛋白(Molecular Probes，Eugene OR)、山羊抗链霉抗生物素蛋白抗体(Vector Laboratories，Burlingame CA)和GENECHIP FluidicsStation 400装置(Affymetrix)，根据生产者的EukGE-WS2v4方案(Affymetrix)进行洗涤和染色。用GENEARRAY扫描仪(Affymetrix)和Microarray Suite软件(Affymetrix)分析阵列。
小鼠基因组MOE430Aplus2阵列(Affymetrix)代表小鼠UniGenedatabase build 107(National Center for Biotechnology Information，Bethesda MD)中所有序列，包括大约14,000个充分鉴定的小鼠基因。
下表3示出在给予化合物A之后小鼠肾脏中血浆铜蓝蛋白表达情况。数据以在对照的未处理的动物中观测到的平均值标准化。
表3
  条件   血浆铜蓝蛋白(相对mRNA水平)
  未处理的   0.81
  CMC对照   1.26
  化合物A-4小时   1.16
  化合物A-8小时   1.39
  化合物A-16小时   1.22
  化合物A-24小时   2.45
  化合物A-48小时   1.44
  化合物A-72小时   2.10
上表3的数据表明本发明的方法和化合物可用于增加血浆铜蓝蛋白基因表达。血浆铜蓝蛋白也称作铁氧化酶-1，其将从贮存部位(如铁蛋白)释放的还原铁转变为氧化形式。氧化的铁能结合其血浆转运蛋白-运铁蛋白。血浆铜蓝蛋白缺乏与铁在肝脏和其它组织中积累相关。有证据表明血浆铜蓝蛋白促进铁从肝脏流出并促进铁流入缺铁的细胞中(见例如Tran et al.(2002)J Nutr 132：351-356)。
下表4示出给予化合物A之后小鼠肝脏中hepcidin mRNA表达。数据以在对照的未处理的动物中观测到的数据标准化。
表4
  条件/动物研究   时间   Hepcidin(相对mRNA水平)
  对照   -   1.0
  I-多次高剂量   -   0.275
  II-多次高剂量   -   0.703
  II-多次低剂量   -   0.129
  III   4小时   0.672
  III   8小时   0.305
  III   16小时   0.119
如表4所示，给予化合物A导致小鼠肝脏中hepcidin mRNA表达降低。降低的hepcidin表达与铁从网状内皮细胞中释放增加及肠道铁吸收增加相关。因此，本发明的方法和化合物可用于降低hepcidin表达和增加肠道铁的吸收。
图6A示出肾中运铁蛋白受体(灰色条柱)和十二指肠铁转运蛋白NRAMP2(天然-抗性-相关的巨噬细胞蛋白2)(也称作Slc11a2(溶质载体家族11，质子偶联的二价金属离子转运蛋白，成员2)，或者称为DCT1(二价阳离子转运蛋白1)，DMT1(二价金属转运蛋白1))(黑色条柱)的相对表达水平。
在另一个实验中，mRNA分离自第四次给予小鼠60mg/kg化合物A、化合物B和化合物C之后4小时收集的小肠。探针从5组处理动物每组两个动物中的每一动物中制备，并与Affymetrix mouseMOE430Aplus2微阵列杂交(每个阵列一只动物)。对得自处理和未处理动物的阵列的数据进行统计学对比。图6B示出NRAMP2 mRNA在用化合物A、化合物B和化合物C处理的动物小肠中的相对表达水平。表达水平以每个表达的基因的超过对照的未处理的动物的诱导倍数表示。这些实验的结果表明本发明的方法和化合物可用于增加肠道中NRAMP2的表达。这些结果进一步提示本发明的方法和化合物可用于增加铁的吸收，从而增加用于血红素合成、血红蛋白合成、红细胞产生及红细胞生成的铁利用度。
图6C示出在处理的动物中与载体对照组相比，5-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS-2)表达的诱导倍数。数据表明用脯氨酰羟化酶抑制剂处理正常动物导致参与铁代谢的基因包括参与从肠道中吸收铁和通过运铁蛋白受体在周围血中转运铁的基因的表达增加。这些基因的表达在给药后16小时恢复到基线(对照)水平。数据还示出在脯氨酰羟化酶抑制剂处理后在指定的组织中ALAS-2的协同表达，ALAS-2是血红素合成途径的第一种酶和血红素合成的限速酶。综合这些结果表明本发明的化合物协同增加编码参与促进红细胞生成包括铁吸收、铁转运和血红素合成的蛋白质的基因的表达。
或者，使用流式细胞计量术测定双重免疫染色的周围血单核细胞中巨噬细胞中表面标记CD 11c和运铁蛋白受体水平。通过检测到巨噬细胞运铁蛋白受体表达增加而示出化合物处理的活性。另外，可收集血浆并使用可商购的ELISA试剂盒(见例如KomaBiotech，Korea)测试运铁蛋白水平。
实施例18：增强的体内红细胞生成
给予本发明的化合物对红细胞生成的作用如下测定。通过长期给予TNF-α使正常小鼠产生贫血并保持贫血状态，这是已知的由于缺少EPO生成及应答TNF-α的信号传导而抑制红细胞生成的一个方案。在诱导贫血1-4周后，给予动物脯氨酰羟化酶抑制剂。检测组织的BFU-E和CFU-E产生情况，并分析血样成分。结果示出用PHIs处理的动物的骨髓、脾和周围血中BFU-E和CFU-E数目增加，和/或血清血红蛋白、网织红细胞和血细胞比容增加，表明是有效的。
另一个实验动物模型用于检验给予脯氨酰羟化酶抑制剂对于红细胞生成的作用。在这个模型中，转基因小鼠由于TNF-α的组成型过表达而产生慢性疾病性贫血。在这些小鼠中发生贫血后，在不同时期使用不同剂量策略给予脯氨酰羟化酶抑制剂。然后收集组织和血样并进行分析。如上所述，结果示出骨髓、脾和周围血中BFU-E和CFU-E数目增加，和/或血清血红蛋白、网织红细胞和血细胞比容增加，有力地证明转基因动物中与TNF-α过量产生相关的贫血可使用本发明的方法和化合物通过给予脯氨酰羟化酶抑制剂而治疗。
实施例19：增加血清铁水平
将雄性和雌性大鼠用各种浓度(0、20、60或150mg/kg)的化合物A每周处理两次(周一和周四)，共93天。测定总的血清铁水平。
表5
  剂量   血清铁(μg/dL)雄性大鼠(平均值+/-SD)   血清铁(μg/dL)雌性大鼠(平均值+/-SD)
  0mg/kg   158+/-37   342+/-91
  20mg/kg   198+/-64   505+/-41*
  60mg/kg   357+/-111*   445+/-46*
  150mg/kg   307+/-142*   399+/-117
如表5所示，给予化合物A在雄性和雌性大鼠中均增加了血清铁水平(表5中的数据是血清铁水平+/-标准误差。*表示血清铁水平与未处理的动物有显著差异)。这些结果表明本发明的方法和化合物可用于增加血清铁水平，从而可用于治疗与缺铁相关的病变。
实施例20：在慢性疾病性贫血/削弱的红细胞生成/削弱的铁代谢动物模型中的效力
慢性疾病性贫血(ACD)与各种炎症病变相关，包括关节炎、肿瘤疾病及与慢性炎症相关的其它疾病。利用ACD大鼠模型，使用本发明的方法和化合物检验HIF稳定对治疗与慢性疾病相关的贫血的作用。在这个动物模型中，在大鼠中通过肽聚糖-多糖聚合物而诱导ACD(见例如Sartor et al.(1989)Infection and Immunity 57：1177-1185)。在这个模型中，动物在初期阶段产生严重的急性贫血，随后在晚期阶段产生中等程度的慢性小红细胞性贫血。
ACD动物模型-实验系列1：
将大约160g的雌性Lewis大鼠用PG-PS10S(Lee Laboratories，15μg/gm体重，腹膜内注射)攻击。PG-PS 10S含有分离自A群化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes，Group A)D58株的细胞壁的纯化的肽聚糖-多糖聚合物。使关节炎和贫血发展35天。在第35天，在全身麻醉(异氟烷)下从尾静脉取血样(大约400μl)进行CBC和网织红细胞计数(由Quality Clinical Labs进行)。离心血细胞比容水平在45％或之上的动物认为不是贫血的，排除在本研究之外。
在PG-PS注射后第35天，贫血动物接受单独的载体或者每周用化合物A(60mg/kg，PO)处理连续两天，共两周。在第35天(见上述)、39、42和49天测定自动全血计数(CBC)，在第49天测定血清铁水平。
网织红细胞计数
如图7所示，给予贫血动物化合物A在第39天(即开始给予化合物5天后)使网织红细胞计数增加。在对照(非贫血)和贫血(PG-PS处理的)动物中网织红细胞水平分别为红细胞的大约2％和4％。然而，处理的动物中网织红细胞水平为红细胞的大约10％。化合物A处理使贫血动物中网织红细胞计数增加。因此，化合物A刺激ACD大鼠动物模型中红细胞生成。
血细胞比容
在用化合物A处理的贫血动物中血细胞比容水平增加。贫血(PG-PS处理的)动物的血细胞比容水平(通过Baker 9000在Quality ClinicalLabs测定)为35％以下，相比之下对照的非贫血动物为41％(见图8)。给予贫血动物化合物A使血细胞比容在开始化合物处理后5天就增加至大约37％。在第二次给予化合物A之后，血细胞比容水平增加至大约40％，与在对照的非贫血动物中观测到的血细胞比容水平相似。使用ACD的大鼠模型，化合物A增加了贫血动物的血细胞比容水平。因此，本发明的方法和化合物可用于增加血细胞比容并治疗慢性疾病性贫血。
血红蛋白
给予化合物A还增加了贫血动物中血红蛋白水平。如图9所示，在第35天，对照的非贫血动物的血红蛋白水平为大约15gm/dL，而PG-Ps处理的动物(即贫血动物)中血红蛋白水平为大约13gm/dL。如图9所示，在贫血动物中给予化合物A5天后(第39天)就增加了血红蛋白水平。血红蛋白水平在第49天仍保持增加，达到与对照的非贫血动物相似的水平，表明本发明的化合物使贫血动物恢复了正常的血红蛋白水平。这些结果示出化合物A增加了ACD大鼠模型的贫血动物的血红蛋白水平。因此，本发明的方法和化合物可用于增加血红蛋白并治疗慢性疾病性贫血。
红细胞计数
给予化合物A增加了贫血动物中红细胞计数。如图10所示，在用化合物A处理的动物中与未处理的贫血动物相比，在开始给予化合物A之后5天(即在图10中的第39天)红细胞计数就增加。使用ACD的大鼠模型，化合物A增加了贫血动物的红细胞计数。因此，本发明的方法和化合物可用于增加红细胞计数并治疗慢性疾病性贫血。
平均红细胞体积
贫血动物示出与非贫血对照动物相比平均红细胞体积降低(见图11)。用化合物A处理的贫血动物示出在处理后5天(图11中的第39天)与未处理的贫血动物相比平均红细胞体积就增加了。处理的动物平均血细胞体积与未处理的动物相比在实验期间均保持增加。这些结果示出化合物A改善了(即降低了)小红细胞症(即小红细胞性贫血，存在许多小红细胞，与各种形式贫血相关的异常小的红细胞)水平。因此，本发明的方法和化合物改善/降低慢性疾病性贫血中的小红细胞症。
平均红细胞血红蛋白
贫血动物还示出平均血红蛋白水平降低。如图12所示，用化合物A处理贫血动物增加了平均红细胞血红蛋白水平，高于在未处理的贫血动物中观测到的水平。这些结果表明本发明的方法和化合物可用于增加平均红细胞血红蛋白水平。
ACD的动物模型-实验系列2
将雌性Lewis大鼠(大约150-200gm)注射PG-PS(腹膜内注射)。使关节炎和贫血发展28天。通过管饲法每周两次(周一和周四)、相应于注射PG-PS后第28、31、35、38、42、45、49、52、56、59、63、66和70天给予动物化合物A，共六周。
在第28、42、56和70天从尾静脉收集全血液以进行CBC分析。另外，在第70天收集血清以进行铁结合分析。CBC和铁结合分析通过Quality Clinical Labs(Mountain View，CA)进行。
血细胞比容
血细胞比容水平在用PG-PS激发(challenge)后28天的动物中降低。图13示出用PG-PS注射的动物是贫血的，血细胞比容是未被激发(即非贫血)的动物的85％(图13中的0周相应于这个实验方案的第28天)。用化合物A(40mg/kg)处理的未被激发的(即非贫血的)动物示出血细胞比容水平随着时间而增加至未被激发的未处理的动物的110％以上。如图13所示，给予贫血动物化合物A导致血细胞比容水平增加。
血红蛋白
给予化合物A在贫血和非贫血动物中均增加了血红蛋白水平。如图14所示，用化合物A(40mg/kg)处理的非贫血动物中血红蛋白水平增加至未处理的对照动物的大约110％(图14中0周相应于这个实验方案的第28天)。在贫血动物中，血红蛋白水平在每周给予2次10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg化合物A时增加。血细胞比容水平持续增加至少4周。
红细胞计数
贫血动物与非贫血动物相比具有较低的红细胞计数。特别地，贫血动物中红细胞计数低于在注射PG-PS 28天后非贫血动物中观测结果的90％。如图15所示，红细胞计数在用化合物A处理的贫血动物中与未处理的动物相比增加(图15中0周相应于这个实验方案的第28天)。在给予化合物后2周观测到红细胞计数增加，并在6周的实验期间持续增加。
平均血细胞体积
贫血动物示出平均血细胞体积与非贫血(无激发)动物相比降低。如图16所示，用PG-PS处理的动物平均血细胞体积随着时间的推移持续降低，表明慢性疾病性贫血导致小红细胞性贫血(其特征部分在于红细胞数降低及红细胞较小)的作用，及由于铁的贮存而不能利用所致不能产生血红蛋白(图16中0周相应于这个实验方案中第28天)。给予贫血动物化合物A导致平均血细胞体积降低的减缓。因此，使用本发明的化合物和方法抑制脯氨酰羟化酶对于降低慢性疾病性贫血和缺铁性贫血相关的平均血细胞体积减小、恢复平均血细胞体积、保持平均血细胞体积等是有效的。这个数据进一步表明本发明的方法和化合物可用于从铁贮存中增加铁的利用度以用于血红蛋白产生。
平均红细胞血红蛋白
贫血动物与对照动物相比具有降低的平均红细胞血红蛋白水平，表明慢性疾病性贫血影响血红蛋白产生。如图17所示，给予化合物A的贫血动物示出随着时间的推移平均红细胞血红蛋白水平的降低减缓(图17中0周相应于这个实验方案中第28天)。
铁状态：血清铁和运铁蛋白饱和度
患有慢性疾病性贫血的患者的临床特征在于血浆铁浓度和运铁蛋白饱和度降低。在正常和贫血动物中测定了本发明的化合物对血清铁和运铁蛋白饱和度的作用。使用慢性疾病性贫血的动物模型，通过腹膜内注射肽聚糖-多糖聚合物而在大鼠中诱导贫血，如上所述。使关节炎和贫血发展28天。然后将动物用各种浓度的化合物A处理，每周2次共6周。通过Quality Clinical Labs确定血清铁水平和运铁蛋白饱和度。
如图18A所示，贫血动物(PG-PS)与非贫血动物(sham)相比具有较低的血清铁水平。给予化合物A在贫血(PG-PS)和非贫血对照(sham)动物中均导致血清铁水平增加。用化合物A处理的动物与未处理的非贫血动物及未处理的贫血动物相比，具有增加的运铁蛋白饱和度(见图18B)。这些结果表明本发明的方法和化合物可用于增加血清铁水平和运铁蛋白饱和度百分比。
铁吸收
在给予贫血动物化合物A(40mg/kg，2次/周)后第6周，进行微阵列分析以检测编码参与肠道中铁转运和吸收的蛋白质的基因的表达。使用上述方法进行微阵列分析，使用The Rat Genome 230Aarray(Affymetirx)进行，其代表Rat Unigene database build 99(NationalCenter for Biotechnology Information，Bethesda，MD)中所有序列，包括大约4,699个充分鉴定的大鼠基因和大约10,467个EST序列及大约700个非EST序列。
如图19所示，给予对照动物化合物A增加了NRAMP2(空心条柱)和sproutin(实心条柱)的mRNA的肠道表达。未处理的贫血动物(PG-PS)对于NRAMP2和sproutin均具有降低的mRNA表达水平。这些结果表明慢性疾病性贫血与参与铁吸收的蛋白质的表达降低相关。然而，用化合物A处理的贫血动物示出肠道中NRAMP2和sproutin表达均增加(图19)。这些结果表明本发明的方法和化合物可用于增加与铁转运和吸收相关的基因的表达。另外，这些结果提示本发明的化合物增加健康对象及慢性疾病性贫血对象中铁的吸收和转运。
实施例21：人对象中增强的红细胞生成
人对象中脯氨酰羟化酶抑制对红细胞生成的作用如下检测。每周给予健康人志愿者两次或三次口服20mg/kg化合物A，共4周。在给予化合物后不同时间，抽取血液分析EPO、血红蛋白、血细胞比容、红细胞计数、可溶的运铁蛋白受体和血清铁蛋白水平。
网织红细胞计数
如图20所示，给予人对象化合物A使网织红细胞计数增加至高于安慰剂对照组。增加的网织红细胞计数出现在每周给予两次或三次化合物的对象中。在处理的个体中，其网织红细胞水平增加至高于大约1.7％，相比之下，未处理的个体网织红细胞水平为1.4％。给予人对象化合物A增加了网织红细胞计数。因此，本发明的方法和化合物可用于增强红细胞生成并从而增加网织红细胞水平。
血细胞比容
在用化合物A处理的人对象中血细胞比容水平增加。在每周给予两次化合物A的人对象中，血细胞比容水平高于46％，相比之下，安慰剂对照组对象大约为44％。
化合物A增加了人对象中血细胞比容。因此，本发明的化合物和方法可用于增强红细胞生成及从而增加血细胞比容。
红细胞计数
给予人对象化合物A增加了红细胞计数。如图21所示，在每周两次或三次用20mg/kg化合物A处理的人对象中与未处理的安慰剂对照对象相比红细胞计数增加。这些数据表明本发明的方法和化合物可用于增强红细胞生成，从而增加红细胞计数。
铁的状态-可溶的运铁蛋白受体和血清铁蛋白
上述结果表明本发明的方法和化合物对于增加人对象中网织红细胞计数、红细胞、血红蛋白和血细胞比容是有效的。如图22所示，给予人对象化合物A使可溶的运铁蛋白受体水平增加至高于未处理对照对象的水平。在每周处理两次或三次的人对象中观测到了可溶的运铁蛋白水平增加。在每周处理两次和三次的患者中，在第21天分别观测到35％和31％的最大应答。安慰剂处理的患者体内的sTfR平均血浆浓度未改变。另外，在用化合物A处理的人对象中血清铁蛋白水平降低大约46％，表明这些对象中铁的利用增加(见图23)。
总之，这些数据表明使用本发明的化合物和方法稳定HIF可增加铁贮存的动员、增加铁转运至骨髓并增加铁用于血红蛋白的合成、红细胞生成及红细胞的产生。
除了本文所示及所述的那些之外，本领域技术人员根据前述描述可显而易见对本发明进行的各种修改。这种修改包含在所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献均以其全文并入参考。

Claims (35)

1.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于治疗对象中的慢性疾病性贫血的药物的用途，其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物
Figure FDA0000369301570000011
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
2.权利要求1的用途，其中所述慢性疾病性贫血与选自如下一组的慢性疾病相关：风湿热，系统红斑狼疮，肿瘤疾病，慢性感染和慢性炎症。
3.权利要求1的用途，其中所述慢性疾病性贫血与类风湿性关节炎,炎症性肠道疾病或血管炎相关。
4.权利要求1的用途，其中所述药物用于增加红细胞生成中可利用的铁的量。
5.权利要求4的用途，其中所述增加红细胞生成中可利用的铁的量是指增加在血红素合成﹑血红蛋白产生或红细胞产生中铁的可利用程度。
6.权利要求1的用途，其中所述对象的血清铁水平低于60μg/dL。
7.权利要求1的用途，其中所述对象的运铁蛋白饱和度水平低于20%，及再者所述对象的血清铁蛋白水平高于200ng/ml。
8.权利要求1的用途，其中所述对象的运铁蛋白饱和度水平低于20%，及再者所述对象的血清铁蛋白水平低于200ng/ml。
9.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于治疗或预防对象中的小红细胞症的药物的用途，其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000021
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
10.权利要求9的用途，其中所述小红细胞症与选自如下一组的疾病相关：慢性疾病及缺铁。
11.权利要求9的用途，其中所述对象的血清铁水平低于60μg/dL。
12.权利要求9的用途，其中所述对象的运铁蛋白饱和度水平低于20%，及再者所述对象的血清铁蛋白水平高于200ng/ml。
13.权利要求9的用途，其中所述对象的运铁蛋白饱和度水平低于20%，及再者所述对象的血清铁蛋白水平低于200ng/ml。
14.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于治疗或预防对象中的缺铁的药物的用途,其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000022
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
15.权利要求14的用途，其中所述缺铁是功能性缺铁。
16.权利要求14的用途，其中所述缺铁是与贫血相关。
17.权利要求14的用途，其中所述缺铁是与选自如下一组的疾病相关：炎症﹑感染﹑免疫缺陷疾病及肿瘤疾病。
18.权利要求14的用途，其中所述对象的血清铁水平低于60μg/dL。
19.权利要求14的用途，其中所述对象的运铁蛋白饱和度水平低于20%，及再者所述对象的血清铁蛋白水平高于200ng/ml。
20.权利要求14的用途，其中所述对象的运铁蛋白饱和度水平低于20%，及再者所述对象的血清铁蛋白水平低于200ng/ml。
21.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于降低对象中海帕西啶的表达的药物的用途,其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000031
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
22.权利要求21的用途，其中所述对象有一慢性疾病。
23.权利要求22的用途，其中所述慢性疾病选自：贫血及缺铁。
24.权利要求23的用途，其中所述贫血选自：慢性疾病性贫血﹑小红细胞性贫血及缺铁性贫血，其中所述缺铁是功能性缺铁。
25.权利要求22的用途，其中所述慢性疾病选自：炎症﹑感染﹑免疫缺陷疾病及肿瘤疾病。
26.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于增加对象中铁的吸收的药物的用途,其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000041
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
27.权利要求26的用途，其中所述铁的吸收是肠道铁的吸收。
28.权利要求26的用途，其中所述铁的吸收是饮食中铁的吸收。
29.权利要求26的用途，其中所述铁的吸收是在十二指肠肠细胞内吸收。
30.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于增加对象中血清铁水平的药物的用途,其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000042
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
31.权利要求30的用途，其中所述对象有一选自如下的病症：贫血及缺铁。
32.权利要求31的用途，其中所述贫血选自：慢性疾病性贫血﹑小红细胞性贫血及缺铁性贫血，其中所述缺铁是功能性缺铁。
33.权利要求30的用途，其中所述血清铁水平增加至介乎50-150μg/dL。
34.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于治疗对象中贫血的药物的用途，其技术特征在对所述对象施用所述药物后，所述对象的血清铁蛋白水平维持高于100ng/ml,其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000051
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
35.一种抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的杂环氨基甲酰化合物在制备用于治疗对象中贫血的药物的用途，其技术特征在对所述对象施用所述药物后，所述对象的运铁蛋白饱和度水平维持高于20%,其中所述杂环氨基甲酰化合物是一式(Ib)的化合物：
Figure FDA0000369301570000061
其中
Q和X是氧；
A是–CH2；
B是–COOH；
R4是氢；
R16是氢；
R17是氢；
R19是氢；
R18是氢，(C1-C20)-烷基或者(C6-C12)-芳氧基；及
R3是氢，(C1-C20)-烷基或卤素。
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